本発明は、(a)フィブロネクチン、フィブ� ��ネクチンフラグメントまたはそれらの混合� ��、および(b)γδT細胞活性化因子の存在下でγ δT細胞を含有する細胞集団を培養することに より、極めて拡大培養率が高く、さらに高い 細胞傷害活性を有するγδT細胞集団が得られ� ��ことを見出し、完成するに至ったものであ� ��。

 なお、本明細書において、本発明の製造� ��法により得られるγδT細胞集団とは、γδT細 胞を高比率に含むT細胞集団を意味する。ま� �、ここで高比率とは、本発明の製造方法に� �されるγδT細胞を含有する細胞集団と比較し てγδT細胞比率が高いことを意味する。

 以下、本発明を具体的に説明する。

(1)本発明に使用されるフィブロネクチンおよ びフィブロネクチンフラグメント
 本明細書中に記載のフィブロネクチンは、� ��然から得られたもの、または人為的に合成� ��れたもののいずれでもよい。フィブロネク� ��ンは、例えば、ルオスラーティ E.ら〔Ruosla hti E., et al.、ジャーナル・オブ・バイオロ� ��カル・ケミストリー(J. Biol. Chem.)、第256巻� ��第14号、第7277~7281頁(1981)〕の開示に基づき� �天然起源の物質から実質的に純粋な形態で� �造することができる。ここで、本明細書に� �載された実質的に純粋なフィブロネクチン� �は、これらが天然においてフィブロネクチ� �と一緒に存在する他のタンパク質を本質的� �含有していないことを意味する。

 なお、フィブロネクチンは多くのスプラ� ��シングバリアントの存在が知られているが� ��本発明に使用されるフィブロネクチンとし� ��は、本発明の所望の効果を発現するもので� ��れば、いずれのバリアントも使用すること� ��できる。例えば、血漿由来のフィブロネク� ��ンの場合、細胞結合ドメインの上流に存在� ��るED-Bと呼ばれる領域、細胞結合ドメインと ヘパリン結合ドメインの間に存在するED-Aと� �ばれる領域が欠失していることが知られて� �るが、このような血漿由来のフィブロネク� �ンも本発明に使用することができる。上記� �フィブロネクチンは、それぞれ単独で、も� �くは複数の種類のものを混合して本発明に� �用することができる。

 本発明において、フィブロネクチンフラ� ��メントとは、フィブロネクチンのアミノ酸� ��列の一部(例えば、3アミノ酸以上、好まし� �は10アミノ酸以上、より好ましくは20アミノ� ��以上)を含む人為的に製造されたフラグメン ト(改変型フィブロネクチンフラグメントと� �いう)を意味する。当該フィブロネクチンフ� ��グメントには、当該フィブロネクチンのア� ��ノ酸配列の一部が、1個もしくは数個含まれ ていれば特に限定はなく、天然型フィブロネ クチンの一部の断片そのものや、当該断片と フィブロネクチン以外に由来するアミノ酸配 列を含むフラグメントが包含される。なお、 本発明に使用できるフィブロネクチンフラグ メント、ならびに該フラグメントの調製に関 する有用な情報は、キミヅカ F.ら〔Kimizuka F . et al.、ジャーナル・オブ・バイオケミス� �リー(J. Biochem.)、第110巻、284~291頁(1991)〕、� �ーンブリット A.R.ら〔Kornbrihtt A. R., et al.� ��EMBO ジャーナル(EMBO J.)、第4巻、第7号、1755 ~1759(1985)〕、およびセキグチ K.ら〔Sekiguchi K ., et al.、バイオケミストリー(Biochemistry)、� �25巻、第17号、4936~4941(1986)〕等より得ること� ��できる。また、フィブロネクチンをコード� ��る核酸配列又はフィブロネクチンのアミノ� ��配列については、Genbank Accession No. NM_002026 、NP_002017に開示されている。

 本発明において、フィブロネクチンフラ� ��メントとしては、例えば、III-8(配列表の配� ��番号1で表されるアミノ酸配列)、III-9(配列� �の配列番号2で表されるアミノ酸配列)、III-10 (配列表の配列番号3で表されるアミノ酸配列) 、III-11(配列表の配列番号4で表されるアミノ� ��配列)、III-12(配列表の配列番号5で表される� ��ミノ酸配列)、III-13(配列表の配列番号6で表� ��れるアミノ酸配列)、III-14(配列表の配列番� �7で表されるアミノ酸配列)、およびCS-1(配列� ��の配列番号8で表されるアミノ酸配列)のい� �れかの領域を構成するアミノ酸配列を少な� �とも1つ含んでなるポリペプチド(m)(第1図参� �)や、前記いずれかのアミノ酸配列において1 もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿 入もしくは付加したアミノ酸配列を少なくと も1つ含んでなるポリペプチドであって、前� �ポリペプチド(m)と同等な機能を有するポリ� �プチド(n)が例示される。フラグメントの長� �としては、例えば、アミノ酸残基数として20 ~1000が好ましく、100~800がより好ましい。なお 、本明細書において、複数個とは数個を含む 概念であり、2~12個が好ましく、2~10個がより� ��ましく、2~8個がさらに好ましく、以下にお� ��ても同様である。

 また、当該フラグメントとしては、細胞� ��着活性および/またはヘパリン結合活性を有 するものが好適に使用できる。細胞接着活性 は、本発明で使用されるフラグメント(その� �胞結合ドメイン)と細胞との結合を公知の方� ��を使用してアッセイすることにより調べる� ��とができる。例えば、このような方法には� ��ウイリアムズ D.A.らの方法〔Williams D. A.,et  al.、ネイチャー(Nature)、第352巻、第438~441頁( 1991)〕が含まれる。当該方法は、培養プレー� ��に固定化したフラグメントに対する細胞の� ��合を測定する方法である。また、ヘパリン� ��合活性は、本発明に使用されるフラグメン� ��(そのヘパリン結合ドメイン)とヘパリンと� �結合を公知の方法を使用してアッセイする� �とにより調べることができる。例えば、上� �のウイリアムズ D.A.らの方法において、細� �に換えてヘパリン、例えば標識ヘパリンを� �用することにより、同様の方法でフラグメ� �トとヘパリンとの結合の評価を行うことが� �きる。

 さらにフィブロネクチンフラグメントと� ��ては、C-274(配列表の配列番号9で表されるア ミノ酸配列)、H-271(配列表の配列番号10で表さ れるアミノ酸配列)、H-296(配列表の配列番号11 で表されるアミノ酸配列)、CH-271(配列表の配� ��番号12で表されるアミノ酸配列)、CH-296(配列 表の配列番号13で表されるアミノ酸配列)、C-C S1(配列表の配列番号14で表されるアミノ酸配� ��)、およびCH-296Na(配列表の配列番号15で表さ� ��るアミノ酸配列)からなる群より選択される ポリペプチドが例示される。

 上記のCH-271、CH-296、CH-296Na、C-274、C-CS1の� ��フラグメントはVLA-5に結合する活性を有す� �細胞結合ドメインを有するポリペプチドで� �る。また、C-CS1、H-296、CH-296、CH-296NaはVLA-4に 結合する活性を有するCS-1を有するポリペプ� �ドである。さらに、H-271、H-296、CH-271、CH-296� ��よびCH-296Naはヘパリン結合ドメインを有す� �ポリペプチドである。なお、CH-296Naは血漿由 来のフィブロネクチンにおける細胞結合ドメ インからCS-1までを含むポリペプチドである� �

 本発明においては、上記の各ドメインが� ��変されたフラグメントも使用することがで� ��る。フィブロネクチンのヘパリン結合ドメ� ��ンは3つのIII型配列(III-12、III-13、III-14)によ� ��て構成されている。前記III型配列のうちの� ��つもしくは二つを欠失したヘパリン結合ド� ��インを含むフラグメントも本発明に使用す� ��ことが可能である。例えば、フィブロネク� ��ンの細胞結合部位(VLA-5結合領域、Pro1239~Ser15 15)と一つのIII型配列とが結合したフラグメン トであるCHV-89(配列表の配列番号16で表される アミノ酸配列)、CHV-90(配列表の配列番号17で� �されるアミノ酸配列)、CHV-92(配列表の配列番 号18で表されるアミノ酸配列)、あるいは二つ のIII型配列とが結合したフラグメントである CHV-179(配列表の配列番号19で表されるアミノ� �配列)、CHV-181(配列表の配列番号20で表される アミノ酸配列)が例示される。CHV-89、CHV-90、CH V-92はそれぞれIII-13、III-14、III-12を含むもの� �あり、CHV-179はIII-13とIII-14を、CHV-181はIII-12と III-13をそれぞれ含んでいる。

 また、上記の各フラグメントにさらにア� ��ノ酸を付加したフラグメントも本発明に使� ��することができる。当該フラグメントは、� ��えば、上記各フラグメントに所望のアミノ� ��を付加することにより製造可能である。例� ��ば、H-275-Cys(配列表の配列番号21で表される� ��ミノ酸配列)は、フィブロネクチンのヘパリ ン結合ドメインを有し、かつC末端にシステ� �ン残基を有するフラグメントである。

 また、フィブロネクチンフラグメントと� ��ては、配列表の配列番号1~8で表されるアミ� ��酸配列を重複して含むポリペプチドを使用� ��ることもできる。例えば、前述のヘパリン� ��合ドメイン及びCS-1ドメインを重複して含む ポリペプチドであるH296-H296(配列表の配列番� �22で表されるアミノ酸配列)が好適に使用さ� �る。

 なお、本発明に使用されるフラグメント� ��しては、本発明の所望の効果が得られる限� ��、上記に例示した天然のフィブロネクチン� ��アミノ酸配列の少なくとも一部を含むフラ� ��メントと同等な機能を有する、当該フラグ� ��ントを構成するポリペプチドのアミノ酸配� ��に1もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失 、挿入もしくは付加を有するアミノ酸配列を 有するポリペプチドからなるものであっても よい。

 アミノ酸の置換等は、本来のポリペプチ� ��の機能が維持され得る範囲内で該ポリペプ� ��ドの物理化学的性状等を変化させ得る程度� ��ものであるのが好ましい。例えば、アミノ� ��の置換等は、本来のポリペプチドの持つ性� ��(例えば、疎水性、親水性、電荷、pK等)を実 質的に変化させない範囲の保存的なものが好 ましい。例えば、アミノ酸の置換は、1.グリ� ��ン、アラニン;2.バリン、イソロイシン、ロ� ��シン;3.アスパラギン酸、グルタミン酸、ア� ��パラギン、グルタミン;4.セリン、スレオニ� ��;5.リジン、アルギニン;6.フェニルアラニン� ��チロシンの各グループ内での置換であり、� ��ミノ酸の欠失、付加、挿入は、ポリペプチ� ��におけるそれらの対象部位周辺の性質に類� ��した性質を有するアミノ酸の、対象部位周� ��の性質を実質的に変化させない範囲での欠� ��、付加、挿入が好ましい。

 なお、本発明に使用されるフラグメント� ��遺伝子工学的に取得した場合、例えば大腸� ��などを宿主として製造する場合は、大腸菌� ��来のメチオニンペプチダーゼ等の影響によ� ��、N末端のメチオニンが欠失される場合があ るが、このようなポリペプチドも本発明にお いて使用することができる。すなわち、配列 表の配列番号15および21に記載のポリペプチ� �のN末端のメチオニンが欠失したポリペプチ� ��も本発明においては好適に使用できる。

 アミノ酸の置換等は種間や個体差に起因� ��て天然に生ずるものであってもよく、また� ��人工的に誘発されたものであってもよい。� ��工的な誘発は公知の方法により行えばよく� ��特に限定はないが、例えば、公知の手法に� ��り、天然のフィブロネクチン由来の前記領� ��や所定のフラグメントをコードする核酸に� ��いて1もしくは複数個の塩基が置換、欠失、 付加もしくは挿入された所定の核酸を作製し 、それを使用して、天然のフィブロネクチン 由来の前記領域や所定のフラグメントと同等 な機能を有する、当該フラグメント等を構成 するポリペプチドのアミノ酸配列に置換等を 有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを製 造することができる。

 また、本明細書において「同等な機能を� ��する」とは、上記のフィブロネクチン、ま� ��はフィブロネクチンフラグメントを使用し� ��得られる、γδT細胞集団の拡大培養率、も� �くは得られるγδT細胞の細胞傷害活性が、比 較対照の上記のフィブロネクチン、またはフ ィブロネクチンフラグメントの非存在下で得 られるγδT細胞集団よりも高いことをいう。� ��記作用は後述の実施例1~7に記載の方法等に� ��じて適宜確認することができる。また、ア� ��ノ酸の置換等を有するポリペプチドからな� ��フラグメントとしては、細胞接着活性およ� ��/またはヘパリン結合活性を有するものが好 適であり、CS-1ドメインを有するものも好適� �ある。細胞接着活性およびヘパリン結合活� �は、それらの前記活性測定方法に準じて評� �することができる。

 アミノ酸の置換等を有するポリペプチド� ��らなるフラグメントとして、例えば、2つの 異なるドメイン間にリンカーとして1以上の� �ミノ酸が挿入されたフラグメントも本発明� �使用することができる。

 また、本発明に使用されるフィブロネク� ��ンまたはフィブロネクチンフラグメントと� ��ては、本発明の所望の効果が得られる限り� ��上記に例示した天然のフィブロネクチンや� ��のアミノ酸配列の少なくとも一部を含むフ� ��グメントと同等な機能を有する、当該フィ� ��ロネクチンまたはフィブロネクチンフラグ� ��ントを構成するポリペプチドのアミノ酸配� ��と50%以上の同一性を有するポリペプチド、� ��ましくは70%以上の同一性を有するポリペプ� ��ド、より好ましくは90%以上の同一性を有す� ��ポリペプチド、さらに好ましくは95%以上の� ��一性を有するペプチドが使用できる。なお� ��同一性の算出には、例えばDNASIS Pro Ver.2.6(� ��カラバイオ(株)製)を用いることができる。

 なお、本発明において、最も好適に使用� ��れるフィブロネクチンフラグメントとして� ��、アミノ酸配列中に少なくともIII-12(配列表 の配列番号5で表されるアミノ酸配列)、III-13( 配列表の配列番号6で表されるアミノ酸配列)� ��III-14(配列表の配列番号7で表されるアミノ� �配列)およびCS-1(配列表の配列番号8で表され� ��アミノ酸配列)のすべてを含む、すなわちヘ パリン結合ドメインとCS-1ドメインの両方を� �むポリペプチドが挙げられ、さらに好適に� �前述のCH-296、H296-H296もしくはそれらと同等� �機能を有する、当該フラグメントを構成す� �ポリペプチドのアミノ酸配列に1もしくは複� ��個のアミノ酸の置換、欠失、挿入もしくは� ��加を有するアミノ酸配列を有するポリペプ� ��ドが挙げられる。

 本明細書中に記載のフィブロネクチンフ� ��グメントは、例えば、米国特許第5,198,423号� ��細書の記載に基づいて遺伝子組換え体より� ��造することもできる。例えば、上記のH-271(� ��列番号10)、H-296(配列番号11)、CH-271(配列番号 12)、CH-296(配列番号13)の各フラグメントなら� �にこれらを取得する方法は当該特許明細書� �詳細に記載されている。また、CH-296Na(配列� �号15)とその製造方法については国際公開第20 05/019450号パンフレットに記載されている。ま た、上記のC-274(配列番号9)フラグメントは米� ��特許第5,102,988号明細書に記載された方法に� ��り得ることができる。さらに、C-CS1(配列番� ��14)フラグメントは日本特許第3104178号明細書 に記載された方法により得ることができる。 上記CHV-89(配列番号16)、CHV-90(配列番号17)、CHV- 179(配列番号19)の各フラグメントは、日本特� �第2729712号明細書に記載された方法により得� ��ことができる。また、CHV-181(配列番号20)フ� �グメントは国際公開第97/18318号パンフレット に記載された方法に準じて得ることができる 。CHV-92(配列番号18)フラグメントは、日本特� �第2729712号明細書および国際公開第97/18318号� �ンフレットを参照し、それらの文献に記載� �れたプラスミドに基づいて定型的にプラス� �ドを構築し、該プラスミドを用いて遺伝子� �学的に取得することができる。また、H296-H29 6(配列番号22)フラグメントは、これらの文献� ��情報をもとに、定型的にプラスミドを構築� ��、該プラスミドを用いた遺伝子工学的に取� ��することができる。

 これらのフラグメントまたはこれらのフラ� ��メントから定型的に誘導できるフラグメン� ��は、〒305-8566日本国茨城県つくば市東1丁目1 番地1中央第6 独立行政法人 産業技術総合研 究所 特許生物寄託センターに下記受託番号� ��もとで寄託された微生物を用いて製造する� ��あるいは各微生物の保持するプラスミドを� ��知の方法により改変することにより製造す� ��こともできる;
FERM BP-2264(H-271をコードするプラスミドを保� �する大腸菌;寄託日 1989年1月30日)、
FERM BP-2800(CH-296をコードするプラスミドを保� ��する大腸菌;寄託日 1989年5月12日)、
FERM BP-2799(CH-271をコードするプラスミドを保� ��する大腸菌;寄託日 1989年5月12日)、
FERM BP-7420(H-296をコードするプラスミドを保� �する大腸菌;寄託日 1989年5月12日)、
FERM BP-1915(C-274をコードするプラスミドを保� �する大腸菌;寄託日 1988年6月17日)、
FERM BP-5723(C-CS1をコードするプラスミドを保� �する大腸菌;寄託日 1990年3月5日)、
FERM BP-10073(CH-296Naをコードするプラスミド;寄 託日 2004年7月23日)
FERM P-12182(CHV-89をコードするプラスミドを保� ��する大腸菌;寄託日 1991年4月8日)、
FERM P-12183(CHV-179をコードするプラスミドを保 有する大腸菌;寄託日 1991年4月8日)。
FERM P-20602(H296-H296をコードする核酸を含有す� ��プラスミド;寄託日 2005年7月22日)。

 フィブロネクチンは巨大な糖タンパク質� ��あるため、天然起源のタンパク質を調製し� ��使用することは産業上および医薬品製造上� ��必ずしも容易ではない。また、フィブロネ� ��チンは多機能タンパク質であることから、� ��の使用の状況によっては、本発明の方法に� ��果を示す領域とは異なる領域に起因する不� ��合が起こることも考えられる。これらのこ� ��から、本発明においては、入手、取り扱い� ��容易さ、安全面の観点から、好適にはフィ� ��ロネクチンフラグメントを使用することが� ��ましい。また、高い拡大培養率を実現する� ��いう観点からも、前述のフィブロネクチン� ��ラグメントを使用することが好ましい。ま� ��、本発明に使用されるフィブロネクチンフ� ��グメントの分子量としては、特に限定はな� ��が、例えば1~230kD、好適には1~200kD、より好� �には5~190kD、さらに好適には5~180kD、さらによ り好適には10~180kDである。当該分子量は、例� ��ば、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動に より測定することができる。

 なお、本発明のフィブロネクチンフラグ� ��ントを構成するポリペプチドのアミノ酸配� ��において、フィブロネクチン由来のポリペ� ��チドのアミノ酸配列以外のアミノ酸配列部� ��は、本発明の所望の効果の発現を阻害しな� ��限り任意であり、特に限定されるものでは� ��い。

(2)γδT細胞集団の製造方法
 以下、本発明のγδT細胞集団の製造方法に� �いて具体的に説明する。本発明はγδT細胞を 高比率に含有する細胞集団を製造する方法で ある。本発明の方法は、前述の(a)フィブロネ クチン、フィブロネクチンフラグメントまた はそれらの混合物(以下、(a)成分と称するこ� �がある)、および(b)γδT細胞活性化因子(以下� ��(b)成分と称することがある)の存在下でγδT� ��胞を含む細胞集団を培養する工程を含有す� ��ことを特徴とする。本発明の製造方法はγδ T細胞の拡大培養率が高く、また当該方法に� �り得られるγδT細胞集団は、高い細胞傷害活 性を有するという、極めて有用な性質を有す る。なお、本願明細書において「それらの混 合物」とは、フィブロネクチン及び前記した フィブロネクチンフラグメントからなる群よ り選択される2種以上の混合物を意味し、フ� �ブロネクチン及び1種以上の前記フィブロネ� ��チンフラグメントの混合物、もしくは2種以 上の前記フィブロネクチンフラグメントの混 合物を意味する。

 本発明の製造方法に使用される、γδT細� �を含有する細胞集団としては、PBMC、造血幹� ��胞、臍帯血単核球等が例示される。なお、� ��願明細書においてPBMCとは、末梢血由来単核 球を意味し、例えば、採血によって得られた 血液や、成分採血によって得られた成分採血 液から比重遠心などの方法により分離・取得 することができる。ただし、PBMCの取得に際� �ては、特に限定されるものではなく組織液� �骨髄液などに含まれる前躯細胞等も利用で� �る。また、前記γδT細胞を含む細胞集団とし ては、γδT細胞を含む血球系細胞であれば本� ��明に使用でき、例えば、末梢血液、臍帯血� ��の血液や、血液から赤血球や血漿等の成分� ��除去したもの、骨髄液等を使用することが� ��きる。また、γδT細胞集団を含む細胞集団� �しては、生体から採取されたもの、あるい� �生体外での培養を経て得られたもの、例え� �本発明の方法により得られたγδT細胞集団を そのままもしくは凍結保存したもののいずれ も使用することができる。また、例えば生体 から得られたPBMC、造血幹細胞、臍帯血単核� �等から種々の分離操作を経て得られたγδT細 胞や、後述のγδT細胞活性化因子による刺激� ��付与することによってγδT細胞比率が高め� �れたT細胞集団を使用することもできる。な� ��、本発明においては、γδT細胞を構成細胞� �一部として含む細胞集団を使用することに� �り、γδT細胞の高比率な拡大培養を実施でき ることから、本発明に使用されるγδT細胞を� ��有する細胞集団としては、前記のPBMC、造血 幹細胞、臍帯血単核球が好ましい。

 本発明において、γδT細胞活性化因子と� �ては、γδT細胞を活性化、もしくは増殖する 作用を有する公知のものが使用できる。特に 限定はないが、例えば、パミドロネート、ア レンドロネート、ゾレドロネート、リセドロ ネート、ネリドロネート、イバンドロネート 、インカドロネート、オルバドロネート、ソ ルバドロネート、ミノドロネート、EB1053、エ チドロネート、クロドロネート、チルドロネ ート、メドロネート等のビスホスフォン酸系 化合物、イソペンテニルピロリン酸、2-メチ� ��-3-ブテニル-1-ピロリン酸、4-ヒドロキシ-3-� �チル-2-ブテニル-1-ピロリン酸等のピロリン� �モノエステル系化合物、3-(ブロモメチル)-3-� ��タノール-1-イル-2リン酸(BrHPP)、3-(ヨードメ� ��ル)-3-ブタノール-1-イル-2リン酸(IHPP)、3-(ク� ��ロメチル)-3-ブタノール-1-イル-2リン酸(ClHPP) 、3-(ブロモメチル)-3-ブタノール-1-イル-3リン 酸(BrHPPP)、3-(ヨードメチル)-3-ブタノール-1-イ ル-3リン酸(IHPPP)、α,γ-ジ-[3-(ブロモメチル)-3- ブタノール-1-イル]-3リン酸(diBrHTP)、α,γ-ジ-[3 -(ヨードメチル)-3-ブタノール-1-イル]-3リン酸 (diIHTP)等のホスホハロヒドリン類、3,4-エポキ シ-3-メチル-1-ブチル-2リン酸(Epox-PP)、3,4-エポ キシ-3-メチル-1-ブチル-3リン酸(Epox-PPP)、α,γ- ジ-3,4-エポキシ-3-メチル-1-ブチル-3リン酸(di-E pox-TP)等のホスホエポキシド類、1-ヒドロキシ -3-(メチルペンチルアミノ)プロピリデン-バイ ホスホン酸等のアミノバイホスホネート系化 合物、またpan-δモノクローナル抗体等のγδ� �のT細胞レセプター(γδTCR)に結合活性を有す� ��抗体等が例示される。

 本発明のγδT細胞集団の製造方法におい� �、製造されるγδT細胞集団を得るための総培 養日数としては、例えば2~60日間、好適には4~ 40日間、より好適には6~30日間とすることが好 ましい。また、本発明のγδT細胞集団の製造� ��法において実施される、上記(a)成分、およ� ��(b)成分の存在下でのγδT細胞集団を含む細� �集団の培養は、特に好適には全培養期間中� �少なくとも初期段階において上記(a)成分、� �よび(b)成分の存在下に培養を実施すること� �好適であり、より好適には少なくとも培養� �始時に本発明の有効成分の存在下での培養� �実施していることが好ましい。なお、本発� �の有効成分の存在下での培養は培養期間中� �全期間であってもよく、また任意の一部の� �間であってもよい。すなわち、γδT細胞の製 造工程の一部に前記工程を含むものであれば 本発明に包含される。好適には(a)成分、およ び(b)成分の存在下での培養を、培養開始時か ら少なくとも6時間以上、より好ましくは12時 間以上、さらに好ましくは24時間以上実施す� ��ことが好ましい。また、本発明のγδT細胞� �製造方法における、これらの(a)成分および(b )成分の存在下での培養工程以外の培養は、� �記(a)成分もしくは(b)成分のいずれかの存在� �、または上記(a)成分および(b)成分の非存在� �で実施することもできる。例えば上記(a)成� �および(b)成分の存在下での2~7日間の培養工� �により得られた細胞集団を、(a)成分もしく� �(b)成分の存在下、または上記(a)成分および(b )成分の非存在下でさらに4~14日間培養するこ� ��ができる。

 本発明において、(a)成分の培養中の濃度� ��しては、特に限定はなく、例えば0.0001~500μg /mL、特に0.001~500μg/mLが好適である。なお、当 該培養中の(a)成分の濃度とは、培地中に溶解 させるか、もしくは適当な担体に固定化して 培地中に存在させた際の濃度を意味する。

 本発明において、(b)成分の培養中の濃度� ��しては、使用されるγδT細胞活性化因子に� �り適宜設定でき、特に限定されるものでは� �いが、例えば0.001~1000μM、好適には0.005~100μM� ��特に好適には0.01~50μMが例示される。

 本発明のγδT細胞集団の製造方法において� �用される培地は、特に限定はなく、γδT細胞 の拡大培養に必要な成分を混合して作製され た公知の培地を使用することができ、たとえ ば市販の培地を適宜選択して使用することが できる。これらの培地はその本来の構成成分 以外にサイトカイン類、適当なタンパク質、 その他の成分を含んでいてもよい。サイトカ イン類としては、例えばIL-2、IL-7、IL-12、IFN-� �、IFN-α、IFN-β、IL-15等が例示され、好適には 、IL-2を含有する培地が使用される。IL-2(サイ トカイン類一般)の培地中の濃度としては、� �に限定はないが、例えば、好適には0.01~1×10 ⁵ U/mL、より好適には0.1~1×10 ⁴ U/mLである。また、適当なタンパク質として� �、CD3リガンドやCD28リガンド、例えば抗CD3抗� ��や抗CD28抗体が例示される。当該成分の培地 中の濃度は、所望の効果が得られれば特に限 定されるものではない。しかしながら、本発 明においては、後述の実施例にも記載のとお り、抗CD3抗体の非存在下でも高いγδT細胞比� ��で拡大培養を実現することができる。すな� ��ち、本発明において、好ましくは抗CD3抗体� ��存在下での培養が実施される。また、その� ��の成分としては、T細胞の活性化に寄与する 各種マイトジェン等が例示される。

 さらに、培養においては、培地中に血清� ��血漿を添加することもできる。これらの培� ��中への添加量は特に限定はないが、0%(v/v)超 ~20%(v/v)が例示され、また培養段階に応じて使 用する血清や血漿の量を変更することができ る。例えば、血清又は血漿濃度を段階的に減 らして使用することもできる。なお、血清又 は血漿の由来としては、自己(培養する細胞� �由来が同じであることを意味する)もしくは� ��自己(培養する細胞と由来が異なることを意 味する)のいずれでも良いが、好適には安全� �の観点から自己由来のものが使用できる。� �た、培地中に血清や血漿を添加せずに培養� �実施することもできる。

 本発明のγδT細胞集団の製造は、通常、上� �の(a)フィブロネクチン、フィブロネクチン� �ラグメントまたはそれらの混合物、および(b )γδT細胞活性化因子の存在下に、所定の成分 を含む培地中で行なわれる。本発明において 使用される培養開始時の細胞数としては、特 に限定はないが、例えば好適には1cell/mL~1×10 ⁸ cells/mL、より好適には1cell/mL~5×10 ⁷ cells/mL、さらに好適には1cell/mL~2×10 ⁷ cells/mLが例示される。また、培養条件に特に� ��定はなく、通常の細胞培養に使用される条� ��を使用することができる。例えば、20~40℃� �好ましくは37℃で、CO ₂ 等の存在下で培養することができる。また、 適当な時間間隔で細胞培養液を新鮮な培地を 加えて希釈するか、培地を交換するか、もし くは細胞培養用器材を交換することができる 。

 本発明のγδT細胞集団の製造方法において� �用される細胞培養用器材としては、特に限� �はないが、例えば、シャーレ、フラスコ、� �ッグ、大型培養槽、バイオリアクター等を� �用することができる。なお、バッグとして� �、細胞培養用CO ₂ ガス透過性バッグを使用することができる。 また、工業的に大量のγδT細胞集団を製造す� ��場合には、大型培養槽を使用することがで� ��る。また、培養は開放系、閉鎖系のいずれ� ��も実施することができるが、好適には得ら� ��るγδT細胞集団の安全性の観点から閉鎖系� �培養を行うことが好ましい。

 なお、上記のフィブロネクチン、フィブ� ��ネクチンフラグメントまたはそれらの混合� ��、γδT細胞活性化因子、サイトカイン類、� �当なタンパク質やその他成分は培地中に溶� �して共存させる他、適切な固相、例えばシ� �ーレ、フラスコ、バッグ等の細胞培養用器� �(開放系のもの、および閉鎖系のもののいず� ��をも含む)、またはビーズ、メンブレン、ス ライドガラス等の細胞培養用担体に固定化し て使用してもよい。それらの固相の材質は細 胞培養に使用可能なものであれば特に限定さ れるものではない。前記担体は、細胞培養時 に細胞培養用器材中の培養液に浸漬して使用 される。前記成分を前記担体に固定化する場 合、その固定化量は所望の効果が得られれば 特に限定されるものではない。

 上記成分の固相への固定化方法としては� ��特に限定はないが、例えば、適当な緩衝液� ��中でこれらの物質を固相と接触させること� ��より固定化することができる。例えば、フ� ��ブロネクチンフラグメントの固相への固定� ��については、国際公開第97/18318号パンフレ� �ト、ならびに国際公開第00/09168号パンフレッ トに記載の方法によっても固定化を実施する ことができる。

 前記の種々の成分を固相に固定化してお� ��ば、本発明の方法によりγδT細胞集団を得� �後、該T細胞集団と固相とを分離するのみで� ��有効成分等と該T細胞集団とを容易に分離す ることができ、該T細胞集団への有効成分等� �混入を防ぐことができる。

 また、本発明の製造方法により得られた� �δT細胞集団を用いて、さらにγδT細胞を高比 率に含有するγδT細胞集団、もしくはγδT細� �のみを分離することもできる。分離操作と� �ては、特に限定はないが、例えばセルソー� �ー、磁気ビーズ、カラム等を用いて公知の� �法で分離することが出来る。

 また、本発明の方法により製造されたγδ T細胞をクローン化することにより、安定し� �γδT細胞として維持することもできる。また 、本発明の方法により得られたγδT細胞集団� ��用いて、さらに本発明の方法や公知の方法� ��より培養することで新たにγδT細胞集団を� �ることもできる。

 本発明の方法により製造されるγδT細胞� �団の投与により効果を示す疾患、すなわち� �発明の方法により製造されるγδT細胞集団に 感受性を示す疾患としては、特に限定はない が、例えば、癌、白血病、悪性腫瘍、肝炎や 、インフルエンザ、HIV等のウイルス、細菌、 真菌が原因となる感染性疾患、例えば結核、 MRSA、VRE、深在性真菌症が例示される。また� �後述のようにさらに遺伝子治療用の外来遺� �子を導入した場合は、目的の各種遺伝子疾� �等に対しても効果を示す。また、本発明の� �法により製造されるγδT細胞集団は、骨髄移 植や放射線照射後の感染症予防、再発白血病 の寛解を目的としたドナーリンパ球輸注等に も利用できる。

 さらに本発明は、上記の本発明の製造方法� ��得られたγδT細胞集団を提供する。また、� �発明は、当該T細胞集団を有効成分として含� ��する医薬(治療剤)を提供する。当該T細胞集� ��を含有する前記医薬は免疫療法への使用に� ��しており、例えば養子免疫療法又はドナー� ��ンパ球輸注用の医薬として使用できる。免� ��療法においては、患者の治療に適したγδT� �胞集団が、例えば注射や点滴による静脈、� �脈、皮下、腹腔内等の投与方法によって患� �に投与される。当該医薬は前述の疾患やド� �ーリンパ球輸注での使用において非常に有� �である。当該医薬は製薬分野で公知の方法� �従い、例えば、本発明の方法により調製さ� �た当該T細胞集団を有効成分として、公知の� ��経口投与に適した有機または無機の担体、� ��形剤、安定剤等と混合し、点滴剤、注射剤� ��として調製できる。なお、医薬における本� ��明のγδT細胞集団の含有量、医薬の投与量� �当該医薬に関する諸条件は公知の免疫療法� �従って適宜、決定できる。例えば、医薬に� �ける本発明のγδT細胞集団の含有量としては 、特に限定はないが、例えば、好適には1×10 ³ ~1×10 ¹¹ cells/mL、より好適には1×10 ⁴ ~1×10 ¹⁰ cells/mL、さらに好適には1×10 ⁵ ~1×10 ⁹ cells/mLが例示される。また、本発明の医薬の� ��与量としては、特に限定はないが、例えば� ��成人一日あたり、好適には1×10 ⁵ ~1×10 ¹² cells/日、より好ましくは、1×10 ⁶ ~5×10 ¹¹ cells/日、さらに好ましくは1×10 ⁶ ~1×10 ¹¹ cells/日が例示される。さらに、当該医薬によ る免疫療法と、公知の薬剤投与による薬剤治 療や放射線治療、外科的手術による治療との 併用を行なうこともできる。また、当該医薬 の投与には、前述のγδT細胞活性化因子を同� ��に投与することにより、生体に投与された� �δT細胞のより高い治療効果が期待できる。� �お、本発明の別の態様として、本発明の製� �方法により得られたγδT細胞集団および前述 のγδT細胞活性化因子のいずれをも含む医薬� ��ットが提供される。

 本発明のγδT細胞集団の製造方法におい� �、当該T細胞に外来遺伝子を導入する工程を� ��らに包含することができる。すなわち、本� ��明は、その一態様として、当該T細胞集団に 外来遺伝子を導入する工程をさらに含むγδT� ��胞集団の製造方法を提供する。なお、「外� ��遺伝子」とは、遺伝子導入対象のγδT細胞� �人為的に導入される遺伝子のことを意味し� �遺伝子導入対象のγδT細胞と同種由来のもの も包含される。

 本発明の製造方法を行うことにより、培� ��されるγδT細胞の増殖能が増強されるが、� �発明のγδT細胞の製造方法を、遺伝子の導入 工程と組み合わせることにより、遺伝子の導 入効率の上昇が期待される。

 外来遺伝子の導入手段には特に限定はな� ��、公知の遺伝子導入方法により適切なもの� ��選択して使用することができる。遺伝子導� ��の工程は、γδT細胞集団の製造の際、任意� �時点で実施することができる。例えば、前� �T細胞集団の製造と同時もしくは途中で、あ� ��いは該工程の後に実施するのが、作業効率� ��観点から好適である。

 前記の遺伝子導入方法としては、ウイル� ��ベクターを使用する方法、該ベクターを使� ��しない方法のいずれもが本発明に使用でき� ��。それらの方法の詳細についてはすでに多� ��の文献が公表されている。

 前記ウイルスベクターには特に限定はな� ��、通常、遺伝子導入方法に使用される公知� ��ウイルスベクター、例えば、レトロウイル� ��ベクター、レンチウイルスベクター、アデ� ��ウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベ� ��ター、シミアンウイルスベクター、ワクシ� ��アウイルスベクターまたはセンダイウイル� ��ベクター等が使用される。特に好適には、� ��イルスベクターとしては、レトロウイルス� ��クター、アデノウイルスベクター、アデノ� ��伴ウイルスベクター、レンチウイルスベク� ��ーまたはシミアンウイルスベクターが使用� ��れる。上記ウイルスベクターとしては、感� ��した細胞中で自己複製できないように複製� ��を欠損させたものが好適である。また、遺� ��子導入の際にレトロネクチン(登録商標、タ カラバイオ社製)などの遺伝子導入効率を向� �させる物質を用いることもできる。

 レトロウイルスベクターならびにレンチ� ��イルスベクターは、当該ベクターが導入さ� ��る細胞の染色体DNA中に該ベクターに挿入さ� ��ている外来遺伝子を安定に組み込むことが� ��き、遺伝子治療等の目的に使用されている� ��当該ベクターは分裂、増殖中の細胞に対す� ��感染効率が高いことから、本発明における� ��造の工程において遺伝子導入を行うのに好� ��である。

 ウイルスベクターを使用しない遺伝子導� ��方法としては、本発明を限定するものでは� ��いが、例えば、リポソーム、リガンド-ポリ リジンなどの担体を使用する方法やリン酸カ ルシウム法、エレクトロポレーション法、パ ーティクルガン法などを使用することができ る。この場合にはプラスミドDNA、直鎖状DNAや RNAに組み込まれた外来遺伝子が導入される。

 本発明においてγδT細胞集団に導入され� �外来遺伝子には特に限定はなく、前記細胞� �導入することが望まれる任意の遺伝子を選� �ことができる。このような遺伝子としては� �例えば、タンパク質(例えば、酵素、サイト� ��イン類、レセプター類等)をコードするもの の他、アンチセンス核酸やsiRNA(small interfering  RNA)、リボザイムをコードするものが使用で きる。また、遺伝子導入された細胞の選択を 可能にする適当なマーカー遺伝子を同時に導 入してもよい。

 前記の外来遺伝子は、例えば、適当なプ� ��モーターの制御下に発現されるようにベク� ��ーやプラスミド等に挿入して使用すること� ��できる。また、効率のよい遺伝子の転写を� ��成するために、プロモーターや転写開始部� ��と協同する他の調節要素、例えば、エンハ� ��サー配列やターミネーター配列がベクター� ��に存在していてもよい。また、外来遺伝子� ��相同組換えにより導入対象のT細胞の染色体 へ挿入することを目的として、例えば、該染 色体における該遺伝子の所望の標的挿入部位 の両側にある塩基配列に各々同一性を有する 塩基配列からなるフランキング配列の間に外 来遺伝子を配置させてもよい。導入される外 来遺伝子は天然のものでも、または人工的に 作製されたものでもよく、あるいは起源を異 にするDNA分子がライゲーション等の公知の手 段によって結合されたものであってもよい。 さらに、その目的に応じて天然の配列に変異 が導入された配列を有するものであってもよ い。

 導入する遺伝子としては、標的細胞の表� ��抗原を認識するTCRをコードする遺伝子や、� ��的細胞の表面抗原に対する抗体の抗原認識� ��位を有し、かつTCR複合体の部分領域(CD3やそ の部分領域等)を含むキメラレセプターをコ� �ドする遺伝子が例示される。ここでTCRとし� �は対象となる疾患に応じてαβ型、γδ型にか かわらず、適切なTCRを選択することができる 。

 また、例えば、癌等の患者の治療に使用� ��れる薬剤に対する耐性に関連する酵素をコ� ��ドする遺伝子をγδT細胞に導入して該T細胞� ��薬剤耐性を付与することができる。そのよ� ��なγδT細胞を用いれば、免疫療法と薬剤療� �とを組み合わせることができ、従って、よ� �高い治療効果を得ることが可能となる。薬� �耐性遺伝子としては、例えば、多剤耐性遺� �子(multidrug resistance gene)が例示される。

 一方、前記の態様とは逆に、特定の薬剤� ��対する感受性を付与するような遺伝子をγδ T細胞集団に導入して、該薬剤に対する感受� �を付与することもできる。かかる場合、生� �に移植した後のT細胞を当該薬剤の投与によ� ��て除去することが可能となる。薬剤に対す� ��感受性を付与する遺伝子としては、例えば� ��チミジンキナーゼ遺伝子が例示される。

 本発明はまた、被験体に、有効量の前述� ��方法により得られるγδT細胞集団を投与す� �ことを含む、疾患の治療方法又は予防方法� �提供する。本明細書中において被験体とは� �特に限定はないが、好ましくは本発明の方� �により製造されるT細胞集団を投与される前� ��に記載するような疾患、すなわち当該T細胞 集団に感受性を示す疾患の患者を示す。また 、当該治療方法としては養子免疫療法又はド ナーリンパ球輸注療法が例示される。なお、 当該T細胞集団とともに、前述のγδT細胞活性 化因子を患者に投与することもできる。

 また、本明細書中において有効量とは、� ��述の方法により得られるγδT細胞集団を上� �被験体に投与した場合に、該T細胞集団を投� ��していない被験体と比較して、治療もしく� ��予防効果を発揮する該T細胞集団の量である 。具体的な有効量としては、投与形態、投与 方法、使用目的および被験体の年齢、体重、 症状等によって適宜設定され一定ではないが 、好ましくは、上記の医薬の投与量と同様に すればよい。投与方法にも限定はなく、例え ば、上記の医薬と同様に、点滴や注射等によ り投与すればよい。

 また、本発明は、医薬の製造のための前� ��の方法により得られるγδT細胞集団の使用� �提供される。当該医薬の製造方法は前述の� �薬と同様に行われる。また、当該医薬の投� �される疾患についても、特に限定はないが� �前述の医薬と同様である。また、当該医薬� �しては、養子免疫療法用又はドナーリンパ� �輸注用の医薬が例示される。

 また、本発明は、養子免疫療法又はドナ� ��リンパ球輸注への使用のための前記γδT細� �集団の使用も提供される。本使用における� �記γδT細胞集団の使用量には限定はないが、 例えば、医薬における前記γδT細胞集団の含� ��量として例示される量が挙げられる。