Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung von Precursor Z zur Herstellung eines Mittels zur Therapie humaner Molyb- däncofaktor-Defizienz und assoziierter Krankheiten, die di- rekt oder indirekt auf eine veränderte Molybdäncofaktor- Synthese zurückzuführen sind.

Der Molybdäncofaktor (Moco), eine hochkonservierte, Molybdän (Mo)-koordinierende Pterin-Verbindung, ist für die Aktivität von allen Mo-Enzymen mit Ausnahme von Nitrogenase notwendig.

Der Moco wird in einem einzigartigen und evolutionär altem mehrschrittigem Syntheseweg hergestellt, aus dem bisher zwei Intermediate identifiziert wurden : das Schwefel-und Metall- freie Pterinderivat Precursor Z und Molybdopterin (MPT), ein Pterin mit einer En-Dithiol-Funktion, die für die Mo-Bindung essenziell ist. Letztere Pterin-Komponente bildet vermutlich ein Pyronapterin ähnlich dem Moco, der in Kristallstrukturen von Mo-Enzymen gefunden wurde. MPT koordiniert ebenso Wolfram (W) in W-abhängigen Enzymen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Gewinnung des Molybdopterin-Derivats Precursor Z zur Verfü- gung zu stellen.

Diese Aufgabe wird in Verbindung mit dem Oberbegriff des An- spruches 1 dadurch gelöst, dass in Wirtsorganismen durch re- kombinante Expression von Precursor Z-synthetisierenden Pro- teinen eine Überproduktion von Precursor Z erfolgt.

Dadurch ist es möglich Precursor Z in einer ausreichenden Menge zur weiteren Verwendung zur Verfügung zu stellen.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird als Wirtsorganismus ein Bakterienstamm, z. Bsp. Bakterium E. co- li, genutzt, der Precursor Z aufgrund eines Defektes in der Umwandlung zu Molybdopterin (MPT) anreichert.

Im Wirtsorganismus erfolgt dabei eine gleichzeitige rekombi- nante Expression der bakteriellen Proteine MoaA und MOaC oder ihrer Homologen im Wirtsorganismus mit einem Defekt in einem zweiten Schritt der Molybdäncofaktor (Moco) Biosynthese.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfin- dung erfolgt die Kultur der Wirtsorganismen unter anaeroben Bedingungen, bei niedrigen Temperaturen und geringen IPTG- Induktorkonzentrationen. Günstig sind dabei Temperaturen von unter 20° C.

Der Precursor Z weist C1oH14NsO8P als Molekülformel auf und stellt ein Pyranopterin dar und trägt ein geminales Diol in der Seitenkette.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der Precursor Z chromatographisch gereinigt und anschließend konzentriert. Dabei wird der Precursor Z durch eine saure Ex- traktion aus den Wirtsorganismen isoliert und nachfolgend auf einer HPLC Reverse-Phase Säule mit Citratpuffer chroma- tographisch aufgetrennt.

Nach einer weiteren Ausführungsform werden Precursor Z- enthaltende Fraktionen in einem weiteren Schritt an einer HPLC Anionenaustausch-Säule (SAX) chromatographiert und an- schließend an einer Reverse-Phase/Anionenaustauscher Säule konzentriert.

Ersatztherapien für Erbkrankheiten, einschliesslich Methoden zum Ersatz von Enzymen, sind häufig durch die begrenzte Ver- fügbarkeit des erforderlichen therapeutischen Wirkstoffes be- schränkt.

Molybdän-Cofaktor- (Moco-) Defizienz ist eine pleiotrope gene- tische Fehlfunktion, die sich durch den Ausfall der molybdän- abhängigen Enzyme Sulfit-Oxidase, Xanthin-Oxidoreduktase und Aldehyd-Oxidase aufgrund von Mutationen in Moco-Biosynthese- Genen auszeichnet. Ein Intermediat dieses Biosynthese-Weges, "Precursor Z", ist stabiler als der Cofaktor selbst und be- sitzt eine konservierte Struktur in allen Organismenreichen.

Aus diesem Grund wurde die Substanz im Bakterium E. coli pro- duziert, gereinigt und zur Behandlung von Precursor Z- defizienten"Knock-out"-Mäusen verwendet, die in ihrem Krank- heitsbild dem der humanen Cofaktor-Defizienz entsprechen.

Precursor Z-behandelte Mäuse erreichen das Erwachsenen- Stadium und sind fortpflanzungsfähig. Biochemische und mor- phologische Analysen sowie Untersuchungen des Verhaltens ge- ben Grund zur Annahme, dass die beschriebene Behandlung zur Abschwächung der meisten Symptome humaner Moco-Defizienz ge- eignet ist.

Alle Molybdän (Mo) enthaltenden Enzyme von Menschen, Tieren, Pflanzen, Archaea und Bakterien, mit der prokaryotischen Nitrogenase als einziger Ausnahme, benötigen einen Cofaktor, der aus einem organischen Gerüst, dem so genannten Molybdop- terin (MPT), und Molybdän zusammengesetzt ist3l. Dieser ein- zigartige und"universelle"Molybdän-Cofaktor (Moco) besitzt in allen phylogenetischen Gruppen die gleiche Grundstruktur und ist in freier Form sehr instabil, insbesondere unter ae- roben Bedingungen, sofern er nicht an ein Apo-Protein gebun- den ist32. Der mehrstufige Biosyntheseweg, über den ein Gua- nosin-Derivat in aktiven Moco umgewandelt wird, ist evolutio- när konserviertB1 und die entsprechenden, an der Moco- Synthese beteiligten Proteine verschiedener Organismen sind extrem homologB3-B7. Ein durch Mutation bedingter Defekt in der Moco-Biosynthese führt zum simultanen Ausfall der Aktivi-

täten aller Mo-Enzyme, einschliesslich der Sulfit- OxidaseB8B9. Humane Moco-Defizienz ist eine schwere, autoso- mal-rezessive genetische Störung, die klinisch von der weni- ger häufig auftretenden Sulfit-Oxidase Defizienz nicht zu un- terscheiden istBl0-3l2. Obwohl einige weniger schwere Fälle be- kannt sind3, weisen die meisten betroffenen Patienten neuro- nale Abnormitäten wie nicht behandelbare Anfälle und Fehlent- wicklungen des Gehirnes auf, was auf die Toxizität von Sul- fit, einen Mangel an Sulfat bzw. beides zurückzuführen ist.

Bis zum heutigen Tag ist keine wirkungsvolle Therapie verfüg- bar, weshalb entsprechende Patienten in der Regel in früher Kindheit versterbenB14.

Die ersten eukaryotischen Gene der Moco-Biosynthese, die iso- liert werden konnten, stammten aus der Pflanze Arabidopsis thalianaBl5. Eine Suche nach homologen Sequenzen führte zur Identifikation des ersten humanen Gens der Moco-Biosynthese, MOCS1B3. Die Genprodukte MOCS1A und MOCS1B, deren Expression ein kompliziertes Muster von alternativem Spleissen beinhal- tetBl6 Bl8t wandeln ein Guanosin-Derivat in den schwefelfreien Precursor Z um, der bereits über die einzigartige, aus vier C-Atomen bestehende Seitenkette des MPT verfügtBl9. Mutationen im MOCS1-Gen wurden bei zwei Drittel der Moco-defizienten Pa- tienten festgestellt, welche die Komplementationsgruppe A bzw. den Moco-Defizienz Typ A darstellenB10,B20. In einem nach- folgenden Schritt wird Precursor Z zu MPT umgewandelt ; dies geschieht durch ein Enzym, das vom MOCS2-Gen codiert und vom MOCS3-Genprodukt aktiviert wird Die Mehrzahl der Typ B- Patienten weist MOCS2-Mutationen aufB12,B13,B21. Schließlich wird Mo durch das multifunktionale Protein Gephyrin auf MPT übertragenB5. Bis jetzt wurde erst eine Familie mit Mutatio- nen im Gephyrin-Gen (GEPH) beschrieben, die zu Moco-Defizienz (Typ C) führten Als Folge von Mutationen in unterschiedlichen Schritten der Moco-Biosynthese wurde herausgefunden, dass Fibroblasten von Typ B-Patienten Precursor Z anreichern und in das Kulturmedi- um abgeben ; dieser kann von Typ A-Zellen im Zuge einer Co-

Kultivierung aufgenommen werden, was zur Wiederherstellung der Mo-Enzymaktivitäten in vivo führte20. Weiterhin konnte nachgewiesen werden, dass Precursor Z aus menschlichen Fibroblasten mit dem bakteriellen Precursor identisch iStB23, B24, da dessen Biosynthese bei allen Organismen konser- viert er folgtB15-B17.

Weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Mittel zur Therapie humaner Molybdäncofaktor-Defizienz und assoziierter Krankhei- ten, die direkt oder indirekt auf eine veränderte Molybdänco- faktor-Synthese zurückzuführen sind, bereitzustellen.

Diese Aufgabe wird in Verbindung mit dem Oberbegriff des An- spruches 12 dadurch gelöst, dass als wesentlicher Bestandteil dieses Mittels Precursor Z verwendet wird.

Damit ist es erstmals möglich, ein Mittel zur Therapie huma- ner Molybdäncofaktor-Defizienz und assoziierter Krankheiten, die direkt oder indirekt auf eine veränderte Molybdäncofak- tor-Synthese zurückzuführen sind, bereitzustellen Es wird die Gewinnung eines Pterin-Intermediates aus Bakte- rien, das erfolgreich zur Therapie einer bislang unheilbaren und tödlichen Krankheit eingesetzt wurde, beschrieben.

Weitere Einzelheiten der Erfindung ergeben sich aus der nach- folgenden ausführlichen Beschreibung und den beigefügten Zeichnungen, in denen bevorzugte Ausführungsformen der Erfin- dung beispielsweise veranschaulicht sind.

In den Zeichnungen zeigen : Figur 1 : Allgemeines Schema der Moco-Biosynthese. Die Struk- turen von Moco (wie in der Kristallstruktur von Mo-Enzymen gefunden) und des Precursor Z-Oxidationsprodukts Compound Z (14,15) sind gezeigt. Nummerierung ist dargestellt und ver-

wendet wie in Standard-Pterin-Nummerierungsschemata, Diskus- sion siehe (12).

Figur 2 : ESI-MS von Precursor Z. A, MS-Spektrum des gereinig- ten Precursor Z und strukturelle Zuordnung der wesentlichen molekularen Ionen. B, MS/MS-Spektrum des Hauptpeaks bei 364 Da, der in (A) gezeigt wird und strukturelle Zuordnung der Hauptfragment-Ionen. Die Spektren wurden im positiven Ionen- modus aufgenommen. Deshalb sind alle dargestellten Molekül- oder Fragmentionen als neutrale Moleküle und nicht im [M+H] + -Modus wie in den Spektren gezeigt.

Figur 3 : lH-NMR-und Korrelations-Spektroskopie bei 300 K von Precursor Z (A), von teilweise oxidiertem Precursor Z (B) und seinem stabilen Oxidationsprodukt Compound Z (C). A-C, Das 1D-1H-NMR-Spektrum von Precursor Z wurde aufgenommen mit 150 pg Probe, in 700 pl D2O gelöst und auf pH 1 angesäuert durch Zugabe von 2 pl DC1 36%. Die Messungen wurden nach partieller (14 Stunden, B) und vollständiger Oxidation (14 Tage, C) wie- derholt. Die relevanten Bereiche von allen drei Spektren sind dargestellt. Bemerkung : Ein Doublet von Triplet-Signalen von Hb'in Coumpound Z liegt unter dem Hintergrundsignal von Was- ser bei 300 K, aber es ist bei 315 K deutlich sichtbar (verl- geiche 5,0-5, 1 ppm in C). D, 2D-COSY-1H-NMR-Spektrum der teilweise oxidierten Precursor Z-Probe aus (B). E, Struktur des Precursor Z wie sie durch ESI-MS-und'H-NMR- Spektroskopie sowie durch die Struktur des Oxidationsprodukts Compound Z bestimmt wurde. Die. Benennung der Protonen ist die gleiche wie in A (Precursor Z) und C (Compound Z) sowie in Tabelle 1 und im Text. Compound Z-Protonen sind mit einem Strich markiert, um sie von denen des Precursor Z zu unter- scheiden.

Figur 4 : HPLC-Reinigung von Precursor Z aus E. coli MJ7 chlM (DE3) 37 Zellen, die pPH15moaA und pPHLysmoaC enthielten. (a) Elutionsprofil von einer präparativen C8 Säule. (b) Eluti- onsprofil von einer SAX Säule. (c) Elutionsprofil von einer analytischen C18 Säule. Details siehe Methoden.

Figur 5 : Gereinigter Precursor Z ist unter physiologischen Bedingungen stabil. (a) Oxidation von Precursor Z zu Compound Z. (b) UV-VIS Absorptionsspektren von 22 pM Precursor Z nach Inkubation von 17 h bei Raumtemperatur in 2x PBS-Puffer (pH 6,9). Die Spektren wurden in Zeitintervallen nach Verdünnung in Puffer aufgenommen wie angegeben. (c). Kinetische Analyse der Oxidation von Precursor Z durch Aufnahme der Absorption bei 350 nm aus den in (b) gezeigten Spektren.

Figur 6 : Wiederherstellung der MPT-Biosynthese in vitro und in vivo. (a) In vitro Wiederherstellung von MOCS1-defizienten Leberextrakten mit Precursor Z. Protein-Rohextrakt einer fünf Tage alten MOCS1 ~/~ Maus wurde inkubiert (1 h) mit den ange- gebenen Mengen von gereinigtem Precursor Z pro mg Protein.

Wiederherstellung der MPT-Synthese wurde mittels nit-1 Re- konstitutionsassay gemessen. (b-d) Biochemische Analyse von Precursor Z-behandelten MOCS1-defizienten Tieren. Den Mäusen wurden zweimal wöchentlich zunehmende Mengen von Precursor Z injiziert, beginnend mit 2 jug nach der Geburt bis zu 8 pg nach der Entwöhnung. Zwischen, den Tagen 25-55 nach der Geburt wurde die Behandlung gestoppt. An den Tagen 0 (4 Stunden nach der letzten Injektion), 1, 4 und 7 wurden jeweils zwei Mäuse getötet. Zwei Leberproben jedes Tieres wurden entnommen und getrennt weiterbearbeitet. Jeder Wert in der Figur wurde so- mit vierfach bestimmt. Gesamt-MPT einschließlich Moco (b), Sulfit-Oxidase Aktivität (c) und Xanthin-Dehydrogenase (d) sind angegeben als Prozentsatz der entsprechenden Wildtyp- Werte (n=4).

Figur 7 : Lernfähigkeit von Precursor Z-behandelten MOCS1- defizienten Mäusen in einem Wasserlabyrinth. Die Werte stel- len einen Durchschnitt von sechs Wildtyp- (wt, schwarze Bal- ken) und sechs Precursor Z-behandelten MOCS1-defizienten Mäu- sen (MOCS1/, weisse Balken) dar. Die Balken zeigen die Zeit bis zum Erreichen der Plattform im ersten Versuch des ersten Durchgangs (A1), die verbleibenden drei Versuche des ersten Durchgangs (A2-4), den ersten Versuch des zweiten Durchgangs

(B1) und schließlich die folgenden drei Versuche des zweiten Durchgangs (B2-4). C, Zeit (von insgesamt 120 Sekunden), die im richtigen Sektor (ohne Plattform) verbracht wurde, der in den Durchgängen A und B die.

Figur 8 : Morphologischer Vergleich von Nieren- (a, b) und Ge- hirnabschnitten (c, d) von Wildtyp- (a, c) und Precursor Z- behandelten MOCS1-defizienten Mäusen (b, d). Behandelt wurde mit 2-4 Hg jeden dritten Tag. (a) Reguläre Niere mit normalem Glomerulus (Pfeil), charakteristisch ausgebildeten Tubuli und dünnem Interstitium (200x). (b) Bei behandelten MOCS1- defizienten Mäusen enthielten die Nieren zahlreiche Steine in den Tubuli (D) bei atrophen Epithelien und Ausbildung von vielkernigen Riesenzellen (Q). Proximale Tubuli waren erwei- tert (28 +/-19 %). Das Interstitium wies eine Vergrößerung der Matrix (13 +/-13 %) und eine unspezifische Infiltrierung mit einkernigen Zellen auf. Der Glomerulus ist normal (Pfeil). (c, d) Entsprechende coronale Gehirnabschnitte (Cx, Cortex ; Hi, Hippocampus ; Str, Striatum ; Th, Thalamus ; Hy, Hy- pothalamus) von Wildtyp- (c) und Precursor Z-behandelten MOCS1--Mäusen (d).

Spektroskopische Charakterisierung und Strukturaufklärung des gereinigten Precursor Z Hochauflösende Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (ESI-MS) erforderte ein [M+H] +-Ion, welches zur Molekülfor- mel C1oHl5N508P kompatibel war. Danach erlaubte die 1H-NMR- Spektroskopie nicht nur die strukturelle Charakterisierung des Moleküls, sondern bestätigt auch, dass dieses Intermedi- at direkter Oxidierung zum bereits früher gut charakterisier- ten, nicht-produktiven Folgeprodukt Compound Z unterliegt.

Die chemische 1H-Verschiebung und die Daten der Kopplungskon- stanten stimmen nicht mit früheren Strukturmodellen überein und deuten an, dass Precursor Z bereits als Pyranopterin- System besteht sowie eine zweifache Diol-Funktion in der C1'- Position besitzt.

Der Molybdäncofaktor (Moco) ist Teil des aktiven Zentrums al- ler Mo-abhängigen Enzyme (1) außer Nitrogenase, und spielt eine wichtige Rolle in den globalen Kohlenstoff-Schwefel- und Stickstoffkreisläufen (2). Mo-Enzyme sind wichtig für di- verse metabolische Prozesse wie z. B. Schwefelentgiftung und Purinkatabolismus in Säugetieren (3) sowie Stickstoffassimi- lierung und Phytohormonsynthese in Pflanzen (4). Der Moco be- steht aus einem organischen Teil, der ursprünglich Molybdop- terin genannt wurde (5), einem Pyranopterin mit einer termi- nalen Phosphatgruppe sowie einem Mo-Atom, das über ein En- Dithiol-System gebunden ist (6) (Fig. 1). In allen bisher un- tersuchten Organismen wird der Moco über einen alten und hochkonservierten Syntheseweg produziert (7). Bei Menschen resultiert eine Mutation in irgendeinem Schritt der Moco- Biosynthese im pleiotropen Ausfall der Aktivitäten von Sulfi- toxidase, Aldehydoxidase und Xanthinoxidoreduktase (8,9). Be- troffene Patienten weisen neurologische Anormalitäten auf und sterben in früher Kindheit, da. bislang keine Therapie vorhan- den ist (10). Zusätzlich enthalten viele Prokaryoten, haupt- sächlich Archaea, Metallenzyme ähnlichen Pyranopterin-En- Dithiolat-Cofaktor, der W statt Mo koordiniert. Deshalb wird die grundlegende Pyranopterinkomponente von Mo-und W-Enzymen als MPT abgekürzt, welches für MolybdoPTerin oder Metall- bindendes Pyranopterin-DiThiolen steht (11, 12). Es wird eben- so vermutet, dass die W-Cofaktor-Biosynthese der Moco- Biosynthese ähnlich ist, den finalen Schritt der Metallinser- tion ausgenommen (7).

Die Moco-Biosynthese (Fig. 1) kann in drei Schritte unter- teilt werden (7,13). Zuerst wird der Schwefel-freie Precursor Z aus einem Guanosinderivat durch die Aktion von zwei Protei- nen (14,15) synthetisiert. Im zweiten Schritt wird Precursor Z durch den Einbau von zwei Schwefelatomen an den C1'-und C2'-Positionen zu MPT umgewandelt (siehe neue Nummerierung in Fig. 1), wodurch eine En-Dithiol-Funktion gebildet wird (16).

Diese Reaktion wird von der heterotetrameren MPT-Synthase ka- talysiert (17), die zwei Schwefelatome von zwei thiocarboxy- lierten kleinen Untereinheiten auf die Kohlenstoffatome C1'

und C2'überträgt (18,19). Im letzten Schritt der Moco- Biosynthese wird ein Mo-Atom auf ein (Pro-und Eükaryoten) oder zwei (Prokaryoten) MPT-Dithiolengruppen übertragen, was zur Bildung des Moco führt (20,21). In Bakterien wurde eine zusätzliche Modifizierung des Pterinphosphats durch Anhängen eines Nukleotids beobachtet (22). Die grundlegende chemische Struktur des Moco wurde durch die Pionierarbeit von Rajagopa- lan und Mitarbeitern (13,23) aufgeklärt. Ihre letzte Be- schreibung des Moco wurde durch die Kristallstrukturen von Mo- (24) und W-haltigen Enzymen aufgeklärt (25), bei denen ein nicht vorhergesehener zusätzlicher Pyranoring entdeckt wurde, der zwischen der Hydroxylgruppe des C3'-Atoms und der C7-Position des Pterins gebildet wird (Fig. 1). Basierend auf dieser Beobachtung wurde vermutet, dass der Pyranoring entwe- der bereits in den Intermediaten vorhanden ist (12, 18, 26), oder dass er während der Insertion in das Apoenzym gebildet wird (27). Bisher wurde weder MPT noch Precursor Z mittels 1H-oder 13C-NMR-Spektroskopie untersucht. oder kristallisiert.

Deshalb bleibt die Frage offen, ob die Pterin-Seitenkette be- reits in einem frühen Schritt der Moco-Biosynthese eine Pyra- nopterinstruktur bildet oder nicht.

Das Strukturmodell von Precursor Z wurde basierend auf der Struktur des Oxidationsprodukts (28), auf 31P-NMR- Spektroskopie, auf Massenspektrometrie (MS) sowie Oxidations- studien aufgestellt (14). Die direkte stöchiometrische Kon- version von Precursor Z durch eine Zwei-Elektronen-Oxidation zum stabilen Oxidationsprodukt Compound Z implizierte einen Dihydro-Zustand von Precursor Z, der durch eine chinonoide Struktur und eine Enol-Funktion in Cl'erklärt wurde, welche einer Keto-Enol-Tautomerisierung unterliegen könnte (14).

Precursor Z ist ebenso wie Compound Z schwe, felfrei und ent- hält ein zyklisches Phosphat, das C2'und C4'verbindet. Im Vergleich zu MPT und Moco ist Precursor Z das stabilste In- termediat mit einer geschätzten Halbwertzeit von einigen Stunden bei niedrigem pH-Wert (14).

Deshalb haben wir eine Methode für die Reinigung großer Men- gen Precursor Z aus E. coli etabliert. Wir berichten von einer detaillierten spektroskopischen Analyse und strukturellen Charakterisierung des Precursor Z. Durch 1H-NMR-und MS- Methoden zeigen wir, dass Precursor Z bereits eine vollstän- dig reduzierte Pyranopterinstruktur besitzt und vorrangig an der C1'-Position hydriert ist, was zu einem zweifachen Diol führt.

Chemikalien NaCl, Hefe, Trypton und Isopropylthiogalactosid stammen von Duchefa Biochemie, Ammoniumacetat von Merck, Zitronensäure- Monohydrat und Natriumcitrat-Dihydrat von Baker, Ameisensäure von Sigma, D20 und DCl waren, von Deutero GmbH und NaOD von der Fluka AG.

Konstruktion der Plasmide für die Coexpression von MoaA und MoaC E. coli moaA und moaC wurden mittels PCR aus pJR11 kloniert (29). Die veröffentlichte Gensequenz (30) wurde für die Her- stellung von Oligonukleotiden genutzt, die die Klonierung in die Nde I-und Xho I-Schnittstellen der Klonierungsregion des pET15b-Expressionsvektors (Novagen) ermöglichten. Die ent- standenen Plasmide wurden pPH15moaA und pPH15moaC genannt.

Die vollständige moaC-Expressionseinheit inklusive des IPTG- regulierten T7-Promotor/Operator-Elements und der syntheti- schen Ribosomen-Bindungsstelle von pPHl5moaC wurde anschlie- ßend in die Sph I-und Hind III-Schnittstellen von pLysS (No- vagen) subkloniert, woraus der pPHLysmoaC entstand.

Isolierung und Reinigung von Precursor Z Precursor Z wurde aus E. coli mittels eines modifizierten Protokolls gereinigt, das bereits beschrieben wurde (14). MJ7 c1M (DE3) -Zellen (31), die die Plasmide pPH15moaA und pPHLys- moaC enthielten, wurde anaerob bei 20°C in LB-Medium mit 120 Hg/ml Ampizillin, 30 pg/ml Chloramphenicol und 50 pM IPTG an- gezogen und mittels Zentrifugation (5 min, 12000 g, 4 °C) ge- erntet. Vor der HPLC-Reinigung wurden die Zellen in zwei Vo-

lumina 0,4 M HCl resuspendiert, sonifiziert und zentrifu- giert. Um etwaige Modifikationen nachzuweisen, die durch die Azidifizierung der Zellen entstehen könnten, wurden die Zel- len in einem Kontrollexperiment in 100 mM Acetat-Puffer (pH 3,0) extrahiert. Der klare Überstand wurde auf eine semi- präparative"Reversed-Phase"-Säule (C8,5 µm, 250*10 mm, Kro- masil, EKA Chemicals) gegeben, die in 5 mM Ammoniunacetat, pH 5,0, äquilibriert worden war. Precursor Z eluierte im ersten Absorptionmaximum und wurde sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren. Im zweiten Schritt wurden die Precursor Z- haltigen Fraktionen vereinigt und auf eine semi-präparative SAX-Säule (15 pm, 250 x 10 mm, Adsorbosphere, Alltech) gege- ben, die in 10 mM Citratpuffer, pH 3,0, äquilibriert worden war. Precursor Z wurde nach etwa 30 ml isokratisch eluiert und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Eine abschließende Reinigung wurde durch das Auftragen von Precursor Z auf eine analytische"Reversed-Phase"-Säule (C18, 5 pm, 250 x 4 mm, Alltech), äquilibriert in 10 mM Ameisensäure, erzielt. Pre- cursor Z-haltige Fraktionen wurden vereinigt, in 20 µl Ali- quots in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zum weite- ren Gebrauch bei-80°C gelagert. Konzentrationen von Precur- sor Z wurde über den Extinktionskoeffizienten 2267nom = 8960 M cm~1 (14) bestimmt.

Elektrospray-Massenspektrometrie Precursor Z wurde in einem 1 : 1 (Vol : Vol) Methanol/1% Amei- sensäure-Gemisch gelöst. Etwa 3 µl dieser Lösung (Endkon- zentration ca. 20 pmol/jul) wurden in eine Gold-beschichtete Nanospray-Kapillare (Protana) gegeben. Die Spitze der Kapil- lare wurde senkrecht vor die Eintrittsöffnung eines"quadru- pole-time-of-flight" (QTOF 2)-Massenspektrometer (Micromass) platziert, das mit einer Nanospray-Ionenquelle ausgestattet war, und es wurde eine Spannung von etwa 1000 V angelegt. Für Kollisions-induzierte Dissoziationsexperimente wurden Paren- tal-Ionen selektiv vom Quadrupol-Massenanalysator in die Kol- lisionszelle transmittiert. Als Kollisionsgas wurde Argon ge- nutzt, und die kinetische Energie wurde auf etwa-25 eV fest- gelegt. Die resultierenden Schwester Ionen wurden anschlie-

ßend durch den orthogonalen"time-of-flight"-Massenanalysator aufgetrennt. Die isotopische Zusammensetzung der Probe wurde im akkuraten Massenmodus bestimmt, der Reserpin ([M+H] + = 609.2811 Da) als internes Referenzmolekül verwendet.

1H-NMR-Spektroskopie Ein- (1D) und zweidimensionale (2D) 1H-NMR- Korrelationsspektren (COSY) wurden bei 300 K mit einem Bruker Avance DMX600 NMR-Spektrometer aufgenommen, der an die über- wiegende Resonanz von Deuterium aus dem Lösungsmittel D20 ge- bunden ist. Chemische Verschiebungen sind in ppm relativ zum Hintergrundsignal des Lösungsmittels (4. 80 ppm) angegeben und Kopplungen in Hz. Precursor Z-haltige Proben (100-200 pg) wurden gefriergetrocknet und in 700 pl entgastem D20 und 2 pl DC1 36% resuspendiert. Zur Vermeidung von Oxidation wurde das Röhrchen für 5 min mit Stickstoffgas begast. Diese Lösungen waren stabil genug für die Aufnahme von sowohl 1D-als auch 2D-COSY-Spektren. Anschließendes Exponieren der Lösung an Luft verursachte die Oxidation des Precursor Z zum gut be- schriebenen Haupt-Einzelprodukt, Compound Z, und diese Reak- tion wurde in regelmäßigen Intervallen durch die Aufnahme von 1D-1H-Spektren verfolgt. Unter normalen Bedingungen ist die- se Reaktion nach 14 Tagen in DsO und DC1 abgeschlossen.

Ergebnisse Isolierung und Reinigung von Precursor Z Precursor Z wurde aus E. coli isoliert und in einer dreischrittigen HPLC-Chromatographie-Prozedur gereinigt, mit der ein homogenes Produkt erzielt wurde, welches durch UV-Vis (Daten nicht gezeigt), ESI-MS und 1H-NMR-Spektroskopie (siehe unten) nachgewiesen wurde. Durchschnittlich wurde ein Ertrag von 40 pg Precursor Z pro Liter E. coli-Kultur erzielt. Das isolierte Molekül war identisch mit früheren Präparationen (12), da es das gleiche UV-Vis-Absorptionsspektrum mit einem Absorptionsmaximum bei 267 nm bei pH 3,0 aufwies und nach Aussetzung an Luft das gleiche, eindeutig eindeutig charakte- risierte Oxidationsprodukt, Compound Z, zur Folge hatte.

ESI-MS von Precursor Z ESI-MS wurde angewendet, um die Molekülmasse des Precursor Z zu bestimmen. Im positive Ionenmodus ergab die ESI-MS ein [M+H] + Ion bei 364 Da (Fig. 2A), welches 18 Da größer war als die erwartete Masse von 346 Da der früheren Modellstruktur (14). Tatsächlich gab es keinen Hinweis auf einen solchen Peak im Spektrum. Ein weiterer kleiner Peak im Spektrum (Fig.

2A) bei 344 Da entsprach der erwarteten Masse für Compound Z (14), welcher in solchen Proben aufgrund partieller Oxidation unausweichlich vorhanden ist (Fig. 2A). Diese Tatsache wurde auch durch 1H-NMR-Analyse bestätigt (siehe unten). Im Gegen- satz zu früheren Versuchen mit Thermospray oder"fast atom bombardment ionization"konnten wir im positiven Ionenmodus mittels ESI-MS mit 364. 0640. 003 Da (364.0658 Da berechnet für CloHlsN508P) eine genaue Masse für Precursor Z bestimmen.

Dementsprechend ist die Molekülformel von Precursor Z CioHi4N5O8P, was nicht mit der früher postulierten Formel C1oH12N507P übereinstimmt (12). Die neue Formel des 364 Da- Peaks lässt eine Hydratisierung des Precursor Z vermuten, die am wahrscheinlichsten an der C1'-Position stattfindet, für die bereits eine einzelne Hydroxylierungsfunktion mit einer möglichen Keto-Enol-Tautomerisierung vorgeschlagen wurde (14). Die zusätzliche Hydratisierung am C1'würde dann in der Bildung eines zweifachen Diols resultieren (Fig. 2A).

Eine MS/MS des 364 Da-Peaks zeigte ein Hauptfragment bei 166 Da (Fig. 2B), welches einem semi-oxidierten Dihydropterin entspricht und auf die Pterinnatur des Peaks hinweist. Das Dihydropterin kann nach der Öffnung des Pyranorings ohne wei- tere Oxidation einfach gebildet werden (vergleiche mit Moco in Fig. 1). Zwei weitere Peaks wurden bei 121 Da und 199 Da beobachtet, die jeweils den Massen der Seitenkette ohne bzw. mit dem zyklischen Phosphat entsprechen. Beide Massen passen nur für hydrierte Seitenketten-Fragmente, die ein zweifaches Diol in der C1'-Position besitzen. Außerdem ergab MS/MS des 344 Da-Peaks in der hinteren Probe oder in der Probe von ge- reinigtem Compound Z eine ähnliches Schwester Ionen Spektrum mit einem dominierenden Fragment bei 164 Da (Daten nicht ge-

zeigt), welches einem vollständig oxidierten nicht- substituierten Pterin entspricht, das mit MS/MS-Daten von an- deren hydrogenierten Pterinen vergleichbar ist (32).

1H-NMR-Spektroskopie von Precursor Z Um die Struktur des Precursor Z aufzuklären und um unsere Hypothese der Hydratisierung zu festigen, die bei der MS beo- bachtet wurde, nahmen wir 1H-NMR-Spektren in azidifiziertem D20 auf und verfolgten die Änderung der Signalpositionen und -intensitäten während der Oxidation zu Compound Z (Fig. 3A- D). Auf Basis der 1H chemischen Verschiebungen (Fig. 3A-C), der Verbindungen der 2D COSY-Spektren (Fig. 3D) und der Grö- ßenordnung der Kupplungskonstanten wurden alle erwarteten Signale (sechs Protonen, Ha-Hf) eindeutig zugeordnet (Tab.

1). Die 1H chemischen Verschiebungen und Kupplungskonstanten (1H-lH und 31P-lH) des Oxidationsprodukts Compound Z waren vergleichbar mit den veröffentlichten Daten (15,28) und iden- tifizierten diesen zweifelsfrei als Compound Z (Fig. 3C).

Die drei 1H-NMR-Signale der Protonen Ha, Hb, und Hc in Pre- cursor Z sind in Bezug auf die chemischen Verschiebungen so- wie die 1H-lH und 1H-3lP Kupplungskonstanten (Fig. 3 und Tab.

1) vergleichbar mit den Protonen, die im Spektrum von Com- pound Z (Ha', Hb', and Ho") vorhanden sind. Diese drei Proto- nen wurden C4' (Ha und Hb) und C3' (Hc) zugeordnet, und die Größenordnung der benachbarten P-Kupplungen der C4'- Protonen (22.7 bzw. 2.1 Hz) wiesen auf das intakte zyklische Phosphat hin (12). Die größte Verschiebung von Hc unter die- sen drei Protonen deutet signifikante Änderungen in der Umge- bung von C3'an, die durch die Öffnung der vorgeschlagenen Pyranopterin-Ringstruktur in Precursor Z während der Oxidati- on zu Compound Z erklärt werden könnten.

Die Signale der übrigen drei Protonen (Hd, He, and Hf) von Precursor Z weichen signifikant von denen von Compound Z (Hd', He', und Hf', Fig. 3 und Tab. 1) ab. Precursor Z zeigt ein 1.7 Hz-Dublett bei 5.39 ppm (Hf), das mit dem breiten Dublett (breites Signal) bei 3.62 ppm (He) korreliert. Diese beiden Signale gehen allmählich während der Konversion zu Compound Z verloren, während gleichzeitig das Signal bei 9.39

ppm (Hf, Fig. 3A-C) erscheint. Die chemische Verschiebung der Hf-und He-Signale ist vergleichbar mit den wenigen chemisch synthetisierten Pyranopteridinen (33). Unabhängig von den hochaufgelösten ESI-MS-Daten sprechen die Kupplungskonstanten und eine große Differenz in den chemischen Verschiebungen dieser zwei Protonen gegen das frühere Strukturmodell, da sie zu einer Stickstoff-substituierten Methylgruppe gehört hät- ten. Das dritte wichtige Signal zeigt ähnliche benachbarte Kupplungen zu Hc und P sowohl in Precursor Z als auch Com- pound Z, aber verschiebt sich während des Oxidationsprozesses feldabwärts von 4.415 ppm zu 6.32 ppm (Fig. 3 und Tab. 1).

Diese Daten implizieren die gleiche relative Anordnung von Hd im Vergleich zu Hc und P in beiden Verbindungen. Die 1.87 ppm Differenz in der chemischen Verschiebung des Hd Signals favo- sisiert sehr einen signifikanten Wechsel im Substitutenten an C1 zwischen Precursor Z und Compound Z, wodurch die Möglich- keit einer unveränderten Ketofunktion in beiden Komponenten ausgeschlossen wird. Zusätzliche 1H-NMR-Spektren wurden bei verschiedenen pH-Werten (1, 3,7 und 10) aufgenommen ohne signifikante Änderungen in den Protonensignalen von Precursor Z zu beobachten (Daten nicht gezeigt). Die einzige bemerkens- werte Differenz bei höheren pH-Werten war die Verbreiterung der He und Hf Signale, die mit einer schnelleren Oxidierung zu Compound Z einherging. Somit sind die hochauflösenden ESI- MS-und 1H-NMR-Daten für Precursor Z zusammen mit den beo- bachteten Änderungen bei der Oxidation zu Compound nur mit der geschlossenen Pyranopterinstruktur und einem zweifachen Diol in C1' (Fig. 4E) kompatibel.

Tabelle 1. 1H-NMR-Signale von Precursor Z und Compound Z bei pH 1 in D2O / DCl.

1H- Chemische Ver-Kopplungskonstanten COSY Signale schiebungen (Hz) J (1H-1H, 31P- 1H) (ppm) * Precursor Z Ha 4.41 (ddd) 22. 7 (31p) 13 (Hb), 1. 9 Hb, Hc (Hc) Hb 4.51 (dt) 13 (Ha), 2.1 (31P), 2.0 Ha, Hc (Hc) Hc 4.12 (q) (br) 1.9 (Ha), 1.9 (Hb), 1.9 Ha, Hb, (31P), 1.9 (Hd) Hd Hd 4.45 (t) (br) 1. 6 (31 p) 6 (Hc),-0. 8 Hc, He (He) He 3.62 (d) (br) # 1. 7 (Hf), # 0.8 (Hd) Hf, Hd Hf 5. 39 (d) 1.7 (He) He Compound Z Ha'4. 26 (ddd) 22. 7 (31p) 12. 5 (Hb), Hb, Hc 1.9 (Hc) Hb' 4. 4. 80 (dt) 12.5 (Ha), 1. 9 (31P), 1.9 Ha, Hc 4. 97 (dt) at (Hc) 315 K Hc'4. 64 (q) 1.9 (Ha), 1. 9 (Hb), 1.9 Ha, Hb, (31P), 1.9 (Hd) Hd Hd'6. 32 (t) 1.6 (31P), 1.6 (Hc) Hc He' - - - Hf'9. 39 (S) - - *Chemische Verschiebungen bei 300 K aufgenommen, wenn nicht anders ange- geben. Kopplungskonstanten sind in Klammern angegeben : s = Singlet, d = Dublett, t = Triplett, q = Quintett. Breite Peaks sind mit (br) gekenn- zeichnet.

Diskussion

Precursor Z wurde zuerst von Wuebbens und Rajagopalan (14) identifiziert und als Dihydropterin-Struktur mit einer C6- substitutierten Vier-Kohlenstoff-Seitenkette sowie einer Hydroxylfunktion in C1'beschrieben. Basierend auf dem Di- hydro-Zustand und der relativen Stabilität des Precursor Z wurde eine chinonoide Struktur des Precursor Z mit einer mög- lichen Keto-Enol-Tautomerisierung in der Cl'-Positon postu- liert (14). Neue Einblicke in die Struktur des Moco wurden aus den Kristallstukturen der Mo-Enzyme abgeleitet (24,34, 35) und warfen die Frage auf, ob ein nicht-koordiniertes MPT und/oder Precursor Z bereits eine Pyranopterin-Struktur be- sitzen (12). In der hier präsentierten Studie haben wir uns dieser Fragestellung zugewandt und die Seiterikettenstruktur des Precursor Z durch die Anwendung von MS und 1H-NMR- Spektroskopie auf ausreichend große Mengen gereinigten Pre- cursors Z beschrieben und. verifiziert.

Ein Ziel dieser Studie war es, den Oxidationszustand des Pre- cursor Z Pterin-Systems zu etablieren, um seine Rolle im Zu- sammenhang mit dem Biosyntheseweg aufzuklären. Die Beobach- tung von zwei Protonen an C6 (He) und C7 (Hf), welche eine benachbarte Kopplung von 1. 7 Hz (COSY) und eine große chemi- sche Verschiebungsdifferenz zeigen, impliziert, dass Precur- sor Z im Pyrazinring des Pterins vollständig hydriert ist.

Ein Dihydropterin würde eine Doppelbindung entweder zwischen N5 und C6 (7,8-dihydro), C6 und C7 (5,8-dihydro) oder N8 und C7 (5,6-dihydro) erfordern. Im Falle eines 7, 8- oder 5,8- Dihydropterins würde das He-Proton verloren gehen, während für das 5,6-Dihydropterin die Anwesenheit einer Doppelbindung zwischen C7 und N8 wegen des Rückzugseffekts der Doppelbin- dung, wie es schon in anderen Dihydropterinen beobachtet wur- de (36). , in einer substanziellen Verschiebung zu einer Nied- rigfeld-Resonanz des Hf-Signals (-7. 5 ppm) führen würde.

Desweiteren ist die chemische Verschiebungsdifferenz zwischen beiden Pterinprotonen (He and Hf) von 1.77 ppm sehr ähnlich zu denen, die in den wenigen Berichten über chemisch synthe- tisierte Pyranopteridine (He =3. 1 ppm, Hf =4.8 ppm in DMSO) beschrieben wurden (33).

Ebenso war es wichtig festzustellen, ob es eine Doppelbindung zwischen Cl'und C2'gibt, wie sie in MPT und Moco gefunden wurde. Die Präsenz des Precursor Z Signals bei 4.41 ppm (Hd), welcher die gleiche Kopplungspartner wie in Compound Z auf- zeigt, erlaubt die Zuordnung des Protons an der C2'-Position.

Demnach schließt die Präsenz von Protonen an C2'und C6 die Anwesenheit von Doppelbindungen entweder zwischen C6 und C1' (14) oder Cl'und C2' (26) aus. Da die 1H-NMR-Daten nicht auf die Anwesenheit eines Protons an C1'hindeuteten, war es mög- lich, dass eine Carbonylgruppe an Cl'positioniert ist ; ver- gleichbar mit derjenigen in Compound Z (15,28). Sowohl das hochauflösende ESI-MS-Massenspektrum des Precursor Z als auch die große Differenz in der chemischen Verschiebung (1.87 ppm) für das C2'-gebundene Hd-Proton zwischen Precursor Z und Compound Z konnten nicht mit der Aromatisierung des Pterin- rings bedingt durch die Oxidation zu Compound Z erklärt wer- den, sondern erfordern zusätzlich eine Änderung in den Sub- stituenten an C1'durch die Bildung eines zweifachen Diols.

Weil alle 1H-NMR und ESI-MS-Spektren bei sauren pH-Werten von 1-3 aufgenommen wurden, könnte das zweifache Diol das Produkt einer in vitro Hydratisierung sein, die unter sauren Bedin- gungen katalysiert wird. Um festzustellen, ob eine Carbo- nylgruppe unter verschiedenen pH-Bedingungen in einer Gleich- gewichtsreaktion gebildet wird, wurden lH-NMR-Spektren bei verschiedenen pH-Werten (1-10) aufgenommen. Der einzige in den Spektren beobachtbare Unterschied war die Verbreiterung der Signale von He Und Hf, während Hd keine Veränderungen zeigte. Daraus können wir schließen, dass das zweifache Diol bei allen pH-Werten das Hauptprodukt ist. Hydration an der Cl'-Position der Seitenkette scheint eine gemeinsames Merkmal bei Tetrahydropterinen zu sein, da bei einem Intermediat (6- Pyruvoyl-5,6, 7,8-Tetrahydropterin) in der Biosynthese von Tetrahydropterin ein zweifaches Diol an der Cl'-Position mit mehr als 90 % Hydroxylierung bei neutralem pH nachgewiesen wurde (37). Neben einer in vitro-Hydratisierung könnte die Möglichkeit einer in vivo-Hydratisierung während der Synthe- se von Precursor Z bestehen. Daraus schließen wir, dass das zweifache Diol in Precursor Z und anderen reduzierten Pteri-

nen als eine Schutzfunktion dienen könnte. Bisher haben die für den Mechansimus der Precursor Z-Biosynthese aufgestellten Theorien (15,38, 39) weder die Bildung eines zweifachen Diols noch die Syntheses eines Pyranopterins in Betracht gezogen.

Es wurde postuliert, dass die Precursor Z-Bildung durch eine alternative Cyclohydroxylase-ähnliche Reaktion mit einem Gua- nosin-Derivat als Startkomponente abläuft (14,15). Während der Precursor Z-Biosynthese werden alle Kohlenstoffatome des Guanosins benutzt, weil das Imidazolring-C8-Atom erhalten bleibt und in einer Umordnungsreaktion als Cl'in Precursor Z inkorporiert wird (14,15). Für diese Reaktion wird die Bil- dung eines transienten Formylesters diskutiert (15), welcher an den konservierten und functional wichtigen C-Terminus von Proteinen der MOCS1A-Familie gebunden sein könnte (40). Das zweifache Diol könnte das Produkt der Formyl- Freisetzungsreaktion während der Precursor Z-Synthese sein.

Neben der erhöhten Stabilität könnte das zweifache Diol eine zweite biosynthetische Funktion besitzt. Wir haben gezeigt, dass E. coli MPT-Synthase zwei Schwefelatome von zwei ver- schiedenen thiocarboxylierten kleinen Untereinheiten auf Pre- cursor Z überträgt, was auf die Bildung eines Ein-Schwefel- Intermediats hinweist (18), dessen Existenz vor Kurzem ge- zeigt wurde (26). Die Übertragung des ersten Schwefels geht mit der Öffnung des zyklischen Phosphats einher, was den ini- tialen Angriff an der C2'-Position andeutet. Letzteres ergibt Sinn in Hinsicht auf die niedrigere Reaktivität des zweifa- chen Diols an Cl'verglichen mit einer Keto-Funktionalität.

Der zweite Schritt der Reaktion würde die Freisetzung beider Hydroxylgruppen sowie die Übertragung des zweiten Schwefel- atoms involvieren.

Zusammenfassend schließen wir, dass die grundsätzliche Struk- tur des Precursor Z ein Pyranopterin ist. Diese Entdeckung zeigt, dass nicht nur der Moco sondern auch beide Intermedia- te des Biosynthesewegs (Precursor Z und MPT) als Pyranopteri- ne vorliegen und dass die Öffnung dieses Pyranoringmerkmals mit hoher Wahrscheinlichkeit alle Zwischenprodukte inclusive des Moco selbst irreversibel zerstören wird. Sowohl die Pyra- noring-Bildung als auch die beobachtete zweifache Diol-

Funktionalität in C1'scheint wichtig zu sein, um (i) Precur- sor Z vor Oxidation zu schützen, (ii) die Stereochemie der Pterin-C6-Position zu erhalten und (iii) für die gerichtete Reaktivität des Precursor Z bei der MPT-Synthese zu sorgen.

Heilung von tödlicher Molybdän-Cofaktor-Defizienz durch einen biosynthetischen Precursor aus Escherichia coli Wir haben jüngst die Konstruktion eines tierischen Modells für humane Moco-Defizienz Typ A beschriebenB25. Diese MOCS1 Knock-out Mäuse zeigen einen schweren Phänotyp, der mit den biochemischen Charakteristika humaner Moco-Defizienz Patien- ten übereinstimmt. Die Mäuse sind im Wachstum gehemmt und sterben innerhalb der ersten 12 Tage nach der. Geburt, bei ei- ner durchschnittlichen Lebensspanne von 7, 5 Tagen.

Dieser lethale Phänotyp kann erfindungsgemäß durch ein bio- synthetisches Intermediat, Precursor Z aus E. coli, wirkungs- voll behoben werden kann.

Ergebnisse Reinigung und Stabilität von Precursor Z Precursor Z wurde durch einen drei Schritte umfassenden HPLC Chromatographie-Verfahren bis zur Homogenität gereinigt (Fig.

4), was sowohl mittels UV-VIS Spektroskopie (Fig. 5b) als auch anhand von Massenspektrometrie demonstriert werden konn- te (Daten nicht gezeigt). Um größere Mengen zu erhalten, be- nutzten wir einen Bakterienstamm, der Precursor Z aufgrund eines Defektes in der Umwandlung zu MPT anreichert. Eine wei- tere Verbesserung der Ausbeute konnte durch Überexpression der Proteine MoaA und MoaC erreicht werden, die den ersten Schritt der Moco-Synthese katalysieren. Dieses führte zu ei- ner etwa 5000-fachen Anreicherung von Precursor Z im Ver- gleich zu Wildtyp-Zellen, bei einer durchschnittlichen Aus- beute von 40 jug je L E. coli Kultur und einer Endkonzentrati-

on von 30-140 Hg/ml. Gereinigter Precursor Z zeigte das glei- che Absorptionsspektrum wie zuvor beschriebenB19 und konnte quantitativ zu Compound Z oxidiert werden (Fig. 5a, b). Unter physiologischen und aeroben Bedingungen bei pH 6,9 (2x PBS Puffer) wurde eine 22 UM Lösung von Precursor Z innerhalb von 5 h vollständig zu Compound Z oxidiertB19. Die Halbwertszeit von Precursor Z bei pH 6,9 konnte mit 6212 min bestimmt wer- den (Fig. 5c).

Wiederherstellung der MPT-Biosynthese in vitro Die biologische Aktivität des gereinigten Precursor Z konnte durch eine quantitative in vitro Umwandlung zu MPT unter Ver- wendung gereinigter E. coli MPT-Synthase nachgewiesen wer- denB26. Bei einem zweifachen Überschuss von MPT-Synthase waren wir in der Lage, Precursor Z nahezu komplett in MPT umzuwan- deln, wie durch HPLC FormA Analyse bestimmt wurde (Daten nicht gezeigt). Um die Menge an Precursor Z zu ermitteln, die zu einer erfolgreichen Wiederherstellung der Moco-Biosynthese in MOCS1-defizienten Mäusen benötigt wird, haben wir eine in vitro Rekonstitution mit verschiedenen Mengen an Precursor Z in Protein-Rohextrakt aus der Leber von fünf Tage alten MOCS1-defizienten Mäusen durchgeführt (Fig. 6a). Beim Einsatz von 134 ng Precursor Z/mg Protein konnte eine nahezu kom- plette Wiederherstellung der Moco-Biosynthese erreicht wer- den, während 27 ng Precursor Z zu einer Rekonstitution von etwa 50 % führten. Der Protein-Gesamtgehalt des für dieses Experiment verwendeten Leberextraktes betrug 6 mg (erhalten aus 50 mg Gesamt-Lebergewebe), was eine gesamt erforderliche Menge Precursor Z von 0,8 jug je Tier zur vollständigen Wie- derherstellung der MPT-Synthese unter in vitro Bedingungen erforderlich macht. Dementsprechend würden für ein erwachse- nes Tier mit einem Köpergewicht von 20 g und einer ungefähren Masse der Leber von 1 g 16 pg Precursor Z zur vollständigen Wiederherstellung benötigt werden, jedoch nur 3 jug für eine Aktivierung von 50 %. Da die Produktionsmöglichkeiten für Precursor Z begrenzt waren, haben wir in den folgenden Expe- rimenten nicht versucht, eine komplette Wiederherstellung zu

erreichen, sondern nur die minimal notwendigen Dosierungen verwendet. Obwohl das in vitro Titrationsexperiment keinen Aufschluss darüber gibt, welcher Anteil des Moco auf die Apo- Sulfit-Oxidase übertragen wird, bezieht sich die ermittelte Menge an Precursor Z auf die maximale Kapazität der MPT- Produktion in der Leber MOCS1-defizienter Mäuse.

Heilung des lethalen Phänotyps in Moco-defizienten Mäusen Es konnte sicher nachgewiesen werden, dass ausschliesslich der Verlust der Sulfit-Oxidase Aktivität für die schweren neurologischen Schäden verantwortlich ist, die als Folge von Moco-Defizienz auftretenB1l. Die Halbwertszeit von Sulfit- Oxidase in Rattenleber wurde auf 3-4 Tage bestimmtB27. Auf dieser Grundlage und anhand der oben aufgeführten Berechnun- gen haben wir Precursor Z in die Leber injiziert, wie in Ta- belle 2 zusammengefasst. Während nicht behandelte homozygote Tiere im Vergleich zu ihren Artgenossen desselben Wurfs deut- lich langsamer an Gewicht zunahmen, und sehr früh starbenBaS, war es optisch ohne Bestimmung des Genotyps unmöglich, behan- delte homozygote Tiere in einem Wurf zu identifizieren. Be- züglich des Gewichts, des Verhaltens oder anderer phänotypi- scher Merkmale konnten bis zur Entwöhnung keine Unterschiede zwischen Precursor Z-behandelten MOCS1-defizienten Mäusen und Wildtyp-bzw. heterozygoten Individuen eines Wurfs festge- stellt werden.

Tabelle 2 Lebensspanne von MOCS1-/-Mäusen bei unterschiedlichen Behandlungen Behandlunga n Durchschnittliche Lebensspanne (Ta- ge) Unbehandeltb 28 7,5 0,2 pg jeden zweiten Tag 11 17,7 1 pg jeden dritten Tag 5 25,2 1 pg (vor Entwöhnung") und 2 pg (nach Ent-30 32,9 wöhnung) jeden dritten Tag 2 pg Precursor Z jeden zweiten Tag 15 47,4 2 pg (vor Entwöhnung) und 4 jug (nach Ent-18 91,8 wöhnung) jeden dritten Tag a Precursor Z wurde durch die Haut in die Leber injiziert. bDaten von Quelle B16.

Entwöhnung fand statt zwischen Tag 20 und 30 nach der Ge- burt.

Wie aus Tabelle 2 hervorgeht, gibt es eine starke Korrelation zwischen der pro Woche injizierten Menge an Precursor Z und der durchschnittlichen Lebensspanne der MOCS1-defizienten Mäuse. Die niedrigste Dosierung betrug 0,2 pg Precursor Z, verabreicht jeden zweiten Tag. Bei dieser Behandlung entwi-

ckelten sich 11 MOCS1-/-Mäuse aus drei Würfen normal und nah- men entsprechend den Artgenossen an Gewicht zu. Obwohl keine Unterschiede im Verhalten festgestellt werden konnten, wurden alle 11 homozygoten Tiere zwischen den Tagen 14 und 19 ge- zielt von ihren Eltern getötet. Bei einer Gabe von 1-2 us je- den dritten Tag erreichten die Mäuse ein höheres Alter und wurden bis Tag 20-30 gesäugt, danach erschienen die MOCS1-/- Tiere jedoch langsamer in ihren Fluchtreaktionen und in der Wahrnehmung ihrer Umgebung als die entsprechenden Kontroll- tiere. Dieser Unterschied verschwand um den Tag 40 herum, nachfolgend waren alle MOCS1-/-Tiere so agil und lebhaft wie die Kontrollindividuen. Etwa die Hälfte der behandelten Tiere starb zwischen Tag 20 und 40. Als erfolgreichste Behandlung erwies sich die Injektion von 2-4 jug Precursor Z jeden drit- ten Tag. Während dieser Behandlung starb kein Tier zwischen den Tagen 40-70, einer Zeitspanne, in der Männchen und Weib- chen das Erwachsenenstadium und die Fortpflanzungsfähigkeit erreichten. Zehn Paarungen dieser behandelten Tiere unterein- ander und vier weitere mit MOCS1 Heterozygoten (zwei Paarun- gen mit homozygoten Männchen und zwei mit homozygoten Weib- chen) ergaben normal ausgetragenen, gesunden Nachwuchs, der im Falle des MOCS1-/-Phänotyps wiederum mit Precursor Z be- handelt werden musste.

Verhinderung von neurologischem Schaden Die allgemeine Aktivität der behandelten Tiere (2-4 jug Pre- cursor Z jeden dritten Tag) wurde im"Open Field"Test ermit- telt, wobei die untersuchten Parameter (Bewegung, Lernen und Sozialverhalten) keine signifikanten Unterschiede zwischen Wildtyp (n=6) und homozygoten Tieren (n=8) eines Wurfs erga- ben. Vermeidung von Licht wurde in der Hell-Dunkel-Box unter- sucht, wobei die Tiere in den hellen Bereich gesetzt wurden und die Zeit bestimmt wurde, bis die Tiere den dunklen Be- reich aufsuchten. Auch dieser Test ergab keine signifikanten Unterschiede zwischen Wildtyp und MOCS1-defizienten, Precur- sor Z behandelten Mäusen (Daten nicht gezeigt).

Einschränkungen der Bewegungen wurden für MOCS1-defiziente und Precursor Z behandelte Mäuse im Laufrad Test nicht fest- gestellt (10 und 20 Umdrehungen pro Minute, Daten nicht ange- geben). Die Lernfähigkeit der MOCS1-defizienten Mäuse, die regelmäßig Precursor Z erhielten, wurde in einem in vier Sek- toren unterteilten Wasserlabyrinth ermittelt, das in einem Sektor eine unsichtbare Plattform enthielt. Die Ergebnisse wurden mit Wildtyp-Kontrolltieren verglichen. Die Mäuse wur- den der Reihe nach in alle vier Sektoren gebracht und es wur- de die Zeit gemessen, bis die Tiere die Plattform fanden und betraten (Fig. 7). In der ersten Versuchsreihe fanden die be- handelten"Knock-out"-Mäuse (n=6) die Plattform schneller als die Wildtyp-Kontrolltiere (n=6). In einer zweiten Versuchs- reihe verringerte sich die durchschnittliche Schwimmzeit gleichermaßen auf 20-25 % des ersten Versuchs sowohl bei be- handelten Knock-out"-Mäusen als auch bei Kontrolltieren. In einer dritten Versuchsreihe wurde die Plattform entfernt und die Zeit gemessen, die die Mäuse in dem"richtigen"Sektor verbrachten, der zuvor die Plattform enthalten hatte. Beide Gruppen verbrachten etwa 50 % der Zeit in dem korrekten Sek- tor.

Auftreten des Defizienz-Phänotyps nach Absetzen der Behand- lung Um zu untersuchen, ob die Behandlung mit Precursor Z nach be- stimmten Entwicklungsstadien eingestellt werden kann, stopp- ten wir die Injektion von Precursor Z bei homozygoten Mutan- ten an den Tagen 1 (n=3), 12 (n=4), 26-28 (n=3) und 64-68 (n=2) nach der Geburt. Eine einzige Injektion von Precursor Z an Tag 1 führte zum Tod nach 15-18 Tagen. Das Absetzen von Precursor Z an Tag 12 resultierte in verringerter Erkundung der Umgebung, beginnend an Tag 18 (d. h. 6 Tage nach der letz- ten Injektion), und dem Tod der Tiere 1-3 Tage später (d. h.

7-9 Tage nach der letzten Injektion). Im Alter von 26-28 Ta- gen, was in die zuvor beschriebene kritische Periode fällt, führte das Absetzen von Precursor Z zum Tod innerhalb von 4-7 Tagen. Absetzen nach 64-68 Tagen führte zu verringerter Er-

kundung der Umgebung nach 7 Tagen und zum Tod nach 9-10 Ta- gen. Um den Phänotyp erfolgreich zu beheben, musste die Ver- sorgung mit Precursor Z innerhalb von 5 Tagen nach der Geburt aufgenommen werden. Eine Aufnahme der Behandlung nach 7 bzw.

10 Tagen führte zu keiner signifikanten Verbesserung des Phä- notyps oder der Lebenserwartung (Daten nicht gezeigt).

Wiederherstellung von Moco-Synthese und Moco-abhängigen En- zym-Aktivitäten in vivo Bei homozygoten MOCS1/Tieren, denen regelmäßig Precursor Z injiziert wurde und die hinsichtlich Gewicht, Aussehen und Verhalten normal erschienen, wurde die Behandlung eingestellt und die Tiere wurden nacheinander an Tag 0, 1, 4 und 7 nach der letzten Injektion getötet, um den MPT-Gehalt und die Mo- Enzymaktivitäten in der Leber zu ermitteln (Fig. 6b-d). Am Tag der Injektion wurde aufgrund der schnellen Umwandlung des verabreichten Precursor Z zu MPT der höchste MPT-Wert gemes- sen (161% des Wildtyps ; Fig. 6b). Innerhalb der folgenden vier Tage fiel der MPT-Gehalt kontinuierlich auf unter 4 % des Wildtyp-Wertes.

Die Aktivität der Sulfit-Oxidase zeigte einen Anstieg von Tag 0 zu Tag 1 nach der letzten Injektion (Fig. 6c). Sowohl Sul- fit-Oxidase-als auch Xanthin-Dehydrogenase-Aktivität er- reichten einen relativen Wert (angegeben in % des Wildtyps), der höher war als der rekonstituierte MPT-Gehalt (Fig. 6d).

Nach Tag 1 nahm die Xanthin-Dehydrogenase-Aktivität schnell ab. Morphologische Untersuchungen von Precursor Z-behandelten Knock-out Mäusen ergaben beidseitig abnormale Nieren ab Tag 20 nach der Geburt (Fig. 8a, b). Dieses korreliert mit den sehr hohen Werten von Xanthin sowie nicht messbaren Werten von Harnsäure im Urin (Daten nicht gezeigt). Neben den Nie- renschäden wurden keine weiteren morphologischen Abnormitäten beobachtet. Untersucht wurden Gewebe aus Herz, Skelettmuskel, Lunge, Bauchspeicheldrüse, Schilddrüse, Milz und Leber (Daten nicht gezeigt) sowie Gehirn (Fig. 8c-d).

Diskussion Die Wiederherstellung von muriner Moco-Biosynthese durch bak- teriellen Precursor Z in vivo und in vitro unterstützt die genetischen Hinweise auf einen einzigartigen und hoch konser- vierten Syntheseweg, der zum Moco und Moco-abhängigen Enzym- aktivitäten führt. Wir beobachteten eine eindeutige Korre- lation zwischen der regelmäßig verabreichten Menge an Precur- sor Z und der Lebensdauer von MOCS1-defizienten Mäusen (Ta- belle 2). Die gezielte Tötung des betroffenen Nachwuchses durch die Eltern infolge der niedrigsten hier verabreichten Dosierung könnte entweder auf einen unterschiedlichen Geruch - möglicherweise verursacht durch erhöhte Werte an schwefel- haltigen Verbindungen-oder geringfügige Änderungen im Sozi- alverhalten hindeuten. Die hohe Sterblichkeit zwischen Tag 20-40 nach der Geburt, die nach Behandlung mit mittleren Men- gen Precursor Z (1-2 jug) und Absetzen der Behandlung eintrat, könnte durch eine kritische Phase in der Gehirnentwicklung bedingt sein, während dieser die Tiere sehr empfindlich auf erhöhte Sulfit-bzw. verminderte Sulfatkonzentrationen rea- gieren. Bei einer hohen Dosierung nimmt die Aktivität der Sulfit-Oxidase innerhalb des ersten Tages der Injektionen von Precursor Z in die Leber zu, was darauf hindeutet, dass (i) das Moco aufnehmende Apoenzym weniger stabil ist als das Ho- loenzym, (ii) die verfügbaren Apoenzym-Moleküle schnell mit Moco saturiert werden und (iii) Apoenzym neu synthetisiert werden muss, um sämtlichen verfügbaren Moco aufzunehmen. Ver- glichen mit dem Wildtyp-Wert überschreitet sowohl die Aktivi- tät der Sulfit-Oxidase als auch die der Xanthin-Dehydrogenase den Prozentsatz an wiederhergestelltem MPT (Fig. 6). Diese Erkenntnis lässt auf einen sehr effizienten Einbau von ver- fügbarem Moco in die Apoenzyme sowie auf eine Fraktion von Moco im Wildtyp, der nicht an Mo-Enzyme gebunden ist, schlie- ßen. Darüber hinaus stimmt diese Erkenntnis mit früheren Beo- bachtungen bei Gephyrin-defizienten Zelllinien überein, wo geringste Mengen an wiederhergestelltem Moco zu einer über- proportional hohen Aktivität der Sulfit-Oxidase führten

Soweit wir wissen, ist die Stabilität der Xanthin- Dehydrogenase in vivo bisher nicht bestimmt worden, jedoch wurde die Halbwertszeit der zugehörigen mRNA auf 12-16 Stun- den geschätztB28, was der Größenordnung der Halbwertszeit der Enzymaktivität entspricht, wie sie anhand der Unterschiede zwischen Tag 1 und 4 nach Precursor Z-Injektion geschätzt wurde (Fig. 6d). Die Aktivität der Sulfit-Oxidase entspricht nach Erreichen des Maximums an Tag 1 der veröffentlichten Halbwertszeit von 3-4 Tagen (Fig. 6c). Möglicherweise ist die durchschnittliche Aktivität der Xanthin-Dehydrogenase aufgrund der starken Fluktuationen niedriger als die Aktivi- tät der Sulfit-Oxidase. Dieses ist der Hauptgrund für die Entstehung von Xanthin-Steinen bei klassischer humaner Xan- thinurie (Typ 1) und letztendlich für ein Versagen der Nieren verantwortlich und scheint somit auch die Todesursache der älteren behandelten Tiere nach 70 Tagen zu sein. Humane Xan- thinurie bleibt jedoch bis auf das gänzliche Fehlen von Xan- thin-Dehydrogenase-Aktivität in den meisten Fällen ohne Symp- tome, und selbst in Fällen mit Symptomen kommt es nur sel- ten zu lebensbedrohlichen Zuständen. Daher muss in diesem Zu- sammenhang ein zusätzlicher. Einfluss der Sulfit-Oxidase- Defizienz auf die Nierenfunktion in Betracht gezogen werden.

So sollte die Behandlung humaner Moco-Defizienz primär auf die Wiederherstellung der Sulfit-Oxidase-Aktivität abzielen.

Bis zum heutigen Tag wurde keine effektive Therapie für Pati- enten mit Moco-Defizienz beschriebenB1l. Für die seltene Typ C Defizienz, die durch Gephyrin-Mutationen verursacht wird, ha- ben wir mittels Molybdat die Wiederherstellung in einer Fibroblasten-Kultur gezeigt, was bereits darauf hinwies, dass schon kleine Mengen von aktivem Moco für eine Wiederherstel- lung des normalen Phänotyps ausreichend sindB22. Da zwei Drit- tel der bekannten Moco-Defizienz-Patienten zur Defizienz- Gruppe A gehörenBl0'Bl2 und alle Komponenten für eine Umwand- lung von Precursor Z zu MPT bei diesen Patienten vorhanden sind B20, B24 stellt gereinigter Precursor Z das erste poten- ziell effektive Heilmittel für die meisten Moco-Patienten dar.

Intravenöse Zuführung von Precursor Z ist eine attraktive An- wendungs-Option für humane Patienten. Dieses beinhaltet je- doch nicht nur eine neue Größenordnung der Precursor Z- Produktion, um dem etwa 1000-fach höheren Körpergewicht von Menschen gerecht zu werden, sondern auch eine starke Verdün- nung, bevor der Wirkstoff die Leberzellen erreicht. Daher sollte bei Menschen die Verwendung eines permanenten Zugangs- systems zur Leber in Betracht gezogen werden. Da die MOCS Mäuse hinsichtlich der biochemischen Parameter dem Phänotyp humaner Patienten entsprechen, erscheint eine Behandlung der humanen Defizienz mit Precurrsor Z auf der Ebene von enzyma- tischer Wiederherstellung und Normalisierung des Stoffwech- sels sehr vielversprechend.

Es wird sich erweisen müssen, ob eine verspätete Aufnahme der beschriebenen Therapie (was in den meisten Fällen aufgrund der benötigten Zeit zur klinischen Feststellung und Diagnose zu erwarten ist) noch dazu geeignet sein wird ; einen neurolo- gischen Schaden zu verhindern. Die beschriebene Precursor Z- Therapie bildet die Basis zur detaillierten Untersuchung des Fortschreitens bzw. Ausbleibens dieser Symptome, da wir nun auch in der Lage sind, durch Veränderung der Wirkstoff- Dosierung zu jeder Zeit Moco-Defizienz im tierischen Modell zu induzieren.

Tetrahydrobiopterin-Defizienz330 ist ein ähnlicher Defekt in der Biosynthese von Tetrahydrobiopterin, was zum Verlust von NO-SynthasenB32 und der Hydroxylasen aromatischer Aminosäuren führtB31, die essentiell sind für die Synthese von Neurotrans- mittern (Dopamin und Serotonin). Die Möglichkeiten der chemi- schen Synthese erlaubten bereits 1979 die erste erfolgreiche Behandlung eines Patienten mit Tetrahydrobiopterin- Defizien ZB33, B34 was mittlerweile eine etablierte Therapie darstelltB30. Daher legen die Ergebnisse unserer Arbeit nach- drücklich klinische Versuchsstudien zur Behandlung von Moco- Defizienzpatienten nahe, sobald ausreichende Mengen an gerei- nigtem Precursor Z produziert werden können.

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Folgende Abkürzungen wurden verwendet : 1D, ein-dimensional ; 2D, zwei-dimensional ; COSY, Korrelati- ons-Spektroskopie ; ESI, Elektrospray-Ionisation ; Moco, Molyb- däncofaktor ; MS, Massenspektrometrie ; MPT, Molybdopterin oder Metall-bindendes Pyranopterin-En-Dithiolat ; Mo, Molybdän ; NMR Nukleäre Magnetische Resonanz ; W, Wolfram