ESTADO DE LA TECNICA Las cefalosporinas son un grupo de antibióticos de gran importancia terapéutica producidos industrialmente por fermentación de A. chryso- genum o alternativamente mediante la expansión química del anillo tiazo- lidínico de las penicilinas generando un anillo dihidrotiazínico. Mediante la incorporación de cadenas laterales en diferentes posiciones de los anillos- lactámico y dihidrotiazínico se pueden sintetizar un ingente número de cefalosporinas con mayor capacidad antibiótica o mejores propiedades farmacocinéticas. La preparación de estos antibióticos semisintéticos ha despertado un gran interés en los últimos años, lo que ha conducido a una optimización e innovación en los procedimientos y métodos utilizados para su preparación.

El ácido 7-aminodesacetoxicefalosporánico (7-ADCA) es uno de los sustratos utilizados para la preparación de cefalosporinas caracterizadas por la ausencia de funcionalización en la posición 3. Debido a esta ausencia de funcionalización, el 7-ADCA es sintetizado generalmente mediante la ex- pansión del anillo tiazolidínico de penicilinas obtenidas por fermentación, mientras que el resto de los compuestos cefalosporánicos son preparados a partir de cefalosporinas naturales obtenidas por fermentación. Habi- tualmente el 7-ADCA es producido a partir de penicilina G o V, requiriendo de 4 a 5 etapas químicas para expandir el anillo de 5 miembros carac-

terístico de las penicilinas hasta el anillo de 6 miembros característico de las cefalosporinas. Dicho proceso, como muchos de los procesos químicos, pre- senta una serie de desventajas frente a los procesos biológicos : se trata de un proceso complejo con múltiples etapas, requiere la utilización de reac- tivos químicos costosos y tóxicos, utiliza solventes orgánicos nocivos para el medio ambiente y durante el proceso se originan subproductos e impu- rezas que requieren complejos sistemas de purificación. Como alternativa al proceso químico se han descrito diferentes estrategias de obtención de 7- ADCA basados en la fermentación de microorganismos y bioconversión. Se trata de procedimientos equivalentes a los desarrollados en los años 80 para la obtención de ácido 6-aminopenicilánico (6-APA) por hidrólisis enzi- mática de las penicilinas G y V o a las estrategias descritas en los años 90 para la obtención de ácido 7-aminocefalosporánico (7-ACA) por hidrólisis enzimática de la cadena lateral de ácido D- (a)-aminoadipico de la cefalosporina C. En este último caso la reacción está catalizada por las enzimas D-aminoácido oxidasa (DAO), la cual participa en la transami- nación que transforma la cadena lateral de ácido aminoadípico en ácido glutárico, y glutaril-7-ACA acilasa, la cual hidroliza la cadena lateral de ácido glutárico generando 7-ACA : La obtención de cepas de A. chrysogenum superproductoras de des- acetoxicefalosporina C (DAOC), precursor directo del 7-ADCA, es com- pleja debido a la existencia en dicho microorganismo de la enzima bi- funcional desacetoxicefalosporina C sintasa (DAOCS o expandasa), la cual expande e hidroxila el anillo tiazolidínico generando desacetilcefalosporina C (DAC). Un problema equivalente se plantea en actinomicetos, donde la presencia de enzimas capaces de metoxilar la posición 7 de la molécula de cefalosporina formando cefamicinas, impide la obtención de cepas super- productoras de DAOC. La mayoría de los intentos de obtención de 7-ADCA mediante un proceso enzimático o fermentativo se han centrado en la uti- lización de enzimas con actividad DAOCS, las cuales catalizan la expansión

del anillo tiazolidínico de 5 miembros presente en las penicilinas al anillo dihidrotiazínico de 6 miembros presente en las cefalosporinas.

Teóricamente, el 6-APA producido directamente por fermentación y/o hidrólisis enzimática de las penicilinas G o V, podría ser expandido a 7- ACA mediante la utilización de DAOCS, pero desafortunadamente ninguna de las DAOCS descritas hasta el momento reconocen el 6-APA como sustrato y por tanto son incapaces de efectuar la expansión del anillo tiazolidinico. Por otro lado, ha sido descrita la posibilidad de expandir las penicilinas G o V, tanto in vitro como in vivo, mediante una DAOCS para formar las correspondientes cefalosporinas G o V, las cuales pueden ser hidrolizadas enzimáticamente a 7-ADCA. No obstante, dada la elevada especificidad de sustrato de la DAOCS, las eficiencias y productividades de estos sistemas se encuentran muy lejos de una aplicación industrial.

Recientemente ha sido descrita la producción de adipoil-7-ADCA mediante la utilización de una cepa recombinante de P. chrysogenum en la cual se ha expresado la DAOCS de S. clavuligerus. La adición de ácido adípico durante la fermentación (en lugar de los ácidos fenilacético o fenoxiacético que se utilizan en la producción de las penicilinas G o V respectivamente) origina la producción de adipoil-6-APA, molécula que es reconocida in vivo por la DAOCS originando la expansion del anillo tiazolidínico y produciendo adipoil-7-ADCA. Posteriormente se purifica el adipoil-7-ADCA del resto de componentes del medio de fermentación (en particular del adipoil-6-APA) y se hidroliza enzimáticamente mediante la utilización de una adipil acilasa generando 7-ADCA. Aunque dicho proceso presenta elevadas eficiencias tanto de producción como de expansion enzimática e hidrólisis de la cadena lateral, presenta como principales des- ventajas : (I) la necesidad de adicionar una cadena lateral de precio elevado como es el ácido adípico y (II) la producción de mezclas de adipoil-6-APA y adipoil-7-ADCA que, debido tanto a la similitud de su estructura como a su comportamiento en hidrólisis enzimática con adipil acilasa, es necesario separar previamente, lo cual aporta una complejidad añadida al proceso.

ESTADO DE LA TÉCNICA Las rutas biosintéticas de penicilinas, cefalosporinas y cefamicinas (esquema 1) han sido estudiadas detalladamente en los últimos años, con lo que se ha alcanzado un conocimiento profundo de los pasos biosintéticos implicados. Los antibióticos P-lactamicos derivan de tres aminoácidos precursores : ácido L-a-aminoadípico, L-cisteína y L-valina, los cuales son condensados para formar el tripéptido precursor #-(L-α-aminoadipil)-L- cisteinil-D-valina (LLD-ACV) por la enzima ACV sintetasa (ACVS). Se- guidamente, el tripéptido lineal es ciclado oxidativamente por acción de la enzima isopenicilina N sintasa (IPNS) dando lugar a isopenicilina N (IPN).

Este compuesto posee una débil actividad antibiótica y es el precursor tanto de penicilinas como de cefalosporinas y cefamicinas. La transformación de IPN en penicilina G tiene lugar mediante el intercambio de la cadena lateral de ácido α-aminoadípico por otra de ácido fenilacético, previamente activado como fenilacetil-CoA, en una reacción catalizada por la enzima acil-CoA : 6-APA aciltransferasa. AcidotVa-Aminoadlpico L-Cistelna L-Valina ACVS (pcbAB) LU H IiN O 8 (LeWninoadipR) Lvenil-D valina (LLD-ACV) W C=I IPNS (pcbC) P.chrysogenum H N IPN 11T' ion g Isopenicilina N (IPN) Penicilina G (Pen G) lPNE () H 1*2N-t O Peniålina N (Pen N) = clawllgerus I H. lacbmdurans A chrysogrwn DAOCS (celE) DAOCSIDACS (celEF) DesacnoxXpom C ou (DAOC) com g DACS(cefF,, li 1 Desacetilosporina C (OAC) Desacebfcefalosporina C (DAC) DAC-CT(cmdi),, O-Carbamoil-DACOCDACj DAC1T () , DAC-AT (ceB) OCDACH (cmd) 1, 7-a-lidroxi-ODAC MS,, 1 C Cafalosporina C (CPC) Cefamicina C ESQUEMA 1

Por su parte, la biosíntesis de cefalosporinas y cefamicinas a partir de IPN se inicia con la isomerización de la cadena lateral de L-a-aminoadipilo en D-a-aminoadipilo, catalizada por la enzima IPN epimerasa (IPNE). La penicilina N formada es transformada en DAOC por acción de la enzima DAOCS, la cual convierte el anillo tiazolidinico de 5 miembros típico de las penicilinas en el anillo dihidrotiazínico de 6 miembros de cefalosporinas y cefamicinas. La siguiente reacción consiste en la hidroxilación de la mo- lécula de DAOC para generar desacetilcefalosporina C (DAC) y está catali- zada por la enzima DAC sintetasa (DACS) o hidroxilasa. La acetilación de la DAC con la consiguiente formación de cefalosporina C (CPC) es el paso biosintético final en los hongos productores de cefalosporinas. Esta reac- ción está catalizada por la enzima DAC acetiltransferasa.

La mayor parte de los genes que codifican para enzimas implicados en la biosíntesis de cefalosporina en A. chrysogenum han sido identi- ficados : pcbAB codifica para ACVS (Gutiérrez et al. 1991. J. Bacteriol.

173 : 2354-2365), pcbC codifica para IPNS (Samson et al. 1985. Nature 318 : 191-194), cefEF codifica para DAOCS/DACS (Samson et al. 1987.

Biotechnology 5 : 1207-1214) y cefG codifica para DAC acetiltransferasa (Gutiérrez et al. 1992. J. Bacteriol. 174 : 3056-3064). Los genes que codifican para las dos primeras enzimas de la ruta biosintética (pcbAB y pcbC) se encuentran agrupados en el cromosoma VI, mientras que cefEF y cefG, los cuales codifican para las enzimas que catalizan los dos últimos pasos de la ruta, se encuentran agrupados en el cromosoma II (Skatrud and Queener, 1989. Gene 78 : 331-338). No obstante, aún no ha sido identifi- cado el gen de A. chrysogenum que codifica para la actividad enzimática IPNE equivalente al gen cefD descrito en actinomicetos (Coque et al. 1993.

Mol. Gen. Genet. 236 : 453-458; Kovacevic et al. 1990. J. Bacteriol. 172 : 3952-3958). Las actividades DAOCS y DACS se encuentran localizadas en un único polipéptido (Scheidegger et al. 1984. J. Antibiot. 37 : 522-531) codificado por el gen cefEF en A. chrysogenum (Samson 1987. Bio- technology 5 : 1207-1214), mientras que en los microorganismos pro-

ductores de cefamicinas, dichas actividades están localizadas en dos poli- péptidos independientes codificados respectivamente por los genes cefE (Kovacevic et al. 1989. J. Bacteriol. 171 : 754-760; Barredo et al. 1991.

Microbiología 7 : 1-12; Ingolia T. D. et al. 1991. US5070020; Coque et al.

1993. Mol Gen. Genet. 236 : 453-458; Kimura et al. 1996. Appl. Microbiol Biotechnol. 44 : 589-596; Enguita et al. 1998. J. Bacteriol. 180 : 5489-5494) y cefF (Kovacevic et al. 1991. J. Bacteriol. 173 : 398-400). Los programas industriales de mejora de cepas de A. chrysogenum han dado lugar a reorganizaciones cromosómicas, las cuales originan patrones electroforé- ticos alterados en cepas con diferente producción de cefalosporina, no conociéndose en profundidad la relación existente entre dichas transloca- ciones y el nivel de producción de antibiótico (Mathison et al. 1993. Curr.

Genet. 23 : 33-41).

Los genes biosintéticos de cefalosporina han sido utilizados previa- mente para la mejora de la producción de una cepa industrial de A. chrysogenum (Skatrud et al. 1989. Biotechnology 7 : 477-485). En dicha cepa, que acumulaba una importante cantidad de penicilina N, se introdu- jeron por transformación copias adicionales de los genes cefEF y cefG consiguiendo incrementar la actividad enzimática DAOCS, disminuir la cantidad de penicilina N acumulada e incrementar notablemente la pro- ducción de CPC. También se han descrito mejoras de producción de CPC en A. chrysogenum mediante el incremento de oxígeno disponible gracias a la expresión de una hemoglobina bacteriana procedente de Vitreoscilla (DeModena et al. 1993. Biotechnology 11 : 926-929). Asimismo, se han desarrollado cepas de A. chrysogenum capaces de producir penicilina G mediante la expresión heteróloga del gen penDE de Penicillium chryso- genum (Gutiérrez et al. 1990. Mol. Gen. Genet. 225 : 56-64). El gen penDE codifica para la actividad enzimática acil-CoA : 6-APA aciltransferasa, la cual es capaz de intercambiar la cadena lateral de ácido a-aminoadípico presente en la molécula de isopenicilina N por otra consistente en ácidos aromáticos, como por ejemplo ácido fenilacético. Otro tipo de transfor-

mantes de A. chrysogenum de gran interés son aquellos capaces de producir directamente ácido 7-amino cefalosporánico (7-ACA) (Isogai et al. 1991.

Biotechnology 9 : 188-191). En este caso, A. chrysogenum fue transformado con los genes que codifican para las actividades D-aminoácido oxidasa (DAO) de Fusarium solani y glutaril-7-ACA acilasa (GLA) de Pseudo- monas diminuta. Dichos transformantes producen pequenas cantidades de 7-ACA, 7-ADCA y ácido 7-aminodesacetilcefalosporánico.

Uno de los compuestos de mayor interés en la industria farmacéutica es el 7-ADCA, el cual se utiliza como sustrato para la producción de cefalosporinas semisintéticas. El procedimiento industrial más utilizado para la producción de 7-ADCA consiste en la expansion del anillo tiazoli- dínico de la penicilina mediante métodos químicos. El punto de partida para la síntesis química de 7-ADCA es una solución acuosa de penicilina, la cual se oxida a sulfóxido de penicilina con un peróxido y seguidamente su anillo de 5 átomos de carbono se expande formando un anillo de 6 átomos (ácido 7-fenilacetamido desacetoxicefalosporánico o FADCH), en presencia de un catalizador químico apropiado. El FADCH purificado se somete a un trata- miento enzimático catalizado por la enzima penicilina amidasa o penicilina acilasa para la eliminación del enlace amídico presente en su molécula.

Como productos de la reacción se obtienen 7-ADCA y la cadena lateral. El último paso consiste en la purificación del 7-ADCA. AcidoLe-Arninoadípico L-Cisteína L-Valina ACVS (pcbAB) *L-a noadipil)-L-cistenii-D-valina (LLD-ACV) IPNS (pcbC) lsopeniciiina N (IPN) IPNE (cerD) H ru 0 d OOOH O. L-Ñ Penicilina N (Pen N) aXE DAOCS(cei ? S clavuligerus N. lactamdurans H HN," X) m Desacetocicefafosporina C (DAOC) ,,'--02+H20 D-Amino acido oxidasa NH, + H., O MW--- -. OH OOQH WH 2 0 2t F"Y V1 CL 2 HHS -CO + H; 0 Glutari I-7-ADCA CO Glutarit acilasa ho i Acido 7-amino desacetoxcefaiosDornico (7-ADCA ESQUEMA 2

Una de las claves para la sustitución del procedimiento químico descrito anteriormente por un proceso biológico de fermentación o biocon- versión consiste en la caracterización de los genes y enzimas implicados en la biosíntesis de cefalosporinas y cefamicinas. En este sentido ha sido descrita la purificación de las actividades enzimáticas IPNS, IPNE y DAOCS a partir de extractos acelulares de diversos organismos procariotas entre los que se incluye S. clavuligerus (Wolfe et al. 1985. US4510246; Wolfe et al. 1985. US4536476). Asimismo, ha sido descrita la clonación y caracterización de los genes cefE, los cuales codifican para DAOCS, de S. clavuligerus y Nocardia lactamdurans (Kovacevic et al. 1989. J. Bacteriol.

171 : 754-760; Coque et al. 1993. Mol Gen. Genet. 236 : 453-458).

A. chrysogenum expresa la enzima DAOCS capaz de expandir el anillo tiazolidínico de las penicilinas hasta el anillo dihidrotiazínico de las cefalosporinas. En este microorganismo está presente el gen cefEF el cual codifica para la enzima bifuncional DAOCS/DACS. Por tanto, el producto final de esta enzima es DAC y no DAOC como ocurre en los organismos productores de cefamicinas, los cuales presentan enzimas DAOCS y DACS separadas. Varios tipos de penicilinas han sido tratadas con un extracto acelular de A. chrysogenum obteniéndose las correspondientes cefalos- porinas (Demain et al. 1979. US4178210; Demain et al. 1979. US4248966; Demain et al. 1981. US4307192). Asimismo, han sido determinados una serie de parámetros de la enzima DAOCS/DACS de A. chrysogenum como punto isoeléctrico, peso molecular, composición de aminoácidos, relación entre las actividades hidroxilasa/expandasa y fragmentación peptídica (Wu- Kuang et al. 1988. US 4753881). A pesar de que se han realizado importan- tes esfuerzos en conseguir enzimas que posean separadas las actividades ex- pandasa e hidroxilasa, y que por tanto pudieran expandir la penicilina N a DAOC, los resultados obtenidos hasta el momento han sido totalmente infructuosos. Se ha sugerido la posibilidad de separar la información genética que codifica para DAOCS y DACS y expresar separadamente ambas actividades, si bien no existe descripción alguna al respecto.

Diferentes intentos han sido descritos para conseguir la expansión enzimática de penicilina G o V a su correspondiente desacetoxicefalospo- rina G o V utilizando DAOCS de diferentes orígenes. Recientemente se ha descrito la optimización de la expansion in vitro de un gran número de penicilinas, entre las que se encuentra la penicilina G, mediante el empleo de un extracto libre de células de S. clavuligerus NP 1, mutante deficiente en la producción de cefalosporinas (Cho et al. 1998. Proc. Natl. Acad. Sci.

USA. 11544-11548). Aunque en este caso se incrementan notablemente los rendimientos de expansión mediante un ajuste de las condiciones de reacción, dichos resultados están lejos de un posible uso industrial debido a la naturaleza y coste de los cofactores, bajos rendimientos del proceso de expansión y dificultades de aislamiento y purificación de la cefalosporina G en presencia de importantes concentraciones de penicilina G no expandida.

Las DAOCS naturales descritas hasta el momento actúan eficiente- mente sobre penicilina N, compuesto intermediario de la biosíntesis de cefalosporinas y cefamicinas no disponible comercialmente, pero no sobre las penicilinas producidas industrialmente por P. chrysogenum : penicilina G y penicilina V. La idea de modificar la especificidad de sustrato de la enzima DAOCS con la finalidad de que sea capaz de utilizar penicilina G como sustrato y expandirlo a fenilacetil-7-ADCA es compartida por una serie de grupos de investigación desde hace años (Cantwell et al. 1990.

Curr. Genet. 17 : 213-221), no obstante, su consecución aún no ha sido des- crita. La cadena lateral aromática del fenilacetil-7-ADCA podría ser fácil- mente eliminada mediante la enzima penicilina acilasa, originando 7- ADCA. Asimismo, los genes cefD y cefE de S. clavuligerus, los cuales codifican para las actividades enzimáticas IPNE y DAOCS, han sido simul- táneamente expresados en P. chrysogenum originando pequeñas cantidades de DAOC debido a la isomerización de IPN a penicilina N y posterior for- mación del anillo de 6 miembros característico de las cefalosporinas (Cantwell et al. 1992. P. Roy. Soc. Lond. B 248 : 283-289). La clonación y caracterización y expresión en E. coli del gen cefE de S. clavuligerus, el

cual codifica para la actividad DAOCS, ha sido previamente descrita (Kovacevic et al. 1989. J. Bacteriol. 171 : 754-760). Asimismo, se conoce la secuencia de DNA del gen cefE de S. clavuligerus y que su expresión en P. chrysogenum genera actividad DAOCS en dicho hongo (Ingolia T. D. et al.

1991. US5070020; Queener et al. 1994. Ann. N. Y. Acad. Sci. 721 : 178- 193). Por su parte, el gen cefEF de A. chrysogenum ha sido expresado en P.

Chrysogenum, si bien, al igual que ocurre con el gen cefE de S. clavu- ligerus, no ha sido demostrada hasta el momento la conversión de penicilina G o V a sus correspondientes cefalosporinas usando estas cepas recombi- nantes de P. chrysogenum.

Otra estrategia utilizada, dada la dificultad de la expansión directa de las penicilinas G o V a las correspondientes cefalosporinas, ha sido la ex- pansión de penicilinas con cadenas laterales diferentes a los ácidos fenilacé- tico o fenoxiacético. La adición de los ácidos fenilacético o fenoxiacético a fermentaciones de P. chrysogenum origina la biosíntesis de penicilina G o penicilina V respectivamente. Asimismo, cuando en el medio de cultivo se añade ácido adípico, P. chrysogenum produce adipil-6-APA o carboxi-n- butil-penicilina (Ballio et al. 1960. Nature 185 : 97-99). El adipil-6-APA producido por P. chrysogenum es un sustrato eficiente para la DAOCS ya que su cadena lateral (ácido adípico) es equivalente a la de la penicilina N, sustrato natural de la DAOCS. Tomando como base estos estudios se rea- lizó la primera descripción de un proceso utilizable industrialmente para la biosíntesis de 7-ACA y 7-ADCA (Crawford et al. 1995. Biotechnology 13 : 58-62; Bovenberg et al. 1998. W09802551A2). En este caso se selecciona- ron transformantes de cepas industriales de P. chrysogenum que expresaban el gen cefE de S. clavuligerus, los cuales eran capaces de producir adipil-7- ADCA en una proporción del 17 % respecto de la producción de penicilina V de la cepa parental. Como era de esperar, la cadena lateral de ácido adí- pico era eficientemente eliminada mediante tratamiento con la actividad enzimática cefalosporina acilasa de Pseudomonas. De forma similar, trans- formantes de P. chrysogenum que expresaban el gen cefEF (DAOCS-

DACS) de C. acremonium produjeron tanto adipil-7-ADCA como ácido adipil-7-aminodesacetilcefalosporánico (adipil-7-ADACA). Asimismo, transformantes de P. Chrysogenum que expresaban los genes cefEF y cefG (DAC acetiltransferasa) produjeron una mezcla de adipil-7-ADCA, adipil- 7-ADACA y adipil-7-ACA. Aunque obtuvieron cantidades relativamente pequeñas de estos adipil-derivados (0,6% de la penicilina V producida en fermentaciones con adición de ácido fenoxiacético), los autores proponen que mediante técnicas clásicas de mejora de cepas se podrían obtener productividades que hicieran posible su aplicación a escala industrial (Crawford et al. 1995. Biotechnology 13 : 58-62).

El método recogido en la presente patente consiste en la obtención de una cepa de A. acremonium cuya ruta biosintética de CPC está bloqueada a nivel de la actividad enzimática DAOCS/DACS, de forma que produce penicilina N. Esta cepa se obtiene por inactivación de la función del gen cefEF mediante disrupción génica por un proceso de doble recombinación con un plásmido en el que el gen cefEF se encuentra interrumpido. La inactivación de la función del gen mediante disrupción es una téenica utilizada para la modificación de rutas de biosíntesis y la acumulación de intermediarios biosintéticos útiles en la obtención de determinados metabo- litos secundarios. Sin embargo, son pocos los casos en los que esta técnica ha sido empleada con éxito en cepas industriales de hongos filamentosos.

Como ejemplo en P. chrysogenum puede citarse la disrupción del gen lys2, consiguiéndose cepas auxótrofas de lisina capaces de biosintetizar una ma- yor cantidad de ácido a-aminoadípico, el cual interviene como precursor de la biosíntesis de penicilina (Casqueiro et al., 1997. Patente española P9701343. Casqueiro et al., 1999. J Bacteriol 181 : 1181-1188). En el caso de A. nidulans se ha disrupcionado el gen phacA lográndose disminuir la actividad fenilacetato hidroxilasa, limitando por tanto la oxidación de ácido fenilacético, y favoreciendo su incorporación en penicilina G (Fernández- Cañón et al., 1997. Patente española P9700833; Fernández-Cañón et al., 1998. PCT/ES98/0010; Mingot et al., 1999. J Biol Chem 274 : 14545-

14550). En A. chrysogenum se ha descrito la inactivación de los genes pcbAB (Hoskins et al. 1990. Curr. Genet. 18 : 523-530), pcbC (Waltz and Kiick. 1993. Curr. Genet. 24 : 421-427) y cefG (Matsuda et al. 1992. Bio- chem. Biophys. Res. Commun. 186 : 40-6), obteniéndose en todos los casos transformantes incapaces de producir cefalosporina C. A pesar de que A. chrysogenum es una especie donde no se obtienen disrupciones génicas con facilidad (Waltz and Kück. 1993. Curr. Genet. 24 : 421-427), en la presente patente se describe por primera vez la inactivación por disrupción del gen cefEF.

La cepa de A. acremonium con la función del gen cefEF inactivada se transforma posteriormente con un plásmido que incluye el gen cefE proce- dente de un actinomiceto expresado bajo el control de diferentes promo- tores fúngicos. Por último se seleccionan los transformantes que producen mayor cantidad de DAOC, la cual se convierte en 7-ADCA mediante un proceso enzimático en dos pasos : (I) Conversión de DAOC en 7-ß-(5- caboxi-5-oxopentanamido)-desacetoxicefalosporina (cetoadipil-7-ADCA) catalizado por la actividad DAO. El cetoadipil-7-ADCA formado reacciona de forma no enzimática con el peróxido de hidrógeno para dar lugar a 7ß (carboxibutanamido)-desacetoxicefalosporina (glutaril-7-ADCA ó GL-7- ADCA). (II) El resto glutarilo del GL-7-ADCA se elimina mediante tratamiento con la enzima GLA generando 7-ADCA. Globalmente, el proceso descrito permite la obtención de 7-ADCA por una via totalmente biológica y sin la utilización de solventes organicos.

Hasta el momento no se ha descrito la disrupción del gen cefEF de A. chrysogenum con la finalidad de incrementar la producción de penicilina N, dado el escaso valor comercial de este antibiótico debido fundamentalmente a : (I) la escasa actividad antimicrobiana que presenta la penicilina N frente a las penicilinas hidrofóbicas (G o V), penicilinas semisintéticas y cefalos- porinas, (II) su escasa utilidad como compuesto intermedio en la prepara- ción de 6-APA dada su reducida estabilidad, así como sus propiedades físi- co-quimicas de solubilidad y acidez-basicidad que complican enormemente

su aislamiento y (III) la imposibilidad de eliminar su cadena lateral con las acilasas de penicilina G o V convencionales. Unicamente se conoce la exis- tencia de mutantes de A. chrysogenum capaces de acumular penicilina N, los cuales han sido utilizados para la caracterización de la ruta biosintética de cefalosporina. Por otro lado, se ha descrito la acumulación de DAOC junto con DAC y CPC en fermentaciones de A. Chrysogenum. En este caso, la DAOC es considerada como un contaminante indeseable que complica la producción industrial de CPC con un grado de pureza aceptable.

La utilización de la DAOC como compuesto intermedio útil en la producción de 7-ADCA no ha sido descrita hasta el momento debido a la imposibilidad de obtener DAOC como único producto de la fermentación de A. chrysogenum. En todos los casos se produce una mezcla de DAOC y DAC dificiles de separar posteriormente. Asimismo, la dificultad de eli- minar hasta hace poco tiempo la cadena lateral de ácido aminoadipico de la molécula de DAOC utilizando procedimientos enzimáticos, hacian de la DAOC una molécula no apta para la fabricación industrial de 7-ADCA. Sin embargo, la construcción de la cepa A. chrysogenum AcefEF-cefE, posi- bilita una elevada producción de DAOC, siendo esta última la cefalosporina mayoritaria. La DAOC producida puede ser transformada a 7-ADCA mediante la utilización de las enzimas DAO y GLA por métodos equiva- lentes a los previamente descritos (Croux et al. 1994. US5354667; Cambiaghi et al. 1991. EP0496993; Garcia et al. 1998. EP0843015).

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION EJEMPLO 1. Disrupción del gen cefEF en A. chrysogenum.

1.1. Construcción de pALC73, plásmido para la inactivación del gen cefEF de A. chrysogenum.

Con el fin de inactivar el gen cefEF de A. chrysogenum y obtener un mutante AcefEF que acumulara penicilina N se utilizó la téeniea de dis-

rupción génica por doble recombinación denominada"one step gene disruption" (Rothstein. 1983. Meth. Enzymol. 101 : 202-211). El resultado de esta técnica consiste en la obtención de un transformante disrupcionado estable, ya que no se generan copias directamente repetidas en la zona de recombinación. El método se basa en integrar un marcador de selección de transformantes en un sitio de restricción del gen de interés, de manera que se rompa el marco de lectura de dicho gen. El gen marcador debe poseer a ambos lados un fragmento de DNA homólogo a la secuencia diana de un tamaño suficiente como para permitir el sobrecruzamiento. Se ha descrito un tamaño mínimo de 500 pb para estas secuencias homologuas (Rothstein, 1991 Meth. Enzymol. 194 : 281-301).

En el presente ejemplo se integró el cassette de resistencia a higromi- cina, formado por el promotor del gen gpd (gliceraldehido-3-fosfato deshi- drogenasa) de A. Nidulans, el gen de resistencia a higromicina (hygR) y el terminador del gen trpC (triptófano C), en el sitio XhoI del gen cefEF (figura 1A-B). Para ello, en primer lugar se eliminó el sitio XhoI presente en pBC KS (+) mediante doble digestión SalI-XhoI y religación, originando el plásmido pBC* KS (+) el cual carece de los sitios de restricción XhoI y SalI. A continuación se insertó en pBC* KS (+) un fragmento BamHI de 7,2 kb que incluye los genes cefEF y cefG de A. chrysogenum, dando lugar al plásmido pALC72 (figura 1A-B). Finalmente se insertó el fragmento BglII- XbaI del plásmido pAN7, 1, el cual incluye el cassette de resistencia a higromicina y cuyos extremos fueron previamente convertidos en romos con Klenow, en el sitio XhoI interno al gen cefEF de pALC72, obtenién- dose el plásmido pALC73 (figura 1A-B). De esta forma el marcador de selección, se encuentra flanqueado por dos fragmentos de DNA de 2,2 kb y 5, 0 kb homólogos a la región del genoma de A. chrysogenum que contiene los genes cefEF y cefG respectivamente. Los transformantes de A. chryso- genum con pALC73 se obtuvieron de acuerdo con procedimientos pre- viamente descritos (Queener et al. 1985. Lieve (ed.) Microbiology-1985. pp. 468-472. ASM. Washington) y se seleccionaron por resistencia a 5-10

pg/ml de higromicina. La cepa que incluye el plásmido pALC73, denomi- nada E. coli TOP10/pALC73 se depositó en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), Universidad de Valencia, Edificio de Investigación, Campus de Burjasot, 46100 Burjasot (Valencia) con el n° 5151.

1.2. Preselección de transformantes por pérdida de producción de cefalosporina.

Los transformantes seleccionados por resistencia a higromicina se crecieron en placas de medio sólido LPE (Le Page & Campbell, 1946, J.

Biol. Chem. 162 : 163-171) mediante incubación durante 7 dias a 28°C. A continuación se extrajeron dos cilindros o tacos de cada transformante con la ayuda de un sacabocados. Con la finalidad de determinar la producción de cefalosporina, uno de los tacos se bioensayó en una placa de medio LB a la que se añadió un cultivo de E. coli sensible a P-lactamas (E. coli ESS) y una preparación de penicilinasa tipo I (Sigma P-0389) a una concentración final de 0,1 mg/ml. El otro taco se ensayó en una placa de medio LB con E. coli ESS pero sin añadir penicilinasa con el fin de determinar la presencia tanto de cefalosporina como de penicilina. Se seleccionaron aquellos trans- formantes que producían halo de inhibición en las placas sin penicilinasa y no originaron halo en las placas con penicilinasa, indicando que eran inca- paces de sintetizar cefalosporinas.

En la tabla siguiente se muestran los resultados obtenidos :

Transformante Resistencia a Halo sin Halo con N° higromicina penicilinasa penicilinasa <BR> <BR> <BR> (fg/ml)(mm)(mm)<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> 2672* 5 12 0 2673* 10 16 0 2674 10 11 12 2675* 10 11 0 2676 5 15 12 2677 5 13 11 2678 5 14 11 2679 5 17 11 2680* 10 14 0 2681 5 17 12 2682 5 14 12 2683 10 14 12 2684 5 15 12 2685 5 16 12 2686 5 15 12 2687 5 18 12 2688 5 17 12 2689 5 16 12 2690 5 15 12 2691* 10 15 0 2692* 10 14 0 2693* 5 18 0 2694* 10 17 0 2695* 10 15 0 2696* 10 14 0 2697* 10 14 0 2698* 10 13 0 2699* 10 12 0 2700 10 12 12 Los transformantes 2672,2673,2675,2680,2691,2692,2693,2694, 2695,2696,2697,2698 y 2699 (señalados con un asterisco) poseían las características buscadas y se seleccionaron para posteriores ensayos.

1.3. Comprobación de la inactivación del gen cefEF mediante estudio de Southern.

El gen cefEF de A. chrysogenum se localiza en un fragmento BamHI de DNA genómico de 7,2 kb. La doble recombinación homologua entre el plásmido pALC73 y los fragmentos adyacentes al gen cefEF debería provocar la modificación del patrón de restricción anteriormente citado, pudiendo visualizarse dicho cambio mediante un análisis de Southern (figu- ra 2). Para ello, se purificó DNA total de la cepa parental A. chrysogenum y de 3 de los transformantes seleccionados por bioensayo (2691,2696 y 2698) tal y como se indica en el apartado anterior. El DNA total se digirió con las enzimas BamHI y SalI y tras su separación electroforética y transferencia a filtros de nitrocelulosa se híbrido utilizando como sonda un fragmento de DNA de 0,5 kb SalI interno al gen cefEF. El resultado obtenido (figura 2) muestra el cambio de patrón de restricción esperado : con la cepa parental A. chrysogenum se obtuvo una banda de hibridación de 7,2 kb BamHI, mientras que en los transformantes aparecieron dos bandas de 5,7 kb y 5,3 kb respectivamente. Asimismo, los resultados con la enzima SalI confirmaron la inactivación del gen cefEF : una banda de hibridación de 0,5 kb en la cepa parental A. chrysogenum y una doble banda de 2,2 kb en los transformantes disrupcionados. Las cepas disrupcionadas en el gen cefEF obtenidas se denominaron A. chrysogenum AcefEF T1, A. chryso- genum AcefEF T2 y A. chrysogenum AcefEF T3.

EJEMPLO 2. Producción de penicilina N por A. chrysogenum AcefEF.

2.1. Fermentación de A. chrysogenum y A. chrysogenum AcefEF.

Para la fermentación de la cepa parental A. chrysogenum y de las cepas portadoras del gen cefEF inactivado A. chrysogenum AcefEFT1, A. chrysogenum AcefEFT2 y A. chrysogenum AcefEFT3, se sembraron slants de medio sólido LPE (Le Page & Campbell, 1946, J. Biol. Chem. 162 : 163- 171) y se incubaron durante 7 días a 28°C hasta obtener un cultivo esporu- lado. La fermentación en medio líquido se inició inoculando las esporas procedentes de un slant en un matraz de 250 ml que contenía 50 ml de medio de inocule complejo (Shen et al., 1986, Bio/Technology 4 : 61-64). Este

matraz se incubó durante 48 horas a 28°C y 250 rpm para obtener un micelio vegetativo abundante. La fermentación en condiciones de producción de anti- bióticos se inició al inocular 0,5 ml (3%) del cultivo vegetativo anterior en un matraz de 500 mi con 15 ml de medio de complejo de fermentación (Shen et al., 1986, Bio/Technology 4 : 61-64). Este cultivo se incubó durante 7 días a 25°C y 250 r. p. m., recogiéndose muestras de 1 ml cada 24 horas para el estudio de la producción de antibióticos a lo largo de la fermentación.

Seguidamente se realizaron análisis con la finalidad de determinar : (I) que el antibiótico producido por los transformantes A. chrysogenum AcefEF era penicilina N, (II) el nivel de producción de penicilina N de estos transformantes y (III) la eventual presencia de otros antibióticos en el medio de fermentación. Los análisis realizados, tal y como se describe a continuación, fueron los siguientes : HPLC, expansión enzimática in vitro y LC masas.

2.2. Determinación de la producción de antibióticos por HPLC.

Las muestras de fermentación se centrifugaron durante 5 minutos a 20.000 g para eliminar el micelio y seguidamente, 50 µl del sobrenadante se diluyeron 10 veces con agua y se analizaron en un cromatógrafo Waters TAD (Waters Associates, Milford, MA) con detector 486M1, bomba W600, autoinyector 717 y una columna Nucleosil Cl8-10 llm (250x4,6 mm) (Phenomenex, Torrance, CA). Las muestras se analizaron con un flujo de 2,3 ml/min y una longitud de onda variable (214 para detectar penicilinas ó 254 nm para detectar cefalosporinas). La elución se realizó utilizando como fase móvil formiato amónico pH 3,3-metanol-tetrahidrofurano (99,85 : 0,1 : 0,05) en modo isocrático durante 30 minutos. La asignación de los picos obtenidos a cada compuesto se realizó por comparación con patrones de CPC, DAC, DAOC y penicilina N analizados en las mismas condiciones.

El análisis de los resultados mostró que, tras 7 días de fermentación, las cepas transformantes A. chrysogenum AcefEF Tl, A. chrysogenum AcefEF T2 y A. chrysogenum AcefEF T3 acumulaban una cantidad de

penicilina N equivalente a la suma de las cantidades de CPC, DAC, DAOC y penicilina N producidas por la cepa parental. Por tanto, la inactivación del gen cefEF origina el bloqueo de la ruta de biosintesis de cefalosporinas sin afectar a la cantidad total de P-lactamas producidas. En la siguiente tabla se <BR> <BR> <BR> <BR> muestran los porcentajes de cada tipo de antibiótico sobre el total de ß- lactamas producido por las diferentes cepas : Cepa CPC DAC DAOC PenN A. chrysogenum 75,2 6,3 1,9 16,5 A. chrysogenum AcefEF Tl 0,0 0,5 0,0 99,5 A. chrysogenum AcefEF T2 0,1 0,3 0,0 99,6 A. chrysogenum AcefEF T3 0,1 0,2 0,0 99,7 2.3. Bioconversión de penicilina N en cefalosporinas.

La expansión enzimática de penicilina N se realizó utilizando células en reposo ("resting cells") o extractos libres de células de Streptomyces clavuligerus NP1. Esta cepa prácticamente no produce cefamicina cuando se compara con la cepa parental (Mahro y Demain, 1987), lo cual facilita la determinación de las cefalosporinas y/o cefamicinas sintetizadas in vitro a partir de penicilina N.

2.3.1. Expansión enzimática utilizando células en reposo de S. clavuligerus NP1.

El medio de inocule MST (1% almidón soluble, 3% trypticase soy broth without dextrose, 90 mM MOPS; pH 7,0) se sembró con una suspensión de esporas de S. clavuligerus NP1 y se incubó a 200 r. p. m. y 28°C durante 48 horas. Como medio de fermentación también se utilizó MST, inoculando en este caso con un 5% del cultivo anterior e incubando a 200 r. p. m. y 28°C durante 24 horas. Una vez crecidos los cultivos, las células se recogieron por centrifugación (10.000 r. p. m./10 min./4°C) y se

lavaron dos veces con agua desmineralizada. Por último, las células se resuspendieron en 40 ml de agua desmineralizada.

La mezcla de reacción (10 ml) para la expansión enzimática se prepa- ró de acuerdo con procedimientos descritos (Shen et al. 1984. Enzyme Microbiol. Technol. 6 : 402-404) utilizando la penicilina N producida por A. chrysogenum AcefEF T1 como sustrato : MOPS 50 mM pH 6,5, FeSO4 (heptahidratado) 1,8 mM, ácido a-cetoglutárico 2,56 mM, 8 ml de suspensión celular y penicilina N 0,2 mM. La reacción se incubó a 30°C y 200 r. p. m. durante 3 horas. A diferentes tiempos se tomaron muestras de 1 ml, las cuales se centrifugaron a 13.000 r. p. m. durante 10 minutos. Los sobrenadantes obtenidos se analizaron por bioensayo y HPLC.

El bioensayo se realizó sobre placas de LB (2% agar) conteniendo E. coli ESS como microorganismo indicador y 50.000 UI/ml de penicilinasa (Difco Bacto penase concentrate, Difco Laboratories, Detroit, MI). En pocillos preparados con ayuda de un sacabocados se colocaron 200 1 de cada muestra y las placas se incubaron a 37°C durante 16 horas. Las muestras tomadas a tiempo cero no presentaron halos de inhibición del crecimiento de E. coli ESS, mientras que aquellas incubadas durante 1 ó 3 horas dieron lugar a halos de inhibición de 17 y 21 mm respectivamente, indicando la presencia de productos de reacción (cefalosporinas) resistentes a penicilinasa.

El análisis de HPLC se realizó con un equipo Waters TAD (Waters Associates, Milford, MA) con detector 486M1, bomba W600, autoinyector 717 y una columna Nucleosil Cl8-10 pLm (250x4,6 mm) (Phenomenex, Torrance, CA). Las muestras de las reacciones de expansión (50 p1) se analizaron con un flujo de 2,3 ml/min y una longitud de onda variable (214 ó 254 nm). El análisis a 214 nm sirve para determinar la presencia de peni- cilinas y a 254 nm para detectar cefalosporinas. La elución se realizó uti- lizando como fase móvil formiato amónico pH 3,3-metanol-tetrahidro- furano (99,85 : 0,1 : 0,05) en modo isocrático durante 30 minutos. El análisis a 214 nm del caldo de fermentación utilizado como substrato reveló la

existencia de un pico a los 10,1 minutos que coincide con el tiempo de retención obtenido para la penicilina N, mientras que a 254 nm no reveló la existencia de cefalosporinas. El análisis de las muestras de reacción a tiempo cero a 214 nm mostró la presencia de un pico a los 10,1 minutos (penicilina N), mientras que a 254 nm aparecieron tres picos con tiempos de retención muy cortos (1, 8-4 min.) que no coincidían con los obtenidos para DAC (2,98 min.), cefamicina C (3,3 min.), DAOC (8,8 min.) y CPC (17 min.). Las muestras de 1-3 horas de reacción analizadas a 254 nm mostraron un pico nuevo con respecto a los cromatogramas de las muestras a tiempo cero. Este pico eluyó a los 8,8 minutos, coincidiendo con el tiempo de retención obtenido para DAOC. Este resultado demuestra que el antibió- tico producido por A. chrysogenum AcefEF T1 es penicilina N, la cual es expandida a la DAOC por células en reposo de S. clavuligerus.

2.3.2. Expansión enzimática utilizando extractos libres de células de S. clavuligerus NP 1.

El medio de inocule MST (1% almidón soluble, 3% trypticase soy broth without dextrose, 90 mM MOPS; pH 7,0) se sembró con una suspensión de esporas de S. clavuligerus NP1 y se incubó a 200 r. p. m. y 28°C durante 48 horas. Las células se recogieron por centrifugación (10.000 r. p. m./10 min./4°C), se lavaron dos veces con buffer E (15 mM Tris HCl pH etanol) y se resuspendieron en buffer E conteniendo DTT 10 mM y PMSF 2 mM. Las células se rompieron por sonicación utilizando un Labsonic 2000 (Braun Biotech) aplicando 3 pulsos de 25 segundos. La muestra se centrifugó a 20.000 r. p. m. y 4°C durante 20 minutos. El extracto resultante se dividió en alícuotas que se congelaron a-20°C y se analizó su contenido proteico por la técnica de Bradford.

La reacción para la expansión enzimática se llevó a cabo añadiendo 100-200 pl del extracto proteico a 0,5 ml de una mezcla de reacción que contenía : Tris HCl 50 mM pH 7,5, ácido ascórbico 4 mM, FeSO4 (heptahidratado) 1,8 mM, ácido a-cetoglutárico 1,28 mM y penicilina N producida por A. chrysogenum AcefEF Tl 0,2 mM. La reacción se incubó a

30°C y 200 r. p. m. durante 2 horas y se detuvo mediante la adición de 1 volumen de metanol y centrifugación a 13.000 r. p. m. durante 10 minutos.

Los sobrenadantes obtenidos se analizaron tanto por bioensayo como por HPLC tal y como se indica en el apartado 2.3.1.

Las muestras tomadas a tiempo cero no originaron halos de inhibi- ción del crecimiento de E. coli ESS, mientras que aquellas incubadas duran- te 2 horas dieron lugar a halos de inhibición, indicando la presencia de productos de reacción (cefalosporinas) resistentes a penicilinasa. Asimismo, el análisis por HPLC a 214 nm de las muestras de reacción a tiempo cero mostró la presencia de un pico a los 10,1 minutos (penicilina N), mientras que a 254 nm aparecieron tres picos con tiempos de retención muy cortos (1,8-4 min.) que no coincidieron con los obtenidos para DAC (2,98 min.), cefamicina C (3,3 min.), DAOC (8,8 min.) y CPC (17 min.). Las muestras de 1-3 horas de reacción analizadas a 254 nm mostraron un pico nuevo con respecto a los cromatogramas de las muestras a tiempo cero. Este pico eluyó a los 8,8 minutos, coincidiendo con el tiempo de retención obtenido para DAOC (figura 3). Este resultado demuestra que el antibiótico producido por A. chrysogenum AcefEF T1 es penicilina N, la cual es expandida a la DAOC por un extracto enzimático de S. clavuligerus.

2.3.3. Expansión enzimática utilizando extractos libres de células de E. coli JM109 (DE3) pALE38.

Para la expresión del gen cefE de Nocardia lactamdurans en E. coli se construyó el plásmido pALE36 (figura 4A-B), el cual posee un fragmento de 400 pb BglII-ClaI del plásmido pT7-7 (Tabor y Richardson, 1985, Proc.

Natl. Acad. Sci USA 82 : 1074-1078) en pBC KS+. Este fragmento contiene una región de clonación múltiple situada aguas abajo del promotor del gen O10 del bacteriófago T7. pALE36 presenta la ventaja frente a pT7-7 de utilizar el gen CmR en lugar del gen ApR. Este último gen codifica para una actividad-lactamasa que degradaria la penicilina N utilizada como sustrato. Seguidamente pALE36 se digirió NdeI-BamHI y se insertó un

fragmento de 1,25 Kb NdeI-BglII que contenia el cefE de N. lactamdurans.

Por último, se comprobó mediante secuenciación que la fusión entre el promotor y el gen cefE era correcta y con el plásmido obtenido, pALE38, se transformaron células competentes de E. coli/JM109 (DE3), seleccionando los clones transformantes por resistencia a cloranfenicol.

Con una colonia de E. coli JM109 (DE3) pALE38 se inoculó un matraz de 250 ml con 50 ml de medio LB al que se añadieron 30 pglml de cloranfenicol (Sambrook, J. et al. 1989. Molecular cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press) y el cultivo se incubó a 250 r. p. m. y 37°C durante 14 horas. Seguidamente se utilizaron 2 ml de este cultivo para sembrar un matraz de 250 ml con 50 ml de medio LB-cloran- fenicol y se incubó a 37°C y 250 r. p. m. hasta que alcanzó una D. O. 660 de 0,4. En ese momento se añadió IPTG a una concentración final 1 mM y se incubó durante 6 horas más. El procesamiento de las células obtenidas, la reacción de expansión enzimática y el análisis por bioensayo y HPLC de los productos de la reacción se realizaron tal y como se indica en el apartado 2.3.2.

Las muestras tomadas a tiempo de reacción cero no originaron halos de inhibición del crecimiento de E. coli ESS, mientras que aquellas incuba- das durante 2 horas dieron lugar a halos de inhibición, indicando la presen- cia de productos de reacción resistentes a penicilinasa. El análisis de HPLC a 214 nm de las muestras de reacción a tiempo cero mostró la presencia de un pico a los 10,1 minutos que se correspondía con penicilina N. Las muestras incubadas durante 2 horas analizadas a 254 nm mostraron un pico nuevo con respecto a los cromatogramas de las muestras a tiempo cero. Este pico eluyó a los 8,8 minutos, coincidiendo con el tiempo de retención obtenido para DAOC. Este resultado demuestra que el antibiótico producido por A. chrysogenum AcefEF es penicilina N, la cual es expandida a la DAOC por un extracto enzimático de E. coli JM109 (DE3) pALE38.

2.4. Determinación de penicilina N por LC masas.

Las muestras de fermentación de la cepa de A. Chrysogenum AcefEF se centrifugaron durante 5 minutos a 20.000 x g con la finalidad de eliminar el micelio. Seguidamente se tomaron 50 ul del sobrenadante, los cuales se diluyeron 10 veces con agua y 25 u. l de esta muestra se analizaron en un cromatógrafo Waters 2690 TAD (Waters Associates, Milford, MA) equipa- do con una columna Symmetry 300 Cl, 5m (2.1 x 150 mm). La fase móvil utilizada fue tampón formiato amónico pH 3,3-metanol-tetrahidrofurano (99,85 : 0,1 : 0,05) con un flujo de 0,25 ml/min. El análisis del espectro de masas se realizó con un detector Waters ZMD utilizando los siguientes parámetros : rango de detección (996) : 200-320 nm; potencial capilar : 3,50 Kvolts; potencial cono : 40 Volts. Scan 1; 70 Volts. Scan 2; interfase : ES+.

El espectro obtenido para el pico que eluye a los 11,92 minutos coincide con el esperado para la penicilina N, presentando un pico molecular a 360 que se corresponde con el peso molecular de la penicilina N (figura 5A-B).

EJEMPLO 3. Expresión del gen cefE en A. chrysogenum AcefEF.

Con el fin de conseguir una cepa de A. chrysogenum que produjera DAOC por fermentación, se expresó el gen cefE, el cual codifica para la actividad DAOCS, en A. chrysogenum AcefEF. Los genes cefE clonados hasta el momento proceden de actinomicetos (S. clavuligerus, Nocardia lactamdurans y Lysobacter lactamgenus). Para su expresión en A. chryso- genum AcefEF, se diseñaron una serie de plásmidos en los que se dispu- sieron los genes cefE de S. clavuligerus y N. lactamdurans bajo el control de promotores de genes fúngicos. Se eligieron dos promotores : uno de ellos correspondiente a un gen con elevado nivel de expresión en condiciones de fermentación (gen pcbC, el cual codifica para IPNS en P. chrysogenum) y el otro perteneciente al gen gpdA de A. nidulans, el cual se expresa constituti- vamente y codifica para la actividad gliceraldehido 3-fosfato deshidro- genasa.

El conjunto formado por el promotor fúngico, el gen cefE y el ter- minador de la transcripción del gen trpC de Aspergillus niger se insertó en

el plásmido pALfleo7 (Barredo et al. 1997. Patente española P9700482).

Este plásmido de 5,4 kb posee el gen de resistencia a fleomicina de Streptoalloteichus hindustanus flanqueado por el promotor del gen gdhA de P. chrysogenum y el terminador de la transcripción del gen trpC de Aspergillus niger.

3.1. Expresión en A. chrysogenum AcefEF del gen cefE de S. clavuligerus.

El gen cefE de S. clavuligerus se subclonó en el plásmido pBluescript I KS (+) (Stratagene) como un fragmento BamHI-KpnI de 1,6 kb del genoma de S. clavuligerus que incluye el gen cefE completo y 582 pb del extremo 3'del gen cefD. Con la finalidad de expresar el gen cefE bajo el control de un promotor fúngico, se creó un sitio de restricción NcoI en el extremo 5'de dicho gen mediante mutación dirigida utilizando el kit comercial QuikChange (Stratagene) y los oligonucleótidos que se describen en SEQ ID N °1 y SEQ ID N° 2. El proceso de mutación se realizó siguien- do las instrucciones del fabricante y se comprobó mediante secuenciación la creación del sitio de restricción NcoI y la ausencia de mutaciones adicio- nales. El plásmido resultante de este proceso se denominó pALC83 (figura 6A-B). pALC83 se digirió con KpnI, se rellenaron sus extremos con Klenow, se digirió posteriormente con NcoI y por último se purificó el fragmento de DNA de 0,95 kb utilizando el kit QIAEX II (Qiagen).

Seguidamente el fragmento de 0,95 kb se ligó con el plásmido pALpcbC (figura 6A-B) digerido con HindIII, rellenado con Klenow y digerido con NcoI. En el plásmido resultante se denominó pALC87 y contiene : (I) el gen cefE de S. clavuligerus expresado bajo el control del promotor del gen pcbC de Penicillium chrysogenum y (II) el terminador del gen trpC de A. nidulans aguas abajo del gen cefE. Por último, pALC87 se digirió con PvuII y el fragmento que contenía el gen cefE se ligó con pALfleo7 digerido con EcoRV y desfosforilado. Como resultado de esta ligación se obtuvo el plás- mido pALC88, el cual es portador del inserto PpcbC-cefE-TtrpC (figura 6A-B).

El gen cefE de S. clavuligerus también se expresó bajo el promotor del gen gpdA de A. nidulans. Para ello, el fragmento de 0,95 kb que contiene el gen cefE de S. clavuligerus utilizado en la construcción de pALC87, se ligó con el plásmido pTh (Uriach et al. 1995. EPA 0684312A2) digerido con HindIII, rellenado con Klenow y digerido posteriormente con NcoI. En el plásmido resultante (pALC92; figura 7A-B) el gen cefE de S. clavuligerus se localiza bajo el control del promotor del gen gpdA de A. nidulans y seguido por el terminador del gen trpC de A. nidulans. El cassette de expresión PgpdA-cefE-TtrpC obtenido por digestión de pALC92 con las enzimas EcoRI y PvuI y rellenado con Klenow se insertó en pALfleo7 digerido con EcoRV y desfosforilado. Como resultado de esta li- gación se obtuvieron los plásmidos pALC93 y pALC94 (figura 7A-B), en los cuales el inserto PpcbC-cefE-TtrpC se encuentra en las dos posibles orientaciones.

3.2. Expresión en A. chrysogenum AcefEF del gen cefE de N. lactamdurans.

El gen cefE de N. lactamdurans se obtuvo por digestión de pALE38 (apartado 2.3.3) con NdeI, rellenado con Klenow y digestión con HindIII.

De esta forma se purificó un fragmento de DNA de 1.250 pb que se ligó con el plásmido pALpcbC (figura 6A-B) previamente digerido con NcoI, eli- minados los extremos protuberantes con nucleasa Mung Bean y digerido con HindIII. En el plásmido resultante (pALC84) el gen cefE de N. lactamdurans se encuentra bajo el control del promotor del gen pcbC de Penicillium chrysogenum y seguido por el terminador del gen trpC de A. nidulans. La fusión entre el promotor y el gen cefE fue confirmada por secuenciación. pALC84 se digirió a continuación con la enzima PvuII y el fragmento generado se ligó con pALfleo7 previamente digerido con EcoRV y desfosforilado. Como resultado de esta ligación se obtuvieron los plásmidos pALC85 y pALC86 (figura 8A-B) en los cuales el inserto PpcbC-cefE-TtrpC se encuentra en las dos orientaciones posibles. La cepa que incluye el plásmido pALC85, denominada E. coli DH5a/pALC85 se depositó en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), Universidad

de Valencia, Edificio de Investigación, Campus de Burjasot, 46100 Burjasot (Valencia) con el n° 5150.

El gen cefE de N. lactamdurans también se expresó bajo el promotor del gen gpdA de A. nidulans. Para ello, el fragmento de DNA de 1.250 pb que contiene el gen cefE de N. lactamdurans descrito anteriormente se ligó con el plásmido pTh (Uriach et al. 1995. EPA 0684312A2) digerido con NcoI, eliminados los extremos protuberantes con nucleasa Mung Bean y digerido posteriormente con HindIII. En el plásmido resultante (pALC89; figura 9A-B) el gen cefE de N. Lactamdurans se encuentra bajo el control del promotor del gen gpdA de A. nidulans y seguido por el terminador del gen trpC de A. nidulans. La fusión entre el promotor y el gen cefE fue confirmada por secuenciación. El cassette de expresión PgpdA-cefE-TtrpC obtenido por digestión de pALC89 con las enzimas EcoRI y PvuI y rellenado con Klenow se insertó en pALfleo7 previamente digerido con EcoRV y desfosforilado. Como resultado de esta ligación se obtuvieron los plásmidos pALC90 y pALC91 (figura 9A-B) en los cuales el inserto se encuentra en las dos orientación posibles.

3.3. Transformación en la cepa A. chrysogenum AcefEF.

Tres cepas diferentes de A. chrysogenum AcefEF (T1, T2 y T3) se transformaron con los plásmidos pALC85, pALC86, pALC88, pALC90, pALC91, pALC93 y pALC94 de acuerdo con procedimientos previamente descritos (Queener et al. 1985. Lieve (ed.) Microbiology-1985. pp. 468-472.

ASM. Washington). Los transformantes se seleccionaron primeramente por resistencia a 3 pg/ml de fleomicina y posteriormente se ensayó su resisten- cia a concentraciones mayores, debido a que existen descripciones que indican que existe una correlación directa entre nivel de resistencia a fleomicina y número de copias del plásmido integradas en el genoma.

3.4. Selección de los transformantes con mayor producción de DAOC.

Los transformantes seleccionados se crecieron en placas de medio sólido LPE (Le Page & Campbell, 1946, J. Biol. Chem. 162 : 163-171)

mediante incubación durante 7 días a 28°C. A continuación, con la ayuda de un sacabocados, se extrajo un cilindro o taco de cada transformante, el cual se bioensayó en una placa de medio LB a la que se añadió un cultivo de E. coli sensible a P-lactamas (E. coli ESS) y una preparación de penicilinasa tipo I (Sigma) a una concentración final de 0,1 mg/ml. De esta forma se seleccionaron aquellos transformantes que producían los mayores halos de inhibición, indicando que eran capaces de sintetizar mayores cantidades de antibióticos resistentes a penicilinasa.

En la tabla siguiente se muestran los resultados obtenidos : Transformante Cepa/plásmido Resistencia a Halo con N° fleomicina penicilinasa (µg/ml)(mm) 3122800T1/pALC88 <BR> <BR> <BR> <BR> 2801 T2/pALC88 6 15<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> 2802 T3/pALC88 9 17<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> 2803 T1/pALC92 9 18<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> 2804 T2/pALC92 9 18<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> 2805 T3/pALC92 6 17<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> 2806 T1/pALC93 9 18<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> 2807 T2/pALC93 9 20<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> 2808 T3/pALC93 6 17<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> 2809 T1/pALC85 9 18<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> 2810 T2/pALC85 9 18<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> 2811 T3/pALC85 9 20 9182812T1/pALC86 <BR> <BR> <BR> <BR> 2810 T2/pALC86 9 18<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> 2811 T3/pALC86 12 20 9182812T1/pALC90 <BR> <BR> <BR> <BR> 2813 T2/pALC90 9 18<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> 2814 T3/pALC90 12 20 9182815T1/pALC91 <BR> <BR> <BR> 2816 T2/pALC91 9 18<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> 2817 T3/pALC91 12 20

Para analizar la integración del gen cefE en el genoma de los transformantes, se purificó DNA total de la cepa parental A. chrysogenum, de las cepas A. chrysogenum AcefEF T1, A. chrysogenum AcefEF T2 y A. chrysogenum AcefEF T3 y de los transformantes (A. chrysogenum AcefEF- cefE) seleccionados por bioensayo. El DNA total se digirió con las enzimas BamHI y SalI y, tras su separación mediante electroforesis y transferencia a filtros de nitrocelulosa, se híbrido utilizando una sonda de 0,6 kb HindIII- KpnI correspondiente al gen cefE de N. lactamdurans (transformantes 2800 al 2808) o con una sonda de 0,5 kb KpnI-ScaI correspondiente al gen cefE de S. clavuligerus (transformantes 2809 al 2817). El resultado obtenido mostró el patrón de restricción esperado : la cepa parental A. chrysogenum y las cepas A. chrysogenum AcefEF T1, A. chrysogenum AcefEF T2 y A. chrysogenum AcefEF T3 no mostraron ninguna banda de hibridación, mien- tras que en los transformantes denominados A. chrysogenum AcefEF-cefE aparecieron bandas de hibridación adicionales que indicaban la integración del gen cefE en el genoma de A. chrysogenum AcefEF.

EJEMPLO 4. Producción de DAOC por A. chrysogenum AcefF-cefE.

4.1. Fermentación de A. chrysogenum, A. chrysogenum AcefEF y A. chrysogenum AcefEF-cefE.

La fermentación de las cepas de A. chrysogenum, A. chrysogenum AcefEF y A. chrysogenum AcefEF-cefE se realizó tal y como se indica en el apartado 2.1, determinándose (I) que el antibiótico producido por A. chryso- genum AcefEF-cefE era DAOC, (II) el nivel de producción de DAOC de dichas cepas transformantes y (III) la eventual presencia de otros antibió- ticos en el medio de fermentación. Los análisis realizados, tal y como se describe a continuación, fueron HPLC y LC masas.

4.2. Determinación de la producción de antibióticos por HPLC.

Las muestras de fermentación se centrifugaron durante 5 minutos a 20.000 g para eliminar el micelio y seguidamente 50 tl del sobrenadante se diluyeron 10 veces con agua y se analizaron en un cromatógrafo Waters TAD (Waters Associates, Milford, MA) con detector 486M1, bomba W600, autoinyector 717 y una columna Nucleosil Cl8-10 pLm (250x4,6 mm) (Phenomenex, Torrance, CA). Las muestras se analizaron con un flujo de 2,3 ml/min y una longitud de onda de 254 nm. La elución se realizó utilizando como fase móvil formiato amónico pH 3,3-metanol-tetrahidro- furano (99,85 : 0,1 : 0,05) en modo isocrático durante 30 minutos. La asig- nación de los picos obtenidos a cada compuesto se realizó por comparación con patrones de CPC, DAC, DAOC y penicilina N analizados en las mismas condiciones.

El análisis de los resultados mostró que, tras 7 días de fermentación, las cepas transformantes A. chrysogenum AcefEF-cefE acumulaban DAOC.

En la siguiente tabla se muestran los porcentajes de cada tipo de antibiótico sobre el total de ß-lactamas producido por las diferentes cepas : Cepa CPC DAC DAOC PenN A. chrysogenum 75,2 6,3 1,9 16,5 A. chrysogenum AcefEF T1 0, 0 0, 5 0, 0 99,5 A. chrysogenum AcefEF-cefE 0,1 0,3 95,9 3,7 T3/pALC85 A. chrysogenum AcefEF-cefE 0,1 0,7 93,3 5,9 T3/pALC86 A. chrysogenum AcefEF-cefE 0,1 0,9 96, 7 2,3 T3/pALC87

4.3. Purificación de la DAOC producida por A. chrysogenum AcefEF-cefE.

Un total de 10 litros del caldo de fermentación de A. chrysogenum AcefEF-cefE conteniendo 20 g/1 de DAOC se ajustó a pH 3,0 con H2SO4 concentrado y se filtro a través de un filtro Büchner con vacío y con la ayu- da de una tierra de diatomeas como coadyuvante de filtración. La biomasa filtrada se lava con 10 litros de agua desmineralizada con el fin de agotar toda la DAOC de la biomasa, obteniéndose un volumen de caldo filtrado de 16,4 litros. El caldo filtrado se pasó a través de una columna (1 m x 16 cm) de resina poliestirénica XAD4 (Rohm & Haas) empaquetada con 10 litros de resina a un caudal de 150 ml/min. La columna se lavó con aproximada- mente 10 litros de agua y se eluyó con una solución de acetato sódico 0,15 M. La fracciones eluídas se analizaron por HPLC para examinar el conteni- do en DAOC. Seguidamente se reunieron aquellas fracciones ricas en DAOC, obteniéndose un volumen de eluato de 23,5 litros.

El eluato se ajustó a pH 5,5 y se sometió a una decoloración y puri- ficación por percolación a través de una columna empaquetada con resina de intercambio aniónico IRA68 (Rohm & Haas). La solución decolorada se sometió a un proceso de concentración mediante osmoses reversa hasta alcanzar una concentración superior a 200 g/l de DAOC. Seguidamente, 1,1 litros del concentrado de osmoses reversa se precipitaron con agitación mediante la lenta adición de 4 litros de alcohol isopropílico. Tras 2 horas de precipitación, se filtro a través de una placa de vidrio poroso y el precipi- tado obtenido se lavó con aproximadamente 1 litro de alcohol isopropílico.

El precipitado se secó en una estufa de vacío a 50°C obteniéndose 147,3 g de DAOC sal sódica con una pureza del 92 %.

EJEMPLO 5. Bioconversión de DAOC en glutaril-7-ADCA.

5.1. Bioconversión de DAOC en glutaril-7-ADCA catalizada por DAO inmovilizada.

Para realizar la bioconversión de la DAOC obtenida tal y como se describe en el ejemplo 4, se disolvieron 66 g de DAOC sal sódica en 2 litros de buffer fosfato potásico 25 mM conteniendo 0,5 g de metabisulfito sódi- co. La solución de DAOC se dispuso en un reactor de 3 litros conteniendo 150 g de DAO inmovilizada en Eupergit C (Rohm) según métodos descritos (Cambiaghi et al. 1991. EP 496993). La mezcla se incubó a 25°C con ligera agitación y borboteo de oxígeno (1 vol./vol./min.) a través de un difusor localizado en el fondo del reactor. El pH se mantuvo a 7,5 por adición auto- mática de hidróxido amónico al 5 %. En 75 minutos la DAOC se transformó completamente obteniéndose una mezcla de glutaril-7-ADCA (90 %) y del cetoadipil-7-ADCA (10 %).

Para transformar el cetoadipil-7-ADCA residual a glutaril-7-ADCA, la solución obtenida después de la incubación se separó por filtración del enzima inmovilizada y se añadieron 10 ml de peróxido de hidrogeno (H202) a una concentración del 3,5 % por cada litro de filtrado. La mezcla se incubó durante 15 minutos a 25°C, después de lo cual se añadieron 0,5 g de piruvato sódico. Tras dicho tratamiento el cetoadipil-7-ADCA es completa- mente transformado en glutaril-7-ADCA, obteniéndose una solución de glutaril-7-ADCA al 3 %. Dicha solución se concentró por osmosis a 4°C hasta una concentración del 5 % para ser utilizada en la siguiente etapa enzimática.

5.2. Bioconversión de DAOC en glutaril-7-ADCA catalizada por células enteras de Rhodotorula gracilis.

Un total de 100 litros de caldo de fermentación de A. chrysogenum AcefEF-cefE conteniendo 35 g/l de DAOC se ajustaron a pH 7,5 y, en el mismo fermentador, se le añadieron 5 Kg de concentrado de células de Rhodotorula gracilis ATCC 26217 correspondientes a 500.000 unidades de DAO según métodos previamente descritos (Cambiaghi et al. 1991. EP 496993). La reacción de bioconversión transcurrió a 25°C bajo ligera agita- ción mientras se añadió oxigeno a 1 vol./vol./min. a través del difusor situa-

do en el fondo del fermentador. El pH se mantuvo a pH 7,5 por adición automática de amoniaco al 5% y al cabo de 90-120 minutos se completó la transformación de DAOC en glutaril-7-ADCA.

Seguidamente se separaron los sólidos de la fermentación, contenien- do principalmente células de A. Chrysogenum y de Rhodotorula gracilis junto a cantidades variables de material insoluble del medio de fermenta- ción, mediante la utilización de un sistema de ultrafiltración a través de membranas con un corte molecular de 30.000 Da. Una vez finalizada la ultrafiltración y con el fin de transformar el cetoadipil-7-ADCA residual a glutaril-7-ADCA, se añadieron con agitación 5 ml de peróxido de hidró- geno (H202) a una concentración del 3,5 % por cada litro de filtrado. La mezcla se incubó durante 15 minutos a 25°C, tras lo cual se añadieron 50 g de piruvato sódico. Después de dicho tratamiento todo el cetoadipil-7- ADCA fue transformado en glutaril-7-ADCA, obteniéndose una solución con una riqueza en glutaril-7-ADCA del 1 %. Dicha solución se concentró por osmoses reversa hasta una concentración aproximada del 5 % en glutaril-7-ADCA.

5.3. Extracción de glutaril-7-ADCA A 1 litro de la solución de glutaril-7-ADCA se le añadió 1 litro de acetato de isobutilo, se agitó fuertemente y se enfrió entre 0 y 5°C. Segui- damente se añadió H2SO4 2 N con agitación hasta que la solución alcanzó un pH de 1,5 y rápidamente se separaron las fases. Esta operación se repitió de nuevo con 1 litro de acetato de isobutilo fresco manteniendo al tempe- ratura entre 0 y 5°C hasta agotar la fase acuosa de glutaril-7-ADCA. Ambos extractos de acetato de isobutilo rico se juntaron y se extrajeron con 0,75 litros de buffer fosfato 25 mM a pH 8,0. La solución se ajustó a pH 8,0 mediante adición de KOH 2 N y se separaron las fases. La fase orgánica se lavó con 0,25 litros de buffer fosfato 25 mM a pH 8,0 con el fin de agotarla exhaustivamente de glutaril-7-ADCA. Los extractos acuosos obtenidos conteniendo 50 g/l de glutaril-7-ADCA se reunieron y fueron utilizados directamente para la siguiente conversión enzimática o bien fueron

sometidos a un proceso de destilación a vacío para eliminar los restos de solvente orgánico y asi aumentar la vida del catalizador en la siguiente conversión enzimática.

EJEMPLO 6. Bioconversión de glutaril-7-ADCA en 7-ADCA.

6.1. Transformación de glutaril-7-ADCA en 7-ADCA catalizada por glutaril acilasa inmovilizada.

Un total de 150 ml de solución de glutaril-7-ADCA conteniendo 7,5 g de glutaril-7-ADCA se incubaron a 25°C en presencia de 30 g de glutaril acilasa inmovilizada en Eupergit C (31 U/g húmedo). La mezcla de reac- ción se incubó con agitación durante 60 minutos, manteniendo el pH a 8,0 mediante adición automática de solución amoniacal al 5%. Al cabo de dicho tiempo la transformación de glutaril-7-ADCA en 7ADCA resultó ser supe- rior al 98%. El biocatalizador se separó de la solución por filtración, laván- dose a continuación con 25 ml de agua y reutilizándose durante un mínimo de 100 ciclos para nuevas bioconversiones (Cambiaghi et al. 1991. EP 496993).

6.2. Recuperación de 7-ADCA.

Un total de 175 ml de solución de conversión de glutaril-7-ADCA en 7-ADCA fue tratada con 3 g de carbón activo durante 20 minutos a temperatura ambiente y con agitación con la finalidad de eliminar impure- zas y reducir el color del producto final. El carbón fue eliminado por filtración y lavado con 10 ml de agua. La solución filtrada se ajustó a pH 4,5 mediante la adición de H2SO4 6 N, de forma que se iniciara la cristalización del 7-ADCA, y se incubó durante 15 minutos con agitación lenta para que la cristalización progresara. La temperatura se disminuyó hasta 5-10°C, ajustándose finalmente el pH a 3,8 por adición de H2SO4 6 N.

Tras 2 horas de incubación, el precipitado se recuperó por filtración y se

lavó con 25 ml de agua. El rendimiento de cristalización fue del 95.5 %, obteniéndose un 7-ADCA con una pureza del 98,3 %.

6.3. Purificación y cristalización de 7-ADCA.

A un total de 875 ml de solución de 7-ADCA se le añadieron 125 ml de diclorometano, se disminuyó la temperatura hasta 0-5°C y se ajustó el pH a 0,8 rápidamente con agitación mediante la adición de H2SO4 6 N. Una vez alcanzado el pH de 0,8, las fases se separaron por decantación o centrifugación, lavándose la fase acuosa con otros 125 ml de diclorometano.

Esta operación tiene como objetivo la eliminación de sustancias hidrofóbi- cas y de carácter ácido, las cuales son extraídas por el diclorometano en estas condiciones, permitiendo alcanzar una mayor pureza del producto final. La fase acuosa así obtenida se trató con 3 g de carbón activo durante 20 minutos con agitación para eliminar impurezas y reducir el color del producto final. El carbón fue eliminado por filtración y lavado con 10 ml de agua. La solución filtrada se ajustó a pH 3,0 por adición de solución amoniacal 2N de forma que se iniciara la cristalización del 7-ADCA. Se- guidamente se incubó durante 15 minutos con agitación lenta hasta que la cristalización progresara, ajustándose finalmente el pH a 3,7 por adición de NH40H 2N y a una temperatura entre 5-10°C. Después de 2 horas el precipitado se recuperó por filtración y se lavó con 25 mi de agua. El rendimiento de cristalización fue del 94 %, obteniéndose un 7-ADCA con una pureza del 98,5 %.

EJEMPLO 7. Producción de 7-ADCA por A. chrysogenum AcefEF-cefE- dao-gla y A. chrysogenum AcefEF-cefE-cac.

Tomando como base una descripción previa, es posible la construc- ción de un operón biosintético para la producción de 7-ACA directamente por fermentación de A. chrysogenum (Isogai et al. 1991 Biotechnology 9 : 188-91). El sistema descrito se basa en la expresión en A. chrysogenum de los genes (cDNAs) que codifican para las actividades enzimáticas DAO y GLA de Fusarium solani y Pseudomonas diminuta respectivamente.

Aplicando esta misma idea a la cepa A. chrysogenum AcefEF-cefE, es posible la construcción de un operón biosintético para la producción de 7- ADCA directamente por fermentación de A. chrysogenum AcefEF-cefE- dao-gla. En este caso, debido a la imposibilidad de A. chrysogenum AcefEF-cefE para producir CPC, tiene lugar la biosíntesis de 7-ADCA en lugar de 7-ACA. El 7-ADCA producido por fermentación de A. chryso- genum AcefEF-cefE-dao-gla puede ser purificado tal y como se indica en el ejemplo 6.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1A-B.-Esquema de la construcción de pALC73, plásmido para la disrupción del gen cefEF de A. chrysogenum. En primer lugar el plásmido pExp7,2 BB, el cual incluye los genes cefEF y cefG de A. chrysogenum se subclonó en el sitio BamHI del plásmido pBC KS (+) al que previamente se le había inactivado el sitio XhoI. El plásmido resultante se denominó pALC72. Seguidamente se insertó el gen de resistencia a higromicina (hygR) en el sitio XhoI del gen cefEF dando lugar a pALC73. Este plás- mido de 14,6 kb incluye el gen de resistencia a cloranfenicol (CmR) como marcador de selección en E. coli y el gen de resistencia a higromicina (hygR) como marcador selectivo en A. chrysogenum. El gen hygR está expresado bajo el control del promotor gpd (gliceraldehido 3 fosfato deshidrogenasa) y posee el terminador trpC (triptófano C).

Figura 2.-Esquema de la disrupción del gen cefEF de A. chrysogenum. El plásmido pALC73 se integra por doble recombinación en uno de los cromosomas de A. chrysogenum inactivando el gen cefEF. En la parte inferior de la figura se muestra el análisis de Southern de los clones de A. chrysogenum disrupcionados en el gen cefEF. La banda de hibridación obtenida mediante digestión BamHI del DNA de la cepa parental se convierte en dos bandas de 5,7 kb y 5,3 kb en las cepas transformantes con el gen cefEF inactivado. Del mismo modo, la banda de hibridación de 0,5 kb SalI de la cepa parental se convierte en otra banda de 2,2 kb en los

transformantes disrupcionados en el gen cefEF. Los transformantes disrupcionados se denominan A. chrysogenum AcefEF T1, A. chrysogenum AcefEF T2 y A. chrysogenum AcefEF T3. P se corresponde con la cepa parental A. chrysogenum, mientras que Tl, T2 y T3 son transformantes de A. chrysogenum con el gen cefEF inactivado.

Figura 3.-Expansión enzimática de penicilina N a DAOC utilizando extractos enzimáticos libres de células de S. clavuligerus NP1. En el panel superior se muestra un cromatograma de la mezcla de reacción a tiempo 0 y en el inferior la misma mezcla tras 2 horas de reacción. Abcisas : tiempo en minutos; Ordenadas : Densidad Optica (D. O.) Figura 4A-B.-Esquema de la construcción de pALE38, plásmido para la expresión del gen cefE de Nocardia lactamdurans en E. coli bajo el control de promotor T7.

Figura 5A-B.-Análisis por LC masas de la penicilina N producida por A. chrysogenum AcefEF T1. En el panel superior se muestra un cromatograma a 214 nm y en el inferior el espectro de masas correspondiente al pico que eluye a los 11,92 minutos.

Figura 6A-B.-Esquema de la construcción de pALC88, plásmido para la expresión del gen cefE de S. clavuligerus en A. chrysogenum bajo el control del promotor del gen pcbC de P. chrysogenum.

Figura 7A-B.-Esquema de la construcción de pALC93 y pALC94, plás- midos para la expresión del gen cefE de S. clavuligerus en A. chrysogenum bajo el control del promotor del gen gpdA de A. nidulans.

Figura 8A-B.-Esquema de la construcción de pALC85 y pALC86, plás- midos para la expresión del gen cefE de N. lactamdurans en A. chryso- genum bajo el control del promotor del gen pcbC de P. chrysogenum.

Figura 9A-B.-Esquema de la construcción de pALC90 y pALC91, plásmidos para la expresión del gen cefE de N. lactamdurans en A. chryso- genum bajo el control del promotor del gen gpdA de A. nidulans.