Solvay Pharmaceuticals GmbH 30173 Hannover VERFAHREN ZUR GEWINNUNG EINES NATÜRLICHEN GEMISCHES KONJUGIERTER EQUINER ÖSTROGENE Beschreibung Die vorliegende Erfindung betrifft die Gewinnung eines natürlichen Gemisches konjugierter equiner Östrogene, welches an phenolischen Harninhaltsstoffen und an nicht-konjugierten lipophilen Verbindungen aus der Gruppe umfassend nicht- konjugierte Flavonoide, nicht-konjugierte Isoflavonoide, nicht-konjugierte Norisoprenoi- de, nicht-konjugierte Steroide, insbesondere Androstan-und Pregnan-Steroide, und vergleichbare nicht-konjugierte Verbindungen, abgereichert ist.

Östrogene werden in der Medizin zur Hormonsubstitutionstherapie eingesetzt.

Insbesondere werden Östrogengemische zur Behandlung und Prophylaxe der, bei Frauen auftretenden Beschwerden der Wechseljahre nach natürlicher oder artifizieller Menopause eingesetzt. Hierbei haben sich natürliche Gemische konjugierter Östroge- ne, wie sie im Harn trächtiger Stuten vorliegen, im Folgenden als natürliche Gemische konjugierter equiner Östrogene bezeichnet, als besonders wirksam und gut verträglich erwiesen.

Der gelöste Feststoffgehalt im Harn trächtiger Stuten (= pregnant mares urine, im Folgenden abgekürzt als"PMU") kann natürlicherweise in weiten Bereichen schwan- ken und im Allgemeinen in einem Bereich von 40 bis 90 g Trockensubstanz pro Liter liegen. Neben Harnstoff und sonstigen üblichen Harninhaltsstoffen sind in dem Fest- stoffgehalt des PMU phenolische Bestandteile in Mengen von ca. 2 bis 5 Gew.-% bezogen auf die Trockensubstanz enthalten. Unter diesen phenolischen Bestandteilen befinden sich Kresole und das als HPMF bekannte Dihydro-3,4-bis [ (3- hydroxyphenyl) methyl]-2 (3H) -furanon. Diese können in freier oder konjugierter Form vorliegen. In dem PMU ist ein natürliches Gemisch von Östrogenen enthalten, welches weitgehend in konjugierter Form, z. B. als Schwefelsäurehalbester-Natriumsalz (im Folgenden abgekürzt als"Sulfatsalz"), vorliegt. Der Gehalt an konjugierten Östrogenen (berechnet als Östrogensulfatsalz) kann zwischen 0, 1 und 0,5 Gew. -% bezogen auf die

Trockensubstanz betragen. Zusätzlich können im Feststoffgehalt des PMU weitere lipophile Verbindungen vorliegen, deren Mengen in weiten Bereichen schwanken können und nicht vorhersehbar sind. Diese lipophilen Verbindungen stammen über- wiegend aus den von den trächtigen Stuten als Nahrung aufgenommen Pflanzen und umfassen vor allem verschiedene Flavonoid-, Isoflavonoid-, Nor-isoprenoid-Derivate und vergleichbare Verbindungen, wie beispielsweise Formononetin, Genistein, Daid- zein, Biochanin A, Equol und Coumestrol. Diese lipophilen Verbindungen ursprünglich pflanzlicher Herkunft können im Harn in konjugierter oder in freier (nicht konjugierter) Form vorliegen. Zu den, im Feststoffgehalt des PMU weiterhin vorkommenden lipophi- len Bestandteilen zählen auch nicht-konjugierte Steroid-Derivate, hier seinen insbe- sondere die Androstan-und Pregnan-Steroide, aber auch nicht-konjugierte Östrogen- Derivate genannt.

Natürliche Gemische konjugierter Östrogene enthaltende Extrakte werden übli- cherweise entweder mittels eines Festphasen-ExtraktionsverFahren oder durch ein Verfahren gewonnen, das auf verschiedenen Flüssig-Flüssig-Extraktionsschritten mit, mit Wasser nicht oder nur wenig mischbaren organischen Lösemitteln basiert. Allge- mein gilt, dass das gewonnene natürliche Gemisch konjugierter Östrogene, um als Wirkstoffkomponente für Pharmazeutika verwendet werden zu können, bestimmte pharmazeutische Spezifikationen erfüllen muss, beispielsweise muss es der in der USP (United States Pharmacopeia) oder European Pharmacopeia festgelegten Spezi- fikation entsprechen. So müssen hinsichtlich des Gehalts an konjugierten Östrogenen bezogen auf die Trockensubstanz bestimmte Grenzwerte eingehalten werden.

Die US Patente No. 2,551, 205 und No. 2, 429, 398 beschreiben ein Verfahren zur Herstellung einer wasser-löslichen Östrogen-Präparation aus PMU, bei dem zunächst durch Adsorption an Aktivkohle oder andere geeignete Adsorbermaterialien, Elution mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, wie z. B. Pyridin, und an- schließende Entfernung des Lösungsmittels ein wässriges Konzentrat erhalten wird, welches den größten Teil der wasserlöslichen Östrogen-Bestandteile des ursprünglich eingesetzten PMUs enthält. Während im US Patent No. 2,429, 398 das Konzentrat durch Extraktion mit Benzol und/oder Ether weiter aufgereinigt wird, wird im US Pa- tent No. 2,551, 205 beschrieben, dass das Konzentrat auf einen pH-Wert zwischen 2 und 6, vorzugsweise zwischen 4 und 5, angesäuert und dann schnell mit einem mit Wasser kaum mischbaren organischen Lösungsmittel aus der Gruppe der aliphati-

schen, aromatischen oder alizyklischen Kohlenwasserstoffe (z. B. Hexan, Benzol, Toluol, Cyclohexan) oder der chlorierten Kohlenwasserstoffe (z. B. Chloroform, Ethy- lendichlorid, Trichlorethylen, Tetrachlorkohlenstoff, Chlorbenzol) extrahiert wird, um unerwünschte Substanzen wie Fette, Öle, freie phenolische Bestandteile und die nicht- konjugierten Steroide durch Überführung in die organische Phase abzutrennen. Ab- schließend wird die wässrige Phase durch Neutralisation stabilisiert. Das US Patent No. 2,551, 205 empfiehlt, den gewonnenen Extrakt durch nachfolgende Extraktions- schritte und Präzipitationen weiter aufzureinigen. Insgesamt wird nach Durchführung des, im US Patent No. 2,551, 205 beschriebenen Verfahrens nur eine Ausbeute von etwa 80% der Östrogen-Bestandteile des eingesetzten Konzentrates erhalten.

Im US Patent No. 2,565, 115 wird die Extraktion der konjugierten Östrogene aus PMU mit Aceton beschrieben. Über die Reinheit der erhaltenen Östrogenfraktion wird keine Aussage gemacht.

Das US Patent No. 2,696, 265 beschreibt ein Verfahren, in dem zunächst die Os- trogene mit einem aliphatischen Alkohol oder Keton, wie Hexanol, Cyclohexanol oder Cyclohexanon, extrahiert werden. Die Östrogene treten in die organische Phase über und werden anschließend weiter aufgereinigt, u. a. wird eine die Ostrogene enthaltende wässrige Phase mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 4 eingestellt und mit Ethylendich- lorid extrahiert.

Im US Patent Nr. 2,834, 712 wird ein Verfahren zur Herstellung von Östrogenge- mischen signifikanter Reinheit und geringer Toxizität offenbart, das auf einer Vielzahl einzelner Extraktionsschritte mit unterschiedlichen Lösungsmitteln und bei Einstellung verschiedener pH-Werte beruht. Dabei finden große Volumina an Lösungsmitteln wie Hexan und Benzol Verwendung. So wird z. B. in einem Schritt ein bereits aufgereinig- tes Konzentrat in Wasser gelöst, mit Salzsäure auf einen pH-Wert von circa 5.0 einge- stellt und mit Benzol und anschließend mit Ether extrahiert, um die phenolischen Be- standteile abzutrennen.

Die internationale Patentanmeldung WO 01127134 beschreibt ein vergleichswei- se einfaches Verfahren, um konjugierte Östrogene aus PMU zu extrahieren : Nach Zugabe eines Salzes, wie z. B. Natriumchlorid, wird der PMU mit mindestens dem gleichen Volumenanteil eines organischen Lösungsmittels, wie z. B. Ethylacetat, extra-

hiert, dabei treten die konjugierten Östrogene in die organische Phase über. Die orga- nische Phase wird abgetrennt und getrocknet, um den Extrakt zu erhalten. In der WO 01/27134 werden keine Aussagen über die Reinheit des erhaltenen Extraktes konju- gierter Östrogene gemacht.

Bei den vorstehend beschriebenen und aus dem Stand der Technik bekannten Flüssig-Flüssig-Extraktionsverfahren treten jedoch eine Vielzahl von Problemen, wie starke Schaumbildung, Sedimentbildung, Emulsionsbildung und schlechte Phasen- trennung auf. Es werden im Allgemeinen mehrere Extraktionsschritte benötigt, was zu Verlusten und nur teilweisen Gewinnung des Östrogengehaltes führt. Weiterhin erfor- dern diese Extraktionsverfahren große Volumina an zum Teil gesundheitsschädlichen Lösungsmitteln. Weiterhin werden in den oben angeführten Patentschriften weder über den Gehalt an nicht-konjugierten lipophilen Bestandteilen, wie beispielsweise nicht- konjugierte Flavonoid-, Isoflavonoid-, Norisoprenoid-Derivate und vergleichbare nicht- konjugierte Verbindungen, oder auch nicht-konjugierte Steroide, insbesondere Andro- stan-und Pregnan-Steroide, in den erhaltenen Produkten noch über eine Abtrennung dieser Bestandteile Aussagen gemacht. Diese aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren liefern entweder keine zufriedenstellenden Ergebnisse hinsichtlich der Aus- beute oder hinsichtlich der Reinheit des erhaltenen Extraktes, gemessen am erhalt- nen Gesamthormongehalt bezogen auf die Trockensubstanz, oder sie beruhen auf einer Vielzahl verschiedener Verfahrensschritte und der Verwendung großer Volumina organischer und z. T. sogar aus toxikologischer Sicht unerwünschter Lösungsmittel.

Weiterhin sind aus dem Stand der Technik verschiedene Festphasen- Extraktionsverfahren bekannt, um ein, an phenolischen Harninhaltsstoffen weitgehend abgereichertes, natürliches Gemisch konjugierter equiner Östrogene zu gewinnen.

So beschreibt die internationale Patentanmeldung WO 98/08526 ein Verfahren, mit welchem in einer Festphasen-Extraktion an einem semipolaren, insbesondere an einem nichtionischen semipolaren, polymeren Adsorberharz ein, an phenolischen Harninhaltsstoffen abgereichertes, weitgehend Kresol-und HPMF-freies, den natürli- chen Östrogen-Gehalt des PMU praktisch vollständig enthaltendes Gemisch gewonnen werden kann. In der internationalen Patentanmeldung WO 98/08526 wird ein ähnliches Verfahren beschrieben, in dem bei der Festphasen-Extraktion Kieselgel als Adsorber- material zum Einsatz kommt. Auch die chinesische Patentanmeldung CN 1308083

beschreibt ein vergleichbares Verfahren, bei dem Cyanogruppen-haltige polare Adsor- berharze verwendet werden. Weiterhin wird in der US Patentanmeldung US 2002/0156303 ein Verfahren beschrieben, bei dem der PMU vor der Aufreinigung über ein Polystyrol Adsorberharz zunächst mit einem alkalischen Solvenz behandelt und durch Filtration vorgereinigt wird. Die so erhaltenen Extrakte eignen sich als Aus- gangsmaterial für die Herstellung von Pharmazeutika, welche als Wirkstoffkomponente das natürliche Gemisch konjugierter Östrogene aus PMU enthalten.

Die gestellten pharmazeutischen Spezifikationsanforderungen, beispielsweise die hinsichtlich des Gehalts an konjugierten Östrogenen bezogen auf die Trockensubstanz einzuhaltenden Grenzwerte, werden normalerweise von den aus PMU gemäß dem Verfahren der WO 98/08526 oder dem Verfahren der WO 98/08525, gewonnenen Gemischen konjugierter Östrogene erFüllt. Insbesondere kann mit Hilfe der dort offen- barten Verfahren ein an phenolischen Harninhaltsstoffen abgereichertes, weitgehend Kresol-und HPMF-freies Produkt gewonnen werden. Es hat sich aber herausgestellt, dass neben dem gewünschten Gehalt an konjugierten Ostrogenen auch nicht- konjugierte lipophile Verbindungen in der gewonnenen Trockensubstanz enthalten sein können. Zu den nicht-konjugierten lipophilen Verbindungen zählen beispielsweise verschiedene nicht-konjugierte Flavonoid-, Isoflavonoid-, Norisoprenoid-Derivate und vergleichbare nicht-konjugierte Verbindungen, wie beispielsweise Formononetin, Geni- stein, Daidzein, Biochanin A, Equol und Coumestrol, aber auch nicht-konjugierte Ste- roide, insbesondere Androstan-und Pregnan-Steroide, und nicht-konjugierte Östroge- ne, wobei diese Aufzählung nicht als abschließend zu betrachten ist. Die Anwesenheit dieser nicht-konjugierten lipophilen Verbindungen im aus dem PMU gewonnenen Gemisch konjugierter Östrogene lässt sich nicht standardisieren, sondern sowohl der Gehalt als auch die Zusammensetzung der freien und der konjugierten lipophilen Ver- bindungen variiert beispielsweise in Abhängigkeit von der aufgenommenen Nahrung der trächtigen Stuten.

Zwar verändert sich die Zusammensetzung des natürlichen Gemisches an kon- jugierten equinen Östrogenen durch die zusätzliche Anwesenheit der nicht- konjugierten lipophilen Verbindungen nicht, aber der Gehalt der konjugierten equinen Östrogene bezogen auf die Trockensubstanz kann vermindert sein. Durch eine gezielte Abtrennung der nicht-konjugierten lipophilen Bestandteile könnte eine höhere Konzen- tration der Wirksubstanzen, d. h. der konjugierten equinen Östrogene, im erhaltenen

Extrakt erreicht werden. Weiterhin gewährleistet eine Abtrennung der nicht- konjugierten lipophilen Verbindungen eine gleichmäßigere Zusammensetzung einzel- ner Extraktchargen, da so die nicht-konjugierten lipophilen Bestandteile, deren Gehalt und Zusammensetzung im PMU in Abhängigkeit von der jahreszeitlich wechselnden Art der aufgenommenen Nahrung der trächtigen Stuten variieren kann, eliminiert wer- den, und damit die erhaltenen Extrakte alle einen vergleichbaren Gehalt konjugierter equiner Östrogene bezogen auf die Trockensubstanz aufweisen. Weiterhin kann eine Abtrennung der nicht-konjugierten lipophilen Verbindungen vorteilhaft sein, um ein gleichmäßiges physiologisches Wirkungsspektrum zu erzielen. Beispielsweise kann es sinnvoll sein, gegebenenfalls anwesende, nicht-konjugierte lipophile Verbindungen, die möglicherweise selbst eine eigene physiologische Wirkung besitzen können, aus dem natürlichen Gemisch konjugierter equiner Östrogene abzutrennen.

Eine Möglichkeit, um die unerwünschten, nicht-konjugierten lipophilen Verbin- dungen abzutrennen, wäre beispielsweise, die mit Hilfe der bekannten, oben aufge- führten Festphasen-Extraktionsverfahren gewonnenen natürlichen Gemische konju- gierter equiner Östrogene einer separaten Flüssig-Flüssig-Extraktion mit einem geeig- neten organischen Lösungsmittel zu unterziehen, welches gezielt die unerwünschten, nicht-konjugierten lipophilen Verbindungen extrahiert, ohne zu einem Verlust an konju- gierten equinen Östrogenen zu führen. Ein solches Verfahren wird generell in der in der anhängigen internationalen Patentanmeldung PCT/EP 03/50703 beschrieben.

Die vorliegende Erfindung hat sich zum Ziel gesetzt, ein technisch und wirtschaft- lich optimales Verfahren zur Gewinnung eines natürlichen Gemisches konjugierter equiner Östrogene zu entwickeln, wobei das Gemisch sowohl an phenolischen Harnin- haltstoffen als auch an nicht-konjugierten lipophilen Verbindungen, insbesondere an nicht-konjugierten Flavonoid-, Isoflavonoid-und Norisoprenoid-Derivaten weitgehend abgereichert ist. Insbesondere ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Ver- fahren zu entwickeln, das im Vergleich zu den bereits bekannten Verfahren zur Gewin- nung natürlicher Gemische konjugierter equiner Östrogene keine zusätzlichen Arbeits- schritte erfordert. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Entwicklung eines Verfah- rens bei dem die Abreicherung sowohl an phenolischen Harninhaltstoffe als auch an nicht-konjugierten lipophilen Verbindungen während einer Festphasen-Extraktion erfolgt. Weiterhin soll ein Verfahren entwickelt werden, das nur auf wenigen Verfah- rensschritten beruht und dabei einen Extrakt konjugierter equiner Östrogene liefert,

welcher einen vergleichsweise hohen Gehalt an konjugierten Östrogenen bezogen auf die Trockensubstanz aufweist. Weiterhin soll es mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung auf einfache Weise möglich sein, auch dann ein natürliches Gemisch konju- gierter Östrogene aus dem Harn trächtiger Stuten zu gewinnen, wenn der Harn wech- selnde und gegebenenfalls erhöhte Mengen an nicht-konjugierten lipophilen Verbin- dungen enthält. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein optimiertes Verfahren zur Festphasen-Extraktion zu entwickeln, so dass das gewonnene natürliche Gemisch konjugierter equiner Östrogene gute Wirkstoffgehalte aufweist und die geforderten pharmazeutischen Spezifikationen erFüllt, insbesondere soll es die erforderlichen Grenzwerte hinsichtlich des Gehalts an konjugierten Östrogenen bezogen auf die Trockensubstanz einhalten.

Es wurde nun ein Verfahren gefunden, mit welchem auf überraschend einfache Weise ein an phenolischen Harninhaltsstoffen abgereichertes, weitgehend Kresol-und HPMF-freies Gemisch konjugierter equiner Östrogene aus PMU gewonnenen werden kann, welches gleichzeitig auch an nicht-konjugierten lipophilen Verbindungen, insbe- sondere an nicht-konjugierten Flavonoid-, Isoflavonoid-und Norisoprenoid-Derivaten weitgehend abgereichert ist, auch wenn der PMU wechselnde und gegebenenfalls erhöhte Mengen an nicht-konjugierten lipophilen Verbindungen aufweist.

Das erfindungsgemäße Verfahren basiert in wesentlichen Schritten auf dem in der WO 98/08526 beschriebenen Verfahren, welches zur Gewinnung eines an phenol- scheri Harninhaltsstoffen abgereicherten natürlichen Gemisches konjugierter Östroge- ne aus dem PMU dient. Weiterhin basiert das erfindungsgemäße Verfahren auf dem in der internationalen Patentanmeldung WO 03/048183 beschriebene n VerFa hren, mit dem auch bei Verwendung von gealterte PMU, der gegebenenfalls erhöhte Anteile an freien Östrogenen enthält, ein natürliches Gemisch konjugierter Östrogene gewon- nen werden kann, welches die geforderten pharmazeutischen Spezifikationen erfüllt.

Demgemäß betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung eines natürlichen Gemisches konjugierter Östrogene aus dem Harn trächtiger Stuten, bei dem man a) eine Harnflüssigkeit, welche gegebenenfalls eine von Schleim-und Feststoffen befreite Harnflüssigkeit, ein eingeengtes Konzentrat dieser Harnflüssigkeit oder ein durch Membranfiltration dieser Harnflüssigkeit erhaltenes eingeengtes Harnre-

tentat darstellt, mit einer zur Adsorption des in der Harnflüssigkeit enthaltenen Gemi- sches konjugierter Östrogene ausreichenden Menge eines polymeren Adsorberharzes kontaktiert, und ein mit dem Gemisch konjugierter Östrogene beladenes polymeres Adsorberharz von der übrigen Harnflüssigkeit abtrennt, und b) das mit dem Gemisch konjugierter Östrogene beladene polymere Ad- sorberharz mit einem auf einen pH-Wert von mindestens 12,0, insbesondere 12,5 bis 14, 0, eingestellten Waschwasser wäscht, und c) gegebenenfalls eine Zwischenwäsche durchführt, bei der das mit dem Gemisch konjugierter Östrogene beladene polymere Adsorberharz mit Wasser gewa- schen wird, und d) das gewaschene Adsorberharz mit einer zur Desorption des daran ad- sorbierten Gemisches konjugierter Östrogene ausreichenden Menge einer Elutions- flüssigkeit kontaktiert, und e) ein das natürliche Gemisch konjugierter Östrogene enthaltende Eluat von dem Adsorberharz abtrennt und gegebenenfalls einengt, wobei sich das erfindungsgemäße Verfahren gegenüber den Verfahren des Standes der Technik dadurch auszeichnet, dass das gewonnene natürliche Gemisch konjugierter equiner Östrogene abge- reichert ist an phenolischen Harninhaltsstoffen und an nicht-konjugierten lipophilen Verbindungen aus der Gruppe umfassend nicht-konjugierte Flavonoide, nicht- konjugierte Isoflavonoide, nicht-konjugierte Norisoprenoide, nicht-konjugierte Steroide, insbesondere Androstan-und Pregnan-Steroide, und an vergleichbaren nicht- konjugierten Verbindungen, und dass man als Elutionsflüssigkeit im Verfahrensschritt (d) ein Ein-oder Zweipha- sen-Gemisch, enthaltend (i) Wasser, welches gegebenenfalls auf einen pH-Wert im alkalischen Bereich eingestellt ist, und

(ii) wenigstens ein für die Elution von nicht-konjugierten lipophilen Verbindun- gen aus oben angegebener Gruppe geeignetes, mit Wasser nicht oder kaum mischba- res organisches Lösungsmittel, und gegebenenfalls (iii) wenigstens ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel ausge- wählt aus der Gruppe bestehend aus mit Wasser mischbaren Ethern, niederen Alkano- len und niederen aliphatischen Ketonen, sowie Mischungen der vorgenannten Lö- sungsmittel, verwendet, und dass man, falls das im Verfahrensschritt e) erhaltene, gegebenenfalls eingeengte Eluat ein Zweiphasengemisch darstellt, die wässrige Phase des erhaltenen, aus zwei Phasen bestehenden Eluats abtrennt, und eine, das natürliche Gemisch konjugierter Östrogene enthaltende wässrige Phase gewinnt und diese gegebenenfalls einengt.

Die Chargenvorbereitung, die an sich bekannten Verfahrensschritte a), b), d) und e) sowie die Verwendung des im Verfahrensschritt e) erhaltenen Eluats, das ein Ge- misch natürlicher konjugierter Östrogene enthält, sind generell bereits in der internatio- nalen Patentanmeldung WO 98/08526 als Verfahrensschritte a), b) und c) beschrieben und dem Fachmann somit aus dieser publizierten Patentanmeldung geläufig. Der an sich bekannte Verfahrensschritt c) der vorliegenden Erfindung ist generell in der inter- nationalen Patentanmeldung WO 03/048183 als"Zwischenwäsche"beschrieben und dem Fachmann somit aus dieser publizierten Patentanmeldung geläufig. Der Inhalt dieser WO 98/08526 sowie WO 03/048183 wird zum Zwecke der Offenbarung auch zum Gegenstand der vorliegenden Anmeldung gemacht. Weitere Einzelheiten zur allgemeinen Verfahrensweise und einsetzbaren Materialien sind im Beispielteil der vorliegenden Anmeldung zusammengefasst.

Beispielsweise können gemäß WO 98/08526 semipolare, insbesondere nichtio- nische semipolare Adsorberharze eingesetzt werden. Darüber hinaus ist es gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung überraschenderweise auch möglich andere Adsorberharze zusammen mit dem erfindungsgemäßen Verfahren einzusetzen, ohne dass die Produktqualität bzw. die einzuhaltende pharmazeutische Spezifikation beein- trächtigt wird. So sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung polymere Adsorberharze für den Einsatz als Adsorbens für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet. Die im

Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendbaren polymeren Adsorberharze werden im Beispielteil der Beschreibung noch näher erläutert.

Erfindungsgemäß wird mit dem vorliegenden Verfahren ein natürliches Gemisch konjugierter equiner Östrogene gewonnen, welches sowohl an phenolischen Harnin- haltsstoffen wie Kresole und HPMF als auch an nicht-konjugierten lipophilen Verbin- dungen aus der Gruppe umfassend nicht-konjugierte Flavonoide, nicht-konjugierte Isoflavonoide, nicht-konjugierte Norisoprenoide, nicht-konjugierte Steroide, insbeson- dere Androstan-und Pregnan-Steroide, und an vergleichbaren nicht-konjugierten Verbindungen, abgereichert ist.

Nach Durchführung der an sich bekannten Verfahrensschritte (a) bis (c) wird hierzu im Verfahrensschritt (d) das gewaschene, mit dem Gemisch konjugierter Östro- gene beladene Adsorberharz mit einer zur Elution des Gemisches der konjugierten Östrogene ausreichenden Menge einer Elutionsflüssigkeit behandelt. Erfindungsge- mäß wird hierzu als Elutionsflüssigkeit im Verfahrensschritt (d) ein Ein-oder Zweipha- sen-Gemisch verwendet, welches (i) Wasser, welches gegebenenfalls auf einen pH-Wert im alkalischen Bereich eingestellt ist, und (ii) wenigstens ein für die Elution von nicht-konjugierten lipophilen Verbindun- gen aus der Gruppe umfassend nicht-konjugierte Flavonoide, nicht-konjugierte Isofla- vonoide, nicht-konjugierte Norisoprenoide, nicht-konjugierte Steroide, insbesondere Androstan-und Pregnan-Steroide, und vergleichbare nicht-konjugierten Verbindungen, geeignetes, mit Wasser nicht oder kaum mischbares organisches Lösungsmittel, und gegebenenfalls (iii) wenigstens-ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel ausge- wählt aus der Gruppe bestehend aus mit Wasser mischbaren Ethern, niederen Alkano- len und niederen aliphatischen Ketonen, sowie Mischungen der vorgenannten Lö- sungsmittel, enthält.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird als Eluti- onsflüssigkeit im Verfahrensschritt (d) ein Ein-oder Zweiphasen-Gemisch verwendet, welches

(i) Wasser, welches gegebenenfalls auf einen pH-Wert im alkalischen Bereich eingestellt ist, und (ii) wenigstens ein für die Elution von nicht-konjugierten lipophilen Verbindun- gen aus der Gruppe umfassend nicht-konjugierte Flavonoide, nicht-konjugierte Isofla- vonoide, nicht-konjugierte Norisoprenoide, nicht-konjugierte Steroide, insbesondere Androstan-und Pregnan-Steroide, und vergleichbare nicht-konjugierten Verbindungen, geeignetes, mit Wasser nicht oder kaum mischbares organisches Lösungsmittel, und (iii) wenigstens ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel ausge- wählt aus der Gruppe bestehend aus mit Wasser mischbaren Ethern, niederen Alkano- [en und niederen aliphatischen Ketonen, sowie Mischungen der vorgenannten Lö- sungsmittel, enthält.

Das als Elutionsflüssigkeit im Verfahrensschritt (d) Verwendung findende Ein- oder Zweiphasen-Gemisch enthält Wasser (i), welches gegebenenfalls auf einen pH- Wert im alkalischen Bereich eingestellt ist.

Handelt es sich bei der im Verfahrensschritt (d) Verwendung findenden Elutions- flüssigkeit um ein Einphasen-Gemisch, liegt der pH-Wert derartiger wasserhaltiger Elutionsflüssigkeiten im neutralen bis alkalischen Bereich bis zu pH 13 und kann vor- teilhaft im Bereich zwischen pH 7 und 10 liegen. Als Lösungsmittelkomponenten in der wasserhaltigen Elutionsflüssigkeit werden in dem eingesetzten pH-Bereich stabile organische Lösungsmittel ausgewählt. Der gewünschte pH-Wert der wasserhaltigen, einphasigen Elutionsflüssigkeit wird durch Zugabe einer entsprechenden Menge einer wasserlöslichen inerten basischen Substanz, vorzugsweise einer anorganischen Base, beispielsweise eines Alkalimetall-oder Erdalkalimetallhydroxides, insbesondere Natri- umhydroxid, eingestellt.

Handelt es sich bei der im Verfahrensschritt (d) Verwendung findenden Elutions- flüssigkeit um ein Zweiphasen-Gemisch, liegt der pH-Wert der wässrigen Phase derar- tiger Elutionsflüssigkeiten nach gründlicher Mischung beider Phasen im neutralen bis alkalischen Bereich bis zu pH 13 und kann vorteilhaft im Bereich zwischen pH 7 und 10 liegen. Sofern die wässrige Phase derartiger zweiphasiger Elutionsflüssigkeiten eine

organische Lösungsmittelkomponente enthält, werden als Lösungsmittelkomponente in dem eingesetzten pH-Bereich stabile organische Lösungsmittel ausgewählt. Der ge- wünschte pH-Wert der wässrigen Phase von zweiphasigen Elutionsflüssigkeiten wird durch Zugabe einer entsprechenden Menge einer wasserlöslichen inerten basischen Substanz, vorzugsweise einer anorganischen Base, beispielsweise eines Alkalimetall- oder Erdalkalimetallhydroxides, insbesondere Natriumhydroxid, eingestellt.

Neben gegebenenfalls alkalisch eingestelltem Wasser (i) enthält das als Elutions- flüssigkeit im Verfahrensschritt (d) Verwendung findende Ein-oder Zweiphasen- Gemisch wenigstens ein, für die Elution von nicht-konjugierten lipophilen Verbindungen aus der Gruppe umfassend nicht-konjugierte Flavonoide, nicht-konjugierte Isoflavonoi- de, nicht-konjugierte Norisoprenoide, nicht-konjugierte Steroide, insbesondere Andro- stan-und Pregnan-Steroide, und vergleichbaren nicht-konjugierten Verbindungen geeignetes, organisches Lösungsmittel (ii). Weiterhin soll das derart geeignete organi- sche Lösungsmittel (ii) mit Wasser nicht oder nur kaum mischbar sein, wobei kaum mischbar bedeutet, dass in der wässrigen Phase maximal 6 Vol.-% gelöstes organi- sches Lösungsmittels vorliegen. Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens stellen für die Elution von nicht-konjugierten lipophilen Verbindungen geeignete, orga- nische Lösungsmittel (ii) beispielsweise folgende organische Lösungsmittel mit 1 bis zu 10 C-Atomen dar, welche geradkettig, verzweigt oder zyklisch angeordnet sein können : C4-C10 Alkohole (wie beispielsweise Butanol, Hexanol, Cyclohexanoi und Pentanol), Ci-Cio veresterte Säuren (wie beispielsweise Ethylacetat (= Essigsäureethylester), Methylacetat, Propylacetat, Isopropylacetat (= Essigsäure-Isopropyl-Ester), Butylace- tat, Amylacetat, Ethylmethylmalonat, Dimethylphosphonat), C3-C10 Aldehyde und C4- C10 Ketone (wie beispielsweise Butanon, Pentanon, Hexan-2,4-dion, Hexandial, Cyclo- hexancarbaldehyd, Butan-1,2, 4-tricarbaldehyd, Methylphenylketon und ähnliche) bzw. generell C3-Clo Alkoxy-Verbindungen, C3-C10 Ether (Diethylether, Methyl-tertiär- butylether), C3-C6 Nitrilen, und CI-C3 Halogenalkanen (Methylenchlorid), sowie Mi- schungen der vorgenannten Lösungsmittel. Insbesondere können Essigsäure-Cl-C4- alkylester, Butanol, Cyclohexanol, Hexanol, Diethylether, Methylenchlorid, Methyl- tertiär-butylether und Mischungen der vorgenannten Lösungsmittel als für die Elution von nicht-konjugierten lipophilen Verbindungen geeignete, mit Wasser nicht oder nur kaum mischbare organische Lösungsmittel (ii) im Rahmen der vorliegenden Erfindung genutzt werden. Aus dieser Auswahl stellen Essigsäure-Ci-C4-alkylester, und insbe- sondere Essigsäureethylester (= Ethylacotat) undlo der Essigsäure-isopropyl-Ester (=

Isopropylacetat), die bevorzugt zu verwendenden, für die Elution von nicht-konjugierten lipophilen Verbindungen geeigneten, mit Wasser nicht oder nur kaum mischbaren organischen Lösungsmittel (ii) der vorliegenden Erfindung dar.

Weiterhin enthält das erfindungsgemäß als Elutionsflüssigkeit im VerFahrens- schritt (d) Verwendung findende Ein-oder Zweiphasen-Gemisch gegebenenfalls wenigstens ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel (iii) ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus mit Wasser mischbaren Ethern, niederen Alkanolen und niederen aliphatischen Ketonen, sowie Mischungen der vorgenannten Lösungsmittel.

Als Etherbestandteile der Elutonsflüssigkeit eignen sich mit Wasser mischbare zykli- sche Ether wie Tetrahydrofuran oder Dioxan, aber auch mit Wasser mischbare offen- kettige Ether wie beispielsweise Ethylenglycoldimethylether (= Monoglyme), Diethylen- glycoldimethylether (= Diglyme) oder Ethyloxyethyloxyethanol (= Carbitol). Als niedere Alkanole eignen sich mit Wasser mischbare Alkylalkohole mit 1-4, vorzugsweise 1-3, Kohlenstoffatomen, insbesondere Ethanol oder Isopropanol. Als niedere aliphatische Ketone eignen sich mit Wasser mischbare Ketone mit 3-5 Kohlenstoffatomen, insbe- sondere Aceton. Als besonders günstig erweisen sich weiterhin Elutionsflüssigkeiten, in denen das mit Wasser mischbare organische Lösemittel (iii) Aceton, Ethanol oder eine Mischung aus Aceton und Ethanol ist.

In einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung enthält das als Elutionsflüssig- keit im Verfahrensschritt (d) Verwendung findende Ein-oder Zweiphasen-Gemisch neben gegebenenfalls alkalisch eingestelltem Wasser (i) als für die Elution von nicht- konjugierten lipophilen Verbindungen geeignetes, mit Wasser nicht oder kaum misch- bares organisches Lösungsmittel (ii) Essigsäure-C1-C4-alkylester, wrzugsweise Essig- säureethylester und/oder Essigsäure-Isopropyl-Ester, und als mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel (iii) Aceton und/oder Ethanol.

In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung enthält das als Eluti- onsflüssigkeit im Verfahrensschritt (d) Verwendung findende Ein-oder Zweiphasen- Gemisch neben gegebenenfalls alkalisch eingestelltem Wasser (i) als für die Elution von nicht-konjugierten lipophilen Verbindungen geeignetes, mit Wasser nicht oder kaum mischbares organisches Lösungsmittel (ii) Essigsäureethylester und als mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel (iii) Aceton.

Das als Elutionsflüssigkeit im Verfahrensschritt (d) erfindungsgemäß Verwen- dung findende Ein-oder Zweiphasen-Gemisch kann ein Volumenverhältnis von Was- ser (i) zu dem mit Wasser nicht oder kaum mischbaren organischen Lösungsmittel (ii) im Bereich von 5 : 1 bis 1 : 5 aufweisen, insbesondere wird ein Volumenverhältnis im Bereich von 2 : 1 bis 1 : 2 als zweckmäßig angesehen.

Weiterhin kann das im Verfahrensschritt (d) als Elutionsflüssigkeit Verwendung findende Ein-oder Zweiphasen-Gemisch ein Volumenverhältnis von Wasser (i) zu dem mit Wasser mischbaren organischem Lösungsmittel (iii) im Bereich von 4 : 1 bis 1 : 5 aufweisen ; vorzugsweise wird ein Volumenverhältnis im Bereich von 2 : 1 bis 1 : 3 als zweckmäßig angesehen.

Insbesondere kann das im Verfahrensschritt (d) als Elutionsflüssigkeit Verwen- dung findende Ein-oder Zweiphasen-Gemisch ein Volumenverhältnis von dem Ge- samtvolumen an Wasser (i) zusammen mit dem mit Wasser nicht oder kaum mischba- ren organischen Lösungsmittel (ii) im Verhältnis zu dem mit Wasser mischbaren orga- nischem Lösungsmittel (iii) im Bereich von 5 : 1 bis 1 : 5, vorzugsweise im Bereich von 2 : 1 bis 1 : 2, aufweisen.

In einer besonders bevorzugten Ausgestaltungsform der vorliegenden Erfindung setzt sich das im Verfahrensschritt (d) als Elutionsflüssigkeit Verwendung findende Ein- oder Zweiphasen-Gemisch aus (i) Wasser, aus (ii) Essigsäure-C1-C4-alkylester, vor- zugsweise Essigsäureethylester und/oder Essigsäure-Isopropyl-Ester, als mit Wasser nicht oder kaum mischbares organisches Lösungsmittel, und aus (iii) Aceton und/oder Ethanol als mit Wasser mischbaren organischem Lösungsmittel in einem Volumenver- hältnis im Bereich von 1 : 1 : 1 bis 1 : 1 : 2 zusammen. Insbesondere findet im Verfahrens- schritt (d) als Elutionsflüssigkeit ein Einphasen-Gemisch Verwendung, welches sich aus (i) Wasser, aus (ii) Essigsäureethylester als mit Wasser nicht oder kaum mischba- res organisches Lösungsmittel, und aus (iii) Aceton als mit Wasser mischbaren organi- schem Lösungsmittel in einem Volumenverhältnis von 1 : 1 : 1,4 zusammensetzt.

Findet im Verfahrensschritt (d) als Elutionsflüssigkeit ein Zweiphasen-Gemisch Verwendung, empfiehlt es sich die zwei Phasen unmittelbar vor Aufgabe auf die Säule gut zu durchmischen.

Das eingesetzte Volumen an Elutionsflüssigkeit kann ca. 3 bis 10, insbesondere ca. 4 bis 6 Bettvolumen pro Bettvolumen polymeres Adsorberharz betragen. Zweck- mäßigerweise wird die Elutionsflüssigkeit durch einen das mit dem Ostrogengemisch beladene Adsorberharz enthaltenden Reaktor mit einer solchen Durchlaufgeschwindig- keit geleitet, dass die Kontaktzeit zur vollständigen Elution des Gemisches konjugierter Östrogene ausreicht. Bei Verwendung eines Einphasengemisches von Wasser, Essig- säureethylester und Aceton im Vol.-Verhältnis 10 : 10 : 14 eignen sich beispielsweise Durchlaufgeschwindigkeiten von 3 bis 10, vorzugsweise 5 bis 7, Vol.-Teilen Elutions- flüssigkeit pro 1 Vol.-Teil Adsorberharz pro Stunde. Zweckmäßig wird die Elution in einem Temperaturbereich von ca. 20°C bis ca. 80 °C, vorzugsweise bei Temperaturen zwischen ca. 30°C und 50°C, durchgeführt. Gewünschtenfalls wird die Durchlaufge- schwindigkeit durch Arbeiten bei leicht erhöhtem Druck, z. B. bei einem Überdruck von bis zu 0,2 bar, reguliert und das Eluat in mehreren Fraktionen aufgefangen.

Die Gehalte der einzelnen Eiuatfraktionen an konjugierten Östrogenen, an phe- nolischen Harninhaltsstoffen wie Kresole und HPMF und an nicht-konjugierten lipophi- ten Verbindungen können auf an sich bekannte Weise durch Hochleistungsflüssigkeits- Chromatographie (= high performance liquid chromatography, abgekürzt als"HPLC") oder auch Gaschromatographisch (abgekürzt als GC") bestimmt werden.

Bei der Elution wird im Verfahrensschritt e) zunächst eine schwach gefärbte bis farblose, praktisch östrogenfreie Vorlauffraktion erhalten, deren Menge im Allgemeinen ca. einem Bettvolumen entspricht. Die Hauptmenge der konjugierten Östrogene, bei- spielsweise zwischen 80 und 99 % der in dem Ausgangs-PMU vorliegenden konjugier- ten Östrogene, befindet sich in den nachfolgenden dunkelgelb-braun gefärbten Haup- teluatfraktionen, deren Menge im allgemeinen 2 bis 4 Bettvolumen umfasst. In den nachfolgenden Nachlauffraktionen sind im Allgemeinen nur noch Spuren an konjugier- ten Östrogenen enthalten. Sofern Nachfolgefraktionen erhalten werden, welche noch einen Gehalt an konjugierten Östrogenen von über 10 Gew. -% bezogen auf Trocken- substanz und weniger als 0,6 Gew.-% bezogen auf Trockensubstanz an Kresole und HPMF enthalten, können diese mit dem östrogenreichen Haupteluat zur Weiterverar- beitung vereinigt werden.

Bei dem im Verfahrensschritt (e) erhaltenen Eluat kann es sich um ein Ein-oder Zweiphasengemisch handeln. Auch bei Verwendung eines Einphasengemisches als

Elutionsflüssigkeit kann durch die Verdrängung des vor der Elution auf der Adsor- berharzsäule vorhandenen Wassers von der Säule und der damit erhaltenen Verschie- bung der Volumenverhältnisse von wässriger und organischer Phase das Eluat aus zwei Phasen bestehen. Gewünschtenfalls kann das im Verfahrensschritt (e) erhaltene ein-oder zweiphasige Eluat auf an sich bekannte Weise weiter eingeengt werden.

Insbesondere wird, falls das im Verfahrensschritt (e) erhaltene Eluat einphasig ist, das Eluat eingeengt, so dass vorzugsweise das mit Wasser mischbare organische Lö- sungsmittel (iii) abgetrennt wird, bis das eingeengte Eluat ein Zweiphasen-Gemisch darstellt.

Erfindungsgemäß wird, falls das im Verfahrensschritt (e) erhaltene, gegebenen- falls eingeengte Eluat ein Zweiphasengemisch darstellt, in einem Verfahrensschritt (f) die wässrige Phase des erhaltenen, aus zwei Phasen bestehenden Eluats abgetrennt, und eine, das natürliche Gemisch konjugierter Östrogene enthaltende wässrige Phase gewonnen. Hierzu lässt man das erhaltene, zweiphasige Eluat stehen, um eine Tren- nung der Phasen zu erreichen. Die Phasentrennung kann je nach den erhaltenen Volumina einen Zeitraum von 10 min bis zu 24 Stunde n einnehmen, vorzugsweise lässt man die Phasen 5 bis 10 h stehen. Wenn sich die wässrige Phase und die orga- nische Phase voneinander separiert haben, wird die wässrige Phase abgetrennt und zur Weiterverwendung aufgehoben, während die organische Phase verworfen wird.

Nach der Trennung der organischen Phase von der wässrigen Phase wird im Verfahrensschritt (f) eine, das natürliche Gemisch konjugierter Östrogene enthaltende wässrige Phase gewonnen. Diese wässrige Phase enthält das im PMU auftretende natürlich Gemisch konjugierter Östrogene neben nur einem geringen Anteil des ur- sprünglich in dem PMU vorhandenen Gehaltes an phenolischen Harninhaltsstoffen, wie Kresole und HPMF, sowie neben nur einem äußerst geringen Anteil des, ursprüng- lich im PMU vorhandenen Gehaltes an nicht-konjugierten lipophilen Bestandteilen.

Gewünschtenfalls kann diese wässrige Phase auf an sich bekannte Weise weiter eingeengt werden, um ein weitgehend von organischem Lösungsmittel befreites, zur Weiterverarbeitung geeignetes Konzentrat zu erhalten. So können beispielsweise aus der erhaltenen wässrigen Phase die noch vorhandenen Reste an organischem Lö- sungsmittel abdestilliert werden. Durch die Destillation kann auch der Trockensub- stanzgehalt der wässrigen Extraktphase auf einen konkreten Wert, vorzugsweise auf einen Trockensubstanzgehalt im Bereich zwischen 5 und 15%, insbesondere auf einen

Trockensubstanzgehalt von 9%, eingestellt werden. Im Anschluss kann zur Stabilisie- rung des gewonnenen natürlichen Gemisches konjugierter equiner Östrogene noch der pH-Wert der wässrigen Extraktiösung auf einen Wert im alkalischen Bereich, vorzugs- weise im Bereich zwischen 8 und 13, vorzugsweise auf einen Wert zwischen 9 und 12, eingestellt werden. Zur Einstellung des pH-Wertes eignen sich üblicherweise für die pH-Wert Einstellung Verwendung findende Basen, beispielsweise 1 N NaOH oder NasCOs.

Die erfindungsgemäß im Verfahrensschritt (f) gewonnene und gegebenenfalls noch weiter aufgearbeitete oder konzentrierte wässrige Phase kann als Ausgangsma- terial für die Herstellung von, das natürliche Gemisch konjugierter equiner Östrogene enthaltenden Arzneimitteln dienen. Gewünschtenfalls kann durch einen geeigneten Trocknungsprozess, wie beispielsweise Sprühtrocknung oder Wirbelschichttrocknung, ein elutionsmittelfreies Feststoffgemisch hergestellt werden. Sofern das natürliche Gemisch konjugierter Östrogene für die Herstellung fester Arzneimittel verwendet werden soll, kann es zweckmäßig sein, der die konjugierten Östrogene enthaltenden wässrigen Phase einen festen Trägerstoff bereits vor einer Konzentrierung oder Trock- nung zuzumischen, um auf diese Weise ein die konjugierten Östrogene und Träger- stoffe enthaltendes Feststoffgemisch zu erhalten. Beispielsweise kann die, die konju- gierten Östrogene enthaltende wässrige Phase in der Wirbelschicht auf einen festen Trägerstoff wie z. B. Cellulose aufgesprüht werden. Sowohl die das Östrogengemisch enthaltende wässrige Phase als auch ein daraus hergestelltes Konzentrat oder ge- trocknetes Feststoffprodukt können in an sich bekannter Weise in feste oder flüssige galenische Zubereitungen wie beispielsweise Tabletten, Dragees, Kapseln oder Emul- sionen eingearbeitet werden. Diese galenischen Zubereitungen können nach an sich bekannten Methoden hergestellt werden unter Verwendung üblicher fester oder flüssi- ger Trägerstoffe wie z. B. Stärke, Cellulose, Milchzucker oder Talkum oder flüssigen Paraffinen und/oder unter Verwendung von üblichen pharmazeutischen Hilfsstoffen, beispielsweise Tablettensprengmitteln, Lösungsvermittlern oder Konservierungsmitteln.

So kann das die konjugierten Östrogene enthaltende Produkt mit den pharmazeuti- schen Träger-und Hilfsstoffen auf an sich bekannte Weise vermischt werden und das Gemisch in eine geeignete Dosierungsform überführt werden.

Bei dem erfindungsgemäß beschriebenen Festphasen-Extraktionsverfahren wird aus einer Harnflüssigkeit, welche gegebenenfalls eine von Schleim-und Feststoffen

befreite Harnflüssigkeit, ein eingeengtes Konzentrat dieser Harnflüssigkeit oder ein durch Membranfiltration dieser Harnflüssigkeit erhaltenes eingeengtes Harnretentat darstellt, ein natürliches Gemisch konjugierter equiner Östrogene gewonnen, wobei das Gemisch in einem einfachen Verfahren sowohl an phenolischen Harninhaltstoffen wie insbesondere Kresole und HPMF als auch an einer Vielzahl nicht-konjugierter lipophiler Verbindungen weitgehend abgereichert wird. Bei den abgetrennten nicht- konjugierten lipophilen Verbindungen handelt es sich insbesondere um nicht- konjugierte Flavonoide, nicht-konjugierte Isoflavonoide, nicht-konjugierte Norisoprenoi- de und nicht-konjugierte Steroide, hierbei insbesondere um nicht-konjugierte Andro- stan-und nicht-konjugierte Pregnan-Derivate.

Im Vergleich zu den bekannten Festphasen-Extraktionsverfahren liefert das er- findungsgemäße Festphasen-Extraktionsverfahren ein natürliches Gemisch konjugier- ter equiner Östrogene, welches sowohl an phenolischen Harninhaltstoffe als auch an nicht-konjugierten lipophilen Verbindungen weitestgehend abgereichert ist, wobei das erfindungsgemäße Verfahren ohne zusätzliche Arbeitsschritte auskommt, da auch die Abreicherung an nicht-konjugierten lipophilen Verbindungen bereits bei der Festpha- senextraktion erfolgt.

Bei dem aus der WO 98/08526 bekannten Verfahren wird ein Teil der nicht- konjugierten lipophilen Verbindungen, beispielsweise das Isoflavon Equol, im Verfah- rensschritt b) ausgewaschen, während andere nicht-konjugierte lipophile Verbindun- gen, beispielsweise Formononetin, mit in das Eluat gelangen und ggf. durch eine nach- folgende Flüssig-Flüssig-Extraktion abgetrennt werden müssen. Ähnliches gilt auch für die nicht-konjugierten, d. h. freien Steroidhormone, die sich ebenfalls zu gewissen Anteilen im Eluat nachweisen lassen. Es ist daher als ausgesprochen überraschend anzusehen, dass für die quantitative Elution der an ein polymeres Adsorberharz adsor- bierten konjugierten Östrogene eine ein-oder sogar zweiphasige Mischung aus Was- ser, einem mit Wasser nicht oder kaum mischbaren organischen Lösungsmittel, sowie ggf. einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel wie niedere Ether, Alkanole oder Ketone, verwendet werden kann, und sich das erhaltene, ggf. eingeeng- te Eluat in zwei Phasen separieren lässt, wobei sich die-quantitativ eluierten-konju- gierten Östrogene fast ausschließlich in der wässrigen Phase wieder finden, während sich die unerwünschten, nicht-konjugierten lipophilen Verbindungen in der organischen Phase befinden und somit leicht abgetrennt werden können.

Weiterhin liefert das erfindungsgemäße Verfahren einen Extrakt konjugierter equiner Östrogene, welcher einen vergleichsweise hohen Gehalt an konjugierten Ös- trogenen bezogen auf die Trockensubstanz aufweist. So ist es mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung auf einfache Weise möglich, auch dann ein natürliches Ge- misch konjugierter Östrogene aus dem Harn trächtiger Stuten zu gewinnen, wenn der Harn wechselnde und gegebenenfalls erhöhte Mengen an nicht-konjugierten lipophilen Verbindungen enthält, ohne an die Festphasenextraktion weitergehende Aufreini- gungsschritte anzuschließen.

Das durch das erfindungsgemäße Verfahren als Wirkstoff-Extrakt gewonnene, an nicht-konjugierten lipophilen Bestandteilen und an phenolischen Harninhaltstoffen abgereicherte natürliche Gemisch konjugierter equiner Östrogene zeichnet sich ge- genüber den durch die bekannten Festphasen-Extraktionsverfahren gewonnenen Wirkstoff-Extrakte durch einen deutliche Optimierung der pharmazeutischen Spezifika- tion aus, wie erfindungsgemäß festgestellt wurde.

Es muss als ausgesprochen überraschend bezeichnet werden, dass durch die erfindungsgemäße Veränderung der bereits bekannten Festphasen- Extraktionsverfahren eine derartige Qualitätsverbesserung des gewonnenen Wirk- stoffextraktes herbeigeführt werden kann, auch wenn der, das natürlichen Gemisches konjugierter Östrogene liefernde Harn trächtiger Stuten unterschiedliche und wech- selnde Mengen nicht-konjugierte lipophiler Bestandteile enthält. Insbesondere ist es sehr überraschend, dass der Anteil an nicht-konjugierten lipophilen Verbindungen, der in Abhängigkeit vom verwendeten PMU sowohl mengenmäßig als auch in der Zusam- mensetzung stark schwanken kann, durch das erfindungsgemäße Verfahren derart sicher verringert werden kann, dass im Verfahrensschritt f) als wässrige Phase ein Gemisch natürlicher konjugierter equiner Östrogene erhalten werden kann, welches die hohen Anforderungen an die pharmazeutische Spezifikation, beispielsweise die gemäß der USP oder der Europäischen Pharmacopeia aufgestellten Anforderungen, erfüllt.

Das erfindungsgemäße Verfahren bietet, wie vorstehend bereits im Detail beschrieben, eine Reihe von Vorteilen und Verbesserungen gegenüber dem Stand der Technik. So ermöglicht die Erfindung die Verwendung auch von wechselnde Mengen nicht-konjugierter lipophiler Bestandteile enthaltendem PMU, der beispielsweise einen erhöhten Anteil an freien Flavonoiden, freien Isoflavonoiden, freien Norisoprenoiden

oder freien Steroid-Derivaten, hier insbesondere an freien Androstan-oder Pregnan- Steroide, aufweisen darf, ohne dass einzuhaltende pharmazeutische Spezifikationen gefährdet werden. Dabei baut das erfindungsgemäße Verfahren auf den bekannten Festphasenextraktionsverfahren auf, kommt aber überraschenderweise ohne weitere Extraktionsschritte aus. So kann mit dem erfindungsgemäßen Verfahren eine gleich- mäßige Zusammensetzung einzelner Extraktchargen gewährleistet werden, da die nicht-konjugierten lipophilen Bestandteile, deren Gehalt und Zusammensetzung im PMU in Abhängigkeit von der Art der aufgenommenen Nahrung der trächtigen Stuten variieren kann, stets eliminiert werden und damit die erhaltenen Extrakte alle einen vergleichbaren Gehalt konjugierter equiner Östrogene bezogen auf die Trockensub- stanz aufweisen. Weiterhin wird durch die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erzielte Abtrennung nicht nur der phenolischen Harninhaltsstoffe, sondern insbesonde- re auch der nicht-konjugierten lipophilen Bestandteile in nur einem Arbeitsverfahren eine höhere Konzentration der Wirksubstanzen, d. h. der konjugierten equinen Östro- gene, im erhaltenen Extrakt erreicht. Das erfindungsgemäße Verfahren weist zusätz- lich auch wirtschaftliche Vorteile auf, da die Gefahr, wertvolle Wirkstoffe bei Nichtein- haltung der pharmazeutischen Spezifikation zu verlieren, beispielsweise bei nicht ausreichenden Gehalten konjugierter Östrogene bezogen auf die Trockensubstanz, deutlich vermindert ist. Weiterhin wird durch die Anwendung des erfindungsgemäß beschriebenen Verfahrens eine wesentlich genauere und reproduzierbarere Einstel- lung des Wirkstoffgehaltes des erhaltenen Extraktes ermöglicht. Diese Wirkstoffkom- ponente eignet sich hervorragend für die Herstellung von Pharmazeutika, die als Wirk- stoff ein Gemisch natürlicher konjugierter equiner Östrogene enthalten.

Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne jedoch ihren Umfang zu beschränken.

Beispiele In nachfolgenden Beispielen wird eine allgemeine Arbeitsvorschrift zur Gewin- nung von Wirkstoff-Extrakten aus PMU angegeben, die das natürliche Gemisch der im PMU enthaltenen konjugierten Östrogene enthalten, und sowohl an phenolischen HArninhaltsstoffen, wie beispielsweise Kresole oder HPMF, als auch nicht- konjugierten lipophilen Verbindungen, wie beispielsweise nicht-konjugierte Flavonoide, nicht-konjugierte Isoflavonoide, nicht-konjugierte Norisoprenoide, nicht-konjugierte

Steroide, insbesondere Androstan-und Pregnan-Steroide, und vergleichbare nicht- konjugierte Verbindungen, weitgehend abgereichert sind. Es wird gezeigt, wie sich erfindungsgemäß auch aus PMU, der wechselnde bzw. erhöhte Anteile an nicht- konjugierten lipophilen Verbindungen aufweisen kann, ein Qualitätsextrakt mit hohen Wirkstoffgehalten gewinnen lässt.

Harnflüssigkeit : Für das erfindungsgemäße Verfahren können als Harnflüssigkeit ebenso wie gemäß der WO 98/08526 der PMU als solcher, ein aus dem PMU durch Einengen gewonnenes Konzentrat oder ein aus dem PMU gewonnenes Konzentrat, welches durch Filtration oder vergleichbare Verfahren bereits vorgereinigt wurde, eingesetzt werden. Der gesammelte Harn (PMU) wird zunächst auf an sich bekannte Weise von Schleim-und Feststoffen befreit. Zweckmäßig lässt man Fest-und Schleimstoffe ab- setzen und trennt diese dann nach an sich bekannten Trennungsmethoden, beispiels- weise Dekantieren, Separieren und/oder Filtrieren ab. So kann der PMU beispielsweise über eine an sich bekannte Trenneinrichtung, z. B. einen Separator, eine Filtrationsan- lage oder einen Sedimentator geleitet werden. Als Trenneinrichtung kann z. B. ein Sandbett dienen, oder es können handelsübliche Separatoren, z. B. Düsen-oder Kammerseparatoren, eingesetzt werden. Gewünschtenfalls können auch eine Mikrofil- trationsanlage oder eine Ultrafiltrationsanlage eingesetzt werden, bei deren Verwen- dung gleichzeitig eine weitgehende Keim-und Virenfreiheit des filtrierten PMU erreicht werden kann.

Gegebenenfalls können dem Harn bzw. dem Harnkonzentrat Konservierungsmit- tel, Germizide, Bakterizide undloder Antihelmintika zugesetzt werden.

Als vorgereinigtes Harnkonzentrat kann auch ein aufkonzentriertes PMU Retentat eingesetzt werden, welches aus dem PMU durch eine an sich bekannte Membranfiltra- tion gewonnen werden kann. Der Feststoffgehalt des Retentates und dessen Zusam- mensetzung können je nach dem eingesetzten PMU und der zur Membranfiltration verwendeten Membran, beispielsweise deren Porenweite, sowie den Bedingungen der Filtration variieren. Beispielsweise kann bei Verwendung einer Nanofiltrationsmembran eine nahezu verlustfreie Konzentration des Östrogengehaltes in dem PMU Retentat bei gleichzeitiger Entfernung von bis zu 50 Gew.-% der niedermolekularen PMU Inhalts-

stoffe erreicht werden. Für das erfindungsgemäße Verfahren können PMU Retentate eingesetzt werden, welche bis zu einem Verhältnis von ca. 1 : 10, beispielsweise einem Verhältnis von ca. 1 : 7 aufkonzentriert wurden und deren Volumen somit bis auf ca.

1/10, beispielsweise ca. 1/7, des ursprünglichen PMU Volumens eingeengt sein kann.

Adsorberharze : Die in dem Verfahrensschritt a) einsetzbaren polymeren Adsorberharze sind ge- mäß WO 98/08526 semipolare, insbesondere nicht-ionische semipolare, polymere Adsorberharze. Die im erfindungsgemäßen Verfahren als Adsorbens einsetzbaren polymeren Adsorberharze sind vorzugsweise poröse organische nichtionische Polyme- re, welche im Gegensatz zu unpolaren hydrophoben polymeren Adsorberharzen eine intermediäre Polarität (= z. B. mit einem Dipolmoment der aktiven Oberfläche des Har- zes im Bereich von 1,0 bis 3,0, insbesondere 1,5 bis 2,0, Debye) und eine etwas hy- drophilere Struktur besitzen, beispielsweise Polycarbonsäureesterharze. Zweckmäßig werden makroporöse semipolare Harze mit vorzugsweise makroretikulärer Struktur und mit durchschnittlichen Porendurchmessern im Bereich von 50 bis 150, vorzugs- weise 70 bis 100, Angström und einer spezifischen Oberfläche im Bereich von 300 bis 900, vorzugsweise 400 bis 500, m2/g eingesetzt. Als besonders geeignet erweisen sich makroporöse quervernetzte aliphatische Polycarbonsäureesterharze, insbesondere quervernetzte Polyacrylesterharze wie z. B. Amberlite XAD-7 (Typ HP) der Fa. Rohm und Haas, die nicht-ionische semipolare Adsorberharze darstellen.

Neben den bevorzugt genannten Adsorbenzien können auch andere Adsor- berharze eingesetzt werden. Als Adsorberharze eignen sich dabei sowohl unpolare, semipolare und auch polare Adsorberharze. Die Menge des Harns, die über den Ad- sorber gepumpt werden kann, ist hierbei zuvor anhand der jeweiligen Adsorberkapazi- tät zu bestimmen. Beispiele für verwendbare Adsorberharze sind handelsübliche Ty- pen wie polymere Amberlite Adsorbenzien mit Styroldivinylbenzolgrundgerüsten (z. B.

Typen XAD-1180, XAD-2, XAD-16), mit Acrylestergrundgerüsten (z. B. XAD-7) oder solche mit hochpolaren Grundgerüsten enthaltend Stickstoff und Sauerstoff (z. B. XAD- 12). Andere Adsorberharze sind Dowex-Harze (Copolymere von Styrol und Divinylben- zol), wie z. B. Dowex 112, Dowex Optipore, Dowex Optipore V 493 ; Lewatite (vernetzte Polystyrole), z. B. Lewatit OC 1064, Lewatit OC 1066 oder Lewatit OC 1163, Polyami- nanionentauscherharze, z. B. Dowex-Harze. Vorteilhafte Adsorberharze sind insbeson-

dere XAD-7 (Typ HP), XAD-16 (Typ HP), XAD 118 und Dowex Optipore, bevorzugt als Dowex Optipore V 493, sowie Lewatite OC 1064, OC 1066 und OC 1163.

Verfahrensschritt a) : Die Adsorption der konjugierten Östrogene an das polymere Adsorberharz kann gemäß WO 98/08526 wie auch im vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahren durch Kontaktierung des ggf. aufbereiteten PMU oder dessen Retentats mit dem Adsor- berharz erfolgen, indem die Harnflüssigkeit in einen das Adsorberharz enthaltenden Reaktor eingeführt und darin für eine zur Adsorption des Östrogengehaltes ausrei- chende Zeit mit dem Adsorberharz in Kontakt gehalten wird. Nach erfolgter Adsorption der konjugierten Östrogene an das polymere Adsorberharz kann das mit dem Gemisch konjugierter Östrogene beladene Adsorberharz von der übrigen Harnflüssigkeit auf an sich bekannte Weise abgetrennt werden. Zweckmäßigerweise kann die Harnflüssigkeit durch eine das Adsorberharz enthaltende Säule mit solcher Durchlaufgeschwindigkeit geleitet werden, dass die Kontaktzeit zur Adsorption des Östrogengehaltes ausreicht.

Geeignet sind beispielsweise Durchlaufgeschwindigkeiten, welche einem Durchlauf von 3 bis 10, vorzugsweise 5 bis 7, Vol.-Teilen PMU/1 Vol.-Teil AdsorberharzlStunde entsprechen. Zweckmäßig kann die Durchlaufgeschwindigkeit der Harnflüssigkeit durch den Reaktor durch Arbeiten bei geringem Überdruck oder Unterdruck gesteuert werden. Die Menge an anzuwendendem polymeres Adsorberharz kann je nach Art des verwendeten Adsorberharzes und Menge des Feststoff-Gehaltes in der Harnflüssigkeit variieren. Bei Verwendung von PMU kann beispielsweise ein Volumenteil Adsor- berharz, z. B. quervernetztes aliphatisches Polycarbonsäureester-Adsorberharz, mit bis zu 80, vorzugsweise von 30 bis 50, Volumen-Teilen vorbehandeltem PMU beladen werden, ohne dass merkliche Mengen Östrogen in der abfließenden Harnflüssigkeit nachweisbar sind. Bei Verwendung eines PMU-Konzentrates oder PMU-Retentates reduziert sich die Beladungskapazität des Adsorberharzes natürlich in dem Maße, in dem diese aufkonzentriert sind. So kann beispielsweise 1 Volumenteil an quervernetz- tem aliphatischem Polycarbonsäureester-Adsorberharz mit einer 20 bis 80, vorzugs- weise 30 bis 50, Volumenteilen PMU entsprechenden Menge Harnflüssigkeit beladen werden.

Verfahrensschritt b) : Das mit dem Gemisch konjugierter Östrogene beladene polymere Adsorberharz wird in Verfahrensschritt b) mit einem auf einen pH-Bereich von mindestens 12,0, insbesondere von 12,5 bis 14, vorzugsweise ca. 12, 5 bis 13,5, eingestellten Wasch- wasser gewaschen. Als Waschwasser können wässrige Lösungen von in der Harnflüs- sigkeit löslichen inerten basischen Substanzen, welche stark genug sind, um einen pH- Wert von mindestens 12,5 zu erreichen, eingesetzt werden. Als gegenüber dem poly- meren Adsorberharz inerte, wasserlösliche basische Substanzen eignen sich vorzugs- weise wasserlösliche anorganische Basen wie Alkalimetall-oder Erdalkalimetallhydro- xide, insbesondere Natriumhydroxid. Zweckmäßig enthält das Waschwasser nur etwa diejenige Menge an basischen Substanzen, welche zum Erreichen des gewünschten pH-Wertes, vorzugsweise ca. pH 13, benötigt wird. Die Menge an Waschwasser wird so gewählt, dass sie ausreicht, um phenolische Harninhaltsstoffe weitgehend zu ent- fernen, ohne dass dabei nennenswerte Mengen konjugierter Östrogene mit ausgewa- schen werden. Als zweckmäßig erweist sich beispielsweise die Verwendung von 2 bis 10, insbesondere 4 bis 6, Bettvolumen Waschflüssigkeit pro Bettvolumen Adsor- berharz. Hierbei wird das Waschwasser zweckmäßigerweise durch einen das Adsor- berharz enthaltenden Reaktor mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 3 bis 10, vor- zugsweise 5 bis 7, Vol.-Teilen Waschwasser/1 Vol.-Teil Adsorberharz/Stunde geleitet.

Verfahrensschritt c) -Zwischenwäsche : Das im Verfahrensschnitt a) mit dem Gemisch konjugierter Östrogene beladene polymere Adsorberharz wird in einer sich an den Verfahrensschritt b) anschließenden Zwischenwäsche mit Wasser gewaschen. Die Menge an Waschwasser wird so ge- wählt, dass das im abschließenden Verfahrensschritt e) erhaltene Eluat ein Gemisch konjugierter Östrogene aufweist, das die Anforderungen an einen Höchstgehalt an freien Östrogenen erfüllt und damit als Wirkstoffkomponente für Pharmazeutika ver- wendet werden kann. Als zweckmäßig erweist sich beispielsweise die Verwendung von 1 bis 8, vorzugsweise 1 bis 4, Bettvolumen Waschwasser pro Bettvolumen Adsor- berharz. Hierbei wird das Waschwasser zweckmäßigerweise durch einen das Adsor- berharz enthaltenden Reaktor mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 3 bis 10, vor- zugsweise 5 bis 7, Vol.-Teilen Waschwasser pro 1 Vol.-Teil Adsorberharz pro Stunde geleitet.

In einer vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Zwischenwäsche bei Temperaturen unterhalb Raumtemperatur, insbesondere bei Temperaturen zwischen 0°C und 10°C, durchgeführt, da sich gezeigt hat, dass durch die zusätzliche Zwischenwäsche gegebenenfalls bedingte Hormon-bzw. Wirkstoffver- luste deutlich vermindert werden können. Als Raumtemperatur wird üblicherweise die Umgebungstemperatur angesehen, z. B. eine Temperatur bezeichnet, die zwischen 20° und 30°C liegt. Sehr zweckmäßig ist es, das Verfahren bei Temperaturen von tatsäch- lich 0°C bzw. annähernd 0°C auszuführen. In der Praxis empfiehlt es sich daher bei Temperaturen von nahe oberhalb 0°C zu arbeiten und durch entsprechende Maßnah- men für die Einhaltung der genannten Temperaturbereiche zu sorgen. Hierzu können an sich übliche Maßnahmen zur Absenkung der Temperatur getroffen werden, z. B. der Einsatz gekühlter Reaktoren, gekühlter Materialien und/oder gekühlter Ausgangsstoffe wie PMU. Als Temperaturen von 0°C bzw. von annähernd 0°C kann unter praktischen Gesichtspunkten ein Temperaturbereich von 0°C bis etwa 5°C, insbesondere von 0°C bis etwa 3°C, betrachtet werden.

Um mögliche Hormonverluste während der Zwischenwäsche so gering wie mög- lich zu halten, wird gemäß dieser Variante das in der Zwischenwäsche und/oder auch das im Verfahrensschritt b) verwendete alkalisch gestellte Waschwasser auf Tempera- turen unterhalb Raumtemperatur, insbesondere auf Temperaturen zwischen 0°C und 10°C, vorgekühlt sein. Weitere zweckmäßige bzw. bevorzugte Temperaturbereiche sind wie vorstehend angegeben Temperaturen von 0°C bis etwa 5°C, insbesondere von 0°C bis etwa 3°C. Bevorzugt wird bei Temperaturen von 0°C bzw. von annähernd 0°C gearbeitet, d. h. vorzugsweise ist das in der Zwischenwäsche und/oder auch das im Verfahrensschritt b) verwendete alkalisch gestellte Waschwasser auf Temperaturen nahe oberhalb 0°C vorgekühlt. Durch die Verwendung von gekühltem alkalisch gestell- tem Waschwasser im Verfahrensschritt b) wird eine Art Vorkühlung oder Aufrechterhal- tung der bereits erfolgten Kühlung des Adsorberharzes erreicht, z. B. um zu vermeiden, dass beim Einsatz von gekühlten Waschwasser für die Zwischenwäsche eine uner- wünschte Wiedererwärmung desselben stattfindet. Bevorzugt werden daher die Zwi- schenwäsche und der vorhergehende Verfahrensschritt b) beide im selben Tempera- turbereich durchgeführt, z. B. bei Temperaturen unterhalb Raumtemperatur, insbeson- dere bei Temperaturen zwischen 0 °C und 10 °C, oder vorzugsweise in den wie oben angegebenen Temperaturbereichen.

In der vorstehenden Variante der Erfindung, in der das Verfahren bei Temperatu- ren unterhalb Raumtemperatur ausgeführt wird, kann es wünschenswert sein, alle verwendeten Vorrichtungen wie Reaktoren zur Aufnahme des polymeren Adsorberhar- zes oder dieses bereits enthaltende Reaktoren und/oder den eingesetzten PMU ent- sprechend auf Temperaturen unterhalb Raumtemperatur, insbesondere auf Tempera- turen zwischen 0°C und 10°C, oder auf die oben angegebenen vorzugsweise einzuhal- tenden Temperaturbereiche vorgekühlt einzusetzen.

Verfahrensschritte d), e) und 1) der vorliegenden Erfindung : Anschließend wird gemäß der Beschreibung im Verfahrensschritt d) der vorlie- genden Erfindung das gewaschene mit dem Gemisch konjugierter Östrogene beladene Adsorberharz mit einer zur Elution des Gemisches der konjugierten Östrogene ausrei- chenden Menge einer Elutionsflüssigkeit behandelt und im Verfahrensschritt e) wird ein das natürliche Gemisch der konjugierten Östrogene des PMU enthaltendes Eluat ge- wonnen und ggf. eingeengt. Falls das erhaltene, ggf. eingeengte Eluat ein Zweipha- sengemisch darstellt, wird in einem Verfahrensschritt f) die wässrige Phase des Eluats abgetrennt, so dass eine das natürliche Gemisch der konjugierten Östrogene des PMU enthaltende, wässrige Phase gewonnen wird, welche ggf. weiter eingeengt werden kann.

Regenerierung der Adsorberharz-Säute Zur Regenerierung wird die Säule zunächst unter Verwendung von jeweils 1 bis 4, insbesondere 2 bis 3, Bettvolumen eines auf pH 13 eingestellten, 50 % Ethanol enthaltenden Ethanoi/Wasser-Gemisches pro Bettvolumen Adsorberharz, dann mit dem entsprechenden Volumen 10-% iger wässriger Natriumcitratlösung und schließlich mit dem entsprechenden Volumen destilliertem Wasser gewaschen. Die gesamte Regeneration erFolgt bei einer Temperatur von 40°C bis 45°C. Die Säule kann mehr- mals, beispielsweise bis zu 40-mal, beladen und wieder regeneriert werden.

Beispiel 1 : Vergleichsbeispiel entsprechend Verfahren der WO 98/08526 und WO 031048183 Beispiele 2a, 2b und 3 (erfindungsgemäßes Verfahren) Beispiel 2a : Elution mit 50-vol. % Ethylacetat bei Raumtemperatur Beispiel 2b : Elution mit 50-vol. % Ethylacetat bei 45°C Beispiel 3 : Elution mit einem einphasigen Ethylacetat-haltigen Elutionsgemisch bei 40°C a) Adsorption des Östrogengehaltes des PMU an ein semipolares Polyacryl- ester-Adsorberharz (für alle Beispiele) Es wird eine Säule von 330 mm Höhe mit einem Durchmesser von 40 mm mit 200 mi eines in Wasser gequollenen semipolaren Polyacrylester-Adsorberharz (= Amberlite XAD-7 (Typ HP) der Fa. Rohm und Haas, Korngröße 0,3 bis 1,2 mm, Dipol- moment 1,8 Debye, durchschnittlicher Porendurchmesser 80 Angström, spezifische Oberfläche ca. 450 m2/g trocken) gefüllt. 7 1 (= 35 Bettvolumen, im Folgenden abge- kürzt als BV) eines durch eine Ultrafiltrationsanlage filtrierten PMU, dessen Gehalt an konjugierten Östrogenen, berechnet als Summe aus Ostronsulfat, Equilinsulfat und 17 a-DH-Equilin, sowie an Kresol mittels HPLC bestimmt wurde (Werte siehe Tabelle I), werden bei Raumtemperatur mit einer Durchflussgeschwindigkeit von durchschnittlich 16,7 ml/min (= 5 BV/h) in Beispiel 1, von 40 ml/min (= 12 BV/h) in Beispiel 2a und von 24,4 ml/min (= 7,3 BV/h) in Beispiel 2b und 3 durch die Säule geleitet. Der Östrogen- gehalt des PMU ist vollständig auf der so beladenen semipolaren Adsorberharz-Säule adsorbiert. Die ablaufende Harnflüssigkeit wird mittels HPLC auf ihren Gehalt an kon- jugierten Östrogenen untersucht und erweist sich als praktisch östrogenfrei. Der Ablauf wird verworfen. b) Waschen der beladenen Adsorberharz-Säule (für alle Beispiele) Die beladene Adsorberharz-Säule wird mit 1,0 1 (= 5 BV) einer wässrigen Natri- umhydroxidlösung mit einem pH-Wert von 13 gewaschen. Hierzu wird das alkalische Waschwasser mit einer Durchflussgeschwindigkeit von durchschnittlich 16,7 ml/min (= 5 BV/h) durch die Säule geleitet. Die ablaufende Waschflüssigkeit wird mittels HPLC

auf ihren Gehalt an konjugierten Östrogenen und Kresol untersucht. Die Untersuchung zeigt, dass während der Waschphase weniger als 5% der gesamten auf die Säule aufgegebenen östrogene ausgewaschen werden. c) Zwischenwäsche (für alle Beispiele) Die beladene Adsorberharz-Säule wird mit 600 mi Wasser (= 3 BV) gewaschen.

Hierzu wird das neutrale Waschwasser mit einer Durchflussgeschwindigkeit von durch- schnittlich 16,7 milmin (= 5 BV/h) durch die Säule geleitet. Die ablaufende Waschflüs- sigkeit wird mittels HPLC auf ihren Gehalt an konjugierten Östrogenen und Kresol untersucht. Die Untersuchung zeigt, dass während dieser Waschphase nur ein gerin- ger Teil (maximal nur etwa einige Prozent) der gesamten auf die Säule aufgegebenen Östrogene ausgewaschen wird. d) und e) Desorption der konjugierten Östrogene von der gewaschenen Adsor- berharz-Säule Beispiel 1-Vergleichsbeispiel 1, 1 f (= 5, 5 BV) der Elutionsflüssigkeit (EthanolNVasser 30 : 70) werden mit einer Fliessgeschwindigkeit von durchschnittlich 8,2 milmin (= 2,4 BV/h) durch die auf eine Temperatur von 4 5°C vorgeheizte Säule geleitet. Das ablaufende Eluat wird in 6 Fraktionen E 1 bis E 5 aufgefangen. Die Fraktionen betragen jeweils 200 ml (= 1 BV) bzw 100 ml (= 0, 5 BV für E 6) und werden mittels HPLC auf ihren Gehalt an konju- gierten Östrogenen und Kresol untersucht (Werte siehe Tabelle 1).

Die ersten vier Fraktionen enthalten ca. 80 bis 98 % der gesamten auf der Säule adsorbierten Menge konjugierter Östrogene. Die letzten Fraktionen enthalten nur noch geringe Menge an konjugierten Östrogenen. Die, die Hauptmenge der konjugierten Östrogene enthaltenden Fraktionen stellen für eine galenische Weiterverarbeitung geeignete Extrakte dar.

Beispiel 2 : Beispiel 2a-Elution mit 50-vol. % Ethylacetat bei Raumtemperatur Beispiel 2b-Elution mit 50-vol. % Ethylacetat bei 45°C 900 ml (= 4,5 BV) der zweiphasigen Elutionsflüssigkeit (Ethylacetat-Wasser Ge- misch im Verhältnis 50 : 50) werden mit einer Fliessgeschwindigkeit von durchschnittlich 16,7 ml/min (= 5,0 BV/h) durch die, auf die angegebene Elutionstemperturtemperierte Säule geleitet. Das ablaufende Eluat wird in 9 Fraktionen E 1 bis E 9 aufgefangen. Die Fraktionen betragen jeweils 100 ml (= 0,5 BV) ; ab der vierten Fraktion wird als Eluat ein Zweiphasen-Gemisch erhalten, welches-zwecks Analyse für jedes Eluat einzeln- in die wässrige und organische Phase separiert wird (E 4 bis E 9, jeweils LM für Lö- sungsmittel und W für Wässrige Phase). Alle Fraktionen werden mittels HPLC auf ihren Gehalt an konjugierten Östrogenen und Kresol untersucht (Werte siehe Tabelle I). Für einige Fraktionen wird auch der Gehalt an nicht-konjugierten lipophilen Verbindungen am Beispiel von Formononetin mittels GC bestimmt (Werte siehe Tabelle II).

Die ersten drei Fraktionen enthalten nur Spuren an Östrogenen. In den nachfol- genden wässrigen Phasen der Fraktionen 4 bis 8 sind dann ca. 80 bis 98 % der ge- samten auf der Säule adsorbierten Menge konjugierter Östrogene enthalten. Die letz- ten Fraktionen enthalten nur noch geringe Mengen an Östrogenen. Die, die Haupt- menge der konjugierten Östrogene enthaltenden Fraktionen stellen für eine galenische Weiterverarbeitung geeignete Extrakte dar.

Zur Kontrolle der Vollständigkeit der erfindungsgemäßen Elution mit dem Ethyl- acetat-Wasser-Gemisch wurde im Anschluss an die Extraktion die bereits bekannte Extraktion mit dem einphasigen Ethanol-Wasser-Gemisch (30 : 70) angeschlossen.

Durch die nachfolgende ethanolische Elution werden im Beispiel 2a jedoch noch deutliche Mengen konjugierter Östrogene, entsprechend ca. 6,8% der aufgegebenen Menge, eluiert. Durch die Erhöhung der Elutionstemperatur auf 45°C konnten die Menge der noch auf der Säule verbleibenden konjugierten Östrogene, die erst durch die ethanolische Elution eluiert werden, auf unter 1% reduziert werden.

Beispiel 3-Elution mit einem einphasigen Ethylacetat-haltigen Elutionsgemisch bei 40°C 1, 0 1 (= 5 BV) der einphasigen Elutionsflüssigkeit (Ethylacetat-Wasser-Aceton Gemisch im Volumenverhältnis 1 : 1 : 1,4) werden mit einer Fliessgeschwindigkeit von durchschnittlich 16,7 ml/min (= 5,0 Bettvolumen pro Stunde) durch die auf 40°C tempe- rierte Säule geleitet. Das ablaufende Eluat wird in 13 unterschiedlich großen Fraktio- nen aufgefangen. Die erste Fraktion betrug 100 ml (= 0,5 BV), die nachfolgenden 10 Fraktionen betrugen jeweils 50 ml (= 0,25 BV), während die letzten beiden Fraktionen mit jeweils 200 ml aufgefangen wurden. Nach der Verdrängung des Waschwassers aus der Säule treten überraschenderweise bereits im Eluat (ab Fraktion 4) zwei Pha- sen auf. Alle Fraktionen werden mittels HPLC auf ihren Gehalt an konjugierten Östro- genen und Kresol untersucht (Werte siehe Tabelle I).

Die erste Fraktion enthält nur Spuren an Östrogenen. In den nachfolgenden Frak- tionen 2 bis 7 sind dann ca. 80 bis 98 % der gesamten auf der Säule adsorbierten Menge konjugierter Östrogene enthalten. Die letzten Fraktion en enth alten nur noch geringe Mengen an Östrogenen. Die, die Hauptmenge der konjugierten Östrogene enthaltenden Fraktionen stellen für eine galenische Weiterverarbeitung geeignete Extrakte dar.

Die Eluate E7 bis E13 haben sich erst nach ca. 24h in 2 Phasen getrennt. Die Eluate E1 bis E7 werden vereinigt und folgendermaßen aufgearbeitet : Die Eluate E1- E7 werden im 500 ml Tropftrichter vereinigt und ergeben ca. 350 ml Lösung. Es erfolgt keine sofortige Phasentrennung, aber nach dem Stehenlassen über das Wochenende ist eine kleine organische Phase von ca. 10 mi oben im Tropftrichter sichtbar. Die Phasen werden mittels HPLC auf ihren Gehalt an konjugierten Östrogenen und Kresol untersucht. Nach Auftrennung der Phasen wird die wässrige Phase am Rotationsver- dampfer bei 70°C bis zu einem TS von 8-10% eingeengt (hier 8,16% TS, Werte siehe Tabelle I).

Regenerierung der Adsorberharz-Säule (für alle Beispiele) Zur Regenerierung wird die Säule zunächst mit 400 ml eines auf pH 13 einge- stellten 50 % Ethanol enthaltenden Ethanol/Wasser-Gemisches, dann mit 400 ml 10- % iger wässriger Natriumcitratlösung und schließlich mit 400 ml destilliertem Wasser gewaschen. Die gesamte Regeneration erfolgt bei einer Temperatur von 40°C bis 45°C. Die Säule kann mehrmals, beispielsweise bis zu 40-mal, beladen und wieder regeneriert werden.

Für die bei der Elution erhaltenen, die Hauptmenge der konjugierten Östrogene enthaltenden Fraktionen sind in der nachfolgenden Tabelle jeweils der TS-Gehalt in Gew.-% und die durch HPLC bestimmten Gehalte an konjugierten Östrogenen (CE berechnet als die Summe aus Natrium-Ostronsulfat, Natrium-Equilinsulfat und 17 a- DH-Equilin) sowie an Kresol angegeben. Weiterhin wird die Ausbeute der Extraktion als Wert angeführt.

Tabelle I : Vergleich der einzelnen Verfahren anhand der Zusammensetzung der die Hauptmenge der konjugierten Östrogene enthaltenden Fraktionen ".. E üe q ausbau % TS 1 ; : G, u :,. GeMr ;. : i4seu= Beispiel 1-Vergleichsverfahren PMU 7, 0 n. b. 329 25, 3 57, 9 64, 9 148, 1 1037 n. b. E 1 0, 2 0, 22 0, 0 21, 2 65, 8 76, 0 163, 0 33 7, 46 E2 0, 2 1, 08 0, 0 345, 9 1093, 8 1237, 0 2676, 7 535 24, 77 E 3 0, 2 0, 44 0, 0 183, 4 524, 7 607, 8 1315, 9 263 30, 24 E 4 0, 2 0, 10 0, 0 30, 2 58, 2 84., 6 173, 0 35 16, 99 E 5 0, 2 0, 06 1, 6 8, 9 7, 5 21, 1 37, 5 8 6, 49 E 24 * 0, 6 0, 54 0, 0 186, 5 558, 9 643, 1 1388, 5 833 25, 71 80% l7. ai a X :. > : : : Equ :-> Es A < , Eq Im,. ;...... :. : ; 01 :. :, : : : Grn : :... sy :. 'ew : Au II n I rn CI . . r.... Il rn tl m ll m. : : o v Beispiel 2a-Elution mit Wasser/Ethylacetat 50 : 50 bei RT PMU 7, 0 n. b. 163, 0 15, 7 41, 1 71, 1 127, 9 895 n. b. E 3 0, 1 0, 29 0, 0 90, 1 254, 8 379, 8 724, 7 72 24, 99 E 4 W 0, 064 2, 70 266, 0 735, 5 1877, 7 2858, 2 5471, 5 350 20, 24 E 5 W 0, 053 1, 00 188, 8 466, 9 1233, 9 1877, 4 3578, 2 190 35, 84 E 6 W 0, 051 0, 50 98, 9 245, 6 666, 9 1015, 1 1927, 6 98 38, 68 E 7 W 0, 051 0, 31 57, 8 136, 2 363, 8 551, 7 1051, 7 54 33, 82 E 8 W 0, 051 0, 23 33, 8 79, 6 208, 0 314, 4 602, 0 31 26, 27 E 4-8 * 0, 27 1, 02 136, 1 353, 1 921, 3 1401, 4 2675, 8 722 25, 91 81% Beispiel 2b-Elution mit Wasser/Ethylacetat 50 : 50 bei 45°C PMU 7, 0 n. b. 549, 1 13, 5 61, 3 56, 3 131, 0 917 n. b. E 3 0, 1 n. b. 31, 8 26, 6 124, 4 122, 7 273, 7 27 n. b. E 4 W 0, 086 2, 67 0, 0 401, 9 1719, 9 1684, 2 3806, 0 327 14, 25 E 5 W 0, 058 1, 49 0, 0 519, 8 2527, 0 2268, 4 5315, 1 308 35, 67 E 6 W 0, 058 0, 60 0, 0 227, 1 878, 3 884, 1 1989, 6 115 33, 16 E 7 W 0, 056 0, 25 0, 0 84, 9 350, 7 357, 9 793, 6 44 S1, 74 E 8 W 0, 053 0, 19 0, 0 50, 4 208, 1 204, 2 462, 8 25 24, 36 E 4-8 * 0, 311 1, 21 0, 0 274, 3 1209, 3 1152, 9 2636, 5 820 21, 87 89% Beispiel 3-Elution mit Wasser/EthylacetatlAceton 10 : 10 : 14 bei 40°C PMU 7, 0 n. b. 266, 4 31, 9 71, 7 91, 5 195, 0 1365 n. b. E 1 0, 1 0, 30 0, 0 58, 4 126, 2 180, 8 365, 3 37 12, 18 0 E 1 | 0, 1 | 0, 30 | 0, 0 | 58, 4 | 126, 2 | 180, 8 | 365, 3 | 37 | 12, 18 | E 2 0, 05 0, 28 0, 0 75, 9 194, 2 272, 8 542, 8 27 19, 39 E 3 0, 05 1, 40 0, 0 794, 0 1834, 5 2304, 5 4933, 0 247 35, 24 E 4 W 0, 046 4, 24 0, 0 2300, 5 5446, 5 6947, 8 14694, 8 676 34, 66 E 5 W 0, 035 1, 68 0, 0 745, 8 1722, 8 2165, 0 4633, 5 162 27, 58 E 6 W 0, 035 0, 57 0, 0 212, 5 454, 0 548, 5 1215, 0 43 21, 32 E 7 0, 05 0, 03 0, 0 81, 0 166, 5 212, 0 459, 5 23- E 8 0, 05 0 0, 0 9, 6 20, 1 25, 0 54, 7 3- E1-7* 0, 366 1, 06 0, 0 526, 6 1227, 0 1563, 1 3316, 8 1214 31, 29 89% E1-7W 0, 34 1, 06 0, 0 508, 0 1146, 6 1516, 8 3171, 4 1078 29, 91 79% E1-7L 0, 01 n. b. 0, 0 97, 0 235, 0 340, 0 672, 0 7- '-7W o, 044 8, 16 0, 0 3878 8798 11780 24456 1076 29, 97 79% Konz.

*) rechnerische Bestimmung der Gehalte.

Bei einer Versuchsdurchführung wie in Beispiel 1, d. h. bei einer ethanolischen Elution, wird ein Teil der Isoflavone, beispielsweise Equol, mit der basischen Wäsche ausgewaschen, ein Teil der Isoflavone, beispielsweise Formononetin, gelangt jedoch ins Eluat, und kann erst durch eine nachfolgende Extraktion abgetrennt werden. Ähnli- ches gilt für andere nicht-konjugierte lipophile Verbindungen, wie beispielsweise freie Steroidhormone. Demgegenüber gelangen bei dem erfindungsgemäßen Elutionsver- fahren die noch auf der Säule befindlichen Isoflavone und freien Steroide zum über- wiegenden Anteil in die, mit Wasser nicht-mischbare Lösungsmittelphase des ggf. eingeengten Eluates, während sich die konjugierten Östrogene zu ca. 98% in der weiter zu verarbeitenden wässrigen Phase dieses Eluates befinden. Diese wässrige Phase ist frei von nicht konjugierten Steroidhormonen und weitgehend abgereichert an Isoflavonen und vergleichbaren nicht-konjugierten lipophilen Verbindungen. Diese Verteilung wird anhand einer GC-Analyse der wässrigen Phase und der organischen Phase des 4. Eluates des Beispiels 2a verdeutlicht, wie nachfolgender Tabelle zu entnehmen ist.

Tabelle 11 : Verteilung der konjugierten Östrogene, der freien Steroidhormone und des Formononetins (als Beispiel für Isoflavone) in der wässrigen Phase und der organi- schen Lösungsmittelphase des 4. Eluats des Beispiels 2a-Auswertung der GC- Analyse (die wässrige Phase wurde vor der Bestimmung ca. 1,8 fach konzentriert) : Se. : I '4 : esänf Fee lörorie'Farmäriattetm ' ; : i' :. :. Phs m/m m l m ri I I L. : L 9. C .. g7 L 1 L ... t,. gl Wasser 34, 1 9, 16 312 97, 9 0 0 0 0, 027 0, 9 45, 2 Ethyl- acetat 30, 5 0, 23 7 2, 1 0, 072 2, 1 100 0, 037 1, 1 54, 8