本发明属于多肽药物制备方法技术领域， 特别涉及奈西立肽的制备方法。

背景技术

奈西立肽 (Nesiritide)是人体 B型尿钠排泄肽， 奈西立肽与血管平滑肌及内皮细胞的鸟 苷酸环化酶受体结合， 细胞内的 cGMP浓度增加， 平滑肌细胞松弛。 在静脉、 动脉的扩张 作用中， cGMP扮演第二信使的角色。 奈西立肽能使用内皮缩血管肽或 a -肾上腺素能的促 效剂去氧肾上腺素制造的离体人动脉和静脉条 收缩模型舒张。

在临床试验中， 奈西立肽能使心衰病人的肺毛细血管楔嵌压 （PCWP ) 降低， 呈剂量 依赖性。 在动物试验中， 奈西立肽对心脏收缩能力或心脏电生理如房室 结传导等无影响。 给充血性心衰的病人静脉注射奈西立肽后， 在血浆中显示出二相性的分布。 奈西立肽的半 衰期 t _1/2 大约为 18分钟， AUC大约为 27。 平均初始消除相估计大约为 2分钟。 在这些病 人中， 奈西立肽中心室的平均分布体积（V _c )估计是 0.073L/kg， 平均稳态分布体积 ( V _ss ) 是 0.19L/kg，平均清除率（CL)大约是 9.2mL/min/kg。在稳定状态，注射剂量范围从 0.01〜

0.03ug/kg/min的奈西立肽后， 血浆奈西立肽的水平从内源性的基础水平增加 大约 3〜6倍。

奈西立肽具有以下的结构：

Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly-Cys-Phe-Gly-Arg-

Lys-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Ser-Ser-Ser-Gly-leu-Gly-Cys-

Lys-Val-Leu-Arg-Arg-His-OH

有关奈西立肽的制备方法， 国内外很少有报道， USA20080287650报道了高纯度奈西立 肽的制备， 采用固相合成 1-31片段， 再与第 32个氨基酸反应， 经酸解后氧化、 纯化得到 产品； US20090035815报道了一种基因工程的奈西立肽制� �方法； US20100317827报道了 奈西立肽一种纯化方法。

中国专利 CN200910104860.9、 CN200910104861.3报道了一种固相制备和纯化方法� � 采 用 HMPB-AM 树脂为载体树脂， 但 HMPB-AM 树脂在与第一个保护氨基酸 Fmoc-HisCTrt)-OH酯化的时候， 有 50%的 Fmoc-His(Trt)-OH将会发生消旋化， 所以在产品 中存在消旋异构体。

本品结构中含有一个 Ser-Ser-Ser-Ser片段， 在固相偶联时需要分 4次接入 Fmoc- Ser (tBu), 在接入第 2个、 第 3个和第 4个 Fmoc-SeittBu)时， 由于自身结构的特性， 无法 进行完全反应， 所以在生产过程中产生大量的 [-Ser]-奈西立肽、 [-2Ser]-奈西立肽和 [-3 Ser]- 奈西立肽杂质， 同时这些杂质与奈西立肽的极性相近， 在纯化过程中很难完全去掉， 所以 本产品常规固相合成总收率很低， 只有 2〜5%， 很难实现规模化生产。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供奈西立肽的 制备方法， 该制备方法使用了新型的保 护氨基酸片段， 避免了 [-l Ser]-奈西立肽， [-2Ser]-奈西立肽和 [-3 Ser]-奈西立肽杂质的产生， 提高生产效率、 实现规模化的固相合成工艺。

本发明奈西立肽的制备方法， 包括固相多肽合成法制备奈西立肽线性肽树脂 、 奈西立 肽线性肽树脂酸解得到奈西立肽线性肽粗品； 奈西立肽线性肽粗品经氧化后得到奈西立肽 粗品， 奈西立肽粗品纯化得到奈西立肽纯品。 其中固相多肽合成法为： 在 Fmoc-His (trt) -载体树脂上通过固相偶联合成法依次接入下� �序列中相对应的 Fmoc-保护氨基酸，得到奈 西立肽线性肽树脂：

R ₁ -Ser(tBu)-Pro-Lys(Boc)-Met-Val-Gln(R ₂ )-Gly-Ser(tBu)-

Gly-Cys(R ₃ )-Phe-Gly-Arg(pbf)-Lys(Boc)-Met-Asp(OtBu)-

Arg(pbf)-Ile-X-Gly-Leu-Gly-Cys(R ₃ )-Lys(Boc)-Val-Leu-

Arg(pbf)- Arg(pbf)-Hi _S (trt)-树脂

其中， X为 Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)， Ri为 Fmoc、 Boc或 H， R ₂ 为 Trt或 H，

R ₃ 为 Trt或 Acm。

接入 X片段时仅用 1或 2次固相偶联合成反应， 偶联所使用的 Fmoc-保护氨基酸为 Fmoc-Ser(tBu)-OH、 Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OH、 Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OH、 Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OH Fmoc-Ser(tBu)-Ser(»FMe,Mepro)-OH 中的至 少一禾中。

优选的， 接入 X片段时仅用 1或 2次固相偶联合成反应， 具体为：

1 ) 1次偶联直接接入 Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OH，

2 ) 分 2次偶联依次接入 2段肽片段， 一段为 Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OH、 一 段为 Fmoc-Ser(tBu)-OH; 或一段为 Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OH、 一段为 Fmoc-Ser(tBu)- Se^Me,Mepro)-OH； 或两段 同 时为 Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)； 或两段 同 时为 Fmoc-Ser(tBu)-Se^Me,Mepro)。 所述保护氨基酸种类分别为： R SeittBu OH Fmoc-Gln(R ₂ )-OH, Fmoc-Cys(R ₃ )-OH,

Fmoc-Arg(pbf)-OH、 Fmoc-Asp(tBu)-OH、 Fmoc-Gly-OH、 Fmoc-Ile-OH、 Fmoc-Leu-OH、

Fmoc-Lys(Boc)-OH、 Fmoc-Met-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Pro-OH,

Fmoc-VaK Fmoc-Ser(TBu)-OH、 Fmoc- Ser(tBu)- Ser(tBu)-OH Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-

Ser(tBu)-OH、 Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OH Fmoc-Ser(tBu)-

8ει·(ΨΜε,ΜερΐΌ)-ΟΗ。

其中， 为 Fmoc、 Boc， R ₂ 为 Trt或 H， R ₃ 为 Trt或 Acm。

Fmoc为 9-芴甲氧羰基， tBu为叔丁基、 Trt为三苯基甲烷、 OtBu为叔丁氧基、 Boc为 叔丁氧羰酰基。

所述 Fmoc-Ser(t -Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OH结构为：

所述 Fmoc-Ser(tBu)- r(tBu)-Ser(tBu)-OH结构为:

所述 Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OH结构为:

所述 Fmoc-SeittBu^Ser M Mepro OH结构为:

保护氨基酸用量为所投料树脂可取代基团总摩 尔数的 1.2〜6倍， 优选 2.5〜3.5倍。 本发明使用了新型保护氨基酸片段， 避免了生产过程中 [-Ser]-奈西立肽、 [-2Ser]-奈西 立肽和 [-3 Ser]-奈西立肽杂质的产生， 克服了现有技术的缺点， 为获得高品质的产品提供了 保障， 产品纯度大于 99.0%， 单一杂质小于 0.5%， 显著提高了产品收率， 且具有反应操作 简单等特点， 具有广泛的实用价值和应用前景。

具体实施方式

本发明奈西立肽的制备方法， 包括固相多肽合成法制备奈西立肽线性肽树脂 、 奈西立 肽线性肽树脂酸解得到奈西立肽线性肽粗品； 奈西立肽线性肽粗品经氧化后得到奈西立肽 粗品， 奈西立肽粗品纯化得到奈西立肽纯品。 其中固相多肽合成法为： 在 Fmoc-His (trt) -载体树脂上通过固相偶联合成法依次接入下� �序列中相对应的 Fmoc-保护氨基酸，得到奈 西立肽线性肽树脂：

R ₁ -Ser(tBu)-Pro-Lys(Boc)-Met-Val-Gln(R ₂ )-Gly-Ser(tBu)-

Gly-Cys(R ₃ )-Phe-Gly-Arg(pbf)-Lys(Boc)-Met-Asp(OtBu)-

Arg(pbf)-Ile-X-Gly-Leu-Gly-Cys(R ₃ )-Lys(Boc)-Val-Leu-

Arg(pbf)- Arg(pbf)-Hi _S (trt)-树脂

其中， X为 Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)， Ri为 Fmoc、 Boc或 H， R ₂ 为 Trt或 H，

R ₃ 为 Trt或 Acm。

接入 X片段时仅用 1或 2次固相偶联合成反应， 偶联所使用的 Fmoc-保护氨基酸为 Fmoc-Ser(tBu)-OH、 Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OH、 Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OH、 Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OH Fmoc-Ser(tBu)-Ser(»FMe,Mepro)-OH 中的至 少一禾中。 固相偶联合成法具体为： 前一步反应得到的保护氨基酸-树脂脱去保护 Fmoc后再与下 一个保护氨基酸偶联反应。 脱去 Fmoc保护的试剂为 10〜30%(V/V)哌啶 (PIP)/N,N-二甲基 甲酰胺 （DMF) 溶液， 优选的为 20%。 使用的去保护试剂用量为每克投料树脂 5〜15ml， 优选为每克投料树脂 10ml。 去保护反应时间为 10〜60分钟， 优选为 15〜25分钟。

偶联时需添加缩合试剂和活化试剂， 缩合试剂选自 Ν,Ν-二异丙基碳二亚胺 （DIC)、

Ν,Ν-二环己基碳二亚胺 （DCC)， 六氟磷酸苯并三唑 -1-基 -氧基三吡咯烷基磷 （PyBOP)、 2-(7-氮杂 -1H-苯并三氮唑 -1-基；) -1, 1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯 (HATU)、 苯并三氮唑

-Ν,Ν,Ν',Ν'-四甲基脲六氟磷酸盐 (HBTU)或 0-苯并三氮唑 -Ν,Ν,Ν',Ν'-四甲基脲四氟硼酸酯

(TBTU); 优选的为 Ν,Ν-二异丙基碳二亚胺。

缩合试剂的摩尔用量为氨基树脂中氨基总摩尔 数的 1.2〜6倍， 优选为 2.5〜3.5倍。 活化试剂选自 1-羟基苯并三唑 (HOBt；)、 N-羟基 -7-氮杂苯并三氮唑 (HOAt；)， 优选的为 1-羟基苯并三唑。

活化试剂用量为氨基树脂中氨基总摩尔数的 1.2〜6倍， 优选的为 2.5〜3.5倍。

偶联反应时间为 60〜300分钟， 优选的为 100〜140分钟。

优选的， 所述载体树脂的取代值为 0.2〜1.0mmol/g 树脂， 优选的取代值为 0.2〜 0.5mmol/g树脂时产率较高。

进一步优选的， 所述载体树脂为三苯甲基氯树脂： 如 Trityl-Cl树脂、 4-Methyltrityl-Cl 树脂、 4-Methoxytrityl-Cl树脂或 2-Cl-Trityl-Cl树脂。 最优选为 2-Cl-Trity-Cl 树脂。

当载体树脂为三苯甲基氯树脂时， Fmoc-His ( trt) -OH 与载体树脂的偶联方法为： Fmoc-His(trt)-OH的羧基与树脂中的 C1-代烷在碱作用下发生酯化反应而接入保护氨 基酸。

所述的碱选自 N.N-二异丙基乙基胺 (DIEA；)、 三乙胺 (TEA；)、 吡啶中的至少一种， 优选 为 DIEA。 碱的摩尔用量为保护氨基酸摩尔数的 1.5〜3倍。

酯化反应时间为 1〜6小时， 优选为 3小时。

进一步的， 奈西立肽线性肽树脂经酸解同时脱去树脂及侧 链保护基得到奈西立肽线性 肽粗品：

Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly-Cys-Phe-Gly-Arg- Lys-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Ser-Ser-Ser-Gly-leu-Gly-Cys-

Lys- Val -Leu- Arg- Arg-His- OH

酸解剂为三氟醋酸 (TFA；)、 1,2-乙二硫醇 (EDT)和水混合溶剂， 混合溶剂的配比为： TFA 的比例为 80-95% (V/V)， EDT的比例为 1〜10% (V/V)， 余量为水。优选的配比为 89-91%、 EDT 4-6% 余量为水。 最优的， 配比为 90%、 EDT 5%、 余量为水。

酸解剂用量为每克肽树脂需要 4〜15 ml 酸解剂， 优选的， 每克肽树脂需要 9〜l lml 酸解剂。

使用酸解剂裂解的时间为室温条件下 1〜5小时， 优选的为 3小时。

进一步的， 奈西立肽线性肽粗品经氧化后得到奈西立肽粗 品：

取奈西立肽线性肽粗品， 用醋酸溶解， 过滤后用氧化剂氧化环化， 得到奈西立肽粗品 溶液。

醋酸的体积百分比浓度为 20〜40%， 优选为 30%。

氧化剂选自空气、 碘、 H ₂ 0 ₂ 或DMSO， 优选碘。 氧化剂采用滴定方式加入， 到氧化终 点时停止加入。 进一步的， 奈西立肽粗品纯化得到奈西立肽纯品的方法为 ： 高效液相色谱纯化的操作 方法为：

奈西立肽粗品溶液用 0.45μιη混合微孔滤膜过滤，纯化用色谱填料� � ΙΟμιη的反相 C18， 流动相系统为 0.1%TFA/水溶液 -0.1%TFA/乙腈溶液， 77mm*250mm 的色谱柱流速为 90ml/min, 采用梯度系统洗脱， 循环进样纯化， 收集主峰蒸去乙腈后， 得奈西立肽纯化中 间体浓缩液。

奈西立肽纯化中间体浓缩液再用 0.45μιη滤膜滤过， 采用高效液相色谱法进行换盐， 流动相系统为 1%醋酸 /水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为 ΙΟμιη的反相 C18， 77mm*250mm 的色谱柱流速为 90ml/min。 采用梯度洗脱， 循环上样方法， 上样于色谱柱中， 启动流动相 洗脱， 采集图谱， 观测吸收度的变化， 收集换盐主峰并用分析液相检测纯度， 合并换盐主 峰溶液， 在小于 40°C水浴条件下减压浓缩， 用旋转蒸发仪蒸去大部分乙腈， 得到奈西立肽 醋酸水溶液， 冷冻干燥得奈西立肽醋酸产品。

下述实施例将有助于理解本发明， 但不能限制本发明的内容：

实施例 1 Fmoc-His(Trt)-2-Cl-Trt-Cl树脂的制备

取 2-Cl-Trt-Cl树脂 lKg (取代值为 0.5mmol/g)， 用 8L N,N-二甲基酰胺（DMF)溶涨 30 分钟， 加入 Fmoc-His(Trt)-OH 620g ( l.Omol)，搅拌 30分钟后加入 260ml DIEA ( 1.5mol) , 室温搅拌反应 3小时， 过滤后树脂分别用 DMF、 二氯甲烷 (DCM)、 甲醇洗涤 3次， 减压干 燥， 得 Fmoc- His(Trt)-2-Cl-Trt-树脂 1576g， 酯化收率 98.7%。

实施例 2 H-His(Trt)-2-Cl-Trt树脂的制备

取上述 Fmoc-His(Trt)-2-Cl-Trt树脂， 用 8L 20%哌啶 (PIP)/NN-二甲基酰胺 （DMF) 溶 液溶涨 10分钟， 过滤后再加入 5L 20%哌啶 (PIP)/NN-二甲基酰胺 （DMF)溶液， 室温搅拌 反应 25分钟， 过滤后树脂分别用 DMF、 二氯甲烷 (DCM)、 甲醇洗涤 3次， 减压干燥即得 H-His(Trt)-2-Cl-Trt树脂的制备。

实施例 3 Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OH的合成

取 3.0mol Ser(tBu)和 3.0mol HOBt, 用适量 DMF溶解； 另取 3.0mol DIC (Ν,Ν-二异丙 基碳二亚胺）， 搅拌下慢慢加入至保护氨基酸 DMF溶液中， 于室温环境中搅拌反应 30分 钟， 得到活化后的保护氨基酸溶液。

取 Fmoc-Ser(tBu)-2-Cl-Trt-树脂 lKg (取代值为 1.0mmol/g); 采用 6L 20% PIP/ DMF溶 液去保护 25分钟， 过滤后树脂分别用 MDF、 DCM洗涤 3次， 加入上述活化后的保护氨基 酸溶液， 室温搅拌反应 3小时， 反应完成后， 过滤后得到二肽树脂分别用 MDF、 DCM洗 涤 3次。

重复上述反应， 二肽树脂与活化后的保护氨基酸溶液反应接入 第 3个 Ser(tBu)， 然后 重复上述反应接入第 4个 Ser(tBu)，制得 Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu 2-Cl-Trt- 树脂。

取 Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu 2-Cl-Trt-树脂，加入 20L六氟异丙醇/ DCM 溶液， 六氟异丙醇体积浓度为 30%， 搅拌反应 2小时， 过滤收集滤液， 减压蒸干溶剂， 减 压干燥，得 Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OH 742g，收率为 91.3%，纯度为 95.7%， MS m/z: 814(M+1)。

实施例 4 奈西立肽线性肽树脂的合成

奈西立肽线性肽树脂为：

H-Ser(tBu)-Pro-Lys(Boc)-Met-Val-Gln(Trt)-Gly-Ser(tBu)-

Gly-Cys(Trt)-Phe-Gly-Arg(pbf)-Lys(Boc)-Met-Asp(OtBu)-

Arg(pbf)-Ile-X-Gly-Leu-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Val-Leu-

Arg(pbf)- Arg( _P bf)-His(trt)-树脂

其中， X为 Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)

取 Fm _0C -His(Trt)-2-Cl-Trt-树脂， 经 Fmoc去保护后， 依次与表 1所示的保护氨基酸偶 联， 制得奈西立肽线性肽树脂。

其中第 11个为实施例 3制得的 Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu) Ser(tBu)-OH。

.0CT80/ll0ZN3/X3d LI^LIIZIOZ OAV 固相偶联合成法具体为：

1、 保护氨基酸的活化：

取 0.9mol保护氨基酸和 0.9mol HOBt， 用适量 DMF溶解； 另取 0.9mol DIC， 搅拌下 慢慢加入至保护氨基酸 DMF溶液中， 于室温环境中搅拌反应 30分钟， 得到活化后的保护 氨基酸溶液。

2、 树脂的脱 Fmoc保护：

取 Fmoc-His(Trt)-2-Cl-Trt-树脂 （取代值为 0.3mmol/g) lKg， 采用 5L 20% PIP/ DMF 溶液去保护 25分钟， 过滤得到去 Fmoc的树脂备用。

3、 偶联：

去 Fmoc的树脂加入第 2个活化后的保护氨基酸溶液， 偶联反应 60〜300分钟， 过滤 洗涤得 2肽树脂。

采用上述同样方法， 依次接入第 3至第 29个氨基酸对应的 Fmoc-保护氨基酸， 即前一 步得到的 Fmoc-[l〜(； n-1)个]氨基酸 -HisCTrt -Cl-Trt-树脂， 脱 Fmoc保护后与活化的 Fmoc- 保护氨基酸 （第 n个） 偶联反应 60〜300分钟， n=2〜29。 接完所有保护氨基酸后， 树脂 再用 10L 20% PIP/ DMF溶液去 Fmoc保护 25分钟， 过滤洗涤后， 即得奈西立肽线性肽树 脂。

实施例 5 奈西立肽线性肽粗品的制备

取实施例 4 制得的奈西立肽线性肽树脂， 加入裂解试剂 [TFA/水/ EDT=95:5:5(V/V) ( 10ml/克树脂）， 搅拌均匀， 室温搅拌反应 3小时， 反应混合物使用砂芯漏斗过滤， 收集 滤液， 树脂再用少量 TFA洗涤 3次， 合并滤液后减压浓缩， 加入无水乙醚沉淀， 再用无水 乙醚洗沉淀 3次， 抽干得白色粉末即为奈西立肽线性肽粗品。

实施例 6 奈西立肽粗品的制备

将上述奈西立肽线性肽粗品用 30%醋酸溶液溶解并制成 lmg/ml的溶液， 搅拌下滴加 碘 /30%醋酸饱和溶液至溶液呈棕红色， 搅拌反应 30分钟后滴加 Vc溶液（中和过量的氧化 剂） 至棕红色消失， 40°C减压浓缩， 得奈西立肽粗品浓缩溶液。

实施例 7 奈西立肽粗品的纯化

取奈西立肽粗品浓缩溶液， 溶液用 0.45μιη混合微孔滤膜过滤， 备纯化用。 采用高效 液相色谱法进行纯化， 纯化用色谱填料为 ΙΟμιη的反相 C18， 流动相系统为 0.1%TFA/水溶 液 -0.1%TFA/乙腈溶液， 77mm*250mm的色谱柱流速为 90ml/min， 采用梯度系统洗脱， 循 环进样纯化， 取粗品溶液上样于色谱柱中， 启动流动相洗脱， 收集主峰蒸去乙腈后， 得奈 西立肽纯化中间体浓缩液。

取奈西立肽纯化中间体浓缩液， 用 0.45μιη滤膜滤过备用。 采用高效液相色谱法进行 换盐， 流动相系统为 1%醋酸 /水溶液-乙腈， 纯化用色谱填料为 ΙΟμιη的反相 C18，

77mm*250mm的色谱柱流速为 90ml/min(可根据不同规格的色谱柱， 调整相应的流速；)。 采 用梯度洗脱， 循环上样方法， 上样于色谱柱中， 启动流动相洗脱， 采集图谱， 观测吸收度 的变化， 收集换盐主峰并用分析液相检测纯度， 合并换盐主峰溶液， 在小于 40°C水浴条件 下减压浓缩， 用旋转蒸发仪蒸去大部分乙腈， 得到奈西立肽醋酸水溶液， 冷冻干燥， 得产 品 196g， 总收率为 18.9%。

分子量： 3465(100% M+H); 比旋度： -82.6°;

水分 1.8%; 醋酸： 10.5%; 纯度： 99.5%。