PROCEDE D'OBTENTION DE COPOLYMERES PAR GREFFAGE DE MOTIFS VINYLIQUES ET COPOLYMERES GREFFES RESULTANTS

L'invention concerne un procédé d'obtention de copolymeres par greffage de motifs vinyliques et les copolymeres bioactifs résultants.

Elle vise plus particulièrement l'obtention de copolymeres comportant au moins une molécule présentant une activité biologique, associée par liaison irréversible à un matériau macromoléculaire, par l'intermédiaire de motifs greffés d'un ou plusieurs monomères vinyliques.

Ce type de copolymeres a été étudié pour élaborer par exemple des prothèses vasculaires ou encore des phases actives utilisables en chromatographie d'affinité.

Dans ces applications, il s'agit de disposer, à la surface d'un matériau, d'une molécule bioactive capable d'interagir avec le milieu dans lequel se trouve le matériau. Selon l'art antérieur, l'association covalente de la molécule bioactive au matériau macromoléculaire support, est généralement obtenue par 1'intermédiaire d'agents de couplage. Ces agents sollicitent le plus souvent la capacité réactionnelle des groupes -OH ou -NH2 de la molécule à lier. La probabilité pour un grand nombre de ces sites appartenant à une même molécule de participer aux processus d'association demeure importante, avec pour conséquence une réduction parallèle de la liberté conformationnelle de la molécule et une diminution de son activité biologique. Suivant une autre voie, certains des co-inventeurs de la présente demande ont tenté d'associer de 1'héparine par greffage radiochimique, à l'aide de monomères vinyliques sur un matériau polymère constitué par un polyester, pour former une prothèse vasculaire (Baquey et al. Innov. Tech. Biol. Med. vol 2, n° 4 1981, 379-389).

Les conditions opératoires utilisées ont bien permis de conférer au polyester des propriétés anticoagulantes, mais celles-ci, associées à son défaut

d'imperméabilité intrinsèque, n'ont pas conduit à des produits industriellement utilisables.

Les développements des travaux des inventeurs sur la technique de greffage mettant en oeuvre des monomères vinyliques ont à présent permis de définir des conditions opératoires assurant l'établissement, entre des molécules bioactives et des matériaux macromoléculaires, de liaisons covalentes, et permettant de munir le matériau macro¬ moléculaire de propriétés biologiques d'intérêt. L'invention a donc pour but de fournir un procédé d'obtention de copolymeres bioactifs assurant un meilleur maintien de la liberté conformationnelle de la molécule biologique et, par là, de son activité biologique.

Elle vise également à fournir des copolymeres permettant notamment de moduler les interactions de matériaux macromoléculaires avec les milieux biologiques avec lesquels ils sont mis en contact.

L'invention vise en outre les applications biologiques de ces copolymeres pour 1'élaboration par exemple de prothèses vasculaires ou de phases actives utilisables en chromatographie d'affinité.

Le procédé d'obtention des copolymeres bioactifs de l'invention est caractérisé en ce qu'on soumet simultanément au moins un composé A choisi parmi une protéine, un peptide, un dérivé de protéine ou de peptide et un matériau B synthétique ou naturel, à un traitement radiochimique, chimique ou photochimique, en présence d'un ou plusieurs monomères vinyliques, d'au moins un inhibiteur d'homopolymerisation et d'un agent reticulant, de manière à obtenir le greffage des motifs d'origine vinylique, par association irréversible sur A et B et la reticulation des motifs d'origine vinylique.

Ces dispositions permettent de fixer le produit A sur un matériau macromoléculaire B par 1'intermédiaire de chaînes polymeriques d'origine vinylique établissant des ponts de longueur variable entre A et B et par reticulation entre ces ponts. Il en résulte d'une part une fixation solide de A sur le matériau macromoléσulâire B et une grande

FEUILLE DE REMPLACEMENT

souplesse au niveau de la liaison entre A et B, la reticulation augmentant la probabilité d'établissement de ponts polymères entre les deux partenaires A et B.

Le choix de la protéine, du peptide ou du dérivé de protéine ou de peptide est effectué en fonction de l'application spécifique envisagée.

D'une manière générale, on a recours à une protéine, un peptide ou à un de leurs dérivés doté d'une activité biologique possédant une affinité particulière pour un ligand donné moléculaire ou cellulaire, par exemple un récepteur cellulaire.

Pour réaliser des revêtements étanches de textiles macromoléculaires, en vue notamment de l'élaboration de prothèses vasculaires, on utilise avec avantage comme protéine A du collagene.

On met plus particulièrement en oeuvre du collagene d'origine bovine contenant une proportion prépondérante de collagene de type I.

D'autres protéines avantageuses possèdent une action pro-inhibitrice des protéases de la coagulation, telle 1'antithrombine III (AT III), ou pro-activatrice de la fibrinolyse, une action inhibitrice de l'adhésion plaquettaire telle l'albumine, ou encore une action médiatrice de la fibrinolyse ou une action médiatrice de l'adhésion et de la croissance cellulaires.

Comme facteurs pro-fibrinolytiques, on citera l'urokinase, l'activateur tissulaire du plasminogène (tpA) la streptokinase.

On notera que l'association de l'AT III à un matériau macromoléculaire permet une inhibition in situ de la thrombine générée au cours de 1'interaction entre le matériau et le sang.

Des protéines favorisant 1'attachement cellulaire et/ou intervenant dans , 1'organisation de la matrice extracellulaire des tissus telles que la fibronectine ou la laminine, utilisées le cas échéant conjointement avec d'autres protéines, par exemple le collagene, permettent de

disposer de copolymeres favorisant 1'attachement de cellules.

D'autres protéines encore comprennent l'élastine ou des facteurs de croissance. Les protéines utilisées selon 1'invention peuvent être en mélange avec d'autres composés, par exemple avec des protéoglycanes et/ou des glycosaminoglycanes.

Les dérivés de protéines sont par exemple des glycoprotéines ou encore des lipoprotéines. Pour disposer de systèmes de purification, il est également avantageux de mettre en oeuvre des protéines utilisables dans les techniques de chromatographie d'affinité telles que des immunoglobulines spécifiques ou encore de 1'antithrombine III. Parmi les peptides appropriés pour la mise en oeuvre de 1'invention, on citera ceux présentant un intérêt dans la maîtrise de 1'adhésion cellulaire et possédant ou correspondant à des séquences particulières jouant un rôle dans l'adhésion des cellules à la matrice extracellulaire. Au vu de leurs propriétés de tels peptides sont avantageusement incorporés dans la structure de surfaces destinées à être colonisées par les cellules.

Une séquence peptidique de ce type reconnue par les récepteurs d'adhésion des cellules est du type arg-gly- asp.

Cette séquence tripeptidique peut être utilisée seule, dans un peptide de synthèse ou dans une séquence répétitive.

Cette séquence ou toute autre séquence d'intérêt peut être également présente dans des chaînons polymères.

L'utilisation selon l'invention d'un peptide ou d'un polypeptide, ou de toute macromolécule contenant une séquence peptidique renfermant un ou plusieurs motifs tripeptidiques tels qu'évoqués plus haut permet notamment d'améliorer le comportement du matériau macromoléσulaire B vis-à-vis des tissus.

Le matériau macromoléculaire B est d'origine synthétique ou naturelle.

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Des matériaux synthétiques particulièrement intéressants pour les applications biologiques de ces copolymeres, comprennent les polymères tels que polyesters, polyuréthannes, polymères formant des fibres. Dans une variante le matériau B lié à A constitue un revêtement à la surface d'un autre type de matériau. La liaison covalente ne met donc en jeu que le réseau macromoléculaire du revêtement superficiel.

Les matériaux macromoléculaires naturels comprennent par exemple la cellulose, l'agarose, le dextrane, 1'amidon.

Préférentiellement, le monomère vinylique est choisi parmi 1'acide acrylique ou méthacrylique ou les acrylates ou méthacrylates d'alcoyle et d'hydroxyalcoyle, en particulier de Ci à C4 notamment de méthyle, des dérivés de ces composés tels l'acrylamide ou 1'acrylonitrile. Le monomère vinylique peut être formé par des composés multivinyliques.

Le greffage est réalisé par tout moyen radiochimique, chimique ou photochimique approprié.

Selon un mode préféré de réalisation de 1'invention le greffage est effectué selon un procédé radiochimique.

L'utilisation de sources radioactives émettant des rayonnements gamma permet une réalisation aisée du greffage.

La dose délivrée est d'au moins 1 kilogray. Le débit de dose est de 3 kilograys/heure environ.

Grâce à 1'addition d'un agent reticulant au milieu réactionnel, les taux de greffage peuvent être limités, ce qui permet de mieux maintenir la liberté conformationnelle de A et donc son activité biologique.

L'agent reticulant permet la ramification et la reticulation des chaînes d'homopolymère en croissance. La probabilité d'établissement de ponts entre les composés A et B se trouve par là-même augmentée.

Comme agents réticulants appropriés, on citera des agents comportant au moins deux doubles liaisons vinyliques tels que le diméthacrylate d'éthylène ou le bis-acrylamide.

FEUILLE DE REMPLACEMENT

Le greffage est de préférence réalisé en phase liquide.

Dans une disposition de ce mode de réalisation le matériau macromoléculaire B est immergé dans une solution aqueuse renfermant le composé A, un monomère vinylique ou multivinylique, l'inhibiteur d'homopolymerisation et l'agent reticulant.

Les proportions de réactifs permettant d'obtenir les propriétés mécaniques satisfaisantes du matériau macromoléculaire et un aspect macroscopique inchangé correspondent à l'utilisation, en pourcentage en poids, du dérivé vinylique à raison de 15 à 25 %, de l'inhibiteur d'homopolymerisation à raison de 5 à 10 % environ, de l'agent de reticulation à raison de 0,001 % à 0,25 %, le composé A représentant environ 30 %, le restant étant de 1'eau.

L'inhibiteur d'homopolymerisation est un sel, par exemple un sel de cuivre ou de fer, tel CuS04 ou Fe SO4.

Selon une variante, on opère en phase vapeur. Le greffage peut être réalisé par voie photochimique ou encore par voie chimique par exemple à l'aide de systèmes rédox tels que le couple Ce ^III+ /Ce ^IV+

L'invention vise également en tant que produits nouveaux les copolymeres greffés tels qu'obtenus par mise en oeuvre du procédé défini ci-dessus.

Ces copolymeres sont caractérisés en ce qu'ils comportent un composé A choisi parmi une protéine, un peptide, un dérivé de protéine ou un dérivé de peptide, associé par liaison covalente à un matériau macromoléculaire B par 1'intermédiaire de chaînons polymères tels que résultant du greffage de monomères de type vinylique ou d'un mélange de tels monomères, formant réseau par l'intermédiaire d'un agent de reticulation vinylique.

Dans ces copolymeres, A et B sont tels que définis ci-dessus. Les chaînons polymères proviennent des monomères vinyliques ou multivinyliques et de leurs dérivés, comme indiqué plus haut.

Des copolymeres de 1'invention sont des copolymeres ternaires de type protéine A/chaînons d'origine vinylique réticulés/matériau macromoléculaire B.

La protéine A est formée par une protéine d'un type donné ou comprend plusieurs protéines choisies en fonction des applications envisagées.

Le matériau macromoléculaire peut être formé d'un seul type de matériau ou de matériaux composites ou de structure complexe dans lesquels seule la surface sert de support à la protéine A.

Dans d'autres copolymeres, le composé A est un dérivé de protéine, un peptide ou un dérivé de protéine ou de peptide comme déjà défini.

Compte tenu de leurs propriétés mécaniques et d'étanchêité particulièrement satisfaisantes, les copoly¬ meres de 1'invention sont spécialement appropriés pour 1'élaboration de substituts de prothèse vasculaires.

L'établissement de liaisons réticulées entre elles, entre le réticulum protéique et, par exemple, un polyester constitutif d'un substitut vasculaire assure le maintien en place de la composante protéique in vivo. La solidité des liens établis entre la matrice protéique, par exemple du collagene et le polyester, et la morphologie alvéolaire, apparaissant sur la figure unique, de cette matrice favorise l'installation pérenne d'un endothelium consécutive à une implantation, ou à la culture in vitro de cellules endothéliales.

D'autres applications des copolymeres de 1'invention comprennent 1'élaboration de phases actives utilisables en chromatographie d'affinité, en particulier pour la purification de molécules biologiques ou pour effectuer un tri cellulaire et dont l'héparine Sepharose ® et le Protéine A Sepharose représentent des exemples particulièrement connus. Ainsi, la fixation d'immunoglobulines sur un matériau B approprié permet de fixer sélectivement les antigènes d'un milieu biologique, spécifiquement reconnus par ces immunoglobulines. ^•

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De même la fixation d'ATIII sur un support B. permet de disposer d'un matériau pour séparer de l'héparine ou des fragments d'héparine d'un milieu donné ou des produits ayant une activité calquée sur celle de l'héparine. La capacité du composé A à être reconnu par les molécules du milieu à analyser permet d'effectuer des séparations avec des rendements élevés.

En effet, les molécules de A liées au support B auquel elles apportent une affinité spécifique pour une molécule donnée, ou un type cellulaire donné, conservent mieux leur intégrité fonctionnelle que lorsqu'elles sont liées selon les procédés chimiques de l'art antérieur.

Pour illustrer l'invention,, on rapporte ci-après des exemples de préparation de copolymeres greffés (1) polytérephtalate d'éthylène/chaînons d'origine vinylique/collagène ou

(2) Cellophane ® /chaînons d'origine vinylique /collagene ou albumine. Dans ces exemples, il est fait référence à la figure unique qui représente une photo d'une vue en microscopie électronique à balayage d'un échantillon de tricot de polytérephtalate d'éthylène associé à du collagene et de l'acide acrylique selon le procédé de l'invention. EXEMPLE 1 - Etude de l'imperméabilisation d'une prothèse en polyester greffé (copolymère polytérephtalate d'éthylène/acide acrylique/collagène) .

- Protocole de greffage

. Préparation des échantillons de polyester Les prothèses sont découpées en échantillons, pesées, lavées à l'eau distillée bouillante dans un appareil de soxhlet jusqu'à masse constante.

• Préparation des réactifs

- Acide acrylique. L'acide acrylique fourni par MERCK contient 200 ppm d'hydroquinone comme inhibiteur de polymérisation. On peut éliminer cet inhibiteur par distillation du monomère qui est ensuite stocké sous vide dans des ampoules à -80°C.

FEUILLE DE REMPLACEMENT

_g_

- Collagene

Le collagene d'origine bovine se présente sous forme lyophilisée, fourni par ORGANOTECHNICS.

Il est dissous dans une solution d'acide acétique glacial à 0,5 mol/1 à une concentration de 1,7 %, puis stocké à +4 ^β C.

- Sulfate de cuivre

Une solution aqueuse de sulfate de cuivre à 10-2 mol/1 est réalisée. Additionnée au milieu reactionnel, elle permet d'éviter 1'homopolymerisation excessive du ou des monomères en solution au cours de l'irradiation.

- Diméthacrylate d'éthylène

L'agent reticulant est stocké à +4°C et utilisé tel quel à très faible concentration. . Mode opératoire

On utilise une solution de greffage renfermant 15 à 30 % d'acide acrylique, 5 à 10 % d'une solution 10~2M de CuS04, 5H20, 40 % de solution de collagene, 0,01 % à 0,25 % d'agent de reticulation avec qsp 100 % d'eau. Les échantillons de polyester sont placés dans une enceinte de verre contenant la solution de greffage homogénéisée. Le contenu de la cellule est dégazé par 4 cycles successifs de congélation - pompage - décongélation.

La congélation est réalisée par immersion de l'enceinte dans l'azote liquide (-196°C).

Le vide est réalisé à 1'aide d'une pompe à palettes.

La cellule est décongelée dans un bain-marie à ^• 37°C. Le nombre de cycles réalisé dépend de la quantité de solution à dégazer. La qualité du dégazage est appréciée de façon visuelle.

La cellule contenant la solution dégazée et les échantillons, est placée dans un irradiateur pour subir 1'irradiation gamme nécessaire à la polymérisation des différents réactifs. Les ^' échantillons sont ensuite récupérés, lavés dans une solution aqueuse d'acide acétique au 1/500, pendant lh, sous agitation, à température ambiante.

Ils sont lavés à l'eau distillée pendant 3 jours de manière à éliminer le copolymère insuffisamment lié à la paroi. Lorsque ^' l'excédent de copolymère est éliminé, les prothèses sont congelées, lyophilisées et pesées. EXEMPLE 2 - Préparation d'un copolymère

Cellophane ¹ /acide acrylique/albumine ou collagene.

Par irradiation gamma jusqu'à absorption de 2 kilograys (gamma de 661 keV du 137cesium), sous un débit de dose de 300.000 rad.h-1, de Cellophane ® préimprégnée par une solution d'albumine ou de collagene et exposée en l'absence d'oxygène à la vapeur saturante d'acide acrylique, on obtient solution d'albumine ou de colla ene et exposéeen l'absence d'oxygène à la vapeur saturante d'acide acrylique^, on obtient l'association irréversible de la protéine à la Cellophane ® . Le matériau obtenu manifeste une biocompatibilité différente de celle de la cellophane de départ, la différence observée dépendant de la protéine utilisée.

EXEMPLE 3 - Préparation d'un copolymère Dacron ®/ acide acrylique / collagene.

Par irradiation gamma jusqu'à absorption de 10 à 15 kilograys (gamma de 661 keV du 137cesium) sous débit de dose de 300.000 rad.h-!, de tricots de polytérephtalate d'éthylène (DACRON^) préimprégnés d'une solution aqueuse de collagene et exposés en l'absence d'oxygène à la vapeur saturante d'acide acrylique, on obtient l'association irréversible du collagene au polyester et 1'étanchéité pariétale immédiate des prothèses confectionnées à partir de ces tricots modifiés.

En outre, d'une manière avantageuse, l'affinité du matériau traité, pour les plaquettes d'une part, et pour le fibrinogène d'autre part, se trouve modifiée par rapport à celle du polyester de départ.

ETUDE DE LA STABILITE DES COPOLYMERES GREFFES

On rapporte les résultats d'une étude effectuée avec de l'albumine de sérum humain (ASH) marquée à 125ι greffée à de la Cellophane ©•

. Des échantillons de Cellophane ® sont mis à incuber en présence d'une solution d'albumine (200 mg/ml) contenant de l'albumine marquée à l'iode 125.

Une première série d'échantillons (série A) est rincée par le tampon solvant jusqu'à obtention d'une valeur constante de leur radioactivité résiduelle ; puis, le rinçage est poursuivi par une solution d'albumine de même concentration que la solution utilisée lors de l'incubation, mais exempte de traceur radioactif. On constate alors une décroissance de la radioactivité résiduelle des échantillons, prouvant un échange de molécules d'albumine préadsorbées, et éventuellement marquées, par des molécules d'albumine froide.

traitement décrit par 1 'invention (Exemple 2 ) . Les échantillons sont ensuite rincés à 1 'eau puis par une solution d'albumine sans traceur radioactif comme les échantillons de la série A. On ne constate pratiquement aucune diminution de leur radioactivité résiduelle ce qui permet de conclure à l'association irréversible de

1 ' albumine à la Cellophane ®.

Le même type d'expérience a été réalisé avec le système Cellophane ® - collagene, et le système polyester - albumine, les résultats obtenus chaque fois confirmant l'établissement d'une liaison irréversible entre le composé

A et le matériau B.

EXEMPLE 4 : CARACTERISATION BIOLOGIQUE. Culture de cellules endothéliales humaines (CEH) en présence d'extraits de copolymeres de 1 'invention (collagène/acide acrylique/Dacron ® ).

Des échantillons greffés selon 1'invention et des échantillons non greffés sont stérilisés avec des rayons gamma 25 kilograys.

Les extraits de matériaux testés sont préparés à partir d'échantillons immergés pendant 120 heures à 37°C dans du sérum physiologique (NaCl 0,9 %). Le volume de sérum utilisé est tel que le rapport entre la surface de l'échantillon à ce volume soit égal à 5 cm2/ml. La concentration finale de l'extrait dans le milieu- de culture est de 10 % (vol/vol).

Les CEH sont isolées à partir de veines de cordon ombilical selon la méthode décrite par Jaffe dans Transplantation proceedings 1980 (Sept) XII, n° 3 Suppl-1, 49-53.

Au troisième passage, on inocule les cellules dans des récipients contenant plusieurs puits à une densité de départ de 7,5 x 103 cellules/cm2. Les cellules sont maintenues à 37"C sous 5 % de C02 et le milieu de culture est renouvelé chaque jour. à 37°C sous 5 % de CO2 et le milieu de culture est renouvel _é chaque jour.

On rapporte les résultats obtenus sur 4 séries :

- un témoin cultivé avec un milieu complet composé de M 199, de 20 % de sérum de veau foetal, Endothelial Cell Growth Supplément*, à raison de 20 ug/ml et d'héparine à raison de 90 ug/ml,

- un contrôle positif mis en culture avec le même milieu contenant 6,4 ug de phénol/ml (ce qui provoque une cytotoxicité constante et reproductible),

- un essai témoin, contenant le même milieu et un extrait de matériau non greffé,

- un essai contenant le même milieu et un extrait de copolymère greffé.

La biocompatibilité du copolymère est évaluée par 1'attachement cellulaire (au bout de 3 à 6 heures), la prolifération et la teneur des cellules en protéines.

FEUILLE DE REMPLACEMENT

A la fin de la période d'incubation choisie, le milieu est éliminé, les cellules sont détachées avec de la trypsine et dénombrées.

Pour effectuer une détermination quantitative des protéines cellulaires, les cellules sont rincées, puis lysées dans de l'eau distillée en utilisant cinq cycles de congélation-décongélation.

La teneur totale en protéines (en ug/105 cellules) est déterminée selon la technique dite Pierce BCA protein assay (Interchim, Paris). Pour une biocompatibilité- spécifique, la présence intracellulaire de facteur VIII (FVIII) est révélée par immunofluorescence dans les témoins et les séries testées au 6ème jour de prolifération.

On observe un attachement complet des cellules pour toutes les séries en 3 heures. Au 6ème jour, les cellules sont homogènes. Les séries testées sont morphologiquement semblables au témoin.

L'étude des cinétiques de prolifération a montré que la présence d'extraits de copolymeres greffés ne conduit pas à une inhibition.

Les CEH expriment et maintiennent leurs caractéristiques, à savoir la synthèse d'antigène FVIII, même en présence d'extraits de matériaux copolymeres selon 1'invention.

EXEMPLE 5 : Application du procédé de 1'invention à 1'association d'une protéine à une phase de chromatographie.

La phase choisie est le SEPHADEX ® G 25 (Dextran réticulé) et la protéine de l'albumine.

Le Sephadéx ® (1 g) est mis à gonfler dans une solution d'albumine (7,0 mg/ml) accompagnée d'albumine marquée à l'iode 125 en tampon phosphate physiologique (PBS

- pH = 7,4), pendant 10 heures.. On ajoute 1 ml d'acide acrylique, 1 ml de solution de sulfate de cuivre (5.10 ^-2 M).

La suspension finale est dégazée sous un vide de 5.102 torr, puis irradiée jusqu'à absorption de 1 Mrad sous un débit de dose de 0,3 Mrad.h-1 environ..

Le gel de Sephadex ® est récupéré par décantation puis extrait au soxhlet par un mélange 1:1 (méthanol/eau) pendant 5 jours.

Il est ensuite rincé sur colonne avec 1000 ml d'eau bidistillee sous un débit de 0,5 ml/min. Il est enfin lyophilisé.

Les mesures de radioactivité permettent de calculer un taux de rétention de 1,03 mg/g de Sephadex ® sec, ce qui est 8 fois plus que la quantité retenue lorsque le Sephadex ® exposé à la solution d'albumine, n'est pas irradié et rincé par 100 ml d'eau seulement (pas d'extraction à chaud).

L'irradiation en présence d'acide acrylique conduit donc à une stabilisation de 1'albumine au sein du gel de Sephadex ® .

L'invention fournit donc des copolymeres greffés de grande stabilité, dont la structure permet de mettre pleinement a profit 1'activité biologique du composé de type protéine ou peptide, ce qui présente un intérêt majeur dans les diverses applications biologiques où ces copolymeres s'avèrent appropriés.