Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Isolierung von Inhaltsstoffen, wie Nukleinsäuren aus natürlichen Quellen durch Abtrennung der aufgeschlossenen natürlichen Quellen wie Zellen oder Zelltrünimer in einer Probe durch Filtration sowie eine Vorrichtung zur Durch¬ führung des Verfahrens.

Bei der Präparation von Zellinhaltsstoffen, insbesondere von Nukleinsäuren, stellt sich oft das Problem, die auf¬ geschlossenen natürlichen Quellen, aus denen diese In¬ haltsstoffe stammen von den gelösten Stoffen zu trennen. Die Abtrennung der Zellen oder Zelltrümmer erfolgt mittels Zentrifugation, wobei sich die größeren Zell¬ trümmer oder Zellen als Pellet im Zentrifugationsröhrchen abscheiden. Die Zellinhaltsstoffe finden sich dann im Überstand und können pipettiert werden. An sich einfachere Filtrationsverfahren konnten sich insbesondere bei der Präparation von Nukleinsäuren nicht durchsetzen, da die aufgeschlossenen Zellen oder deren Bruchstücke entweder durch die zu grobporige Filter durchlaufen und somit für Trübungen und Verunreinigungen im Filtrat sorgen oder bei Verwendung von Filtern mit entsprechenden engen Poren es jedoch zwangsläufig zur Verstopfung der Filter kommt, so daß eine sinnvolle Präparation der Zellinhaltsstoffe nicht mehr möglich ist.

Der vorliegenden Erfindung liegt mithin das Problem zu¬ grunde, ein Verfahren bereitzustellen und eine Vor-

richtung zu schaffen, mit deren Hilfe Zentrifugations- schritte zur Präparation von Zellinhaltsstoffen aus natürlichen Quellen wie Zellen vermieden werden können durch einfacher zu handhabenden Filtrationsschritten.

Das der Erfindung zugrundeliegende technische Problem wird gelöst durch ein Verfahren gemäß den Merkmalen des Anspruchs 1. Die sich daran anschließenden Unteransprüche betreffen bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsge¬ mäßen Verfahrens. Die erfindungsgemäße Vorrichtung weist die Merkmale des Anspruchs 10 auf. Die sich daran an¬ schließenden Unteransprüche betreffen bevorzugte Aus¬ führungsformen der erfindungsgemäßen Vorrichtung.

Um Inhaltsstoffe aus Zellen zu isolieren, werden diese überlicherweise zunächst aufgeschlossen. Bei der Prä¬ paration von Nukleinsäuren müssen die Zellen beispiels¬ weise zunächst durch die Verwendung von Enzymen, wie z. B. Proteinase K, Lysozym und Detergenzien wie SDS, Brij, Triton X 100, Twen 20, DOC und Chemikalien wie Natrium¬ hydroxid, Guanidin-Hydrochlorid und Guanidin-Isothio- cyanat aufgeschlossen werden. Danach wird das so aufbe¬ reitete Probenmaterial einer Filtration unterworfen, wobei die Porengröße des zur Filtration zur Anwendung kommenden Filters in Fließrichtung der Probe abnimmt.

In einer bevorzugten Ausführungsform kann der Fluß der Probe bei der Filtration durch Anlegen eines Überdrucks oder Unterdrucks erleichtert werden. Durch die Kon¬ figuration der Porengröße des Filters ist jedoch auch ein Durchgang der zu filtrierenden Probe durch den Filter, allein getrieben durch die Schwerkraft, möglich. Des¬ weiteren kann auch, zur Beschleunigung des Passierens der Probe durch den Filter, die Probe durch Zentrifugation durch den Filter befördert werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere zur Prä¬ paration von Plasmid-DNA oder genomischer DNA mit einer Größe von 1 bis 50 Kb geeignet.

Als Filter, die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden können, kommen insbesondere solche aus gesintertem Polyethylen, Polypropylen, Polytetrafluoroethylen, Glas, Silicagel, Aluminiumoxid oder geschütteter Diatomeenerde, z. B. Cellit oder Silicagel, verwebten oder verklebten Vliesen aus Polypropylen, Polyester, Glasfasern und Silica sowie Papier, gepreßtem Papier, Vliesen aus Papier oder Kombinationen davon in Betracht.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsge¬ mäßen Verfahrens werden gleichzeitig mehrere Proben auf¬ gearbeitet und durch entsprechende Vorrichtungen, die in vorteilhafter Weise an Mikrotitrationssysteme adaptiert sind, geführt.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens besteht aus einem vorzugsweise zylindrischen Hohlkörper 40 mit Einlaß- und Auslaßöffnung 50, 60 sowie einer Filtrationseinrichtung 70, die im Hohlkörper 40 angeordnet ist. Zur Fixierung der Filtrationseinrichtung 70 können übliche Befestigungsmittel dienen wie bei¬ spielsweise Verklebungen oder aber auch Fixierung durch Reibungskräfte, indem die Filtrationseinrichtung 70 im Hohlkörper 40 eingeklemmt ist.

Die erfindungsgemäß Vorrichtung besteht aus mindestens einem Filter mit abnehmender Porengröße, in Richtung der Auslaßöffnung 60 gesehen. Die Figur 1 zeigt eine be¬ sonders bevorzugte Variante der erfindungsgemäßen Vor¬ richtung, indem im vorzugsweise zylindrischen Hohlkörper 40 die Filtrationseinrichtung 70 aus einer dreilagigen Schicht gestaltet ist. Die obere Schicht 20 kann dabei

vorzugsweise Porengrößen von 100 bis 300 μm, die zweite Schicht eine Porengröße von 30 bis 100 μm und die dritte Schicht eine Porengröße von 5 bis 30 μm aufweisen. Als Materialien, aus denen die einzelnen Schichten bestehen können, kommen insbesondere solche aus gesintertem Polyethylen, Polypropylen, Polytetrafluoroethylen, Glas, Silicagel, Aluminiumoxid oder geschütteter Diatomeenerde, z. B. Cellit oder Silicagel, verwebten oder verklebten Vliesen aus Polypropylen, Polyester, Glasfasern und Silica sowie Papier, gepreßtem Papier, Vliesen aus Papier oder Kombinationen davon in Frage.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform kann bei¬ spielsweise die Filterschicht 20, 21 aus einem an¬ organischen Material mit der angegebenen Porengrößenab- stufung bestehen, wohingegen die Filterschicht 22 auch aus Papier bestehen kann.

Es kann vorteilhaft sein, eine zusätzliche Schicht 23 in dem Hohlkörper 40 anzuordnen und zwar oberhalb der Schicht 20 oder unterhalb der Schicht 22, die ein vor¬ zeitiges Eindringen der zu filtrierenden Lösung in den Filter oder das Austreten der Lösung aus der erfindungs¬ gemäßen Vorrichtung verhindert. Es ist jedoch ebenso mög¬ lich, die Schicht 20 oder Schicht 22 als poröse, hydro¬ phobe Schicht auszubilden. Ist die hydrophobe Trenn¬ schicht 23 oberhalb der Trennschicht 20 angeordnet, ist es vorteilhaft, wenn die Porengröße dieser Trennschicht nicht kleiner als diejenige der darunterliegenden Schicht 20 ist. Dieses Erfordernis ist bei der anderen Kon¬ figuration, wobei die hydrophobe Trennschicht unterhalb der Schicht 20 angeordnet ist, nicht so kritisch.

Die Figuren 2 a) und 2 b) zeigen die entsprechenden Kon¬ figurationen mit hydrophober Trennschicht gemäß der bevorzugten Vorrichtung nach Figur 1.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Vorrichtung mit weiteren zur Nuklein- säurepräparation notwendigen Instrumenten kombinierbar und zwar solchen, wie sie in der parallelen Anmeldung P 41 39 664 näher beschrieben sind.

In der P 41 27 276 sind z. B. auch entsprechende In¬ strumente beschrieben. Der Anionenaustauscher ist in eine Membran eingebettet (3M Empore-Membran) . Diese Systeme sind unter der Bezeichnung QIAwell handelsüblich.

Die Figur 3 zeigt eine Anordnung, in dem die erfindungs¬ gemäße Vorrichtung, bestehend aus einem dreilagigen Filter 20, 21, 22, auf eine Kartusche aufgesteckt ist, in der sich zwischen zwei Einrichtungen 5 und 6 ein Anionen- austauschermaterial 10 angeordnet befindet. Die aufzu¬ trennende Probe wird auf die Filterschicht 20 geschich¬ tet, der Filteraufsatz auf die Kartusche (im wesentlichen ein ebenfalls zylindrischer Hohlkörper) 1 (Extraktions¬ säule) aufgesteckt. Danach passiert die zu trennende Lösung die Filtereinrichtung 70, gegebenenfalls durch Anlegen eines leichten Über- oder Unterdruckes und tropft in den darunterliegenden Behälter (Extraktionssäule) , in denen das Anionenaustauschermaterial 10 angeordnet ist. Unter geeigneten Pufferbedingungen (niedriger Salzkon- zentration) binden dann beispielsweise Nukleinsäuren an dem Anionenaustauschermaterial. Die Zelltrümmer befinden sich in dem erfindungsgemäßen Filteraufsatz 40, wohin¬ gegen die interessierenden Nukleinsäuren an den Ionen¬ austauschern adsorbiert vorliegt. Nach Verwerfen des Filterkuchens in der Filtrationseinrichtung 40 kann dann der zylindrische Hohlkörper 1 mit den darin befindlichen Nukleinsäuren weiter verarbeitet werden.

Die Figur 4 zeigt eine analoge Situation wie Figur 3 mit dem erfindungsgemäßen Filteraufsatz 40, wobei ein zwei-

lagiger Filter verwendet wird, der durch eine hydrophobe Trennschicht 23 abgeschlossen wird. Die Auslaßöffnung 60 der erfindungsgemäßen Vorrichtung wird vorzugsweise so dimensioniert, daß sie in die entsprechende Kartusche 1 des Nukleinsäure adsorbierenden Materials eingeschoben werden kann und dort aufgrund von Reibungskräften fixiert ist.

Die in den Figuren 1, 2 a) und 2 b) gezeigten Filtrations¬ einrichtungen können ebenfalls auf eine Kartusche auf¬ gesteckt werden, in der ein Material angeordnet ist, das Nukleinsäuren bei hohen Ionenstärken zu binden vermag. Dies sind insbesondere Materialien wie Glas, Silicagel und andere mineralische Stoffe. Eine Nukleinsäureprä- paration kann dann beispielsweise unter Hochsalzbe¬ dingungen durchgeführt werden. Die entsprechend vorbe¬ reitete und aufgeschlossene Probe wird dann durch die erfindungsgemäße Filtrationseinrichtung nach einer der Konfigurationen gemäß Figuren 1, 2a) oder 2b) passiert und dann in der Figur 5 gezeigten Vorrichtung 1 an Silicagel, Glasfaser, gepreßtem Glaspulver Materialien 11 unter Bedingungen hoher Ionenstärke adsorbiert.

Die Figur 5 zeigt die erfindungsgemäße Vorrichtung mit einer Filterschicht 70, die eine asymmetrische Poren- größenverteilung, in Fließrichtung der Probe gesehen, aufweist. Dabei nimmt in Fließrichtung die Porengröße kontinuierlich oder diskontinuierlich von etwa 100 bis 500 μm auf 5 bis 30 μm ab.

Die Figur 6 zeigt eine Anordnung, in der die erfindungs¬ gemäße Vorrichtung in einer Konfiguration ähnlich der Figur 5 auf einer Extraktionssäule angeordnet ist, in der sich ein Anionenaustauschermaterial 10 oberhalb des mineralischen Trägers 11 gemäß Figur 5 angeordnet ist. Diese Anordnung ist vorteilhaft, da die aufgeschlossene

Probe in der erfindungsgemäßen Vorrichtung von Zell- trümmern befreit wird und in die Extraktionssäule 1 hineintropft, um unter Niedrigsalzbedingungen an dem Anionenaustauschermaterial 10 adsorbiert zu werden. Nach dem Verwerfen des Filterkuchens kann dann die im Ionen¬ austauscher gebundene Nukleinsäure zunächst unter Be¬ dingungen niedriger Ionenstärke gewaschen werden und dann unter Bedingungen hoher Ionenstärke vom Anionenaus- tauscher 10 eluiert werden. Daraufhin wird die unter Hochsalzbedingungen vom Anionenaustauscher eluierte Nukleinsäure vom anorganischen Material 11, beispiels¬ weise Silicagel oder Glasfasern, adsorbiert. Nach wei¬ teren Waschschritten kann dann durch Zugabe von bei¬ spielsweise destilliertem Wasser die RNA vom Träger 11 desorbiert und eluiert werden.

Die Figur 7 zeigt eine weitere bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Einrichtung, die in Form von Mikrotitrationsstreifen vorliegen kann. Die Figur 7 zeigt eine Anordnung, in der die erfindungsgemäße Vorrichtung 40, die linear hintereinander angeordnet sind und bereits auf eine entsprechende Anordnung von Kartuschen wie sie beispielsweise in Figur 3 bereits beschrieben wurde, an¬ geordnet ist. Die hydrophobe Schicht 23 kann unter- oder oberhalb der Filtrationseinrichtung angeordnet sein.

Entsprechende Konfigurationen sind mit jeweils anderen Adsorptionsmaterialien in den Figuren 8 und 9 beschrie¬ ben.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird anhand der folgenden Beispiele näher erläuert.

Beispiel 1

Plasmid-Minipräparation

Eine 1,5 ml HB 101 E.coli Kultur mit pUC 18 Plasmid-DNA in LB-Medium wird 5 Minuten bei 3.000 g zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Das Zellpellet wird in 0,25 ml 50 ml Tris-HCl, 10 M EDTA, pH 8,0, 100 μg/ml RNAse A resuspendiert. Zur Zell-Lyse werden 0,6 ml 0,2 M NaOH, 1% SDS zur Zellsuspension gegeben, vorsichtig gemischt und 5 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Danach wird 0,25 ml 3 M K-Acetat, 2 M Essigsäure zur Neutralisation zugegeben, gemischt und 15 Minuten auf Eis inkubiert. Das Lysat wird ^' in die Filtrationsvorrichtung nach Figur 1 überführt. Die ganze Vorrichtung wird auf eine Vakuum¬ kammer aufgesetzt und das Zell-Lysat mit 20 bar - 800 mbar Differenzdruck durch die erfindungsgemäße Filtervor¬ richtung in ein 2 ml Röhrchen gesaugt. Alternativ kann die Probe mit einem Kolbenstempel oder Überdruck durch die Filtrationsschichten gedrückt werden. Nach der Filtration wird die Filtrationsvorrichtung abgenommen und der Filterkuchen mit den Zellbruchstücken, den de¬ naturierten Proteinen und dem ausgefallenen SDS ver¬ worfen. Die DNA im Filtrat wird mit 0,5 Volumen Iso-Pro- panol ausgefällt und das Alkoholpellet durch eine Zentri¬ fugation pelletiert.

Wenn die erfindungsgemäße Filtrationsvorrichtung im Microtiter-Format ausgelegt wird, können gleichzeitig bis zu 96 Proben aufgearbeitet werden. Somit läßt sich die Zeit für die Präparation von 96 Proben von 240 min auf 15 min reduzieren.

Beispiel 2

Plasmid-Minipräparation an Anionenaustauscher

Eine 1,5 ml HB 101 E.coli Kultur mit pUC 18 Plasmid-DNA in LB-Medium wird 5 Minuten bei 3.000 g zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Das Zellpellet wird in 0,25 ml 50 ml Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 8,0, 100 μg/ml RNAse A resuspendiert. Zur Zell-Lyse werden 0,25 ml 0,2 M NaOH, 1% SDS zur Zellsuspension gegeben, vorsichtig gemischt und 5 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Danach wird 0,25 ml 3 M K-Acetat, 2 M Essigsäure zur Neutrali¬ sation zugegeben, gemischt und 15 Minuten auf Eis inku¬ biert. Das Lysat wird in die Filtrationsvorrichtung nach Figur 3. überführt. Die ganze Vorrichtung wird auf eine Vakuumkammer aufgesetzt und das Zell-Lysat mit 20 mbar - 800 mbar Differenzdruck durch die erfindungsgemäße Filtervorrichtung gesaugt und auf eine Anionenaus- tauschersäule filtriert. Alternativ kann die Probe mit einem Kolbenstempel oder Überdruck durch die Filtra¬ tionsschichten gedrückt werden. Nach der Filtration wird die Filtrationsvorrichtung abgenommen und der Filter¬ kuchen mit den Zellbruchstücken, den denaturierten Pro¬ teinen und dem ausgefallenen SDS verworfen. Das Filtrat wird vollständig durch die Extraktionssäule gesaugt oder gedrückt, um eine Adsorption der DNA zu erreichen. Die Extraktionssäule wird anschließend 2 mal mit 1 ml 1 M NaCl, 15% Ethanol, 50 mM MOPS, pH 7,0 gewaschen, um RNA und Proteine zu entfernen. Die DNA wird mit 1 ml 1,25 M NaCl, 15% Ethanol, 50 mM Tris-HCl, pH 8,5 eluiert. Die eluierte DNA wird zur Entsalzung und zur Konzentrierung mit Alkohol gefällt und das Alkoholpellet durch eine Zentrifugation pelletiert.

Beispiel 3

Plasmid-Minipräparation mit Zell-Lyse im Filter

Eine 1,5 ml HB 101 E.coli Kultur mit pUC 18 Plasmid-DNA in LB-Medium wird 5 Minuten bei 3.000 g zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Das Zellpellet wird in 0,25 ml 50 ml Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 8,0, 100 μg/ml RNAse A resuspendiert und in die Filtrationsvorrichtung nach Figur 4 überführt. Zur Zell-Lyse werden 0,25 ml 0,2 M NaOH, 1% Zellsuspension in die Filtrationsvorrichtung nach Abb. C gegeben, die Vorrichtung mit einem Stopfen oder einer Klebefolie verschlossen, vorsichtig gemischt und 5 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Danach wird 0,25 ml 3 M K-Acetat, 2 M Essigsäure zur Neutrali¬ sation zugegeben, die Vorrichtung mit einem Stopfen oder einer Klebefolie verschlossen, vorsichtig gemischt und 15 Minuten auf Eis inkubiert. Durch die hydrophobe Trenn¬ schicht wird ein vorzeitiges Austreten der Lysereagenzien durch die Filterschicht vermieden, und eine Zell-Lyse direkt in der Filtereinheit ermöglicht. Die ganze Vor¬ richtung wird auf eine Vakuumkammer aufgesetzt und das Zell-Lysat mit 20 mbar - 800 mbar Differenzdruck durch die Vorrichtung gesaugt. Alternativ kann die Probe mit einem Kolbenstempel oder Überdruck durch die Filtrations¬ schichten gedrückt werden. Nach der Filtration wird die Filtrationsvorrichtung abgenommen und der Filterkuchen mit den Zellbruchstücken, den denaturierten Proteinen und dem ausgefallenen SDS verworfen. Die Extraktionssäule wird 2 mal mit 0,8 ml 1 M NaCl, 15% Ethanol, 50 mM MOPS, pH 7,0 gewaschen, um RNA und Proteine zu entfernen. Die DNA wird mit 1 ml 1,25 M NaCl, 15% Ethanol, 50 mM Tris-HCl, pH 8,5 eluiert. Die eluierte DNA wird zur Ent¬ salzung und zur Konzentrierung mit Alkohol gefällt und das Alkoholpellet durch eine Zentrifugation pelletiert.

Beispiel 4

Plasmid-Minipräparation an Silicagel

Eine 1,5 ml HB 101 E. coli Kultur mit pUC 18 Plasmid-DNA in LB-Medium wird 5 Minuten bei 3.000 g zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Das Zellpellet wird in 0,25 ml 50 ml Tris-HCl, 10 M EDTA, pH 8,0, 100 μg/ml RNAse A resuspendiert. Zur Zell-Lyse weden 0,25 ml 0,2 M NaOH, 1% SDS zur Zellsuspension gegeben, vorsichtig gemischt und 5 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Danach wird 0,5 ml 4,5 M Guanidin-HCl, 0,75 M K-Acetat, pH 5,5 zur Neutralisation zugegeben, gemischt und 15 Minuten auf Eis inkubiert. Die ganze Vorrichtung nach Figur 5 wird auf eine Vakuumkammer aufgesetzt und das Zell-Lysat mit 20 mbar - 800 mbar durch die Vorrichtung in ein Proben- röhrchen filtriert. Im Probenröhrchen befindet sich 10 mg eines mineralischen Trägers, z. B. Silicagel oder Glas mit einer Partikelgröße von 1 - 5 μm in 0,1 ml 4,5 M Guanidin-HCl, 0,75 M K-Acetat, pH 5,5, der in der Lage ist, die DNA unter diesen Bedingungen zu adsorbieren. Alternativ kann die Probe mit einem Kolbenstempel oder Überdruck durch die Filtrationsschichten gedrückt werden. Nach der Filtration wird die Filtrationsvorrichtung abgenommen und der Filterkuchen mit den Zellbruchstücken, den denaturierten Proteinen und dem ausgefallenen SDS verworfen.

Das Filtrat mit der DNA in Hochsalz und dem mineralischen Träger in Hochsalz wird 1 - 5 ml inkubiert, um eine Ad¬ sorption der DNA zu erreichen. Die Suspension wird 5 min bei 3.000 rpm abzentrifugiert und der überstand ver¬ worfen. Die Suspension wird in 1 ml 80% Ethanol, 10 mM Tris-HCl, pH 7,0 resuspendiert und abermals abzentri¬ fugiert, und das Pellet mit der gebundenen DNA 5 min bei Raumtemperatur an der Luft getrocknet. Zum Schluß wird

die DNA mit 100 μl 10 mM Tri-HCl, pH 8,0 eluiert. Die eluierte DNA kann direkt in einer enzymatischen Reaktion wie z. B. Restriktionsspaltung, Markierung, Sequenzierung oder Amplifikation eingesetzt werden.

Beispiel 5

Plasmid-Minipräparation an Glasmembran

Eine 1,5 ml HB 101 E.coli Kultur mit pUC 18 Plasmid-DNA in LB-Medium wird 5 Minuten bei 3.000 g zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Das Zellpellet wird in 0,25 Ml 50 Ml Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 8,0, 100 μg/ml RNAse A resuspendiert. Zur Zell-Lyse werden 0,25 ml 0,2 M NaOH, 1% SDS zur Zellsuspension gegeben, vorsichtig gemischt und 5 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Danach wird 0,5 ml 4,5 M Guanidin-HCl, 0,75 M K-Acetat, pH 5,5 zur Neutralisation zugegeben, gemischt und 15 Minuten auf Eis inkubiert. Die ganze Vorrichtung nach Figur 5 wird auf eine Vakuumkammer aufgesetzt und das Zell-Lysat mit 20 mbar - 800 mbar durch die Vorrichtung gesaugt. Alternativ kann die Probe mit einem Kolbenstempel oder Überdruck durch die Filtrationsschichten gedrückt werden. Nach der Filtration wird die Filtrationsvorrichtung abgenommen und der Filterkuchen mit den Zellbruckstücken, den denatuierten Proteinen und dem ausgefallenen SDS verworfen. Das Filtrat mit der DNA in Hochsalz wird durch die Silicagelextraktionssäule mit einer z. B. 2 mm dicken Glasfasermembran gesaugt oder gedrückt um eine Adsorption der DNA zu erreichen. Die Extraktionssäule wird 2 mal mit 1 ml 6,5 M Guanidin-HCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,0 ge¬ waschen, um RNA und Proteine zu entfernen. Die Extrak¬ tionssäule wird mit 2 mal 1 ml 80% Ethanol, 10 mM Tris-HCl, pH 7,0 und mit 1 mal 0,8 ml 90% Ethanol/Wasser gewaschen und die Ethanolspuren abgesaugt. Zum Schluß

wird die DNA mit 10 μl 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 eluiert und in neuen 1,5 ml Rörchen aufgefangen. Die eluierte DNA kann direkt in einer enzymatischen Reaktion wie z. B. Restriktrionsspaltung, Markierung, Sequenzierung oder Amplifikation eingesetzt werden.

Beispiel 6

Plasmid-Minipräparation an Anionenaustauscher/Glasmembran

Eine 1,5 ml HB 101 E. coli Kultur mit pUC 18 Plasmid-DNA in LB-Medium wird 5 Minuten bei 3.000 g zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Das Zellpellet wird in 0,25 ml 50 ml Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 8,0, 100 μg/ml RNAse A resuspendiert und in eine Vorrichtung nach Figur 6 über¬ führt. Zur Zell-Lyse werden 0,25 ml 0,2 M NaOH, 1% SDS zur Zellsuspension gegeben, vorsichtig gemischt und 5 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Danach wird 0,25 ml 3 M K-Acetat, 2 M Essigsäure zur Neutralisation zugegeben, die Vorrichtung mit einem Stopfen oder einer Klebefolie verschlossen, vorsichtig gemischt und 15 Minuten auf Eis inkubiert. Durch die hydrophobe Trenn¬ schicht wird ein vorzeitiges Austreten der Lysereagenzien durch die Filterschicht vermieden und eine Zell-Lyse direkt in der Filtereinheit ermöglicht.

Die ganze Vorrichtung wird auf eine Vakuumkammer aufge¬ setzt und das Zell-Lysat mit 20 mbar - 800 mbar Diffe¬ renzdruck durch die Vorrichtung gesaugt. Alternativ kann die Probe mit einem Kolbenstempel oder Überdruck durch die Filtrationsschichten gedrückt werden. Nach der Filtration wird die Filtrationsvorrichtung abgenommen und der Filterkuchen mit den Zellbruchstücken, den dena¬ turierten Proteinen und dem ausgefallenen SDS verworfen. Die Extraktionssäule wird mit 0,8 ml 1 M NaCl, 15%

Ethanol, 50 mM MOPS, pH 7,0 und mit 0,8 ml I M NaC10 ₄ 15% Ethanol, 10 mM Na-Acetat pH 7,0 gewaschen, um RNA und Proteine zu entfernen. Die DNA wird mit 7 M NaClO., 5% Ethanol, 10 mM Tris-HCl, pH 7,0 von der Anionenaus- tauscherschicht (10) eluiert und dabei direkt an die Silicagelschicht (11) gebunden. Die Extraktionssäule wird mit 2 mal 0,8 ml 80% Ethanol, 100 mM NaCl, 10 mM Na- Acetat pH 7,0 und mit 0,8 ml 90% Ethanol/Wasser ge¬ waschen. Die in der Extraktionsschicht vorhandenen Ethanol-H-O-Reste werden durch ein Durchsaugen von Raumluft durch ein Vakuum für 1 - 2 Minuten verflüchtigt. Anschließend werden die Proben mit je 100 μl 1 mM Tris-HCl, pH 8,0 eluiert in in neuen 1,5 ml Röhrchen auf¬ gefangen. Die eluierte DNA kann direkt in einer enzyma¬ tischen Reaktion wie z. B. Restriktionsspaltung, Markierung, Sequenzierung oder Amplifikation eingesetzt werden.

Beispiel 7

Plasmid-Minipräparation in einem "Mikrotitrations¬ streifen"

8 mal 1,5 ml XL Blue E. coli Kulturen mit pUC 18 Plasmid-DNA in LB-Medium werden 5 Minuten bei 3.000 g zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Die Zell¬ pellets werden in 0,25 ml 50 ml Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 8,0, 100 μg/ml RNAse A resuspendiert und in die Vor¬ richtung nach Figur 7 überführt. Zur Zell-Lyse werden 0,25 ml 0,2 M NaOH, 1% SDS zur Zellsuspension in die Filtrationsvorrichtung gegeben, die Vorrichtung mit einem Stopfen oder einer Klebefolie verschlossen, vorsichtig gemischt und 5 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Danach wird 0,25 ml 3 M K-Acetat, 2 M Essigsäure zur Neutralisation zugegeben, gemischt und 15 Minuten auf Eis

inkubiert. Die ganze Vorrichtung auf eine Vakuumkammer aufgesetzt und das Zell-Lysat mit 20 mbar - 800 mbar durch die Vorrichtun gesaugt. Alternativ kann die Probe mit Überdruck durch die Filtrationsschichten ge¬ drückt werden. Nach der Filtration wird die Filtrations¬ vorrichtung abgenommen und der Filterkuchen mit den Zellbruchstücken, den denaturierten Proteinen und dem ausgefallenen SDS verworfen. Die Extraktionssäule wird mit 0,8 ml 1 M NaCl, 15% Ethanol, 50 mM MOPS, pH 7,0 ge¬ waschen, um RNA und Proteine zu entfernen. Die DNA wird mit 8 mal 1 ml 1,25 M NaCl, 15% Ethanol, 50 mM Tris-HCl, pH 8,5 eluiert. Die eluierte DNA wird zur Entsalzung und zur Konzentrierung mit Alkohol gefällt und das Alkohol¬ pellet durch eine Zentrifugation pelletiert.

Beispiel 8

Plasmid-Minipräparation in einem "Mikrotitrations¬ streifen"

8 mal 1,5 ml LX Blue E.coli Kulturen mit pUC 18 Plasmid-DNA in LB-Medium werden 5 Minuten bei 3.000 g zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Die Zell¬ pellets werden in 0,25 ml 50 ml Tris-HCl, 10 M EDTA, pH 8,0, 100 μg/ml RNAse A resuspendiert und in die Vor¬ richtung nach Figur 8 überführt. Zur Zell-Lyse werden 0,25 ml 0,2 M NaOH, 1% SDS zur Zellsuspension in die Filtrationsvorrichtung gegeben, die Vorrichtung mit einem Stopfen oder einer Klebefolie verschlossen, vorsichtig gemischt und 5 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Danach wird 0,5 ml 4,5 M Guanidin-HCl, 0,75 M K-Acetat, pH 5,5 zur Neutralisation zugegeben, gemischt und 15 Minuten auf Eis inkubiert. Die ganze Vorrichtung nach Abb. G wird auf eine Vakuumkammer aufgesetzt und das Zell-Lysat mit 20 mbar - 800 mbar durch die Vorrichtung

gesaugt. Alternativ kann die Probe mit einem Kolben¬ stempel oder Überdruck durch die Filtrationsschichten gedrückt werden. Nach der Filtration wird die Filtra¬ tionsvorrichtung abgenommen und der Filterkuchen mit den Zellbruchstücken, den denaturierten Proteinen und dem ausgefallenen SDS verworfen. Das Filtrat mit der DNA in Hochsalz wird durch die silicagelextraktionssäule mit einer 2 mm dicken Glasfasermembran gesaugt oder gedrückt um eine Adsorption der DNA zu erreichen. Die Extraktions¬ säule wird 1 mal mit 1 ml 6,5 M Guanidin-HCl, 10 mM Na-Acetat, pH 7,0 gewaschen, um RNA und Proteine zu ent¬ fernen. Die Extraktionssäule wird mit 2 mal 1 ml 80% Ethanol, 10 mM Tris-HCl, pH 7,0 und mit 0,8 ml 90% Ethanol/Wasser gewaschen und die Ethanolspuren durchge¬ saugt. Zum Schluß wird die DNA mit 100 μl 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 eluiert und in neuen 1,5 ml Röhrchen aufgefangen. Die eluierte DNA kann direkt in einer enzymatischen Reaktion wie z. B. Restriktionsspaltung, Markierung, Sequenzierung oder Amplifikation eingesetzt werden.

Beispiel 9

Plasmid-Minipräparation in einem "Mikrotitrations¬ streifen" mit Ionenaustauscher und Glasmembran

8 mal 1,5 ml XL Blue E. coli Kulturen mit pUC 18 Plasmid-DNA in LB-Medium werden 5 Minuten bei 3.000 g zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Die Zell¬ pellets werden in 0,25 ml 50 ml Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 8,0, 100 μg/ml RNAse A resuspendiert und in die Vor¬ richtung nach Figur 9 überführt. Zur Zell-Lyse werden 0,25 ml 0,2 M NaOH, 1% SDS zur Zellsuspension in die Filtrationsvorrichtung gegeben, die Vorrichtung mit einem Stopfen oder einer Klebefolie verschlossen, vorsichtig gemischt und 5 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen.

Danach wird 0,25 ml 3 M K-Acetat 2 M Essigsäure zur Neutralisation zugegeben, gemischt und 15 Minuten auf Eis inkubiert. Die ganze Vorrichtung wird auf eine Vakuum¬ kammer aufgesetzt und das Zell-Lysat mit 20 mbar - 800 mbar durch die Vorrichtung gesaugt. Alternativ kann die Probe mit Überdruck durch die Filtrationsschichten ge¬ drückt werden. Nach der Filtration wird die Filtrations¬ vorrichtung abgenommen und der Filterkuchen mit den Zell¬ bruchstücken, den denaturierten Proteinen und dem ausgefallenen SDS verworfen. Die Extraktionssäule wird mit 0,8 ml 1 M NaCl, 15% Ethanol, 50 mM MOPS, pH 7,0 und mit 0,8 ml 1 M NaC10 ₄ 15% Ethanol, 10 mM Na-Acetat pH 7,0 gewaschen, um RNA und Proteien zu entfernen. Die DNA wird mit 7 M NaCIO , 5% Ethanol, 10 mM Tris-HCl, pH 7,0 von der Anionenaustauscher-Schicht eluiert und dabei direkt an die Silicagelschicht gebunden. Die Extraktionssäule wird mit 8 mal 0,8ml 80% Ethanol, 100 mM NaCl, 10 mM Na-Acetat pH 7,0 und mit 8 mal 0,8 ml 90% Ethanol/Wasser gewaschen. Die in der Extraktionsschicht vorhandenen Ethanol-H ₂ 0-Reste werden durch ein Durchsaugen von Raum¬ luft durch ein Vakuum für 1 bis 2 Minuten verflüchtigt. Anschließend werden die 8 Proben mit je 10 μl 1 mM Tris-HCl, pH 8,0 eluiert.

Beispiel 10

Präparation von genomischer DNA

100 mg Lebergewebe von einer Ratte weden mit einem Skalpell in 1 mm große Stücke zerkleinert und in 1 ml 500 mM Guanidin-HCl, 50 M Tris-HCl, 10 M EDTA, pH 8,0 re¬ suspendiert und die Zellen durch Zugabe von 0,1 ml Proteinase K (10 mg/ml) 2 Stunden bei 50"C lysiert. Das Lysat wird in die Filtrationsvorrichtung nach Figur 9 überführt. Die ganze Vorrichtung wird auf eine Vakuum-

ka er aufgesetzt und das Zell-Lysat mit 20 mbar - 800 mbar durch die Vorrichtung gesaugt. Alternativ kann die Probe mit Überdruck durch die Filtrationsschichten ge¬ drückt werden. Nach der Filtration wird die Filtrations¬ vorrichtung abgenommen und der Filterkuchen mit den Zellbruchstücken und den denaturierten Proteinen verw¬ orfen. Die Extraktionssäule wird mit 0,8 ml 1 M NaCl, 15% Ethanol, 50 mM MOPS, pH 7,0 und mit 0,8 ml 1 M NaC10 ₄ 15% Ethanol, 10 mM Na-Acetat pH 7,0 gewaschen, um RNA und Proteine zu entfernen. Die DNA wird mit 7 M NaCIO., 5% Ethanol, 10 mM Tris-HCl, pH 7,0 von der Anionenaus- tauscherschicht (10) eluiert und dabei direkt an die Silicagelschicht (11) gebunden. Die Extraktionssäule wird mit 8 mal 0,8 ml 80% Ethanol, 100 mM NaCl, 10 mM Na- Acetat pH 7,0 und mit 8 mal 0,8 ml 90% Ethanol/Wasser gewaschen. Die Probenröhrchen werden zur Entfernung der Hochsalzlösung mit 0,8 ml 70% Ethanol, 100 mM NaCl, 10 mM Na-Acetat, pH 7,0 und 0,8 ml 90% Ethanol/Wasser ge¬ waschen. Die in der Extraktionsschicht vorhandenen Ethanol-H_0-Reste werden durch ein Durchsaugen von Raum¬ luft durch ein Vakuum für 1 - 2 Minuten verflüchtigt. Anschließend werden die 8 Proben mit je 50 μl 1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0 eluiert.

Beispiel 11

Präparation von genomischer DNA mit Filtration und Glas¬ membran

100 mg Lebergewebe von einer Ratte werden mit einem Skalpell in 1 mm große Stücke zerkleinert und in 1 ml 500 mM Guanidin-HCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 8,0 re¬ suspendiert und die Zellen durch Zugabe von 0,1 ml Proteinase K (10 mg/ml) zwei Stunden bei 50 ^β C lysiert. Danach wird 0,5 ml 5 M Guanidin-HCl, 10 mM Tris-HCl-, pH 7

oder 0,25 ml Ethanol zugegeben und gemischt, um die Probe auf Adsorptionsbedingungen an das Glas einzustellen. Die ganze Vorrichtung nach Figur 9 wird auf eine Vakuumkammer aufgesetzt und das Zell-Lysat mit 20 mbar- 800 mbar durch die Vorrichtung gesaugt. Alternativ kann die Probe mit einem Kolbenstempel oder Überdruck durch die Filtrations¬ schichten gedrückt werden. Nach der Filtration wird die Filtrationsvorrichtung abgenommen und der Filterkuchen mit den Zellbruchstücken verworfen. Das Filtrat mit der DNA in Hochsalz oder in Ethanol wird durch die Silica- gelextraktionssäule mit einer 2 mm dicken Glasfaser¬ membran gesaugt oder gedrückt um eine Adsorption der DNA zu erreichen. Die Extraktionssäule wird 1 mal mit 1 ml 5 M Guanidin-HCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,0 gewaschen, um RNA und Proteine zu entfernen. Die Extraktionssäule wird mit 2 mal 1 ml 80% Ethanol, 10 mM Tris-HCl, pH 7,0 und mit 0,8 ml 90% Ethanol/Wasser gewaschen und die Ethanol¬ spuren durchgesaugt. Zum Schluß wird die DNA mit 100 μl 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 eluiert und in neuen 1,5 ml Röhrchen aufgefangen. Die eluierte genomische DNA kann direkt in einer enzymatischen Reaktion wie z. B. Re¬ striktionsspaltung, Markierung oder Amplifizierung ein¬ gesetzt werden.