技术领域

本发明涉及动物转基因技术， 具体涉及一种制备抗蓝耳病的转基因猪的方 法。 背景技术

猪繁殖与呼吸综合症 ( Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome , PRRS ), 俗称蓝耳病， 是由猪繁殖与综合症病毒 （PRRSV )所引起的一种传染 性疾病。该病于 1987年在美国首次发现， 2006年我国部分省巿猪群暴发高致病 性蓝耳病， 且该病毒与经典的蓝耳病病毒相比， 基因发生了较大的变异， 具有 很强的致病性。

在 PRRSV的大流行中 PRRS造成的经济损失早已经为人们所熟知。据� �计 PRRS给美国养猪生产者造成的损失每年达 5.6亿美元 (Cho and Dee，2006)。 我国 是养猪大国， 几乎占世界养猪总量的一半。 随着猪集约化和规模化养殖的发展, 猪的传染性疾病发病率增高， 特别是近几年爆发的 "无名高热病" 等带来的损 失都是每年以亿元为计算单位， 给养猪业带来巨大损失， 极大地挫伤了养猪者 的积极性。 同时， 2007-2008年猪肉价格一涨再涨， 以至使猪肉价格创历史最高 记录， 极大地影响了人们生活。

目前在病毒防治中主要釆用疫苗， 许多学者对 PRRS 病毒进行了较深入的 研究， 并在此基础上研制了弱毒苗、 灭活苗和基因工程疫苗， 试图通过免疫途径 控制该病， 但是由于蓝耳病病毒能导致猪持续感染、.病� �血症及免疫性能低下， 至今还没有能有效地控制 PRRS的技术和措施。此外， PRRSV感染可引起机体的 细胞免疫功能低下， 而体内高水平的病毒特异性抗体又不足以清除 病毒， 造成 病毒在猪体内的持续性感染 (Pirzadeh and Dea, 1998)，这给 PRRSV的防治带来很 大的困难， 也对现行的免疫策略和疫苗研制手段提出了严 峻的挑战。 许多国家 包括美国已将蓝耳病列为危害最大和控制最难 的猪传染病。

RNA干涉（ RNAi )是指双链 RNA特异性诱导同源靶基因表达沉默的现象， 它具有高度特异性， 能快速引发转录后基因沉默。 RNA干涉是由 21 ~ 23个核苷 酸组成的双链 RNA引发的， 小干涉 RNA(siR A)可以在体外化学合成， 也可通 过表达载体转录而成， '它参与降解同源靶基因、 抵御病毒入侵、 抑制转座子等， 将是基因功能研究、 病毒防治、 疾病治疗和品种改良等的有力工具。

研究证实， RNAi能够抑制病毒基因的复制、 阻止病毒粒子的装配及影响病 毒与宿主之间的相互作用， RNAi用于抗病毒研究的唯一前提是已知病毒基� �组 序列， 且 siRNA能快速、 高效、 特异地降解同源 mRNA而不产生任何副作用'， 从而成为抗病毒感染的有效手段。 并在抗病毒研究方面已经取得了显著成效。

口蹄疫病毒 （FMDV )是感染偶蹄动物的危险病毒。 Kahana 等针对所有 FMDV的 3个保守区设计了 3个特殊的 siRNA, 细胞结果显示与对照相比， 几 乎显示了 100%的生长抑制作用。 Liu等针对 FMDV基因组的保守区域 5'NCR， VP4, Vpg, POL, 3，NCR设计了 siRNA, 转染后 12h使 BHK221细胞系 FMDV 的效价下降 10倍， 1000倍，且这种抑制作用可持续至转然后第 6d。针对 FMDV 基因组的保守区设计的 siRNA能抑制 FMDV病毒的复制，是治疗高基因变化的 FMDV病毒的新策略。

禽流感病毒 H5N1 已经在人类和禽类中引起了广泛的呼吸系统疾 病， 但目 前的疫苗免疫和药物治疗都存在局限。 Zhou等针对流感病毒基因组的保守区域 设计了特异的 siRNA ( pBabe-NP、 pBabe-PA, pBabe-PBl ), 受孕鸡卵和 BALB/c 小鼠中显示了明显抑制流感病毒的复制增殖。 其中 pBabe-NP抑制禽流感病毒增: 殖的特异性最好。 RNAi技术提供了预防和治疗禽流感病毒在人类� �禽类中传染 的方法。

近年来， 由虹彩病毒引起的爬行动物、 两栖动物和鱼类疾病已在美洲、 欧 洲、 亚洲和澳洲等地普遍流行， 真鲷虹彩病毒 （RSIV ) 能引起海洋鱼类产生疾 病。 Dang等构建了靶向 RSIV中编码病毒衣壳蛋白基因 （MCP ) 的 siRNA， 在 转染感染了病毒的细胞后的 84h和 94h后， 对病毒 MCP基因表达的抑制达到 55.2%和..97.1%。 同时， 病毒的增殖也被抑制了， 表明针对 MCP基因的 siRNA 干扰作用能特异和有效阻止 RSIV的复制，是一种潜在的控制—病毒感染引� �的疾 病的方法。 显示了 RNAi 作为一种基因治疗的手段也可用于水生生物的 病毒防 治。

传染性法氏囊病（IBD )在鸡群中能引起严重的免疫抑制和高致死率� � 进而 给家禽业带来巨大的经济损失。为研究 RNAi是否能有效抑制传染性法氏囊病毒 ( IBDV ) 的复制， Gao等针对 IBDV保守区域的 VP1基因设计了 3个短干扰 siRNA ( siVP1618, siVP11115, 和 siVP12571 ), 然后转染感染了 IBDV的 VERO 细胞系， 结果显示， siVP12571是最有效的控制 IBDV复制的位点， 并以该位点 设计 shRNA, 并用鼠 U6作为启动子构建了 shRNA表达载体 pEC2571-shRNA, 转染感染了 IBDV的 VERP细胞， 结果显示， 该载体对 IBDV复制的抑制率达 到 87.4%, 该结果表明 DNA载体介导的 RNAi能有效抑制 IBDV的复制。 猪瘟病是一种高度传染性疾病， 已经在全世界范围引起了严重的经济损失。

Xu等构建了靶向猪瘟病毒 （CSFV ) Npro和 NS5B基因的不同区域的 siRNA 。 结果显示， 转染了 siRNA的细胞能使病毒基因组的复制减少 4-12倍， 设计的 3 个特异的 siRNA抑制病毒增殖持续 72h-84h之久。

从当前的研究结果发现， RNAi针对不同基因序列都有效， 而且特异性强、 效率高， 操作方便。 RNA 干涉的出现为病毒防治提供了一种新的思路。 RNAi 在抵抗动物病毒， 提高动物抗病能力和畜牧业经济效益方面具有 重大意义。 发明内容

本发明的目的是提供一种制备抗蓝耳病转基因 猪的方法。

为实现上述目的， 本发明首先提供一种转基因细胞， 其含有编码以蓝耳病 病毒 ORFlb、 ORF5、 ORF6或 ORF7为干扰靶基因的 shRNA的 DNA。 优选所 述干扰靶基因为 SEQ ID No.l、2、3和 /或 4所示的序列。更优选，所述编码 shRNA 的 DNA序列如序列表 SEQ ID No.6 & 7、 SEQ ID No.8 & 9、 SEQ ID No.lO&ll或 SEQ ID No.l2&13所示。

通过上述编码 shRNA的 DNA序列克隆到带有重组酶识别序列的重组载体 中， 转化宿主细胞， 获得转基因细胞。 在本发明实施例中， 将上述编码 shRNA 的 DNA接入到 ρΡΝΤΠΙ载体中。

上述细胞为哺乳动物体细胞， 例如胎儿成纤维细胞。 对于制备抗蓝耳病转 基因猪而言， 优选选择猪胎儿成纤维细胞。

进一步本发明提供一种制备克隆胚胎的方法， 其以上述转基因细胞为核移 植供体细胞， 离体的卵母细胞为核移植受体细胞， 通过核移植技术获得克隆胚 胎。

进而， 通过将上述方法制备的克隆胚胎通过非手术法 移入家畜子宫内进行 妊娠， 获得转基因家畜。

本发明还提供一种优选地对蓝耳病病毒具有显 著抑制作用的 shRNA, 编码 该 shRNA的 DNA序列如序列表 SEQ ID No.6 & 7、 SEQ ID No.8 & 9、 SEQ ID No.lO&l l或 SEQ ID No.l2&13所示。 将所述 DNA序列克隆到表达载体可以获 得编码 shRNA的重组载体， 进而制备得到转基因细胞。 结果表明这些细胞具有 显著的抗蓝耳病病毒能力。

本发明通过筛选小干扰 RNA， 获得了对蓝耳病病毒具有显著抑制活性的 shRNA; 通过将编码所述 shRNA的 DNA导入表达载体， 进而转化宿主细胞， 获得了转基因细胞； 以所述转基因细胞为核移植供体细胞， 离体的卵母细胞为 核移植受体细胞， 通过核移植技术获得克隆胚胎； 将该克隆胚胎通过非手术法 移入家畜子宫内进行妊娠， 获得转基因家畜。 本发明方法制得的转基因猪具有 显著的抗蓝耳病能力。

附图说明

图 1为 psiCHECK ^TM -2载体的质粒图谱；

图 2为 ORFlB、 5 , 6和 7连接入 pMD19-T Simple载体的 PCR鉴定结果， 其中， M为 DNA分子量标准， 泳道 1为接入 ORF1B的重组载体， 泳道 2、 3 为接入 ORF5的重组载体， 4、 5为接入 ORF6的重组载体， 6、 7为接入 ORF7 的重组载体；

图 3为 ORFlB、 5， 6和 7连接入 pMD19-T Simple载体的酶切鉴定结果； 图 4显示的是荧光标记的 siRNA转染 MARC-145细胞；

图 5显示的是 siRNA干扰靶点对目标基因表达的抑制率；

图 6为 pGenesil-1载体的质粒图谱；

图 7为将表 2-1 中的 DNA克隆入 pGenesil-1载体的酶切鉴定结果， M为 DNA分子量标准， 1〜4分别是 ORFlB-135、ORFlB-372、ORF 6-135和 ORF 6-169; 图 8为 pGenesil- 1+2+3+4载体图谱；

图 9为图 8载体双酶切 （ BamHl+MM )鉴定结果；

图 10为 ρΡΝΤΠΙ载体图谱；

图 11为接入 hU6+lB-372/6-135的 ρΡΝΤΠΙ的双酶切鉴定结果， 其中 Μ为 DNA分子量标准；

图 12显示的是攻毒后 72h细胞病变效应；

图 13每组接种病毒稀释液情况；

图 14显示的是 shRNA在 MARC-145细胞中干扰病毒生产情况；

图 15显示的是 24-96h四个时间段的病毒基因的拷贝数；

图 16显示的是 72h病毒基因的拷贝数；

图 17显示的是 pPNTIII lb-372和 pPNTIII 6-135转染细胞后 24h的 PKR和 OAS-1的 RT-PCR结果，其中 OAS-1泳道组从左到右分别为转染浓度为 50nM、 100nM、 150nM的 pPNTIII lb-372和 50nM、 100nM、 150nM的 pPNTIII6-135的 OAS-1基因的 RT-PCR结果， PKR泳道组从左到右分别为转染浓度为 50nM、 100nM、 150nM的 pPNTIII lb-372和 50nM、 100nM、 150nM的 ρΡΝΤΠΙ6-135的 PKR基因的 RT-PCR结果， （3 -actin泳道组从左到右分别为转染浓度为 50nM、 ΙΟΟηΜ, 150nM的 { ΡΝΤΙΠ lb-372和 50nM、 100nM、 150nM的持家基因 β -actin 的 RT-PCR结果；

图 18显示的是 M蛋白 western blot的结果；

图 19是 pPNTIII-shRNAlB-372和 pPNTIII-shRNA6-135 , 经 Aatll酶切图； 泳道从左到右分别为 DNA Marker, pPNTIII-shRNAlB-372酶切后、 酶切前的电 泳结果， 以及 pPNTIII-shRNA6-135酶切后、 酶切前的电泳结果；

图 20为整合 pPNTIII-shRNAlB-372和 pPNTIII-shRNA6-135阳性细胞克隆 的二次 PCR鉴定结果， M为 DNA Marker其它各泳道为不同细胞克隆点的鉴定 情况；

图 21为整合 pPNTIII-4shRNA联合质粒的阳性细胞克隆的 PCR鉴定结果， 各泳道为不同细胞克隆点的鉴定情况；

图 22为转基因克隆猪；

图 23转基因克隆猪 PCR扩增结果， 从左到右 1-7泳道分别是 1-7头克隆猪 个体的 PCR鉴定情况；

图 24为来自转基因猪个体的成纤维细胞攻毒后 72h细胞病变效应， 其中 1 号为转基因阴性猪， 3-7号为转基因阳性猪；

图 25为 12-120h九个时间段的病毒基因 lb的表达水平，其中 1号为转基因 阴性猪， 3-7号为转基因阳性猪；

图 26为 lb蛋白 western blot的结果， 其中 1号为转基因阴性猪， 3-7号为 转基因阳性猪。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容， 但不应理解为对本发明的限制。 在 不背离本发明精神和实质的情况下， 对本发明方法、 步骤或条件所作的修改或 替换， 均属于本发明的范围。

若未特别指明， 实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所 熟知的常规 手段， 所用试剂均可从商业途径获得。

材料: _ — MARC-145细胞购于北京信得威特科技有限公司技� ��中心；

双荧光素酶报告基因表达载体 psiCHECK ^TM -2购于 Promega公司 （货号 C8021 );

Dual-Luciferase Reporter Assay System购于 Promega公司 （货号 El 910)；

DharmaFECT Duo 转染试剂购于 Thermo公司 （货号 T-2010-01);

pMD™ 19-T Simple Vector购自 Takara公司 （ D 104 );

shRNA表达载体 pGenesile- 1载体购于武汉晶赛生物工程技术有限公司； 引物合成和序列测定由上海生工完成；

T4DNA连接酶为 Biolabs公司产品； Taq酶和核酸内切酶为 Takara公司产品

质粒纯化及回收试剂盒为 Omega公司产品；

酶切、 连接、 回收、 转化、 PCR扩增等常规分子生物学实验操作步骤详见《 分子克隆 (第 三版)》。 实施例 1

1. siRNA干扰靶点的筛选

1. 1 RNA干扰靶基因的选择

近五年来，在我国流行的蓝耳病病毒 85%以上均属于 JXwn毒株型，该毒株 属于高致病性毒株。 本发明选择该病毒的主要结构蛋白基因 （ORF5 , 6, 7 )及 RNA聚合酶基因 （ORFlb )为干扰靶基因。

1. 2 siRNA序列的设计与合成

虽然以 JXwn毒株型为目标，但为实现所选干扰靶点利� �的最大化，避免因 不同毒株间的序列差异而限制 RNAi效应， 因此， siRNA的靶序列尽量选择在不 同毒株间较为保守的区域。 选择标准以不同毒株间完全一致的序列为最佳 ， 如 果达不到该要求， 至少满足在不同毒株中 21个核苷酸只有至多 1个的错配， 所 设计的 siRNA与已知的任何宿主基因都没有同源性。

利用 Invitrogen公司在线软件针对每个目标基因设计 5条 siRNA干扰序列， 共 20条（如表 1-1所示）， 合成由上海吉玛制药技术有限公司完成。

表 1-1 siRNA序列

siRNAs sense antisense

lb-135 5' -GGACAUGCUCAAGGUUCAAdtdt-3 ' 5， -UUGAACCUUG AGCAUGUCCdtdt-3 ' lb-372 ' 5， -CCAC AUG A AGGC A AGU A AUdtdt-3 ' 5， -AUUACUUGCCUUCAUGUGGdtdt-3 ' lb-761 5， -GCCCUCUAGAUGAGGUGUUdtdt-3 ' 5' -AACACCUCAUCUAGAGGGCdtdt-3 ' lb-947 5' '-CCUUGCUCCCUACUUGUAAdtdt-3 ' 5， -UUACAAGUAGGGAGCAAGGdtdt-3 ' lb-1153 5' ' -GCAGGUACAACGCUGCAAUdtdt-3 ' 5' -AUUGCAGCGUUGUACCUGCdtdt-3 '

5-252 5' -GGUAUGUCUUGAGUAGCAUdtdt-3 ' 5' -AUGCUACUCAAGACAUACCdtdt-3 '

5-289 5' -GGCUGCGCUGAUUUGCUUUdtdt-3 ' 5' -A A AGCA A AUCAGCGCAGCCdtdt-3 '

5-295 5， -GCUGAUUUGCUUUGUCAUUdtdt-3 ' 5 '-AAUGACAAAGCAAAUCAGCdtdt-3

5-342 5 ^: ' -GCUACUCUUGUACCAGAUAdtdt-3 ' 5' -UAUCUGGUACAAGAGUAGCdtdt-3 '

5-463 5' -CCUCAAGAGAGUUGUGCUUdtdt-3 ' 5' -AAGCACAACUCUCUUGAGGdtdt-3，

6-95 5， -GCACUUUGAGAGCACAAAUdtdt-3 ' 5' -AUUUGUGCUCUCAAAGUGCdtdt-3 '

6-135 5' -GCAGUAGUUGCACUUCUUUdtdt-3 ' 5， -AAAGAAGUGCAACUACUGCdtdt-3 '

6-169 5' -CC AUAG A A ACCUGG A A AUUdtdt-3 ' 5， -AAUUUCCAGGUUUCUAUGGdtdt-3，

6-196 5 ^: ' -CCAGAUGCCGUUUGUGCUUdtdt-3 ' 5' -AAGCACAAACGGCAUCUGGdtdt-3 '

6-285 5， ' -GCAAAUGAUAACCACGCAUdtdt-3 ' 5， -AUGCGUGGUUAUCAUUUGCdtdt-3 '

7-56 5， -GCCAAAUGCUGGGUAAGAUdtdt-3 ' 5， -AUCUUACCCAGCAUUUGGCdtdt-3 '

7-66 5 ^: ' -GGGUAAGAUCAUCGCCCAAdtdt-3 ' 5， -UUGGGCGAUGAUCUUACCCdtdt-3 ' 5 ' -CCCUCUAGCGACUGAAGAUdtdt-3 ' 5 '-AUCUUCAGUCGCUAGAGGGdtdt-3， 5， -GCAAUUGUGUCUGUCGUCGdtdt-3 ' 5， -CGACGACAG ACACAAUUGCdtdt-3， 5， -GAUCCAGACUGCCUUCAAUdtdt-3 ' 5 '-AUUGAAGGCAGUCUGGAUCdtdt-3， 5 '-UUCUCCGAACGUGUCACGUdtdt-3 ' 5 '-ACGUGACACGUUCGGAGAAdtdt-3 '

1. 3 psiCHECK- 2-1B, -5, -6, -7载体的构建

psiCHECK™-2载体为起始优化 RNAi提供定量而快速的工具。 该载体可以 监控与报告基因 （海肾萤光素酶） 融合的靶基因的表达变化。 所研究的基因要 克隆在多克隆位点上。 针对所研究基因合成的 siRNA起始的 RNAi过程将导致 融合 mRNA的切断及其降解。 通过测量海肾萤光素酶活性的降低来监控 RNAi 的效果， 该载体的图谱如图 1所示。

选择 psiCHECK ^TM -2载体上的;^ ol和 Notl酶切位点，完成载体双酶切备用。 克隆目标基因 1B， 5 , 6和 7的引物设计如表 1-2所示（这四个基因的 PCR 引物均设计有 οΙ和 Notl酶切位点， 表中斜体字母）， 先将 1B， 5 , 6和 7连 接入 pMD19-T Simple载体， 经 PCR和酶切鉴定（图 2和 3所示）， 片段大小均 与目标基因符合， 测序。

测序鉴定正确的阳性质粒，经^ w?I和 Notl酶切,酶切产物亚克隆入经 和 No l -酶切的 psiCHECK-2 载体， 最后获得含有目标基因的四种质粒： psiCHECK-2-lb, psiCHECK-2-5 , psiCHECK-2-6和 psiCHECK-2-7。

表 1-2 引物序列

引物名 序列 （5'-3，）

ORFlbF CCCrCG^GTCTGGCGACCCGATTACC

ORFlbR TTGCGGCCGCAGTTCTTGCCAGGACACC

ORF5F CCCrCG^GGCCGTTCTATCTTGCTGTG

ORF5R TTGCGGCCGCTGTTCCGCTGAAACTCTG

ORF6F CCCrC04GATGCTCTAAAGGTAAGTCGC

ORF6R TTGCGGCCGCGGTTTACCACTCCCTGCTT

ORF7F CCCrCG^GAACGGCAAGCAGCAAAAG

ORF7R TTGCGGCCGCACAGGGCACAAGTTCCAG

1. 4 siRNA和 psiCHECK-2质粒共转染 MARC- 145细胞。

siRNA与对应的基因的质粒共转染 MARC-145 细胞， 釆用 96孔板进行转 染实验，转染试剂为 DharmaFECT Duo Transfection Reagent, 0.3ul转染试剂 /well; lOOng plasmid/well; ΙΟΟηΜ siRNA/welL 实验设定空白对照 （只转质粒）， 阴性 对照 （随机 siRNA+质粒）， 转染细胞如图 4所示。

1. 5各干扰靶点对载体表达基因抑制效果的检测 转染 48h后， 通过萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶-双荧光� �酶报告系统， 检测各干扰靶点对目标基因的抑制效果，经过 标准化变换之后，计算每个 siRNA 的干扰效率， 结果如图 5所示， 干扰效率在 60%以下的未显示。

本实验设计三个重复组， 每组包含三个样品孔重复， 共计 9个样品重复， 结果显示组内组间重复性非常好（放弃 1/69*3孔),实验的标准差很小，所得到的 结果真实可靠， 可以反映 siRNA对靶点序列抑制的真实情况（表 1-3所示）。

表 1-3 siRNA的干扰效率

苹已点 干扰效率

Flasmid only 0

Plasmid + scrambled siRMA 3.44士 1.12

Plasmid +1B-135 88.90 ±0.78

Plasmid -lB-372 88.90 ±1.20

Plasmid +1B-761 73.90 ±1.55

Plasmid +1B-947 64. lOzbl.09

Plasmid +1B-1153 60.50 + 1.23

Plasmid +5-252 21.01 ±0.97

Plasmid +5-289 10.90 ±2.98

Plasmid +5-295 S.39zbl.59

Plasmid +5-342 43.30 ±3.42

Plasmid +5-463 48.69 ±0.88

Plasmid 92.60 ±4.50

Plasmid +6-135 97.80士 2.34

Plasmid +6-169 95.50土 1.63

Plasmid +6-196 86.00士 3 58

Plasmid +6-285 87.50 ±0.98

Plasmid +7-56 7.90d l.08

Plasmi d +7-66 17.34土 3- 86

Plasmid +7-153 13.87土 1.68

Flasmid +7-204 9.07±1.21

Plasmid +T-222 24.83 ±3.75 上述实验结果表明， 10条 siRNA对目标基因的干扰效率在 60%以上， 并且 囊括基因 1B和基因 6的全部靶点。

最后选择抑制效率较好的四个靶点 1B-135 ( 89%), 1B-372 (89%), 6-135 (98%), 6-169 (96%)， 进行 sh NA表达载体的构建。

2. shRNA表达载体的构建

2.1 single shRNA表达载体 pGenesil- 1的构建

单个 shRNA载体的构建以 pGenesil-1载体为骨架（如图 6所示；)，首先将该 载体进行 Bamm和 Hindltt双酶切处理。

合成 4对编码短发夹 RNA ( shRNA ) 的 DNA单链序列 （如表 2-1所示）， 退火成 dsDNA, 克隆入经 Bamm和 Hindm双酶切后的 pGenesil- 1载体， 酶切 鉴定如图 7所示。

表 2-1编码 shRNA的 DNA单链序列

名称 编码 shRNA的 DNA单链序列 （5' -3')

ORF1B-135 Top: ^TCiiGGACATGCTCAAGGTTCAAttcaagagaTTGAACCTTGAGCATGTCCTTTTT^ Bottom: ^^mAAAAGGACATGCTCAAGGTTCAAtctcttgaaTTGAACCTTGAGCATGTCCi;

ORF1B-372 Top: ^^iXCACATGAAGGCAAGTAATt tcaagagaATTACTTGCCTTCATGTGGTTTTT^

Bot tom: ^^TAAAAACCACATGAAGGCAAGTAATtc tct tgaaATTACTTGCCTTCATGTGGi;

ORF 6-135 Top: tcaagagaAAAGAAGTGCAACTACTGCTTTTT/i

Bot tom: ^^OTAAAAAGCAGTAGTTGCACTTCTTTtctc t tgaaAAAGAAGTGCAACTACTGC^

ORF 6-169 Top: ^^CiXCATAGAAACCTGGAAATTt tcaagagaAATTTCCAGGTTTCTATGGTTTTT l

Bot tom: ^^rAAAAACCATAGAAACCTGGAAATTtctc t tgaaAATTTCCAGGTTTCTATGGi;

2. 2 multiple shRNA表达载体的构建

multiple shRNA表达载体以 1B-135 , 1B-372, 6-135 , 6-169为干扰靶点， 以 hU6, mU6, h7SK, hHl为启动子， 该载体如图 8所示， 酶切鉴定如图 9所 示 （ 1 , 2 , 3 : Loxp+ORFlB-135+ ORF 1 B-372+ORF6- 135+ ORF6-169 BamHl+Mlul )。

首先分别构建一个载体编码一条 shRNA质粒产品， 测序， 挑选测序正确的 产品，亚克隆构建一个载体编码多条 shRNA质粒产品，一条载体编码多条 shRNA 质粒的构建由武汉晶赛生物工程技术有限公司 完成。

2.3. pPNTIII载体的构建

选择含有 Ιοχρ位点的载体 ρΡΝΤΠΙ (图 10 ), 将测序正确的 pGenesil-1质粒 进行 coRl和// mffll双酶切， 将切下的目标片段（启动子 hU6+lB-372/6-135 ) 插入到 ρΡΝΤΠΙ载体的 EcoRl和 Hindlll双酶切位点， 酶切鉴定如图 11所示。 类似的方法分别获得质粒 ρΡΝΤΠΙ-shRNA- 1 b- 135、 pPNTlII-shRNA- 1 b-372、 pPNT III-shRNA-6-135、 pPNTlII-shRNA-6-169及 pPNTffl-4shRNA。

3 shRNA对病毒基因抑制效果研究

3. 1. 细胞病变效应 （CPE )

为了研究 shRNA对细胞病变效应 （CPE, cytopathic effect ) 的影响， 将质 粒 pPNTlII-shRNA-lb-135、 pPNTlII-shRNA-lb-372 , pPNTlII-shRNA-6-135 , pPNTlII-shRNA-6-169及 pPNTIII-4shRNA转染 MARC- 145细胞，每孔转染 4.0ug ( 6孔板），每个质粒三个重复，质粒 pPNTlII-shRNA empty (无 shRNA插入）和 pPNTlII-shRNA scrambled (表达非特异 shRNA)为阴性对照， 并做相同处理， 转 染试剂为 Lipofectamine™ 2000。 转染 5小时后 , 细胞感染 JXWN毒株第 5代， 该毒株的 TCID50为 10 ⁴ · ⁵ , 每孔接种 PRRSV 0.35 MOI ( 6孔板）， 每天显微镜下 观察细胞形态， 攻毒后 72h, 病毒感染细胞以及转染阴性对照细胞开始出现 明显 的拉网状和细胞脱落的病变，而转染 shRNA表达质粒的细胞未见明显病变效应， 如图 12所示。

3. 2. 病毒滴度 ( Tissue culture infectious dose, TCID50 )检测

感染前 24h在 96孔培养板接种 MARC-145细胞（ 10 ⁴ 细胞 /孔）， 收集 3.1实 验中病毒感染 72h的细胞培养液， 并进行倍比稀释（10 -10_ ¹⁽⁾ )， 接种到 96孔板 (100 ul/孔)， 每个稀释度接种 8个孔。 平行设定只接种病毒未转染 shRNA以及 转染阴性 shRNA的对照组， 共五组（ 1B-135+V, 1B-372+V, 6-135+V, 6-169+V, 4shRNA+V )，每组接种情况如图 13所示。 观察细胞病变，连续监测 7天， TCID50 计算方法参考 Reed-Munch法。

结果表明： 4shRNA ( TCID50为 10 ^{1 5} )、 1B-372 ( TCID50为 10 ^{1 7} )、 1B-135 ( TCID50为 10 ² · ³ )、 6-135 ( TCID50为 10 ^{4 14} )及 6-169 ( TCID50为 10 ⁴²⁷ ) 转 染组中病毒滴度比病毒对照组（TCID50为 10 ⁴ ' ⁵ )分别降低了 1000倍、 600倍、 150倍、 2.3倍及 1.7倍。 该结果证实了的 shRNAs能有效抑制 MARC-145细胞 中病毒复制， 如图 14所示。

3. 3. 反转录及 Real-time PCR分析

为了检测 shRNAs能否在 MARC-145细胞中有效抑制病毒基因 mRNA表达， ρΡΝΤΠΙ 1 b- 135、 ρΡΝΤΠΙ 1 b-372、 ρΡΝΤΠΙό- 135、 ρΡΝΤΠΙό- 169、 ρΡΝΤΠΙ scrambled、 ρΡΝΤΠΙ empty质粒分别转染 6孔板细胞， 转染后 4h进行 PRRSV攻毒实验， 非转染细胞施行同样的病毒感染处理。

感染后 24-96h，提取各时间段细胞总 RNA，操作过程参照 Rneasy Micro Kit (Qiagen, USA) , 少量的污染的 DNA通过 RNase-Free DNase Set (Qiagen, USA)除 去， 根据 Promega反转录程序， 总体系 25ul, 42 °C 反应 1 h， 上海生工合成 Taq-Man探针和引物 （如表 3-1所示）。

表 3-1 引物和探针序列

引物或探针名 序列 （5'-3')

bRT-lbF ACCAGACCATGCTCGACATG

bRT-lb CAGGGAATTGCAGCGTTGTA

bRT-lbP FAM-ACGTGCCGGTTCAACGTTCCAGC-TAMRA bRT-5F CTCACCACCAGCCATTTCCT

bRT-5R CAAGACATACCGCCCGTGAT

bRT-5P FAM-TGGTCTGGCCACTGTGTCCA-TAMRA

bRT-6F CGGGCTTTCATCCGATTG

b T-6R ATGTGCCGTTGACCGTAGTG

bRT-6P FAM-ACCACGCATTTGTCGTCCGGC-TA RA

"RT-7F CCGGAGAAGCCCCATTTC

bRT-7R CAGACACAATTGCCGCTCACT ^b RT-7P FAM-TGACGTCAGGCATCACTTTACCC-TAMRA

cp-actinF CGGGCTTTCATCCGATTG

°P-actinR ATGTGCCGTTGACCGTAGTG

cP-actinP FAM-ACCACGCATTTGTCGTCCGGC-TAMRA ^b PRRSV lb， 5， 6, 7的引物和探针序列

。 持家基因 β -actin的引物和探针序列序列， F， R和 P 分别代表正向引物， 反向引物和探 针

GCGGCCGC, Notl 酶切位点； CTCGAG, Xhol 酶切位点； cc 和 tt， 保护性碱基

FAM和 TAMRA, 荧光标记物 荧光定量 PCR在 ABI Prism7900HT检测系统 (Applied Biosystems, USA)运 行， 使用 TaqMan universal PCR master 混合物（Takara, Japan), 反应条件为 50°C 2 min; 95 °C 10 min; 95 °C 15 s, 60 °C 1 min, 共 40个循环。

Real-time PCR结果表明： 随时间的增加， 未转染 shRNA的攻毒组的病毒 lb和 6基因的表达量增加， 而转染 shRNAlb-135和 lb-372的攻毒组在攻毒后 24h就产生了抑制效果, 在攻毒后 72h， 与对照组相比， lb-135, lb-372, 6-135, 6-169使病毒表达量分别减少了 99.4%, 99.5%, 82%, 54%。 图 15为 24, 48, 72, 96h四个时间段的病毒基因的表达情况。

另外， 1B-135和 1B-372两个靶点在减少 1B基因表达的同时， 也明显减少 了 5， 6和 7基因的表达， 如图 16所示。

3. 4. RNAi特异性检测

双链 RNA能被细胞识别并诱发细胞中干扰素的释放， 后者能被临近细胞作 为一种信号， 进而启动病毒防御措施， 依赖 RNA的蛋白激酶（PKR )及 2' -5' 寡腺甘酸合成酶（OAS-1 ) 也能通过结合双链而被激活， 进而导致 mRNA降解 以致翻译抑制。 研究认为 PKR和 OAS-1的激活需要至少 30nt长的序列。

dsRNA ( 21-23nt )引发 RNAi并能避免 PKR和 OAS-1的激活， 为排除干扰 素系统的抗病毒活性，本实验以检测 PKR和 OAS-1的表达水平为目标，以 293-FT 为宿主细胞， mRNA为转染 pPNTIII lb-372和 ρΡΝΤΠΙ6-135 ( 3个浓度分别为 50ηΜ, ΙΟΟηΜ, 150nM ) 24h后的细胞裂解物， 图 17为 RT-PCR检测结果， 随 shRNA浓度浓度的增加， PKR和 OAS-1的转录本水平未明显增加

随后， 进行了 PKR和 OAS-1转录本的实时荧光定量 PCR检测， 表 3-2为 Taqman探针序列， real-time PCR结果显示最高浓度的 shRNA ( 150nM )确实增 加了这两个转录本的表达， 然而， 与对照相比， 无统计学意义。 该结果证实了 PRRSV基因表达减少是 RNAi引起的， 并非干扰素相关的防御机制的作用。

表 3-2 Taqman探针序列

名称 探针序列 5'-3'

OAS-1 FAM-TTCCTGAAGCAGCGCCCCACC-TAMRA

PKR FAM-TCAGCAGGTTTCTTCATGGAGGAA-TAMRA β-actin FAM-TCTGGCGGCACCACCATGT-TAMRA

3. 5病毒蛋白翻译的抑制

为了研究 shRNA表达载体对病毒蛋白翻译的抑制效果， 对 pPNTlII-shRNA 质粒转染后 72 h的细胞提取总蛋白， 然后执行 M蛋白的 western blot分析， 病 毒感染细胞， 阴性对照 （包括 ρΡΝΤΠΙ negative和 ρΡΝΤΠΙ empty ) 细胞组均呈 现大小为 18-19 kDa的 M蛋白带， 对比之下， 转染 shRNA表达质粒（ ρΡΝΤΠΙ lb-135, pPNTlIIlb-372, ρΡΝΤΠΙ6-135, ρΡΝΤΐΠ6-169, pPNTlH4-shRNA ) 的细胞 组没有目标带出现， 如图 18所示。

4. 体细胞核移植生产抗 PRRSV转基因猪

4. 1. RNAi载体 ρΡΝΤΠΙ的单酶切、 线性化

两 个 高 效 的 干 涉 靶 点 质 粒 ， 包 括 pPNTIII-shRNAlB-372 和 pPNTIII-shRNA6-135, 经 Aatll酶切 （37°C酶切 3h )， 线性化， 回收， 目的是线 性目标片段整合到基因组， 图 19为两质粒单酶切图。

4. 2. 转 RNAi载体阳性细胞的筛选与鉴定

将 线 性 化 的 pPNTIII-shRNAlB-372 、 pPNTIII-shRNA6-135 及 pPNTIII-4shRNA转染大白猪的胎儿成纤维细胞系 NDB1和 PCB1 ( NDB1F0,新 美系大白 δ ; PCB1F0, 新美系长白？）， 进行大约 8d左右的 G418筛选， 消化 单克隆点， 对转基因阳性的细胞克隆点进行目的基因整合 的 PCR检测， 扩增引 物及 PCR鉴定结果如下：

整合 pPNTIII-shRNAlB-372和 pPNTIII-shRNA6-135的阳性细胞鉴定引物为 Positive Sense primer: CTGTTCCACATACACTTCATT CT; Positive Antisense primer: CACAGATGCGTAAGGAGAAA , 扩增长度为 739bp。 扩增结果显示第 一批转染共获得了 9个转基因阳性克隆点 ( 6-135: 1， 2, 3 , 6, 20, 23 , 46; 1B-372: 7， 35 ), 将第一次 PCR结果阳性的细胞克隆点进行二次 PCR鉴定， 如 图 20所示。

整合 pPNTIII-4shR A 联合质粒的阳性细胞鉴定引物为 MS2-sense： 5-CAGTTAGGGTGGGTTTCC-3 ； MS2-antisense : 5-GAAGATGGCTGTGAGG GA -3 , 扩增长度为 784bp, 筛选的全部细胞克隆点均为阳性， 如图 21所示。 4. 3. 转基因猪制备

转基因猪制备方法可以釆用显微注射法、 体细胞克隆法、 精子载体法等方 法。 本发明优选体细胞核移植法制备转基因猪， 但不限于体细胞核移植法。

以上述转基因阳性细胞为核移植供体细胞， 以体外成熟的初情期前母猪卵 母细胞为核移植受体细胞， 将核移植供体细胞移入去核的卵母细胞， 经电融合 与激活， 构建成克隆胚胎， 挑选形态优良的克隆胚胎用非手术法移入自然 发情 的经产母猪子宫内进行妊娠,非手术法胚胎移� �步骤为用无巴比妥略作麻醉后， 从受体母猪阴道向子宫颈管道插入外径 10毫米的粗导管， 然后将直径 5亳米的 细导管插入粗导管内侧， 伸入到子宫体或一侧子宫角。 将克隆胚胎连同 2 亳升 保存液一起通过细导管移植进去， 具体是用干冰产生出来的二氧化碳经过导管 将胚胎吹入到子宫内 1-3分钟。 胚胎移植后 30天 B型超声波检测妊娠与否。 移植日期， 移植胚胎数等见表 4-1所示。

表 4-1核移植情况

耳号 胚胎移植曰期 发情曰期 核移植曰期 体细胞系 移植胚胎数

2064 09.10.21 09.10.21早 09.10.20 NDB 1-6- 135-46 391

2040 09.10.22 09.10.22早 09.10.21 PCB1-1B-372-35 416

2033 09.10.27 09.10.27 09.10.26 PCB 1-1B-372-35 259

2445 09.10.29 09.10.29 09.10.28 PCB1-1B-372-7/35 290

2100 09.10.30 09.10.30 09.10.29 NDB 1-6- 135-20/23 396

PCB 1-1B-372-7

2098 09.10.31 09.10.31 09.10.30 NDB1-6-135-20 418

PCB1-1B-372-35

2116 09.11.2 09.11.1下 09.10.31 PCB1-1B-372-35/7 368

2054 09.11.2 09.11.2 09.11.1 PCB1-1B-372-7 355

2460 09.11.3 09.11.3早 09.11.2 PCB1-1B-372-7 372

2163 09.11.5 09.11.4 09.11.3 NDB 1-6-135-3 289

2159 09.11.5 09.11.5 09.11.4 NDB 1-6- 135-1 358

2015 09.11.7 09.11.7 09.11.5/6 NDB1-6-135-1 500

2444 09.11.12 09.11.12 - 09.11.11 NDB 1-6- 135-2/5 343

2174 09.11.13 09.11.13 09.11.12 NDB1-6-135-8/15 361

2032 09.11.16 09.11.16 09.11.15 NDB1-6-135-3/5/8/46 325

2086 09.11.18 09.11.18 09.11.17 NDB1-6-135-38 255

2407 09.11.20 09.11.20 09.11.18/19 NDB 1-6- 135-41 381 . 4.克隆猪出生状况

2010年 4月 24、 25日， 共出生 7头克隆猪， 健康状况良好， 克隆猪图片见 —―. —- , 丄 Λ / υ υ L/ /

22所示。

4. 5 转基因克隆猪阳性检测

保留克隆猪脐带组织， 然后提取其基因组， 根据表 4-1的记录可知， 转染的 RNAi载体是 1B-372 , 利用鉴定阳性细胞克隆的 PCR引物 (1B-372)对克隆猪进 行 PCR检测， 目标片段大小为 739bp, 结果如图 23所示。 该结果证实目的基因 整合到克隆猪的基因组中。 目前共获得转基因阳性猪 5头。

5. 阳性转基因克隆猪的抗病能力检测

5. 1. 构建稳定表达猪繁殖与呼吸综合症特异性 shRNA转基因猪胎儿成纤维细胞 系

对生产的转基因猪仔（ 1号， 3-7号），其中 3-7号为转基因阳性猪（实验猪）， 1号为转基因阴性猪 （对照猪）， 在不超过 1 日龄时分别取其耳组织， 建立成纤 维细胞系。

5.2. 细胞感染实验

分别对 1号， 3-7号猪来源的胎儿成纤维细胞系， 进行攻毒实验， 感染毒株 代次、 TCID50、 以及每孔接种量（6孔板， 0.35 MOI/孔）均与 3.1中所述一致， 镜下观察细胞形态， 攻毒后 72h， 对照 1号猪来源的成纤维细胞出现明显细胞毒 症状（拉网状和细胞脱落）， 而 3-7号猪来源的胎儿成纤维细胞未见明显病变效 应， 如;图 24所示。 -

5.3. lb基因表达水平分析

对 1号、 3-7号猪来源的细胞， 分别收取病毒感染后 12-120h的细胞， 提取 各时间段细胞总 RNA, 引物探针以及操作过程见 3.3所述。

Real-time PCR结果如图 25所示： 随时间增加， 1号攻毒组细胞的病毒 lb 基因的表达量增加， 而 3-7号在攻毒后 24h就产生了抑制效果， 在攻毒后 72h， 与对照组 1号相比， 3-7号细胞的病毒 lb基因表达分别减少了 61.19%, 66.21%, 58.07%, 54.80%, 76.35%。

5.4 lb蛋白翻译水平检测

对 1号、 3-7号猪来源的细胞， 病毒感染 72h， 提取细胞总蛋白， 然后执行 lb蛋白的 western blot分析， 1号猪（转基因阴性）呈现明显的 lb蛋白带， 对比 之下， 3-7号猪的细胞没有目标带出现， 如图 26所示。 工业实用性 本发明提供了抗蓝耳病转基因猪的制备方法， 通过该方法获得的转基因猪 具有显著的抗蓝耳病的能力， 可以在畜牧业上广泛使用。