Cam o de la invención

La presente invención se engloba dentro del campo de la■ fabricación de dispositivos sobre un substrato, más concretamente, a la definición y preparación de superficies estructuradas con el objetivo de ser aplicables en procesos de análisis de sustancias en química y en biotecnología.

En este último aspecto, y de forma más concreta la invención se relaciona, en general, con un procedimiento de obtención y aplicaciones de un biosensor basado en la inmovilización de moléculas o materiales biológicos sobre superficies de Ti0 ₂ , pudiéndose ser aplicado en la detección y caracterización de moléculas de ácidos nucleicos en general y/o otras sustancias o compuestos, como células procarióticas (bacterias), células eucarióticas y virus de interés biotecnológico, biosanitario, clínico, veterinario, medioambiental, agrario o alimentario.

Antecedentes de la invención

En el ámbito de la biotecnología ha supuesto un avance importante el desarrollo reciente de la tecnología de microarrays de distintos elementos biológicos como los anteriormente presentados, entre otros. Estos microarrays también son denominados chips o microchips. Según esta tecnología, miles de sondas moleculares con capacidad para reconocer específicamente moléculas diana de distinta naturaleza se pueden fijar covalentemente. a un soporte sólido (vidrio, nitrocelulosa, nylon etc.). Mediante estos microarrays se pueden realizar por ejemplo experimentos de expresión génica, estudios de polimorfismos de nucleótidos (SNPs), minisecuenciación y genotipado de microorganismos y de genes eucarióticos. Han sido aplicadas diferentes tecnologías para la fabricación de estos microarrays [Chun y cois., 2009; Yarmush y King, 2009; Barbulovic-Nad y cois., 2006; Truskett y Watts, 2006]. Sin embargo estas presentan limitaciones muy importantes como son la resolución de los mismos (que impide obtener arrays de muy alta densidad o nanoarrays) y el número de puntos de reconocimiento que pueden ser fabricados simultáneamente. Tales circunstancias se deben principalmente a la dificultad de inmovilizar los materiales biológicos, usualmente presentes en forma de dispersión líquida, sin que estos depósitos líquidos se superpongan entre sí. A esta dificultad se le añade la de depositar pequeños volúmenes de líquido de manera precisa a alta velocidad. En estas técnicas, se utilizan robots con agujas, microscopios de fuerza atómica (AFM) modificados o sellos elastoméricos que se impregnan con unas soluciones que contienen el material biológico de interés y se ponen en contacto con el substrato receptor. Dichas soluciones se depositan en zonas precisas para facilitar su posibilidad de reacción con la superficie en las áreas de contacto. Para facilitar la deposición sin que se mezclen los líquidos sobre el substrato es posible recurrir a substratos dotados de patrones tridimensionales o pocilios donde depositar el material [WO 2007/011405; US 2008/0245109]. Sin embargo, con las actuales técnicas de fabricación y los materiales de estos substratos, usualmeñte basados en silicio o materiales poliméricos, la profundidad y las dimensiones de estos pocilios están limitadas por los métodos de obtención. Estos substratos presentan serias dificultades o limitaciones para su uso y su reutilización esto es: señal óptica, estabilidad química y física. En muchos casos la superficie de estos materiales está recubierta de otros para el anclaje del material biológico sobre su superficie o mejora de su reflectancia.

El dióxido de titanio es un material biocompatible, el cual ha sido estudiado como soporte para la adhesión de oligonucleótidos, virus y células entre otros. Este dióxido de titanio toma la forma de láminas delgadas, cubriendo otros materiales, o micro y nanopartículas, en forma aislada o recubriendo también otros materiales [WO 2007/009994; Bo Li y col. 2009].

Las técnicas litográfícas más extendidas actualmente que permiten producir patrones tridimensionales con escalas por debajo de la miera, están basadas en haces focalizados de electrones (e-beam) o de iones (FIB) [C. J. Lo y col., 2006; D. Stein y col., 2002; H. Chang y col., 2006]. Los haces focalizados de electrones constituyen un paso intermedio en el proceso de generación de patrones tridimensionales sobre otros substratos, ya que producen materiales parcialmente modificados, normalmente polímeros, que posteriormente se eliminan mediante procesos químicos, con objeto de obtener patrones, que a su vez servirán como máscaras sobre otros materiales. La técnica de haces focalizados de iones citada en segundo lugar representa un método adecuado para ia generación de patrones tridimensionales directamente sobre los substratos, ya que usa como elemento activo un haz de iones que modifica y elimina partes sólidas del material. Sin embargo, en la actualidad esta técnica no resulta apropiada para su implementación a escala industrial debido al tiempo requerido para crear nanoestructuras sobre áreas extensas a escala macroscópica y a la baja relación de aspecto (profundidad / dimensión lateral) de las estructuras creadas. En esta técnica típicamente se emplean iones Ga de 10-50 keV de energía. Estos iones presentan una dispersión lateral notable a su paso por el material, debida a interacciones predominantes con los núcleos de los átomos del material. Como consecuencia, estos iones quedan implantados a decenas de nanómetros de las estructuras creadas pudiendo originar fenómenos no deseados en estas.

El uso de máscaras en técnicas de implantación iónica es muy habitual en la industria de semiconductores. Una de las alternativas mas recientes es la llamada Litografía por Proyección de Iones (Ion Proyection Lithography, IPL) [F. Watt y col., 2005], en la que se utilizan máscaras litográficas de no contacto (stencil masks) ΓΤ. Shibata y col., 2002] y una óptica electromagnética reductora que focaliza el haz de iones. Sin embargo, esta técnica presenta dificultades por el hecho de que debe mantener la alineación entre el haz de iones, la máscara y el substrato [A. A. Tseng. 2005).], para lo que recurre a sistemas externos de alineamiento y reducción de vibraciones. Este sistema litográfico ha sido empleado con iones en el rango energético de los cientos de keV. No tenemos conocimiento, hasta el momento, de su utilización con iones de mayor energía.

Por otra parte es posible usar iones con un rango energético de MeV para generar modificaciones a su paso por los materiales, en los que genera zonas con características distintas a las obtenidas por iones de menor energía. Estas modificaciones se deben al favoreci miento de interacciones electrónicas de los iones con los electrones de los átomos del material. Estos iones de rango energético de MeV, denominados en la bibliografía científica iones pesados rápidos (R. Spohr, "Ion tracks and microtechnoiogy. Basic principies and applications", Vieweg, Wiesbaden, (1990)) presentan a su paso por el material una desviación lateral mínima al inicio de su camino a través del material, incluyendo por tanto la sección de interés a emplear en los procesos laográficos, que es del orden de una tercera parte del alcance del ión en el material. La profundidad máxima a la que los iones quedan detenidos es elevada, por lo que su alcance constituye otra ventaja del uso de iones pesados con energía de MeV frente a las estructuras creadas con iones de menor energía. Los iones implantados de esta forma permanecen a distancias del orden del micrómetro de las superficies de las estructuras generadas. Estas estructuras, en la práctica, resultan por tanto exentas de la inclusión de los iones utilizados. La irradiación de iones pesados rápidos ha sido empleada satisfactoriamente en las últimas décadas para inducir modificaciones aisladas en materiales sensibles. Cuándo un ión pasa por el materia!, induce una traza de material modificado o trazas latentes. Estas modificaciones al ser eliminadas mediante ataques químicos, generan poros sobre materiales tales como polímeros, aleaciones y cristales. La irradiación con iones pesados rápidos también se ha utilizado para la generación de nanoestructuras en diversos materiales sensibles a esta radiación sin ser necesaria la eliminación del material afectado. La dificultad para seleccionar la zona a radiar a escalas por debajo de la miera puede resolverse sin recurrir a la focalización del haz de iones usando máscaras litográficas sólidas que restrinjan las zonas expuestas a ¡a irradiación.

Los efectos de la irradiación de dióxido de titanio monocristalino en fase rutilo y otros materiales con iones pesados en el rango de MeV para la generación de trazas latentes, tanto aisladas como superpuestas, así como su posterior ataque para generar micro y nanoestructurás con profundidades de varios micrómetros y con relaciones de aspecto (profundidad-dimensión lateral) superiores a 25, han sido estudiadas en profundidad por diversos autores y recogidas por .Sanz, "Nanoestructurás basadas en Ti0 ₂ y ZnO obtenidas mediante irradiación iónica", Tesis Doctoral, Universidad Autónoma de Madrid, Marzo 2009 (http://hdl.handle.net/10261/22699).

En estos trabajos se describen e indican los valores de energía umbral de los iones empleados, fluencia para conseguir una amortización volumétrica del material y parámetros para su disolución, tanto en regímenes de traza aislada como en superposición de estas. Los volúmenes de dióxido de titanio afectado por ia irradiación tienen carácter amorfo y no todo este material afectado puede ser eliminado mediante un ataque ácido selectivo. Este material amortizado presenta cualidades distintas al obtenido por otros métodos de síntesis tanto químicos como físicos.

Por otro lado, el substrato descrito en US 2006157873 permite el depósito y la fijación de múltiples sustancias tras la funcionalización química de su superficie basada en Si, pero su falta de transparencia dificulta su uso en exámenes de microscopía. Sumada a esta capacidad se encuentra la relativa a la no emisión de fluorescencia del óxido de titanio en el rango de longitudes de onda normalmente empleadas por los marcadores biológicos habituales.

Así mismo los substratos dotados de pocilios obtenidos mediante litografía óptica (WO20100 1939) no tienen la capacidad de fijación de sustancias biológicas y emiten fluorescencia.

Descripción de la invención

La presente invención trata de resolver los problemas derivados de la deposición de materiales sobre substratos mediante un proceso de litografía con iones sobre substratos de dióxido de titanio que genera estructuras tridimensionales con distintas características físico-químicas. Las. zonas expuestas a la irradiación presentan la capacidad por sí mismas de ser funcionales para la inmovilización o soporte de materiales químico o biológico, evitando el solapamiento de éstos y facilitando su examen mediante el uso de técnicas de microscopía óptica, fluorescencia y/o AF .

El uso de irradiación iónica para la generación de estructuras en óxido de titanio amorfo y su utilización como elemento en cristales fotónicos es conocido, sin embargo, nada hace evidenciar del estado de la técnica su aplicación para la deposición de material biológico o químico. .

El sustrato de Ti0 ₂ irradiado de la invención da lugar a estructura amorfa del Ti0 ₂ con un comportamiento hidrofílico, frente al comportamiento hidrofóbico del material no irradiado, así como con una gran capacidad para el soporte de material biológico, y la inmovilización dé material químico y biológico. Estas características y capacidades no resultan evidentes dadas las variaciones que presenta la estructura amorfa frente a las anteriormente obtenidas mediante otros procesos tanto químicos como físicos. Además de esto, las propiedades ópticas del material, transparencia en longitudes de onda del espectro visible y el hecho de no emitir fluorescencia en las longitudes de onda en la que emiten los marcadores fluorescentes comúnmente empleados para el mareaje de material biológico, hacen al óxido de titanio más adecuado que otros materiales usados como soporte como, vidrio, Si, Si0 ₂ y polímeros. Como ejemplo para ilustrar estas ventajas, podemos indicar la posibilidad de iluminar la superficie opuesta a la superficie donde se ha realizado el depósito de material (iluminación en transmisión). Esto simplifica en gran medida el proceso de iluminación y detección al estar las fuentes de luz y los detectores situados en lugares opuestos, por ejemplo pero no limitativo en exámenes con microscopía confocal.

La presente invención se refiere a un método de fabricación de un biosensor que puede aplicarse a múltiples exámenes, detecciones y reacciones de muestras biológicas y/o químicas con alta eficacia, alta fidelidad, bajo coste y compatibilidad entre técnicas de detección habituales.

El biosensor obtenido por el procedimiento de la invención es un substrato de óxido de titanio expuesto total o parcialmente de su superficie a al menos un proceso de irradiación de iones pesados en el rango energético de MeV, en adelante irradiación iónica, que sustenta o al que queda adherido uno o varios depósitos de material químico ó biológico que pueden realizarse tanto sobre zonas del substrato de óxido ^' de titanio vírgenes, como en aquellas que han sido modificadas tanto superficial como volumétricamente mediante la irradiación iónica y expuestas o no al efecto de un ataque químico que elimina parte de estos volúmenes, ¹ El procedimiento comprende las siguientes etapas:

1) Irradiación iónica

Una primera etapa de irradiación iónica sobre determinadas zonas de un sustrato de óxido de titanio monocristalino en fase rutilo, dando lugar a T¡0 ₂ amorfo en las zonas del sustrato irradiado.

El tipo de irradiación puede ser de cualquier ión pesado acelerado, entendiendo por ión pesado cualquier masa superior a la del H, que deposite por medio de interacciones ifielásticas, con ta nube electrónica de los átomos, al menos en superficie, una energía superior a 5,1 KeV por nm recorrido.

La irradiación, a su paso por un substrato de Ti0 ₂ monocristalino en fase rutilo, generará un volumen de material dañado denominado traza. La forma de esta traza puede ser continua o discontinua dependiendo de la energía del ión, en un caso general puede ser asociada a una forma cilindrica, cuyo . radio y profundidad dependerá de la energía total depositada por el ión. Si la irradiación iónica supera una fluencia umbral, esto _, es número de iones que atraviesan una superficie, se logra la superposición de estas trazas, en principio singulares, formándose un volumen conexo susceptible de ser disuelto mediante un ataque químico compuesto por una disolución acuosa de HF.

El valor de la fluencia umbral necesaria depende de la energía del ión empleado. Por ejemplo, para irradiaciones con iones Br de energías comprendidas desde 9 MeV hasta 50 eV, la fluencia umbral debe ser igual o superior a 8-10 ¹³ cm ^'z .

Sin embargo experimentos realizados con iones de mayor energía, por ejemplo iones

Cu de 84.5 MeV, muestran fluencias umbrales de 5-10 ¹³ cm ^"2 .

Para la que la radiación iónica sea en unas zonas específicas del sustrato de ^" ΠΟ2, se realiza una etapa previa de fijación sobre el substrato de óxido de titanio, de al menos un elemento que actúen como máscara cuya diferencia de densidad y o grosores de motivos permita un frenado selectivo de los iones.

Cualquier material capaz de frenar un flujo de iones puede ser empleado para componer la máscara a utilizar, dependiendo de la capacidad de frenado deseada. Son preferibles los materiales de carácter sólido que resistan el flujo iónico sin sufrir altas deformaciones, por ejemplo metales como Au, Cu, Cu/Ni, óxidos como Al ₂ 0 ₃₎

S1O2. Es posible usar máscaras espacialmente heterogéneas de distintos materiales para aprovechar las distintas capacidades de frenado de cada material. Dentro de los materiales se prefieren los metales o las máscaras cuya primera capa expuesta al flujo de iones sea de carácter metálico, para difundir más fácilmente el calor generado. La fijación de la máscara al substrato de óxido de titanio puede ser mediante elementos físicos o químicos.

2) Depósito de sustancia o material de carácter químico o biofógico '.

Una segunda etapa de depósito de una sustancia o un material seleccionado entre químico o biológico, como por ejemplo una disolución química de moléculas orgánicas o una suspensión de células, oligonucleótidos, ácidos grasos o proteínas incluyendo enzimas y anticuerpos,, sobre toda la superficie o al menos en una de las estructuras tridimensionales generadas de el Ti0 ₂ amorfo obtenido.

3) Fijación opcional por UV.

El material de carácter químico o biológico depositado en la segunda etapa puede ser fijado en una tercera etapa con luz ultravioleta para la adhesión de, por ejemplo, oligonucleótidos.

4) Ataque ácido intermedio entre la primera y segunda etapa

Las zonas sometidas a la irradiación iónica pueden ser expuestas posteriormente al efecto de, al menos, un ataque químico que elimine parte de los volúmenes correspondientes a esas zonas para generar así un patrón tridimensional en profundidad, así, opcionalmente, se puede realizar una etapa intermedia entre la primera y la segunda, en la que, tras el proceso de irradiación iónica, el substrato se somete a un ataque ácido selectivo con objeto eliminar parte del material expuesto, pudiéndo aplicarse cuantos procesos de irradiación iónica y ataques ácidos sean necesarios con la retirada o sustitución de diferentes máscaras si se requiriera, hasta la obtención de la estructura tridimensional con los perfiles topográficos deseados sobre el substrato de Ti0 ₂ . El tiempo necesario para la disolución del Ti0 ₂ afectado dependerá de la concentración del ácido empleado. Por ejemplo, una disolución de HF al 20% en volumen atacará la totalidad del volumen susceptible de disolución en 25 minutos a temperatura ambiente.

Las profundidades obtenidas tras eí ataque ácido, para fluencias iguales o superiores a 8-10 ¹³ cnrf ² de iones Br con distintas energías sobre substratos de Ti0 ₂ monocristalino en fase rutilo independientemente de su orientación de -superficie se recogen en la siguiente tabla:

Energía (MeV) Profundidad

9 10 nm

13 700 nm

25 2000 nm

50 4000 nm La técnica permite concatenar varios procesos de irradiación iónica y ataque químico posterior para aumentar la profundidad de las zonas tratadas.

En o sobre las micro ó nanoestructuras obtenidas tras la irradiación iónica, tales como pilares, o tas obtenidas tras al menos alguno de los procesos de irradiación iónica y ataque químico posterior tales como canales o pocilios, pueden llevarse a cabo ó facilitarse ciertos procedimientos de tipo físico, químico, biológico, biofísico, bioquímico, etc. Estos procesos pueden llevarse a cabo directamente sobre las estructuras mismas o sobre estructuras funcionalizadas mediante la deposición de otros materiales. A modo de ejemplos podemos indicar la adhesión de oligonucleótidos al menos a una de estas estructuras y el soporte de células sobre estas mismas.

El biosensor obtenido del depósito de materia biológica sobre el sustrato de dióxido de titanio monocristalino en fase rutilo, puede ser utilizado para el estudio de interacciones específicas mediante el depósito, sobre, toda la superficie o al menos en una de las estructuras tridimensionales donde se ha realizado la deposición del material biológico, de un oligónucieótido complementario al adherido al substrato en la segunda etapa, mediante su examen con AFM o señal de fluorescencia si los oligonucleótidos complementarios están dotados de marcadores fluorescentes.

Las formas de cada estructura o grupo de estructuras pueden ser adaptadas a ias necesidades particulares, a modo de ejemplo de estructura aislada y no limitativa, cuadrado, rectángulo, círculo o elipse.

Un aspecto particular de !a invención es que el biosensor obtenido por el citado procedimiento permite que pueda ser iluminado desde la base inferior del substrato. Este aspecto es una ventaja crucial para su compatibilidad con técnicas de detección habituales mediante microscopía óptica, como por ejemplo, a examen de proliferación celular o análisis con microscopía confocai, y que otros substratos no poseen.

Otro aspecto particular del biosensor obtenido por el procedimiento de la invención, viene dada por su resistencia a temperaturas elevadas, menores a 450°C y estabilidad química, lo que le otorga capacidad de reutilización mediante su limpieza mediante disolventes orgánicos, como acetona, con disoluciones agresivas, como por ejemplo H ₂ S0 ₄ :H ₂ 0 ₂ (1:1), permitiendo también procesos de autoclavado. Estas propiedades de resistencia a procesos de esterilización y limpieza le confieren capacidades de reutilización, lo que reduce el coste de operación. ,

Breve descripción de los dibujos

A continuación se pasa a describir de manera muy breve una serie de dibujos que _. ayudan a comprender mejor la invención y que se relacionan expresamente con una realización de dicha invención que se presenta como un ejemplo no limitativo de ésta.

La Figura 1 muestra un esquema dei procedimiento de obtención del biosensor con una etapa intermedia de ataque ácido.

La Figura 2 muestra un esquema del procedimiento de la invención sin etapa intermedia de ataque ácido

En las figuras anteriormente citadas se identifican una serie de referencias que corresponden a los elementos indicados a continuación, sin que ello suponga carácter limitativo alguno:

1. - biosensor

2. - sustrato de Ti0 ₂ litografiado con iones pesados

3. - zonas expuestas a irradiación iónica

4. - depósito biológico ,

5. - Ti0 ₂ amorfo

6. - pozo

Descripción detallada de un modo de realización

Tal y como puede verse en la figura 2, el procedimiento de fabricación del biosensor de la invención comprende:

una primera etapa (A) en la que se aplica una irradiación iónica sobre determinadas zonas (3) de un substrato -de ΤΊΟ2 moriocristalino en fase rutilo dando lugar a T1O2 amorfo (5),

- una segunda etapa (B) de deposición de material biológico (4) sobre el Ti0 ₂ amorfo (5) obtenido en la etapa _. primera, seleccionado entre oligonucleótidos, enzimas; proteínas o moléculas orgánicas

Opcionalmente se puede realizar una etapa intermedia (C) entra la primera y la segunda etapa, como se muestra en la figura 1, en la que se realiza un ataque ácido sobre el substrato de ^" ΠΟ2 irradiado iónicamente (2), dando lugar a una pluralidad de pocilios (7) en los que el propio ataque ácido no elimina todo el ^" ΠΟ2 amorfo (5) obtenido de la irradiación de la primera etapa, tal y como puede verse en la figura 1. De esta manera, el material biológico que se deposita en la segunda etapa, se sigue depositando sobre el Ti0 ₂ amorfo (5) obtenido de la irradiación.

A modo de ejemplo de realización, se ha aplicado el método descrito en las líneas anteriores con él fin de comprobar que ia invención posee la capacidad de adhesión de oligonucleótidos en zonas irradiadas frente a la no adhesión sobre las zonas no irradiadas. Para este propósito, un deoxioligonucleótido de 50 bases de longitud correspondiente al ADNc derivado del ARNm del gen de la ?-actina (SEQ, ID. NO:1 ) de rata fue marcado en ei extremo 5' con una molécula fluorescente, concretamente el fluorocromo Cy3. Tras resuspender el oligonucleótido marcado en agua estéril libre de nucleasas, alícuotas de un microlitro a concentración diez micromolar fueron depositadas en substratos estructurados en forma de pocilios.

Para la generación de los pocilios sobre el substrato de dióxido de titanio sé emplearon substratos monocristalinos en fase rutilo con orientación <100> y de dimensiones 10 x 5 x 0,5 mm ³ , con las dos superficies mayores pulidas hasta grado óptico (MTI Corp.). Las zonas expuestas a la irradiación fueron obtenidas cubriendo parte de una de ellas mediante una máscara'. La máscara consistía en una rejilla tipo TEM (Spi supplies Cu-400) y fue inmovilizada a la superficie mediante pegamento termorreversible Crystaibond 509 (Electron Microscopy . Sciences). Se sometió al conjunto a una irradiación de iones Br ^+r de 25 MeV hasta una fluencia de 1 -10 ¹⁴ cm ^"2 para obtener üna amorfización volumétrica susceptible de ser disuelta completamente hasta los 2200 nm. Este proceso induce una amorfización de las zonas expuestas y por consiguiente una expansión volumétrica del material creando una elevación topográfica de estas frente a las no afectadas de 175 nm. Tras este proceso se procedió a retirar la máscara y el substrato fue sumergido en una disolución acuosa de ácido fluorhídrico (HF) al 20% en volumen, durante 25 minutos para disolver parte de las zonas afectadas por la irradiación.

Antes de depositar las muestras de oligonucleótido, se esterilizaron los substratos con pocilios mediante autoclave de vapor saturado durante 20 minutos a 120 grados centígrados y 1,0 atmósferas de presión. A continuación se aplicaron en los substratos correspondientes un microlitro de solución de oligonucleótido de 50 bases marcado en el extremo 5' con fluorocromo Cy3, a concentración 10 micromolar. De cada ensayo se hicieron cuatro réplicas. Como control de fluorescencia inespecífica, se utilizó otra serie de cuatro réplicas en las que de depositó un microlitro de agua bidestilada estéril. Las ocho muestras se incubaron a 65 ⁰ durante 0 minutos para favorecer la evaporación del solvente de la solución. A continuación, las ocho muestras fueron tratadas durante 60 minutos con luz ultravioleta de 254 nanómetros de longitud de onda para favorecer la unión del nucleótido al substrato. Tras la irradiación, se procede a realizar lavados sistemáticos de las muestras en solución de urea 8,3 molar para favorecer la retirada de oligonucleótido no unido al substrato. Tras cada lavado se toma imagen de la fluorescencia emitida por el oligonucleótido que aún permanece unido al substrato. Las mediciones de fluorescencia fueron realizadas en un escáner Typhoon 9210 Variable Mode Imager con software específico ImageQuant TL (Amersham Biosciences). Las condiciones de análisis fueron optimizadas para detectar ia emisión de fluorescencia del oligonucleótido marcado.

Se seleccionaron las ocho muestras de substrato tratado en las que se habían generado pocilios. Cuatro de ellas fueron usadas para depositar un microlitro de solución de oligonucleótido marcado fluorescentemente, a concentración diez micromolar. Otras cuatro muestras fueron usadas como control de irradiación inespecífica del material en la longitud de onda del fluoróforo de! oligonucleótido. En esta segunda serie se depositó en cada muestra un microlitro de agua bidestilada estéril. El motivo de usar cuatro réplicas para cada ensayo es descartar la posible variabilidad entre las distintas muestras a lá hora de observar si efectivamente el oligonucleótido ha quedado retenido sobre el substrato debido a la acción de la irradiación ultravioleta.

La primera imagen de fluorescencia obtenida tras esterilizar las muestras demuestra que no hay emisión fluorescente significativa en la muestra, ya sea en la zona tratada o en la zona no tratada. En las imágenes sucesivas tomadas después de cada lavado con solución de Urea 8,3 molar, disolución empleada comúnmente en ensayos de hibridación de distinta naturaleza como agente desnaturalizante de ácidos nucleicos, se observa que la zona tratada retiene específicamente el oligonucleótido, ya que no se pierde señal de fluorescencia después de cada lavado. También se observa que las zonas no tratadas no retienen el oligonucleótido.

En los resultados obtenidos al estudiar la posible retención de oligonucleótido por el substrato cuando no hay irradiación con luz ultravioleta, se observa que el substrato por sí solo lio es capaz de retener el oligonucleótido ni en la zona tratada ni en la zona sin tratar, ya que se pierde completamente la emisión de fluorescencia.

A modo de ejemplo de realización, se ha aplicado el método descrito en el ejemplo anterior con el fin de comprobar que el biosensor obtenido por el procedimiento de la invención posee la capacidad de soporte e inmovilización de células sobre la superficie litografiada.

Para la generación de los pocilios sobre el substrato de dióxido de titanio se emplearon substratos monúcristalinos en fase rutilo con orientación <110> y de dimensiones 10 x 5 x 0,5 mm ³ , con las dos superficies mayores pulidas hasta grado óptico ( TI Corp.). Las zonas expuestas a la radiación, fueron obtenidas cubriendo parte de , una de ellas mediante una máscara. La máscara consistía en una rejilla comercial tipo TEM {Spi supplies Cu-400) y fue inmovilizada a la superficie mediante pegamento termorreversible Crystalbond 509 (Electron IVlicroscopy Sciences). Se sometió al conjuntó a una irradiación de iones Br ⁺⁷ de 25 MeV hasta una fluencia de 1 - 0 ¹⁴ cm ^"2 . Tras la irradiación se procedió a mover la máscara manualmente y realizar un proceso de irradiación de iones Br ⁺⁷ de 13 MeV 1 -10 ¹⁴ cm ^"2 coh el objetivo de generar una estructura de distintas alturas y diferente a un patrón regular de pocilios. Tras este proceso se procedió a retirar la máscara y ef substrato fue sumergido en una disolución acuosa de ácido fluorhídrico (HF) al 20% en volumen durante 25 minutos para disolver parte de las zonas afectadas por la irradiación. El patrón obtenido resultante es una superficie de pocilios superpuestos en línea y separados por paredes de material virgen.

Para el proceso de inmovilización de células se sembraron células de músculo liso vascular (CMLV), aisladas de aorta de rata a una densidad de 40.000-60.000, en los pocilios superpuestos en línea y separados por paredes de material virgen del biosensor fabricado. Los cultivos se crecieron en los soportes empleando un medio de cultivo DMEM con baja glucosa suplementado con suero fetal bovino al 10 % en volumen. Al día siguiente se fijaron con paraformaldehido al 4% en volumen, preparado en tampón fosfato salino (Phosphate buffer saline PBS)) durante 10 minutos y tras distintos lavados con PBS se montaron en portas, visualizándose por microscopía óptica empleando distintos aumentos. Las células inmovilizadas e individualizadas podrán emplearse para llevar a cabo de forma simultánea el análisis cuantitativo y cualitativo de parámetros bioquímicos, genéticos y/o moleculares en un único biosensor. Entre estas aplicaciones destaca la cuantificación del consumo de oxígeno de un tipo celular en distintas situaciones experimentales y/o patofisio lógicas o la determinación de patrones de expresión y localización de distintas proteínas o ácidos nucleicos. Así, estos biosensores permitirán analizar el efecto sobre el consumo de oxígeno y la expresión y/o localización de una proteína o ácido nucleico de tantos tratamientos como pocilios con células inmovilizadas se hayan empleado en el ensayo. Igualmente, el biosensor, entendido este como soporte con capacidad de inmovilización celular, permitirá analizar el efecto de un tratamiento sobre la expresión y/o localización de un número de proteínas b genes igual al número de pocilios con células inmovilizadas en su interior que el usuario haya decidido a emplear.