Oestrogene werden in der Medizin zur Hormonsubstituti- onstherapie eingesetzt. Insbesondere werden Oestrogengemische zur Behandlung und Prophylaxe der bei Frauen auftretenden Be- schwerden der Wechseljahre nach natürlicher oder artifiziel- ler Menopause eingesetzt. Hierbei haben sich natürliche Gemi- sche konjugierter Oestrogene, wie sie im Harn trächtiger Stu- ten vorliegen, als besonders wirksam und gut verträglich er- wiesen.

Der gelöste Feststoffgehalt im Harn trächtiger Stuten (= pregnant mares urine, im folgenden abgekürzt als"PMU") kann natürlicherweise in weiten Bereichen schwanken und im allgemeinen in einem Bereich von 40 bis 90 g Trockensubstanz pro Liter liegen. Neben Harnstoff und sonstigen üblichen Harninhaltsstoffen sind in dem Feststoffgehalt des PMU pheno- lische Bestandteile in Mengen von ca. 2 bis 5 Gew.-% bezogen auf die Trockensubstanz enthalten. Unter diesen phenolischen Bestandteilen befinden sich Kresole und das als HPMF bekannte Dihydro-3,4-bis [ (3-hydroxyphenyl) methyl]-2 (3H) -furanon. Diese können in freier oder konjugierter Form vorliegen. In dem PMU ist ein natürliches Gemisch von Oestrogenen enthalten, wel- ches weitgehend in konjugierter Form, z. B. als Schwefelsäu- rehalbester-Natriumsalz (im folgenden abgekürzt als"Sul- fatsalz"), vorliegt. Der Gehalt an konjugierten Oestrogenen (berechnet als Oestrogensulfatsalz) kann zwischen 0,3 und 1 Gew.-% bezogen auf die Trockensubstanz betragen.

Aus der WO 98/08526 ist bereits ein geeignetes Verfahren bekannt, mit welchem in einer Festphasen-Extraktion an einem semipolaren, insbesondere nichtionischen semipolaren, polyme- ren Adsorberharz ein an phenolischen Harninhaltsstoffen abge- reichertes, weitgehend Kresol-und HPMF-freies, den natürli- chen Oestrogen-Gehalt des PMU praktisch vollständig enthal- tendes Gemisch gewonnen werden kann. Dieser Extrakt eignet sich als Ausgangsmaterial für die Herstellung von Pharmazeu- tika, die das natürliche Gemisch konjugierter Oestrogene als Wirkstoffkomponente enthaltenden.

Um als Wirkstoffkomponente für Pharmazeutika verwendet werden zu können, muss das gewonnene natürliche Gemisch kon- jugierter Oestrogene jedoch bestimmte pharmazeutische Spezi- fikationen erfüllen, z. B. der in der USP (United States Phar- macopeia) oder European Pharmacopeia festgelegten Spezifika- tion entsprechen. Auch sollte der Gehalt an freien Oestroge- nen bezogen auf die Trockensubstanz bestimmte Grenzwerte nicht übersteigen. Normalerweise werden die gestellten phar- mazeutischen Spezifikationsanforderungen von den aus PMU ge- mäß dem Verfahren der WO 98/08526 gewonnenen Gemischen konju- gierter Oestrogene erfüllt.

Es hat sich aber herausgestellt, dass die geforderten pharmazeutischen Spezifikationen, beispielsweise der vorste- hende Grenzwert des maximal tolerierbaren Gehaltes an freien Oestrogenen, oft dann nicht eingehalten werden kann, wenn ein "gealteter"Harn, z. B. ein über längere Zeit und/oder ggf. bei erhöhten Temperaturen gelagerter oder transportierter PMU, zur Gewinnung des natürlichen Gemisches konjugierter Oestrogene verwendet wird. Diese Alterung des PMU ist wahr- scheinlich darauf zurückzuführen, dass je nach Lager-und/- oder Transportbedingungen der Gehalt an konjugierten Oestro- genen mit der Zeit oder bei erhöhten Temperaturen abnehmen kann, während der Gehalt an unerwünschten freien Oestrogenen in der Folge zunimmt. Die ursprüngliche Zusammensetzung des natürlichen Gemisches an Oestrogenen kann somit gegenüber frischem Harn bei gealtertem Harn nachteilig verändert sein.

Für das mit dem Verfahren der WO 98/08526 gewonnene natürli- che Gemisch konjugierter Oestrogene besteht bei gegebenfalls veränderter Zusammensetzung eines gealterten Ausgangsproduk- tes oft die Gefahr, dass der gewonnene Extrakt nicht mehr die geforderten pharmazeutischen Spezifikationen, insbesondere den maximal tolerierbaren Gehalt an freien Oestrogenen ein- halten kann. Besonders nachteilig daran ist, dass aus geal- tertem PMU gewonnene Chargen mit dem an sich wertvollen Wirk- stoff-Extrakt des Gemisches konjugierter Oestrogene dann nicht mehr zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparates verwendet werden kann und daher verworfen werden muss. Der Verlust eines wertvollen natürlichen pharmazeutischen Wirk- stoffes ist angesichts der aufwendigen und nur zu bestimmten Perioden der Trächtigkeit durchführbaren Sammlung von PMU und der damit verbundenen logistischen Randbedingungen in der Praxis und unter wirtschaftlichen Gesichtspunkten in hohem Maße unbefriedigend.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein technisch und wirtschaftlich optimales Verfahren zur Gewin- nung eines an phenolischen Harninhaltsstoffen abgereicherten natürlichen Gemisches konjugierter Oestrogene aus dem PMU zu entwickeln, bei dem als Ausgangsprodukt auch gealterter PMU, d. h. über längere Zeiträume und/oder bei erhöhten Temperatu- ren gelagerter oder transportierter PMU, der ggf. einen er- höhten Anteil an freien Oestrogenen aufweisen kann, sicher ohne Ausschuß verwendet werden kann, und bei dem insbesondere das aus diesem PMU gewonnene natürliche Gemisch konjugierter Oestrogene gute Wirkstoffgehalte aufweist und die geforderten pharmazeutische Spezifikation, insbesondere auch im Hinblick auf den maximal tolerierbaren Gehalt an freien Oestrogenen, erfüllt.

Es wurde nun ein Verfahren gefunden, mit welchem auf überraschend einfache Weise ein Gemisch konjugierter Oestro- gene auch aus gealtertem, d. h. insbesondere aus einem ggf. einen erhöhten Anteil an freien Oestrogenen aufweisenden, PMU gewonnenen werden kann, wobei das gewonnene Gemisch konju- gierter Oestrogene eine hohe Produktqualität aufweist und die Anforderungen pharmazeutischer Spezifikation, insbesondere auch im Hinblick auf den maximal tolerierbaren Gehalt an freien Oestrogenen, sicher erfüllt.

Das erfindungsgemäße Verfahren geht aus von dem in der WO 98/08526 beschriebenen Verfahren, welches zur Gewinnung eines an phenolischen Harninhaltsstoffen abgereicherten na- türlichen Gemisches konjugierter Oestrogene aus dem PMU dient. Demgemäß betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Ge- winnung eines an phenolischen Harninhaltsstoffen abgereicher- ten natürlichen Gemisches konjugierter Oestrogene aus dem Harn trächtiger Stuten bei dem man a) eine Harnflüssigkeit, welche gegebenenfalls eine von Schleim-und Feststoffen befreite Harnfüssigkeit, ein einge- engtes Konzentrat dieser Harnflüssigkeit oder ein durch Memb- ranfiltration dieser Harnflüssigkeit erhaltenes eingeengtes Harnretentat darstellt, mit einer zur Adsorption des in der Harnflüssigkeit enthaltenden Gemisches konjugierter Oestroge- ne ausreichenden Menge eines semipolaren polymeren Adsor- berharzes kontaktiert und ein mit dem Gemisch konjugierter Oestrogene beladenes semipolares polymeres Adsorberharz von der übrigen Harnflüssigkeit abtrennt, b) das mit dem Gemisch konjugierter Oestrogene beladene semipolare polymere Adsorberharz mit einem auf einen pH- Bereich von mindestens 12,0 insbesondere von 12,5 bis 14,0, eingestellten Waschwasser wäscht c) das gewaschene Adsorberharz mit einer zur Desorption des dar an adsorbierten Gemisches konjugierter Oestrogene ausreichenden Menge einer Elutionsflüssigkeit, welche ein mit Wasser mischbares organisches Lösemittel aus der Gruppe mit Wasser mischbarer Ether, niederer Alkanole und niederer a- liphatischer Ketone oder ein Gemisch aus dem mit Wasser mischbaren organischen Lösemittel und gegebenenfalls alka- lisch eingestelltem Wasser darstellt, kontaktiert und ein das natürliche Gemisch konjugierter Oestrogene enthaltendes Eluat von dem Adsorberharz abtrennt und gegebenenfalls einengt, wo- bei sich das erfindungsgemäße Verfahren gegenüber dem Verfah- ren des Standes der Technik dadurch auszeichnet, dass man zwischen den Verfahrensschritten b) und c) eine Zwischen- wäsche durchführt, bei der das mit dem Gemisch konjugierter Oestrogene beladene semipolare Adsorberharz mit Wasser gewa- schen wird.

Die Chargenvorbereitung, die an sich bekannten Verfah- rensschritte a), b) und c) sowie die Verwendung des im Ver- fahrensschritt c) erhaltenden Eluats, das ein Gemisch natür- licher konjugierter Oestrogene enthält, sind generell bereits in der internationalen Patentanmeldung WO 98/08526 beschrie- ben und dem Fachmann somit aus dieser publizierten Patentan- meldung geläufig. Der Inhalt dieser WO 98/08526 wird zum Zwe- cke der Offenbarung auch zum Gegenstand der vorliegenden An- meldung gemacht. Weitere Einzelheiten zur allgemeinen Verfah- rensweise und einsetzbaren Materialien sind im Beispielteil der vorliegenden Anmeldung zusammengefaßt. Beispielsweise können gemäß WO 98/08526 semipolare, insbesondere nichtioni- sche semipolare, Adsorberharze eingesetzt werden. Darüber hinaus ist es gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung überraschenderweise auch möglich andere Adsorberharze zusam- men mit der erfindungsgemäßen Zwischenwäsche einzusetzen, oh- ne dass die Produktqualität bzw. die einzuhaltende pharmazeu- tische Spezifikation beeinträchtigt wird. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendbaren Adsorberharze werden wei- ter unten in der Beschreibung noch näher erläutert.

Erfindungsgemäß wird das im Verfahrensschnitt a) mit dem Gemisch konjugierter Oestrogene beladene semipolare Adsor- berharz in einer sich an den Verfahrensschritt b) anschlie- ßenden Zwischenwäsche mit Wasser gewaschen. Die Menge an Waschwasser wird so gewählt, dass das im anschließenden Ver- fahrensschritt c) erhaltene Eluat ein Gemisch konjugierter Oestrogene aufweist, das die Anforderungen an einen Höchstge- halt an freien Oestrogenen erfüllt und damit als Wirkstoff- komponente für Pharmazeutika verwendet werden kann. Als zweckmäßig erweist sich beispielsweise die Verwendung von 2 bis 8, vorzugsweise 3 bis 5, Bettvolumen Waschwasser pro Bettvolumen Adsorberharz. Hierbei wird das Waschwasser zweck- mäßigerweise durch einen das Adsorberharz enthaltenden Reak- tor mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 3 bis 10, vor- zugsweise 5 bis 7, Vol. -Teilen Waschwasser pro 1 Vol. -Teil Adsorberharz pro Stunde geleitet.

Es muss als ausgesprochen überraschend bezeichnet wer- den, dass ein vermeintliches einfaches, zwischen den Verfah- rensschritten b) und c) durchgeführtes Waschen des Adsor- berharzes mit Wasser auch bei Verwendung von gealtertem PMU derart zur Optimierung der pharmazeutischen Spezifikation der als Wirkstoff-Extrakt gewonnenen natürlichen Gemische konju- gierter Oestrogene führt, wie erfindungsgemäß festgestellt wurde. Insbesondere ist es sehr überraschend, dass der vor allem in gealtertem PMU gegebenenfalls enthaltene erhöhte An- teil an freien Oestrogenen derart sicher verringert werden kann, dass im Verfahrensschritt c) als Eluat ein Gemisch na- türlicher konjugierter Oestrogene erhalten werden kann, wel- ches die hohen Anforderungen an die pharmazeutische Spezifi- kation, beispielsweise die gemäß der USP oder der Europäi- schen Pharmacopeia aufgestellten Anforderungen, erfüllt und insbesondere auch aus gealtertem PMU ein natürliche konju- gierte Oestrogen-Gemische enthaltendes qualitativ und quanti- tativ hohwertiges Wirkstoff-Extrakt erhalten werden kann.

Diese Wirkstoff-Extrakte halten die maximal tolerierbaren Höchstgehalte an freien Oestrogenen unabhängig von Alter und Herkunft des eingesetzten PMU sicher ein und erweisen sich somit als ein vorteilhaftes bzw. wertvolles Ausgangsprodukt für die Herstellung von Pharmazeutika. Ein unerwünschter und wirtschaftlich nachteiliger Verlust von wertvollen pharmazeu- tischen Rohstoffen, wie hier die Gemische aus natürlichen konjugierten Oestrogenen, kann somit auch unter schwierigen Bedingungen vermieden werden.

Es hat sich beim erfindungsgemäßen Verfahren als weite- rer Vorteil herausgestellt, dass das im Verfahrensschritt c) gewonnene Eluat im Vergleich zum Stand der Technik einen, be- zogen auf die Trockensubstanz, erhöhten Gesamthormongehalt aufweist. Dadurch wird ein z. B. in bezug auf den Wirkstoff- Gehalt deutlich verbessertes Qualitätsprodukt erhalten.

In einer vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemä- ßen Verfahrens wird die Zwischenwäsche bei Temperaturen un- terhalb Raumtemperatur, insbesondere bei Temperaturen zwi- schen 0 °C und 10 °C, durchgeführt, da sich gezeigt hat, dass durch die zusätzliche Zwischenwäsche gegebenfalls bedingte Hormon-bzw. Wirkstoffverluste deutlich vermindert werden können. Als Raumtemperatur wird üblicherweise die Umgebungs- temperatur angesehen, z. B. eine Temperatur bezeichnet, die zwischen 20° und 30°C liegt. Sehr zweckmäßig. ist es, das Ver- fahren bei Temperaturen von tatsächlich 0 °C bzw. annähernd 0 °C auszuführen. In der Praxis empfiehlt es sich daher bei Temperaturen von nahe oberhalb 0 °C zu arbeiten und durch entsprechende Maßnahmen für die Einhaltung der genannten Tem- peraturbereiche zu sorgen. Hierzu können an sich übliche Maß- nahmen zur Absenkung der Temperatur getroffen werden, z. B. der Einsatz gekühlter Reaktoren, gekühlter Materialien und/oder gekühlter Ausgangsstoffe wie PMU. Als Temperaturen von 0 °C bzw. von annähernd 0 °C kann unter praktischen Ge- sichtspunkten ein Temperaturbereich von 0 °C bis etwa 5 °C, insbesondere von 0 °C bis etwa 3 °C, betrachtet werden.

Um mögliche Hormonverluste während der Zwischenwäsche so gering wie möglich zu halten, wird gemäß dieser Variante der Erfindung das in der Zwischenwäsche und/oder auch das im Ver- fahrensschritt b) verwendete alkalisch gestellte Waschwasser auf Temperaturen unterhalb Raumtemperatur, insbesondere auf Temperaturen zwischen 0 °C und 10 °C, vorgekühlt sein. Weite- re zweckmäßige bzw. bevorzugte Temperaturbereiche sind wie vorstehend angegeben Temperaturen von 0 °C bis etwa 5 °C, insbesodere von von 0 °C bis etwa 3 °C. Bevorzugt wird bei Temperaturen von 0 °C bzw. von annähernd 0 °C gearbeitet, d. h. vorzugsweise ist das in der Zwischenwäsche und/oder auch das im Verfahrensschritt b) verwendete'alkalisch gestellte Waschwasser auf Temperaturen von Temperaturen nahe oberhalb 0 °C vorgekühlt. Durch die Verwendung von gekühltem alkalisch gestelltem Waschwasser im Verfahrensschritt b) wird eine Art Vorkühlung oder Aufrechterhaltung der bereits erfolgten Küh- lung des Adsorberharzes erreicht, z. B. um zu vermeiden, dass beim Einsatz von gekühlten Waschwasser für die Zwischenwäsche eine unerwünschte Wiedererwärmung desselben stattfindet. Be- vorzugt werden daher die Zwischenwäsche und der vorhergehende Verfahrensschritt b) beide im selben Temperaturbereich durch- geführt, z. B. bei Temperaturen unterhalb Raumtemperatur, ins- besondere bei Temperaturen zwischen 0 °C und 10 °C, oder vor- zugsweise in den wie oben angegebenen Temperaturbereichen.

In der vorstehenden Variante der Erfindung, in der das Verfahren bei Temperaturen unterhalb Raumtemperatur ausge- führt wird, kann es wünschenswert sein, alle verwendeten Vor- richtungen wie Reaktoren zur Aufnahme des semipolaren Adsor- berharzes oder dieses bereits enthaltende Reaktoren und/oder den eingesetzten PMU entsprechend auf Temperaturen unterhalb Raumtemperatur, insbesondere auf Temperaturen zwischen 0 °C und 10 °C, oder auf die oben angegebenen vorzugsweisen Tempe- raturbereiche vorgekühlt einzusetzen.

Als Adsorbens für das erfindungsgemäße Verfahren sind polymere Adsorberharze für den Einsatz geeignet. Besonders bevorzugte Adsorberharze sind semipolare, insbesondere nicht- ionische semipolare, polymere Adsorberharze. Die im erfin- dungsgemäßen Verfahre als Adsorbens einsetzbaren semipolaren polymeren Adsorberharze sind vorzugsweise poröse organische nichtionische Polymere, welche im Gegensatz zu unpolaren hyd- rophoben polymeren Adsorberharzen eine intermediäre Polarität (= z. B. mit-e-imem DipPlmome-n-t der aktiven Oberfläche des Har- zes im Bereich von 1,0 bis 3,0, insbesondere 1,5 bis 2,0, De- bye) und eine etwas hydrophylere Struktur besitzen, bei- spielsweise Polycarbonsäureesterharze. Zweckmäßig werden mak- roporöse semipolare Harze mit vorzugsweise makroretikularer Struktur und mit durchschnittlichen Porendurchmessern im Be- reich von 50 bis 150, vorzugsweise 70 bis 100, Angström und einer spezifischen Oberfläche im Bereich von 300 bis 900, vorzugsweise 400 bis 500, m2/g eingesetzt. Als besonders ge- eignet erweisen sich makroporöse quervernetzte aliphatische Polycarbonsäureesterharze, insbesondere quervernetzte Poly- acrylesterharze wie z. B. Amberlite XAD-7R der Fa. Rohm und Haas, die nicht-ionische semipolare Adsorberharze darstellen.

Neben den bevorzugt genannten Adsorbenzien können auch andere Adsorberharze eingesetzt werden. Als Adsorberharze eignen sich dabei sowohl unpolare, semipolare und auch polare Adsorberharze. Die Menge des Harns, die über den Adsorber ge- pumpt werden kann, ist hierbei zuvor anhand der jeweiligen Adsorberkapazität zu bestimmen. Beispiele für verwendbare Ad- sorberharze sind handelsübliche Typen wie polymere Amberlite Adsorbenzien mit Styroldivinylbenzolgrundgerüsten (z. B. Typen XAD-1180, XAD-2, XAD-4, XAD-16), mit Acrylestergrundgerüsten (z. B. XAD-7) oder solche mit hochpolaren Grundgerüsten ent- haltend Stickstoff und Sauerstoff (z. B. XAD-12). Andere Ad- sorberharze sind Dowex-Harze (Copolymere von Styrol und Divi- nylbenzol), wie z. B. Dowex 112, Dowex Optipore, Dowex Optipo- re V 493 ; Lewatite (vernetzte Polystyrole), z. B. Lewatit OC 1064, Lewatit OC 1066 oder Lewatit OC 1163, Polyaminanionen- tauscherharze, z. B. Dowex-Harze. Vorteilhafte Adsorberharze sind insbesondere XAD-7, XAD-16 (Typ HP), XAD 118 und Dowex Optipore, bevorzugt als Dowex Optipore V 493, sowie Lewatite OC 1064, OC 1066 und OC 1163.

Das erfindungsgemäße Verfahren bietet, wie vorstehend bereits im Detail beschrieben, eine Reihe von Vorteilen und Verbesserungen gegenüber dem Stand der Technik. So ermöglicht die Erfindung die Verwendung auch von gealtertem PMU, der auch einen erhöhten Anteil an freien Oestrogenen aufweisen darf, ohne dass einzuhaltende pharmazeutische Spezifikationen gefährdet werden. Das erfindungsgemäße Verfahren weist daher auch wirtschaftliche Vorteile auf, da die Gefahr wertvolle Wirkstoffe bei Nichteinhaltung der pharmazeutischen Spezifi- kation, z. B. bei nicht mehr tolerierbaren Gehalten an freien Oestrogenen, deutlich vermindert ist. Das erfindungsgemäße Verfahren liefert eine qualitätsverbesserte Wirkstoffkompo- nente mit einem auf den Trockensubstanz-Gehalt bezogenen er- höhtem Hormongehalt. Diese Wirkstoffkomponente eignet sich hervorragend für die Herstellung von Pharmazeutika, die als Wirkstoff ein Gemisch natürlicher konjugierter Oestrogene enthalten.

Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne jedoch ihren Umfang zu beschränken.

Beispiele In den nachfolgenden Beispielen werden allgemeine Ar- beitsvorschriften zur Gewinnung von Wirkstoff-Extrakten aus PMU angegeben, die das natürliche Gemisch der im PMU enthal- tenen konjugierten Oestrogene enthalten und an phenolischen Harninhaltsstoffen weitgehend abgereichert sind. Es wird ge- zeigt, wie sich erfindungsgemäß auch aus gealtertem PMU, der einen erhöhten Anteil an freien Oestrogenen aufweisen kann, ein Qualitätsextrakt mit hohen Wirkstoffgehalten gewinnen läßt.

Verfahren der WO 98/08526 Für das erfindungsgemäße Verfahren können ebenso wie ge- mäß der WO 98/08526 der PMU als solcher, ein daraus durch Einengen gewonnenes Konzentrat oder ein daraus durch Membran- filtration gewonnenes Retentat eingesetzt werden. Der gesam- melte Harn wird zunächst auf an sich bekannte Weise von Schleim-und Feststoffen befreit. Zweckmäßig läßt man Fest- und Schleimstoffe absetzen und trennt diese dann nach an sich bekannten Trennungsmethoden, beispielsweise Dekantieren, Separieren und/oder Filtrieren ab. So kann der PMU beispiels- weise über eine an sich bekannte Trenneinrichtung, z. B. einen Separator, eine Filtrationsanlage oder einen Sedimentator ge- leitet werden. Als Trenneinrichtung kann z. B. ein Sandbett dienen, oder es können handelsübliche Separatoren, z. B. Düsen-oder Kammerseparatoren, eingesetzt werden. Gewünschtenfalls können auch eine Microfiltrations- anlage oder eine Ultrafiltrationsan-lage eingesetzt werden, bei deren Verwendung gleichzeitig eine weitgehende Keim-und Virenfreiheit des filtrierten PMU erreicht werden kann.

Gewünschtenfalls können dem Harn Konservierungsmittel, Germizide, Bakterizide und/oder Anthelmintika zugesetzt wer- den.

Sofern anstelle des PMU ein aufkonzentriertes PMU- Retentat eingesetzt werden soll, kann dieses aus dem PMU durch an sich bekannte Membranfiltration gewonnen werden. Der Feststoffgehalt des Retentates und dessen Zusammensetzung können je nach dem eingesetzten PMU und der zur Membranfilt- ration verwendeten Membran, beispielsweise deren Porenweite, sowie den Bedingungen der Filtration variieren. Beispielswei- se kann bei Verwendung einer Nanofiltrationsmembran eine na- hezu verlustfreie Konzentration des Oestrogengehaltes in dem PMU-Retentat bei gleichzeitiger Entfernung von bis zu 50 Gew. -% der niedermolekularen PMU-Inhaltsstoffe erreicht wer- den. Für das erfindungsgemäße Verfahren können PMU-Retentate eingesetzt werden, welche bis zu einem Verhältnis von ca.

1 : 10, beispielsweise einem Verhältnis von ca. 1 : 7 aufkonzen- triert wurden und deren Volumen somit bis auf ca. 1/10, bei- spielsweise ca. 1/7, des ursprünglichen PMU-Volumens einge- engt sein kann.

Die in dem Verfahrensschritt a) einsetzbaren semipolaren polymeren Adsorberharze sind poröse organische nichtionische Polymere, welche im Gegensatz zu unpolaren hydrophoben poly- meren Adsorberharzen eine intermediäre Polarität (= z. B. mit einem Dipolmoment der aktiven Oberfläche des Harzes im Be- reich von 1,0 bis 3,0, insbesondere 1, 5 bis 2, 0, Debye) und eine etwas hydrophylere Struktur besitzen, beispielsweise Po- lycarbonsäureesterharze. Zweckmäßig werden makroporöse semi- polare Harze mit vorzugsweise makroretikularer Struktur und mit durchschnittlichen Porendurchmessern im Bereich von 50 bis 150, vorzugsweise 70 bis 100, Angström und einer spezifi- schen Oberfläche im Bereich von 300 bis 900, vorzugsweise 400 bis 500, m2/g eingesetzt. Als besonders geeignet erweisen sich makroporöse quervernetzte aliphatische Polycarbonsäure- esterharze, insbesondere quervernetzte Polyacrylesterharze wie z. B. Amberlite XAD-7R der Fa. Rohm und Haas.

Die Adsorption der konjugierten Oestrogene an das semi- polare Adsorberharz kann gemäß WO 98/08526 wie auch im vor- liegenden erfindungsgemäßen Verfahren durch Kontaktierung des PMU oder dessen Retentats mit dem Adsorberharz erfolgen, in- dem die Harnflüssigkeit in einen das Adsorberharz enthalten- den Reaktor eingeführt und darin für eine zur Adsorption des Oestrogengehaltes ausreichende Zeit mit dem Adsorberharz in Kontakt gehalten wird. Nach erfolgter Adsorption der konju- gierten Oestrogene an das semipolare Adsorberharz kann das mit dem Gemisch konjugierter Oestrogene beladene Adsorberharz von der übrigen Harnflüssigkeit auf an sich bekannte Weise abgetrennt werden. Zweckmäßigerweise kann die Harnflüssikgeit durch eine das Adsorberharz enthaltende Säule mit solcher Durchlaufgeschwindigkeit geleitet werden, daß die Kontaktzeit zur Adsorption des Oestrogengehaltes ausreicht. Geeignet sind beispielsweise Durchlaufgeschwindigkeiten, welche einem Durchlauf von 3 bis 10, vorzugsweise 5 bis 7, Vol. -Teilen PMU/1 Vol.-Teil Adsorberharz/Stunde entsprechen. Zweckmäßig kann die Durch- laufgeschwindigkeit der Harnflüssigkeit durch den Reaktor durch Arbeiten bei geringem Überdruck oder Unterdruck gesteu- ert werden. Die Menge an anzuwendendem semipolarem Adsor- berharz kann je nach Art des verwendeten Adsorberharzes und Menge des Feststoff-Gehaltes in der Harnflüssigkeit variie- ren. Bei Verwendung von PMU kann beispielsweise ein. Volumen- teil Adsorberharz, z. B. quervernetztes aliphatisches Poly- carbonsäureester-Adsorberharz, mit bis zu 80 Volumen-Teilen vorbehandeltem PMU beladen werden, ohne daß merkliche Mengen Oestrogen in der abfließenden Harnflüs- sigkgeit nachweisbar sind. Bei Verwendung eines PMU- Konzentrates oder PMU-Retentates reduziert sich die Bela- dungskapazität des Adsorberharzes natürlich in dem Maße, in dem diese aufkonzentriert sind. So kann beispielsweise 1 Vo- lumenteil an quervernetztem aliphatischem Polycarbonsäu- reester-Adsorberharz mit einer 20 bis 80, vorzugsweise 30 bis 50, Volumenteilen PMU entsprechenden Menge Harnflüssigkeit beladen werden.

Das mit dem Gemisch konjugierter Oestrogene beladene se- mipolare Adsorberharz wird in Verfahrensschritt b) mit einem auf einen pH-Bereich von mindestens 12,0, insbesondere von 12,5 bis 14, vorzugsweise ca. 12,5 bis 13,5, eingestellten Waschwasser gewaschen. Als Waschwasser können wäßrige Lösun- gen von in der Harnflüssigkeit löslichen inerten basischen Substanzen, welche stark genug sind, um einen pH-Wert von mindestens 12,5 zu erreichen, eingesetzt werden. Als gegen- über dem semipolaren polymeren Adsorberharz inerte, wasser- lösliche basische Substanzen eignen sich vorzugsweise wasser- lösliche anorganische Basen wie Alkalimetall-oder Erdalkali- metallhydroxide, insbesondere Natriumhydroxid. Zweckmäßig enthält das Waschwasser nur etwa diejenige Menge an basischen Substanzen, welche zum Erreichen des gewünschten pH-Wertes, vorzugsweise ca. pH 13, benötigt wird. Die Menge an Waschwas- ser wird so gewählt, daß sie ausreicht, um phenolische Har- ninhaltsstoffe weitgehend zu entfernen, ohne daß dabei nen- nenswerte Mengen konjugierter Oestrogene mit ausgewaschen werden. Als zweckmäßig erweist sich beispielsweise die Ver- wendung von 2 bis 10, insbesondere 4 bis 6, Bettvolumen Waschflüssigkeit pro Bettvolumen Adsorberharz. Hierbei wird das Waschwasser zweckmäßigerweise durch einen das Adsor- berharz enhaltenden Reaktor mit einer Durchflußge- schwindigkeit von 3 bis 10, vorzugsweise 5 bis 7, Vol.-Teilen Waschwasser/1 Vol. -Teil Adsorberharz/Stunde geleitet.

Im Verfahrensschritt c) wird anschließend das gewaschene mit dem Gemisch konjugierter Oestrogene beladene Adsorberharz mit einer zur Elution des Gemisches der konjugierten Oestr- ogene ausreichenden Menge einer Elutionsflüssigkeit behandelt und ein das natürliche Gemisch der konjugierten Oestrogene des PMU enthaltendes Eluat gewonnen. Die erfindungsgemäß ver- wendete Elutionsflüssigkeit stellt ein mit Wasser mischbares organisches Lösemittel aus der Gruppe mit Wasser mischbarer Ether, niederer Alkanole und niederer aliphatischer Ketone oder ein Gemisch aus einem solchen mit Wasser mischbaren Lö- semittel und gegebenenfalls alkalisch gestelltem Wasser dar.

Als Etherbestandteile der Elutionsflüssigkeit eignen sich mit Wasser mischbare cyclische Ether wie Tetrahydrofuran oder Di- oxan, aber auch mit Wasser mischbare offenkettige Ether wie beispielsweise Ethylenglycoldimethylether (= Monoglyme), Diethylenglycoldimethylether (= Diglyme) oder Ethyloxyethyl- oxyethanol (= Carbitol). Als niedere Alkanole eignen sich mit Wasser mischbare Alkylalkohole mit 1-4, vorzugsweise 1-3, Kohlenstoffatomen, insbesondere Ethanol oder Isopropanol. Als niedere aliphatische Ketone eignen sich mit Wasser mischbare Ketone mit 3-5 Kohlenstoffatomen, insbesondere Aceton. Als besonders günstig erweisen sich Elutionsflüssigkeiten, in de- nen das organische Lösemittel Ethanol ist. Zweckmäßig werden als Elutionsflüssigkeiten Gemische aus einem der vorgenannten mit Wasser mischbaren organischen Lösemittel und gegebenen- falls alkalisch eingestelltem Wasser eingesetzt. Der pH-Wert derartiger wasserhaltiger Elutionsmittel liegt im neutralen bis alkalischen Bereich bis zu pH 13 und kann vorteilhaft ca.

10 bis 12 betragen. Als Lösemittelkomponente in der wasser- haltigen Elutionsflüssigkeit wird ein in dem eingesetzten pH- Bereich stabiles Lösemittel ausgewählt. In wasserhaltigen al- kalischen Elutionsflüssigkeiten mit pH-Werten von ca. 10 bis 12 eignen sich als Lösemittelkomponente niedere Alkanole, vorzugsweise Ethanol. Der gewünschte pH-Wert der wasser- haltigen Elutionsmittel wird durch Zugabe einer entsprechen- den Menge einer wasserlöslichen inerten basischen Substanz, vorzugsweise einer anorganischen Base, beispielsweise eines Alkalimetall-oder Erdalkalimetallhydroxides, insbesondere Natriumhydroxid, eingestellt. In wasserhaltigen Elutions- flüssigkeiten kann ein Volumenverhältnis von mit Wasser mischbarem organischem Lösemittel zu Wasser im Bereich von 40 : 60 bis 20 : 80, vorzugsweise ca. 30 : 70 vorliegen. Die einge- setzte Menge an Elutionsmittel kann ca. 3 bis 10, insbesonde- re ca. 4 bis 6, Bettvolumen pro Bettvolumen Adsorberharz betragen. Zweckmäßigerweise wird die Elutionsflüssigkeit durch einen das mit dem Oestrogengemisch beladene Adsor- berharz enthaltenden Reaktor mit einer solchen Durchlaufge- schwindigkeit geleitet, daß die Kontaktzeit zur vollständigen Elution des Gemisches konjugierter Oestrogene ausreicht. Bei Verwendung eines Gemisches von Ethanol mit Wasser im Vol.- Verhältnis 30 : 70 eignen sich beispielsweise Durchlaufge- schwindigkeiten von 3 bis 10, vorzugsweise 5 bis 7, Vol.- Teilen Elutionsflüssigkeit pro 1 Vol. -Teil Adsorberharz pro Stunde. Zweckmäßig wird die Elution in einem Temperaturbe- reich von Raumtemperatur bis ca. 60 °C, vorzugsweise bei ca.

40 bis 50 °C, durchgeführt. Gewünschtenfalls wird die Durch- laufgeschwindigkeit durch Arbeiten bei leicht erhöhtem Druck, z. B. bei einem Überdruck von bis zu 0,2 bar, reguliert und das Eluat in mehreren Fraktionen aufgefangen. Die Gehalte der einzelnen Eluatfraktionen an konjugierten Oestrogenen und phenolischen Harninhaltsstoffen wie Kresolen und HPMF können auf an sich bekannte Weise durch Hochleistungsflüssigkeits- Chromatographie (= high performance liquid chromatography, abgekürzt als"HPLC") bestimmt werden.

Bei der Elution wird zunächst eine schwachgefärbte bis farblose, praktisch oestrogenfreie Vorlauffraktion erhalten, deren Menge im allgemeinen ca. einem Bettvolumen entspricht.

Die Hauptmenge der konjugierten Oestrogene, beispielsweise zwischen 80 und 99 % der in dem Ausgangs-PMU vorliegenden konjugierten Oestrogene, befindet sich in den nachfolgenden dunkelgelb-braun gefärbten Haupteluatfraktionen, deren Menge im allgemeinen 2 bis 4 Bettvolumen umfaßt. In den nachfolgen- den Nachlauffraktionen sind im allgemeinen nur noch Spuren an konjugierten Oestrogenen enthalten. Sofern Nachfolgefraktio- nen erhalten werden, welche noch einem Gehalt an konjugierten Oestrogenen von über 10 Gew. -% bezogen auf Trockensubstanz und weniger als 0,6 Gew. -% bezogen auf Trockensubstanz an Kresolen und HPMF enthalten, können diese mit dem oestrogen- reichen Haupteluat zur Weiterverarbeitung vereinigt werden.

Beispiel 1 (Vergleichsbeispiel) : a) Adsorption des Oestrogengehaltes des PMU an ein semipola- res Polyacrylester-Adsorberharz Es wird eine Säule von 220 mm Höhe mit einem Durchmesser von 40 mm mit 300 ml eines in Wasser gequollenen semipolaren Po- lyacrylester-Adsorberharz (= Amberlite XAD-7 der Fa. Rohm und Haas, Korngröße 0,3 bis 1,2 mm, Dipolmoment 1,8 Debye, durch- schnittlicher Porendurchmesser 80 Angström, spezifische Ober- fläche ca. 450 m2/g trocken) gefüllt. 10,5 1 (= 35 Bettvolu- men) eines durch eine Ultrafiltrationsanlage filtrierten PMU (mittels HPLC bestimmte Gehalte an Oestronsulfatsalz und Kre- sol siehe nachfolgende Beispielstabelle) werden bei Raumtem- peratur mit einer Durchflussgeschwindigkeit von durchschnitt- lich 24 ml/min (= 4,8 Bettvolumen pro Stunde) durch die Säule geleitet. Der Oestrogengehalt des PMU ist vollständig auf der so beladenen semipolaren Adsorberharz-Säule adsorbiert. Die ablaufende Harnflüssigkeit wird mittels HPLC auf ihren Gehalt an konjugierten Oestrogenen (berechnet als Oestronsulfatsalz) untersucht und erweist sich als praktisch oestrogenfrei. Der Ablauf wird verworfen. b) Waschen der beladenen Adsorberharz-Säule Die beladene Adsorberharz-Säule wird mit 1,5 1 einer wässri- gen Natriumhydroxidlösung mit einem pH-Wert von 13 gewaschen.

Hierzu wird das alkalische Waschwasser mit einer Durchfluss- geschwindigkeit von durchschnittlich 24,6 ml/min (= 4,9 Bett- volumen pro Stunde) durch die Säule geleitet. Die ablaufende Waschflüssigkeit wird mittels HPLC auf ihren Gehalt an Oestronsulfatsalz und Kresol untersucht. Die Untersuchung zeigt, dass während der Waschphase weniger als 5 % der gesam- ten auf die Säule aufgegebenen Oestrogene ausgewaschen wird. c) Desorption der konjugierten Oestrogene von der gewaschenen Adsorberharz-Säule 1,5 1 der Elutionsflüssigkeit (Ethanol/Wasser 30 : 70) werden mit einer Fliessgeschwindigkeit von 25 ml/min (= 5,0 Bettvo- lumen pro Stunde) durch die auf die in der Beispieltabelle angegebene Elutionstemperatur vorgeheizte Säule geleitet. Das ablaufende Eluat wird in 5 Fraktionen aufgefangen. Die Frak- tionen betragen jeweils 300 ml (= 1 Bettvolumen) und werden mittels HPLC auf ihren Gehalt an Oestronsulfatsalz und Kresol untersucht.

Die erste Fraktion enthält nur Spuren an Oestrogensulfatsalz.

Das Eluat erscheint farblos bis schwach gelb gefärbt. In den nachfolgenden Fraktionen 2 bis 4 sind dann ca. 80 bis 98 % der gesamten auf der Säule adsorbierten Menge konjugierter Oestrogene enthalten. Die Eluate haben hier einen intensiven dunkelbraunen Farbton. Die letzte Fraktion enthält nur noch geringe Menge an Oestrogensulfatsalz, was auch deutlich an der Abnahme der Farbintensität sichtbar ist.

Für die die Hauptmenge der konjugierten Oestrogene enthalten- den Fraktionen sind in der nachfolgenden Tabelle jeweils der TS-Gehalt in Gew.-% und die durch HPLC bestimmten Gehalte an Oestronsulfatsalz und Kresol angegeben. Diese Fraktionen stellen für eine galenische Weiterverarbeitung geeignete Ex- trakte dar. d) Regenerierung der Adsorberharz-Säule Zur Regenerierung wird die Säule zunächst mit 600 ml eines eingestellten 50 % Ethanol enthaltenden Ethanol/Wasser- Gemisches, dann mit 600 ml eines eingestellten 70 % Ethanol enthaltenden Ethanol/Wasser-Gemisches, anschließend mit 600 ml 10-% iger wässriger Natriumcitratlösung und schließlich mit 600 ml destilliertem Wasser gewaschen. Die gesamte Regenera- tion erfolgt bei einer Temperatur von 45 °C. Die Säule kann mehrmals, beispielsweise bis zu 40-mal, beladen und wieder regeneriert werden.

Beispiel 2 (Erfindungsgemäßes Verfahren) : Beispiel 1 wurde mit der erfindungsgemäßen Zwischenwäsche zwischen den Verfahrensschritten b) und c) wiederholt.

Zwischenwäsche Die beladene Adsorberharz-Säule wird mit 900-ml Wasser gewa- schen. Hierzu wird das neutrale Waschwasser mit einer Durch- flussgeschwindigkeit von durchschnittlich 25,0 ml/min (= 5,0 Bettvolumen pro Stunde) durch die Säule geleitet.

Die ablaufende Waschflüssigkeit wird mittels HPLC auf ihren Gehalt an Oestronsulfatsalz und Kresol untersucht. Die Unter- suchung zeigt, dass während dieser Waschphase nur ein gerin- ger Teil (maximal nur etwa einige Prozent) der gesamten auf die Säule aufgegebenen Oestrogene ausgewaschen wird. Erfin- dungsgemäß reduziert sich aber bei Durchführung des Erfin- dungsgemäßen Verfahrens auch der Anteil an freien Oestrogenen (siehe Beispiel 4). Tabelle I : Ergebnisse des Vergleichsbeispiels 1 und des erfindungsgemäßen Beispiels 2 Beispiel Nr. 1 2 Verfahrensschritt a) : Ausgangs-PMU Estron mg/1 86,4 92,3 Equilin mg/1 57,0 57,0 Kresol mg/l 1191,1 877, 6 Verfahrensschritt b) : Waschwasser = wässrige NaOH-Lösung pH 13 pH 13 Zwischenwäsche : Waschwasser = Wasser Waschfraktion 1 : Estron mg/1 0,0 Equilin mg/l 20, 9 Kresol mg/l Vergleich: 18,0 Waschfraktion 2 : Zwischenwäsche Estron mg/1 nicht 125,0 Equilin mg/1 0,0 Kresol mg/1 durchgeführt 0, 0 Waschfraktion 3 : Estron mg/1 290,6 Equilin mg/1 138,0 Kresol mg/l 31, 5 Verfahrensschritt c) : Ethanol/Wasser Ethanol/Wasser Elutionsflüssigkeit 30 : 70 30 : 70 Elutionstemperatur 45 °C 45 °C Eluatfraktion 1 : Gewichts-% TS 4, 3 0, 2 Estron mg/1 (Gew.-% TS) 0, 0 (0,00) 342,7 (17,14) Equilin mg/1 (Gew.-% TS) 24,8 (0,06) 182,6 (9,13) Eluatfraktion 2 : Gewichts-% TS 1, 9 0,9 Estron mg/1 (Gew.-% TS) 2788,6 (14,68) 2053,5 (22,81) Equilin mg/l (Gew.-% TS) 1528,0 (8,04) 1120,1 (12,45) Eluatfraktion 3 : Gewichts-%-TS 0,2 0,2 Estron mg/1 (Gew.-% TS) 193,2 (9,66) 38,9 (1,95) Equilin mg/1 (Gew.-% TS) 99,8 (4,99) 19,8 (0, 99) Eluatfraktion 4 : Gewichts-%-TS 0, 1 0, 1 Estron mg/1 (Gew.-% TS) 7, 1 (0,71) 0,0 (0,00) Equilin mg/1 (Gew.-% TS) 9, 3 (0,93) 0,0 (0,00) Beispiel 3 (erfindungsgemäßes Verfahren mit Kühlung) : Reduzierung der Hormonverluste während der Neutralen Wäsche Es wird wie in den Beispielen 1 und 2, jedoch unter Kühlung gearbeitet. Die Kühlung dient zur Minimierung von Hormonver- lusten während der Zwischenwäsche. Wird die Zwischenwäsche statt bei Raumtemperatur mit Eiswasser durchgeführt, so kön- nen die Hormonverlusten um bis zu ca. 50 % gesenkt werden, insbesondere wenn im Verfahren die Temperatur tatsächlich 0 °C bzw. annähernd 0 °C beträgt. Hierbei empfiehlt es sich, nicht nur Eiswasser aufzugeben, welches sich aufgrund des mit Raumtemperatur vorliegenden Säuleninhaltes relativ schnell erwärmen kann, sondern es ist vielmehr die gesamte Säule auf 0 °C zu kühlen.

Versuchsdurchführung Die für die Zwischenwäsche erforderliche Säulentemperatur von 0 °C wurde durch eine Abkühlung während der vorgehenden basi- schen Wäsche erreicht, d. h. bereits die basische Wäsche lief bei 0 °C. Die Aufgabe von 5 Bettvolumen mit 0 °C bei der Ba- sischen Wäsche war dabei ausreichend, um den Säuleninhalt von Raumtemperatur auf 0 °C abzukühlen. Die sich anschließende Zwischenwäsche konnte dann bei 0 °C ablaufen. Neben der Mini- mierung der Hormonverluste wurde auch der mögliche Tempera- tureinfluss auf die Kresolabtrennung während der basischen Wäsche mit untersucht.

Zum direkten Vergleich wurden zwei Versuche durchgeführt : Beispiel 3a : Basische Wäsche und Zwischenwäsche bei : Raumtemperatur.

Beispiel 3b : Basische Wäsche und Zwischenwäsche Wäsche bei 0 °C.

Alle anderen Schritte erfolgten im Standardverfahren wie oben für das in der WO 98/08526 beschriebene Verfahren oder in den Beispielen 1 und 2 angegeben.

Versuchseraebnisse Die Tabelle III gibt die Versuchsparameter und Versuchsergeb- nisse bei Raumtemperatur und mit Temperierung auf 0 °C wie- der.

Die Versuchsergebnisse lassen deutlich erkennen, dass a) die basische Wäsche, d. h. die Kresolentfernung, durch die Temperaturabsenkung auf 0 °C nicht beeinträchtigt wird. Die Abtrennung von Kresol verläuft quantitativ.

Die Tabelle III gibt einen Überblick. b) die Hormonverluste während der Zwischenwäsche durch die Temperaturerniedrigung um ca. 50 % reduziert werden. Die Tabelle II gibt einen Überblick. Tabelle II Hormonverluste und deren Minimierung durch Zwischenwäsche bei 0 °C Beispiel Nr. 3a 3b Raumtemperatur Eiswasser (T = ca. 25 °C) (T = ca. 0 °C) Estron 2, 7 Gew.-% 1,8 Gew.-% Equilin 3, 4 Gew.-% 1, 4 Gew.-% Die Aufgabe von auf etwa 0 °C temperierter Natronlauge wäh- rend der basischen Wäsche bietet damit eine einfache Möglich- keit, ohne Beeinträchtigung der Kresolabtrennung die Hormon- verluste der Zwischenwäsche durch Arbeiten bei etwa 0 °C e- benfalls zu senken.

Die Absenkung der Temperatur während der Zwischenwäsche auf ca. 0 °C ermöglicht eine Minimierung, d. h. Verminderung der durch die zusätzliche Zwischenwäsche unvermeidlichen Hormon- verluste um bis zu etwa 50 %.

Die Säulentemperierung während der Zwischenwäsche kann auf einfache Weise erreicht werden, wenn die vor der Zwischenwä- sche durchgeführte basische Wäsche ebenfalls bei ca. 0 °C ab- läuft. Die bei der basischen Wäsche stattfindende Kreso- labtrennung wird durch die Temperaturerniedrigung nicht nega- tiv beeinflußt.

Tabelle III Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens bei Raumtempe- ratur und unter Kühlung Beispiel Nr. 3a 3b Raumtemperatur Eiswasser (T = ca. 25 °C) (T = ca. 0 °C) Verfahrensschritt a) : Ausgangs-PMU Estron mg/1 64, 9 65 4 Equilin mg/1 57,9 57,6 Kresol mg/l 329,0 333,0 Verfahrensschritt b) : Waschwasser = wässrige NaOH-Lösung pH 13 pH 13 Waschfraktion 1 : Estron mg/1 4, 4 1, 7 Equilin mg/1 0, 0 1, 6 Kresol mg/1 55, 1 51, 6 Waschfraktion 2 : Estron mg/1 28,8 27,9 Equilin mg/1 31, 5 24, 8 Kresol mg/1 6942,5 7011,0 Waschfraktion 3 : Estron mg/1 0,0 0,0 Equilin mg/l 11, 5. 18, 3 Kresol mg/1 2215, 2 2774, 0 Waschfraktion 4 : Estron mg/l 0, 0 0, 6 Equilin mg/l 0,0 3,2 Kresol mg/l 280,6 268,6 Waschfraktion 5 : 0, 0 0,0 Estron mg/l 0, 0 0,0 Equilin mg/l 76,6 44,1 Kresol mg/l Hormonverluste Waschfraktion 1-5 Estron 1, 5 % 1,3 % Equilin 2,1 % 2,4 % Zwischenwäsche : Waschwasser = Wasser Waschfraktion 1 : Estron mg/1 0,0 0,0 Equilin mg/1 0,0 0,0 Kresol mg/1 22,8 19,4 Waschfraktion 2 : Estron mg/1 13,3 8,2 Equilin mg/1 9,7 5,9 Kresol mg/1 33,2 11,8 Waschfraktion 3 : Estron mg/1 48,0 32,0 Equilin mg/1 58,3 23,3 Kresol mg/1 76,0 0,0 Hormonverluste Waschfraktion 1-3 Estron 2,7 % 1,8 % Equilin 3,4 % 1,4 % Verfahrensschritt c) : Ethanol/Wasser Ethanol/Wasser Elutionsflüssigkeit 30 : 70 30 : 70 Elutionstemperatur 45 °C 45 °C Eluatfraktion 1 : Gewichts-% TS 0,2 0,2 Estron mg/1 (Gew.-% TS) 76,0 (3,80) 58,0 (2,90) Equilin mg/1 (Gew.-% TS) 65,8 (3,29) 48,2 (2,41) Eluatfraktion 2 : Gewichts-% TS 1,0 0,9 Estron mg/1 (Gew.-% TS) 1237,0 (12,37) 1145,6 (12,73) Equilin mg/1 (Gew.-% TS) 1093,8 (10,94) 1135,0 (12,61) Eluatfraktion 3 : Gewichts-%-TS 0,4 0,5 Estron mg/1 (Gew.-% TS) 607,8 (15,20) 840,0 (16,80) Equilin mg/l (Gew.-% TS) 524,7 (13,12) 748,4 (14,97) Eluatfraktion 4 : Gewichts-%-TS 0,1 0,1 Estron mg/l (Gew.-% TS) 84,6 (8,46) 144,6 (14,46) Equilin mg/1 (Gew.-% TS) 58,2 (5,82) 107,4 (10, 74) Kresol mg/1 (Gew.-% TS) 0,0 (0,00) 0,0 (0,00) Eluatfraktion 5 : 0,1 0,1 Gewichts-%-TS 21,1 (2,11) 34,3 (3,43) Estron mg/1 (Gew.-% TS) 7,5 (0,75) 17,9 (1,79) Equilin mg/1 (Gew.-% TS) Eluatfraktion 6 : 9,0 15,2 Estron mg/1 0,0 3,4 Equilin mg/1 Beispiel 4 (Verminderung des Gehaltes an freien Hormonen) : Gemäß den Verfahrensweisen der vorhergehenden Beispiele 1 bis 3 wurde untersucht, wie sich der Gehalt an freien Hormonen bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens vermindert.

Die Ergebnisse sind in den nachfolgenden Tabelle IV a Ver- gleichsversuche ohne Zwischenwäsche) und IV b (erfindungsgemä- ße Versuche mit Zwischenwäsche) dargestellt.

Tabelle IV Minimierung der freien Hormone : Tabelle IV a Vergleichsversuche ohne Zwischenwäsche Gehalt an freien Gesamtgehalt Estrogenen im Konzent-an konjugierten Estro- rat genen bezogen auf den Trockensubstanzgehalt im Konzentrat (Gew. -%) (Gew.-%) Versuch 1 3,21 3,2 Versuch 2 3, 67 4, 4 Versuch 3 2, 38 9, 2 Versuch 4 4,14 12,2 Versuch 5 4, 03 9, 9 Tabelle IV b Versuche mit Zwischenwäsche (erfindungsgemäß) Gehalt an freien Gesamtgehalt Estrogenen im Konzent-an konjugierten Estro- rat genen bezogen auf den Trockensubstanzgehalt im Konzentrat (Gew.-%) (Gew.-%) Versuch 6 0, 0 25, 2 Versuch 7 0, 77 17, 2 Versuch 8 0, 35 23, 9 Versuch 9 0, 20 29, 3 Versuch 10 0, 0 27, 7