本明細書において使用される用語は、特� ��言及する場合を除いて、当該分野で通常用� ��られる意味で用いられる。以下に特に本明� ��書で用いられる用語について説明する。

 本発明において、「チトクロームP450」は 、アダマンタン骨格を有する化合物の水酸化 の触媒として利用される。例えば、N-(5-ヒド� ��キシ-2-アダマンチル)-ベンズアミド誘導体� �水酸化することによりN-(5-ヒドロキシ-2-アダ マンチル)-ベンズアミド誘導体を製造する方� ��において触媒として利用される。P450である タンパク質がアダマンタン骨格を有する化合 物の水酸化の触媒として利用可能か否かは、 例えば、基質であるN-(2-アダマンチル)―ベン ズアミド誘導体に、該タンパク質、又は該タ ンパク質及び該タンパク質に電子を供給する フェレドキシンと還元酵素からなる還元系を 作用させることによって、N-(5-ヒドロキシ-2-� ��ダマンチル)-ベンズアミド誘導体が得られ� �か否かで判断することができる。より詳し� �は、P450を発現可能な微生物を、好適な培地� ��培養し、培地中に蓄積されたN-(5-ヒドロキ� �-2-アダマンチル)-ベンズアミド誘導体の有無 を検出する方法を用いることができる。必要 であればP450に電子を供給するフェレドキシ� �と還元酵素からなる還元系を微生物内に導� �することにより、より効率的に検出するこ� �ができる。N-(5-ヒドロキシ-2-アダマンチル)-� ��ンズアミド誘導体の検出は、例えば、本発� ��により得られるN-(5-ヒドロキシ-2-アダマン� �ル)-ベンズアミド誘導体を標準品として用い た高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により、 行うことができる。具体的には後述の実施例 に記載の方法を用いることができる。本発明 に有用なP450としては、例えば、CYP109B1、CYP101 、CYP105D等、及びこれらの誘導体等が挙げら� �る。

 P450の「誘導体」とは、実質的にP450と同じ� �物学的機能又は活性、すなわち本発明にお� �ては、水酸化活性を有するポリペプチドを� �味する。該ポリペプチドのC末端はカルボキ� ��ル基、カルボキシレート、アミド又はエス� ��ルのいずれであってもよい。例えば、他の� ��ンパク質との融合タンパク質、修飾基を付� ��して得られた修飾体、アミノ酸残基を欠失� ��置換若しくは付加することにより得られた� ��異体等が挙げられる。
 融合タンパク質に用いられる「他のタンパ� ��質」としては、融合することによって、該� ��合タンパク質が、実質的にP450と同じあるい はそれ以上の水酸化活性を示すことになるも のが好ましい。例えば、R450Rhf reductase domain� ��P450BM3 reductase domain等が挙げられる。
 修飾体の修飾基としては、蛍光性を呈する� ��能基、ポリペプチドの立体構造の形成には� ��与しない官能基等が挙げられる。また、天� ��由来のP450を構成するアミノ酸残基以外のア ミノ酸残基(例えば、β-アラニン等)であって� ��よい。蛍光性を呈する官能基としては、エ� ��シンやフルオレセインイソチオシアネート( FITC)等が挙げられる。ポリペプチドの立体構� ��の形成には関与しない官能基としては、β-� ��ラニン残基等に代表されるスペーサー基等� ��挙げられる。かかる官能基は末端に存在す� ��ことが好ましい。
 変異体としては、P450のアミノ酸配列におい て、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換� �しくは付加されたアミノ酸配列からなるP450� ��機能を有するタンパク質等が含まれる。

 「1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換 若しくは付加されたアミノ酸配列」とは、例 えば、(A)P450のアミノ酸配列中の1又は2個以上 (好ましくは、1~30個程度、好ましくは1~10個程 度、さらに好ましくは数(1~5)個)のアミノ酸が 欠失したアミノ酸配列、(B)P450のアミノ酸配� �中の1又は2個以上(好ましくは、1~30個程度、� ��ましくは1~10個程度、さらに好ましくは数(1~ 5)個)のアミノ酸が他のアミノ酸で置換された アミノ酸配列、(C)P450のアミノ酸配列に1又は2 個以上(好ましくは、1~30個程度、好ましくは1 ~10個程度、さらに好ましくは数(1~5)個)のアミ ノ酸が付加したアミノ酸配列、又は(D)それら を組み合わせたアミノ酸配列を含有するタン パク質が挙げられる。アミノ酸配列が欠失、 置換又は付加されている場合、その欠失、置 換又は付加の位置としては、特に限定されな い。但し、本発明に使用されるP450の変異体� �、欠失、置換又は付加によっても、アダマ� �タン骨格を有する化合物の水酸化の触媒作� �を有するポリペプチドである。P450のアミノ� ��配列と少なくとも60%以上の相同性を有する� ��リペプチド、好ましくは80%以上の相同性を� ��するポリペプチド、さらに好ましくは、95%� ��上の相同性を有するポリペプチドが挙げら� ��る。

 本明細書において、「CYP109B1」とは、配列� �号:1記載のアミノ酸配列からなるタンパク質 を意味する。
 「CYP109B1の変異体」とは、配列番号:1記載の アミノ酸配列において1若しくは数個のアミ� �酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ� �配列を含有し、かつ水酸化活性を有するタ� �パク質を意味する。具体的には、配列番号:1 記載のアミノ酸配列において、I77F、L357P、A36 2T、F41L、I77W、M105I、T234A、F232I、F232L及びF232M� ��らなる群より選ばれる1若しくは数個の変異 を持つアミノ酸配列からなるタンパク質等が 挙げられる。「1若しくは数個の変異」とは� �1~5個程度、好ましくは1~3個、さらに好まし� �は1又は2個の変異を意味する。特に、配列番 号:1記載のアミノ酸配列において、I77F、I77F� �L357P、I77FとM105IとT234A、I77FとF232Mからなる群� ��り選ばれる1~5個、好ましくは1~3個の変異を� ��つアミノ酸配列からなるタンパク質が好ま� ��い。

 「CYP109FK」とは、配列番号:3記載のアミノ酸 配列からなるタンパク質を意味する。
 「CYP109FK変異体」とは、配列番号:3記載のア ミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ� �が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸� �列を含有し、かつ水酸化活性を有するタン� �ク質を意味する。具体的には、配列番号:3記 載のアミノ酸配列において、I77F、I77W、M105I� �A196D、F232I、F232L、F232M、T234A、T244A、V399E及び K702Eからなる群より選ばれる1若しくは数個の 変異を持つアミノ酸配列からなるタンパク質 等が挙げられる。「1若しくは数個の変異」� �は、1~5個程度、好ましくは1~3個、さらに好� �しくは1又は2個の変異を意味する。特に、配 列番号:3記載のアミノ酸配列において、I77F、 I77W、M105I、A196D、F232I、F232L、F232M、T234A、T244A 、V399E及びK702Eからなる群より選ばれる1~5個� �好ましくは1~3個、特に好ましくは1個の変異� ��持つアミノ酸配列からなるタンパク質が好� ��しい。

 「アダマンタン骨格を有する化合物」とは� ��アダマンタン骨格を有する化合物であれば� ��いずれの化合物も包含される。好ましくは� ��保護された2-アミノアダマンタンが挙げら� �る。
 「保護された2-アミノアダマンタン」とは� �アダマンタナミンのアミノ基が保護された� �合物であれば、いずれの化合物も包含され� �。なお、アダマンタン部分の水酸化される� �外の部分が置換基を有していてもよい。該� �換基は特に限定されないが、例えば、F、Cl� �Br、I等のハロゲン、置換されていてもよい� �ルキル(例えば、非置換アルキル、カルバモ� ��ルアルキル)、ヒドロキシ、アルコキシ、ニ トロ、アリール、アリールアルキル、カルボ キシ、エステル(例えば、アルコキシカルボ� �ル等)、カルバモイル、アルケニル、アルキ� ��ル、カルバモイルオキシ、保護されたヒド� ��キシ(例えば、アルキルヒドロキシ等)等が� �換基として挙げられる。好ましくは、N-(2-ア ダマンチル)-ベンズアミド誘導体、N-(2-アダ� �ンチル)-ベンズアミド、N-(アダマンタン-2-イ ル)-フタルアミド酸、N-(2-アダマンチル)-p-メ� ��キシベンジルオキシカルボニルアミン等が� ��げられる。

 「N-(2-アダマンチル)-ベンズアミド誘導体」 とは、N-(2-アダマンチル)-ベンズアミド又は� �の誘導体を意味する。誘導体としては、例� �ば、ベンゼン環部分が、ハロゲン、アルキ� �、ヒドロキシ、アルコキシ、ニトロ、アリ� �ル、アリールアルキル、カルボキシ、エス� �ル、カルバモイル等で置換された化合物、� �ダマンチル基の水酸化される以外の部分が� �ロゲン、アルキル、ヒドロキシ、アルコキ� �、ニトロ、アリール、アリールアルキル、� �ルボキシ、エステル、カルバモイル等で置� �された化合物、また、ベンゼン環部分及び� �ダマンタン部分が上記の置換基で置換され� �化合物も含まれる。好ましくは、

(式中、Rは水素又は親水性基である)
で示される化合物が挙げられる。

 「親水性基」とは、水との親和性が強い基� ��ある。すなわち、静電気的相互作用や水素� ��合等により水分子と弱い結合を形成しうる� ��子団を指す。例えば、-OH、-COOH、-NH ₂ 、-OSO ₃ H、―SO ₃ H、-OPO ₃ H ₂ 等が挙げられる。特に、-COOHが好ましい。

 「N-(5-ヒドロキシ-2-アダマンチル)-ベンズア ミド誘導体」とは、N-(モノヒドロキシ-2-アダ マンチル)-ベンズアミド又はその誘導体を意� ��する。誘導体としては、例えば、ベンゼン� ��が、ハロゲン、アルキル、ヒドロキシ、ア� ��コキシ、ニトロ、アリール、アリールアル� ��ル、カルボキシ、アルコキシカルボニル、� ��ルバモイル等で置換された化合物も含まれ� ��。好ましくは、

(式中、Rは水素又は親水性基である)
で示される化合物が挙げられる。さらに好ま しくは、

(式中、Rは水素又は親水性基である)
で示される化合物が挙げられる。

 本発明により得られた、アダマンタン骨格� ��有する化合物の、例えば、N-(5-ヒドロキシ-2 -アダマンチル)-ベンズアミド誘導体は、保護 基をはずすことにより、容易にモノヒドロキ シ-2-アダマンタナミン、つまり、
式:

で表される化合物に変換することができる。

 また、本発明において、N-(2-アダマンチ� �)-ベンズアミド誘導体からN-(5-ヒドロキシ-2-� ��ダマンチル)-ベンズアミド誘導体を製造し� �脱保護によりモノヒドロキシ-2-アダマンタ� �ミンを得る工程の中で、N-(5-ヒドロキシ-2-ア ダマンチル)-ベンズアミド誘導体を単離して� ��よいし、単離しなくてもよい。N-(5-ヒドロ� �シ-2-アダマンチル)-ベンズアミド誘導体を製 造した際に、一度精製して脱保護を行うこと もできる。また、実施例8に記載のように、� �菌をしながら脱保護を行うことによってN-(5- ヒドロキシ-2-アダマンチル)-ベンズアミド誘� ��体を単離せずにモノヒドロキシ-2-アダマン� ��ナミンを得ることもできる。

 さらに上記で得られたモノヒドロキシ-2-ア� ��マンタナミンを、
式(II):A-R ¹ -R ² -R ³ -X
(式中、Aは置換されていてもよい環式炭化水� ��基又は置換されていてもよい複素環式基で� ��り、R ¹ は単結合、-C(=O)-、-O-又はNR ⁴ -であり、R ² は単結合又は置換されていてもよいアルキレ ンであり、R ³ は単結合又はC(=O)-であり、Xは水酸基、ハロ� �ン又は水酸基から導かれる脱離基であり、R ⁴ は水素又は置換されていてもよいアルキルで ある)で示される化合物と反応させることに� �って、式(III):

で示される化合物を製造することができる。

 式(I)で示される化合物と式(II)で示される化 合物を反応させ、式(III)で示される化合物を� ��造する工程である。
 溶媒としては、N-ジメチルホルムアミド、� �メチルスルホキシド、芳香族炭化水素類(例� ��トルエン、ベンゼン、キシレン等)、飽和炭 化水素類(例、シクロヘキサン、ヘキサン等)� ��ハロゲン化炭化水素類(例、ジクロロメタン 、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン等)、エ� ��テル類(例、テトラヒドロフラン、ジエチル エーテル、ジオキサン、1,2-ジメトキシエタ� �等)、エステル類(例、酢酸メチル、酢酸エチ ル等)、ケトン類(例、アセトン、メチルエチ� ��ケトン等)、ニトリル類(例、アセトニトリ� �等)、アルコール類(例、メタノール、エタノ ール、イソプロパノール、tert-ブタノール等) 、水及びそれらの混合溶媒等が挙げられる。 好ましくは、ハロゲン化炭化水素類(例、ジ� �ロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエ� ��ン等)、ニトリル類(例、アセトニトリル等)� ��エーテル類(例、テトラヒドロフラン、ジエ チルエーテル、ジオキサン、1,2-ジメトキシ� �タン等)、アルコール類(例、メタノール、エ タノール、イソプロパノール、tert-ブタノー� ��等)及び水等である。
 限定されないが、好ましくは、N,N-ジメチル ホルムアミド、ジメチルスルホキシド、キシ レン、ジクロロメタン、クロロホルム、1,2-� �クロロエタン、ジエチルエーテル、ジオキ� �ン、1,2-ジメトキシエタン、アセトニトリル� ��メタノール、エタノール、イソプロパノー� ��、tert-ブタノール、トルエン、テトラヒド� �フラン及び水である。
 さらに好ましくは、ジクロロメタン、メタ� ��ール、エタノールである。
 R ⁵ が-C(=O)-であり、Xが水酸基の場合は、該工程� ��おいて縮合剤及び塩基を用いることができ� ��。縮合剤としては、例えば1,1-カルボニルジ イミダゾール、ジシクロヘキシルカルボジイ ミド又は水溶性カルボジイミド(1-エチル-3-(3� ��-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド)� ��が使用できる。塩基としては、例えば金属� ��素化物(例、水素化ナトリウム等)、金属水� �化物(例、水酸化ナトリウム、水酸化カリウ� ��、水酸化リチウム、水酸化バリウム等)、金 属炭酸塩(例、炭酸ナトリウム、炭酸カルシ� �ム、炭酸セシウム等)、金属アルコキシド(例 、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキ シド、カリウムtert-ブトキシド等)、炭酸水素 ナトリウム、金属ナトリウム、有機アミン(� �、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチ� �アミン、DBU、2,6-ルチジン等)等が挙げられる 。
 R ⁵ が-C(=O)-であり、Xがハロゲンである場合は、� ��工程において上記記載の塩基を用いること� ��できる。
 R ³ が-C(=O)-であり、R ⁴ が置換されていてもよいアルキレンであり、 R ⁵ が単結合であり、Xがハロゲン又は水酸基か� �導かれる脱離基である場合は、該工程にお� �て上記の塩基を用いることができる。
 反応条件は、特に制限されないが、約-20~100 ℃、好ましくは約-10~80℃で通常1時間~36時間� �好ましくは1時間~24時間攪拌すればよい。
 こうして得られた化合物(III)は11β-ヒドロキ システロイド脱水素酵素阻害剤及びDipeptidyl  PeptidaseIV(DPP IV)阻害剤、Jak3阻害剤等として有 用である。

 「ハロゲン」とは、フッ素、塩素、臭素及� ��ヨウ素を包含する。
 「アルキル」とは、炭素数1~10個の直鎖状又 は分枝状のアルキル基を意味し、例えば、メ チル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n -ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチ� �、n-ぺンチル、イソぺンチル、ネオぺンチル 、n-ヘキシル、イソヘキシル、n-ヘプチル、n- オクチル、n-ノニル、n-デシル等が挙げられ� �。好ましくは、炭素数1~6又は1~4個のアルキ� �であり、例えば、メチル、エチル、n-プロピ ル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、s ec-ブチル、tert-ブチル、n-ぺンチル、イソぺ� �チル、ネオぺンチル、n-ヘキシル、イソヘキ シルが挙げられる。
 「アルコキシ」、「アルコキシカルボニル� ��のアルキル部分は、上記のアルキルと同意� ��である。
 「アリール」とは、単環芳香族炭化水素基( 例:フェニル)及び多環芳香族炭化水素基(例:1- ナフチル、2-ナフチル、1-アントリル、2-アン トリル、9-アントリル、1-フェナントリル、2- フェナントリル、3-フェナントリル、4-フェ� �ントリル、9-フェナントリル等)が挙げられ� �。
 「アリールアルキル」は、上記のアリール� ��置換された上記アルキルを意味する。
 「環式炭化水素基」とは、「シクロアルキ� ��」、「シクロアルケニル」、「アリール」� ��包含する。
 「シクロアルキル」とは、炭素数3~15の環状 飽和炭化水素基を意味し、例えば、シクロプ ロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シ クロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオク チル、橋かけ環式炭化水素基、スピロ炭化水 素基等が挙げられる。
 「橋かけ環式炭化水素基」とは、2つ以上の 環が2個又はそれ以上の原子を共有している� �素数5~8の脂肪族環から水素を1つ除いてでき� ��基を包含する。具体的にはビシクロ[2.1.0]ペ ンチル、ビシクロ[2.2.1]ヘプチル、ビシクロ[2 .2.2]オクチル及びビシクロ[3.2.1]オクチル、ト リシクロ[2.2.1.0]ヘプチル等が挙げられる。
 「スピロ炭化水素基」とは、2つの炭化水素 環が1個の炭素原子を共有して構成されてい� �環から水素を1つ除いてできる基を包含する� ��具体的にはスピロ[3.4]オクチル等が挙げら� �る。
 「シクロアルケニル」とは、炭素数3~7個の� ��状の不飽和脂肪族炭化水素基を意味し、例� ��ば、シクロプロペニル、シクロブテニル、� ��クロペンテニル、シクロヘキセニル、シク� ��ヘプテニルが挙げられ、好ましくはシクロ� ��ロペニル、シクロブテニル、シクロペンテ� ��ル、シクロヘキセニルである。シクロアル� ��ニルには、環中に不飽和結合を有する橋か� ��環式炭化水素基及びスピロ炭化水素基も含� ��。
 「複素環式基」とは、「ヘテロアリール、� ��テロサイクル」を包含する。
 「ヘテロアリール」とは、単環芳香族複素� ��式基及び縮合芳香族複素環式基を意味する� ��単環芳香族複素環式基は、酸素原子、硫黄� ��子、及び/又は窒素原子を環内に1~4個含んで いてもよい5~8員の芳香環から誘導される、置 換可能な任意の位置に結合手を有していても よい基を意味する。縮合芳香族複素環式基は 、酸素原子、硫黄原子、及び/又は窒素原子� �環内に1~4個含んでいてもよい5~8員の芳香環� �、1~4個の5~8員の芳香族炭素環若しくは他の5~ 8員の芳香族ヘテロ環と縮合している、置換� �能な任意の位置に結合手を有していてもよ� �基を意味する。例えば、フリル(例:2-フリル� ��3-フリル)、チエニル(例:2-チエニル、3-チエ� ��ル)、ピロリル(例:1-ピロリル、2-ピロリル、 3-ピロリル)、イミダゾリル(例:1-イミダゾリ� �、2-イミダゾリル、4-イミダゾリル)、ピラゾ リル(例:1-ピラゾリル、3-ピラゾリル、4-ピラ� ��リル)、トリアゾリル(例:1,2,4-トリアゾール- 1-イル、1,2,4-トリアゾール-3-イル、1,2,4-トリ� ��ゾール-4-イル)、テトラゾリル(例:1-テトラ� �リル、2-テトラゾリル、5-テトラゾリル)、オ キサゾリル(例:2-オキサゾリル、4-オキサゾリ ル、5-オキサゾリル)、イソキサゾリル(例:3-� �ソキサゾリル、4-イソキサゾリル、5-イソキ� ��ゾリル)、チアゾリル(例:2-チアゾリル、4-チ アゾリル、5-チアゾリル)、チアジアゾリル、 イソチアゾリル(例:3-イソチアゾリル、4-イソ チアゾリル、5-イソチアゾリル)、ピリジル(� �:2-ピリジル、3-ピリジル、4-ピリジル)、ピリ ダジニル(例:3-ピリダジニル、4-ピリダジニル )、ピリミジニル(例:2-ピリミジニル、4-ピリ� �ジニル、5-ピリミジニル)、フラザニル(例:3-� ��ラザニル)、ピラジニル(例:2-ピラジニル)、� ��キサジアゾリル(例:1,3,4-オキサジアゾール-2 -イル)、ベンゾフリル(例:2-ベンゾ[b]フリル、 3-ベンゾ[b]フリル、4-ベンゾ[b]フリル、5-ベン ゾ[b]フリル、6-ベンゾ[b]フリル、7-ベンゾ[b]� �リル)、ベンゾチエニル(例:2-ベンゾ[b]チエニ ル、3-ベンゾ[b]チエニル、4-ベンゾ[b]チエニ� �、5-ベンゾ[b]チエニル、6-ベンゾ[b]チエニル� ��7-ベンゾ[b]チエニル)、ベンズイミダゾリル( 例:1-ベンゾイミダゾリル、2-ベンゾイミダゾ� ��ル、4-ベンゾイミダゾリル、5-ベンゾイミダ ゾリル)、ジベンゾフリル、ベンゾオキサゾ� �ル、キノキサリル(例:2-キノキサリニル、5-� �ノキサリニル、6-キノキサリニル)、シンノ� �ニル(例:3-シンノリニル、4-シンノリニル、5- シンノリニル、6-シンノリニル、7-シンノリ� �ル、8-シンノリニル)、キナゾリル(例:2-キナ� ��リニル、4-キナゾリニル、5-キナゾリニル、 6-キナゾリニル、7-キナゾリニル、8-キナゾリ ニル)、キノリル(例:2-キノリル、3-キノリル� �4-キノリル、5-キノリル、6-キノリル、7-キノ リル、8-キノリル)、フタラジニル(例:1-フタ� �ジニル、5-フタラジニル、6-フタラジニル)、 イソキノリル(例:1-イソキノリル、3-イソキノ リル、4-イソキノリル、5-イソキノリル、6-イ ソキノリル、7-イソキノリル、8-イソキノリ� �)、プリル、プテリジニル(例:2-プテリジニル 、4-プテリジニル、6-プテリジニル、7-プテリ ジニル)、カルバゾリル、フェナントリジニ� �、アクリジニル(例:1-アクリジニル、2-アク� �ジニル、3-アクリジニル、4-アクリジニル、9 -アクリジニル)、インドリル(例:1-インドリル 、2-インドリル、3-インドリル、4-インドリル 、5-インドリル、6-インドリル、7-インドリル )、イソインドリル、ファナジニル(例:1-フェ� ��ジニル、2-フェナジニル)又はフェノチアジ� ��ル(例:1-フェノチアジニル、2-フェノチアジ� ��ル、3-フェノチアジニル、4-フェノチアジニ ル)等が挙げられる。
 「ヘテロサイクル」とは、酸素原子、硫黄� ��子、及び/又は窒素原子を環内に1~4個含んで いてもよく、置換可能な任意の位置に結合手 を有していてもよい非芳香族複素環式基を意 味する。また、そのような非芳香族複素環式 基がさらに炭素数1~4のアルキル鎖で架橋され ていてもよく、シクロアルカン(5~6員環が好� �しい)やベンゼン環が縮合していてもよい。� ��芳香族であれば、飽和でも不飽和でもよい� ��例えば、1-ピロリニル、2-ピロリニル、3-ピ� ��リニル、1-ピロリジニル、2-ピロリジニル、 3-ピロリジニル、1-イミダゾリニル、2-イミダ ゾリニル、4-イミダゾリニル、1-イミダゾリ� �ニル、2-イミダゾリジニル、4-イミダゾリジ� ��ル、1-ピラゾリニル、3-ピラゾリニル、4-ピ� ��ゾリニル、1-ピラゾリジニル、3-ピラゾリジ ニル、4-ピラゾリジニル、ピペリジノ、2-ピ� �リジニル、3-ピペリジニル、4-ピペリジニル� ��1-ピペラジニル、2-ピペラジニル、2-モルホ� ��ニル、3-モルホリニル、モルホリノ、テト� �ヒドロピラニル等があげられる。
 「アルキレン」とは、メチレンが1~6個連続� ��た2価の基を包含し、具体的にはメチレン、 エチレン、トリメチレン、テトラメチレン、 ペンタメチレン及びヘキサメチレン等が挙げ られる。
 「水酸基から導かれる脱離基」とは、-OMs、 -OTs、-OTf、-ONs等があげられる。ここで、「Ms� ��はメタンスルホニル基、「Ts」はパラトル� �ンスルホニル基、「Tf」はトリフルオロメタ ンスルホニル基、「Ns」はオルトニトロベン� ��ンスルホニル基を表す。

 式(II)及び式(III)中のAとしては、好ましくは 、置換されていてもよい複素環式基である。 さらに好ましくは、置換されていてもよいヘ テロアリール又は置換されていてもよいヘテ ロサイクルが挙げられる。より好ましくは、 フラン、チオフェン、ピロール、ピラゾール 、トリアゾール、オキサゾール、チアゾール 、イソチアゾール、ピリジン、モルホリン、 ピペリジン、ピペラジン、ピロリジン、テト ラヒドロチオフェン、ベンゾオキサジン、ベ ンゾフラン、ピロロピリジンが挙げられる。 限定されないが、特に、イソキサゾール及び ピラゾールが好ましい。また、Aとして、置� �されていてもよい環式炭化水素基が挙げら� �る。好ましくは、フェニルである。
 置換基としては、-OR ⁵ 、-SR ⁵ 、置換されていてもよいアルキル、置換され ていてもよいアルケニル、置換されていても よいアルキニル、置換されていてもよいシク ロアルキル、置換されていてもよいシクロア ルケニル、置換されていてもよいアリール、 置換されていてもよいヘテロアリール、置換 されていてもよいヘテロサイクル、式:-CH=CH-C (R ^a R ^b )-R ^c -R ^d で示される基又は式:-(CR ^e R ^f ) _m -C(R ^a R ^b )-R ^c -R ^d で示される基等が挙げられる。
R ^a 及びR ^b は各々独立して水素、置換されていてもよい アルキル又はハロゲンであり、
又はR ^a とR ^b は隣接する炭素原子と一緒になって置換され ていてもよい環を形成していてもよく、
R ^c は-(CH ₂ )n-(ここでnは0~3の整数である。)であり、
R ^d は水素、ハロゲン、ヒドロキシ、カルボキシ 、シアノ、置換されていてもよいアルキル、 置換されていてもよいアルケニル、置換され ていてもよいアルキニル、置換されていても よいシクロアルキル、置換されていてもよい シクロアルケニル、置換されていてもよいア リール、置換されていてもよいヘテロアリー ル、置換されていてもよいヘテロサイクル、 式:-C(=O)-NR ^g R ^h で示される基又は式:-NR ⁱ R ^j で示される基であり、
R ^e 及びR ^f は各々独立して水素、ハロゲン又は置換され ていてもよいアルキルであり、
R ^g 及びR ^h は各々独立して水素、置換されていてもよい アルキル、置換されていてもよいアルケニル 、置換されていてもよいアルキニル、置換さ れていてもよいシクロアルキル、置換されて いてもよいシクロアルケニル、置換されてい てもよいアリール、置換されていてもよいヘ テロアリール、置換されていてもよいヘテロ サイクル、置換されていてもよいアルキルス ルホニル、置換されていてもよいシクロアル キルスルホニル、置換されていてもよいアリ ールスルホニル、置換されていてもよいヘテ ロアリールスルホニル、置換されていてもよ いヘテロサイクルスルホニル、置換されてい てもよいアルキルオキシ、置換されていても よいカルバモイル若しくはR ^g とR ^h は隣接する窒素原子と一緒になって置換され ていてもよい環を形成していてもよく、
R ⁱ 及びR ^j は各々独立して水素、カルボキシ、ヒドロキ シ、置換されていてもよいアルキル、置換さ れていてもよいアルケニル、置換されていて もよいアルキニル、置換されていてもよいシ クロアルキル、置換されていてもよいシクロ アルケニル、置換されていてもよいアリール 、置換されていてもよいヘテロアリール、置 換されていてもよいヘテロサイクル、置換さ れていてもよいアシル、置換されていてもよ いカルバモイル、置換されていてもよいチオ カルバモイル、置換されていてもよいアルキ ルスルホニル、置換されていてもよいシクロ アルキルスルホニル、置換されていてもよい アリールスルホニル、置換されていてもよい ヘテロアリールスルホニル、置換されていて もよいヘテロサイクルスルホニル、置換され ていてもよいアルキルオキシカルボニル、置 換されていてもよいシクロアルキルオキシカ ルボニル、置換されていてもよいアリールオ キシカルボニル、置換されていてもよいヘテ ロアリールオキシカルボニル、置換されてい てもよいヘテロサイクルオキシカルボニル、 置換されていてもよいアルキルカルボニル、 置換されていてもよいシクロアルキルカルボ ニル、置換されていてもよいアリールカルボ ニル、置換されていてもよいヘテロアリール カルボニル、置換されていてもよいヘテロサ イクルカルボニル、置換されていてもよいス ルファモイル、若しくはR ⁱ とR ^j は隣接する窒素原子と一緒になって置換され ていてもよい環を形成していてもよく、
R ⁵ は置換されていてもよいアルキル、置換され ていてもよいアルケニル、置換されていても よいシクロアルキル、置換されていてもよい アリール、置換されていてもよいヘテロアリ ール又は置換されていてもよいヘテロサイク ルであり、
mは各々独立して1~3の整数である。
 R ¹ は、好ましくは、単結合である。
 R ² は、好ましくは、単結合である。
 R ³ は、好ましくは、-C(=O)-である。
 Xは、好ましくは、水酸基である。
 式(II)及び式(III)で表される化合物及びそれ� ��の調製方法の詳細は、国際公開第2006/132197� �パンフレット、国際公開第2007/058346号パンフ レット、PCT/JP2007/056538、特願2007-132259に集合� �に記載されている。

 本発明のアダマンタン骨格を有する化合物� ��水酸化する方法、例えば、N-(2-アダマンチ� �)―ベンズアミド誘導体を水酸化することに� ��って、N-(5-ヒドロキシ-アダマンタン-2-イル) -ベンズアミド誘導体を製造する方法(以下、� ��本発明の製造方法」と称することもある。) は、水酸化活性を持つP450(以下、「本発明の� ��ンパク質」と称することもある。)を触媒と して使用することを特徴とする。具体的には 、本発明の製造方法は、基質であるN-(2-アダ� ��ンチル)―ベンズアミド誘導体に、
(a)本発明のタンパク質、又は該タンパク質及 び該タンパク質に電子を供給するフェレドキ シンと還元酵素からなる還元系、又は
(b)本発明のタンパク質を発現可能な微生物
の少なくとも1つを作用させ、アダマンタン� �分を選択的に水酸化させる工程を含む。

(a)本発明のタンパク質
 本発明のタンパク質は、該タンパク質をコ� ��ドするポリヌクレオチド(以下、「本発明の 遺伝子」と称することもある。)を取得し、� �用することによって作成することができる� �以下に、本発明の遺伝子の取得方法、本発� �のタンパク質の作製方法(発現ベクターの作� ��方法、形質転換体の作成方法等)を具体的に 記載する。

(1)本発明の遺伝子の取得方法
 バチルス サチルス(Bacillus subtilis)より、常 法によりcDNAライブラリーを作製することに� �って、本発明の遺伝子を取得することがで� �る。

 cDNAライブラリー作製法としては、Molecular  Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition(1989)(Cold  Spring Harbor Laboratory Press)、Current Protocols in� �Molecular Biology(1994)(Wiley-Interscience)、DNA Cloning  1:Core Techniques、A Practical Approach,Second Editio n(1995)(Oxford University Press)等に記載された方� �、あるいは市販のキット、例えば、SuperScript  Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloni ng(インビトロジェン社製)やZAP-cDNA Synthesis Ki ts(ストラタジーン社製)等を用いる方法が挙� �られる。

 該方法により取得されるcDNAとして、例え ば、配列番号:1記載のアミノ酸配列からなる� ��ンパク質をコードするDNA等を挙げることが� ��き、具体的には、配列番号:2記載の塩基配� �からなるDNA等を挙げることができる。該cDNA� ��、本発明の遺伝子を適当な発現ベクターに� ��み込んだ発現用プラスミドの作製に使用す� ��ことができる。発現ベクター、発現用プラ� ��ミドの使用方法等については「本発明のタ� ��パク質の作製方法」に後述する。

 また、アミノ酸配列に基づいて、本発明� ��タンパク質をコードするDNAを化学合成する� ��とによってもDNAを調製することができる。D NAの化学合成は、チオホスファイト法を利用� ��た島津製作所社製のDNA合成機、フォスフォ� ��ミダイト法を利用したパーキン・エルマー� ��製のDNA合成機model392等を用いて行うことが� �きる。

 さらに、アミノ酸配列に基づいて、オリ� ��ヌクレオチドをセンスプライマー及びアン� ��センスプライマーとして用い、これらDNAに� ��補的なmRNAを発現している細胞のmRNAから調� �したcDNAを鋳型として、PCRを行うことによっ� ��も、目的とするDNAを調製することができる� ��

(2)本発明のタンパク質の作製方法 
 本発明のタンパク質は、Molecular Cloning:A Lab oratory Manual,Second Edition(1989)(Cold Spring Harbor  Laboratory Press)、Current Protocols in Molecular Biol ogy(1994)(Wiley-Interscience)等に記載された方法等� ��用い、例えば、以下の方法により、本発明� ��タンパク質をコードするポリヌクレオチド� ��宿主細胞中で発現させ、製造することがで� ��る。
 宿主細胞としては、原核細胞、酵母、動物� ��胞、植物細胞、昆虫細胞等、目的とする遺� ��子を発現できるものであればいずれも用い� ��ことができる。発現ベクターとしては、上� ��宿主細胞において自律複製が可能、又は染� ��体中への組込みが可能で、本発明のタンパ� ��質の転写に適した位置にプロモーターを含� ��しているものが用いられる。

(i)原核生物を宿主として用いる場合
 本発明のタンパク質の発現ベクターは、原� ��生物中で自律複製可能であると同時に、プ� ��モーター、リボソーム結合配列、本発明の� ��リペプチドをコードするDNA、転写終結配列� ��より構成されていることが好ましい。プロ� ��ーターを制御する遺伝子が含まれていても� ��い。

 発現ベクターとしては、例えば、pBTrp2、p BTac1、pBTac2(ロシュダイアグノスティックス社 製)、Bluescript II SK(+)、pBluescript II SK(-)(スト ラタジーン社製)、pSTV28、pUC118、pUC19(宝酒造� �製)、pKK233-2(GEヘルスケア社製)、pSE280、pSupex� ��pUB110、pTP5、pC194、pTrxFus(インビトロジェン� �製)、pGEMEX-1(プロメガ社製)、pQE-8(キアゲン社 製)、pGEX(GEヘルスケア社製)、pETシステム(ノ� �ジェン社製)、pMAL-c2(New England Biolabs社製)、p KYP10(特開昭58-110600)、pKYP200(Agricultural Biologycal  Chemistry,48,669(1984).)、pLSA1(Agricultural Biologycal� �Chemistry,53,277(1989).)、pGEL1(Proceeding of the Natio nal Academy of Sciences USA,82,4306(1985).)、pEG400(Jou rnal of Bacteriology,172,2392(1990).)、pTrs30(FERM BP-54 07)、pTrs32(FERM BP-5408)、pGHA2(FERM BP-400)、pGKA2(FE RM B-6798)、pPA1(特開昭63-233798)、pTerm2(特開平3-2 2979、US4686191、US4939094、US5160735)等を例示する� ��とができる。

 プロモーターとしては、大腸菌等の宿主� ��胞中で発現できるものであればいかなるも� ��でもよい。例えば、trpプロモーター(Ptrp)、l acプロモーター(Plac)、PLプロモーター、PRプロ モーター、PSEプロモーター等の、大腸菌やフ ァージ等に由来するプロモーター、SPO1プロ� �ーター、SPO2プロモーター、penPプロモーター 等をあげることができる。またPtrpを2つ直列� ��せたプロモーター(Ptrpx2)、tacプロモーター� �lacT7プロモーター、letIプロモーターのよう� �人為的に設計改変されたプロモーター等も� �いることができる。

 リボソーム結合配列であるシャイン-ダル ガノ(Shine-Dalgarno)配列と開始コドンとの間を� �当な距離、例えば、6~18塩基に調節したプラ� ��ミドを用いることが好ましい。本発明の遺� ��子の発現には転写終結配列は必ずしも必要� ��はないが、構造遺伝子直下に転写終結配列� ��配置することが好ましい。

 宿主細胞としては、Escherichia属、Serratia属 、Bacillus属、Brevibacterium属、Corynebacterium属、Mi crobacterium属、Pseudomonas属等の原核生物が挙げ� ��れ、Escherichia属としてE.coliのXL1-Blue株、XL2-Bl ue株、DH1株、MC1000株、KY3276株、W1485株、JM109株 、HB101株、No.49株、W3110株、NY49株、BL21株、BL21 (DE3)株、BL21(DE3)pLysS株、HMS174(DE3)株及びHMS174(DE 3)pLysS株等が、Serratia属として、S.ficaria株、S.f onticola株、S.liquefaciens、S.marcescens株等が、Bacil lus属として、B.subtilis株、B.amyloliquefaciens株等� ��、Brevibacterium属として、B.ammoniagenes株、B.Imma riophilum(ATCC:14068)株、B.saccharolyticum(ATCC:14066)株� ��が、Corynebacterium属として、C.glutamicum(ATCC:1303 2)株、C.glutamicum(ATCC:14067)株、C.gulutamicum(ATCC:138 69)株、C.acetoacidophilum(ATCC:13870)株等が、Microbact erium属として、M.ammoniaphilum(ATCC:15354)株等が、P seudomonas属として、P.mephitica株等が例示される 。

 組換えベクターの導入方法としては、上� ��宿主細胞へDNAを導入する方法であればいず� ��も用いることができ、例えば、エレクトロ� ��レーション法(Nucleic Acids Research,16,6127(1988). )、リン酸カルシウム法(Proceedings of the Nation al Academy of Sciences USA,69,2110(1972).)、プロト� �ラスト法(特開昭63-2483942)、Gene,17,107(1982).やMo lecular & General Genetics,168,111(1979).に記載の 方法等があげられる。

(ii)酵母を宿主として用いる場合
 宿主として酵母を用いる場合、発現ベクタ� ��として、例えば、YEp13(ATCC:37115)、YEp24(ATCC:370 51)、YCp50(ATCC:37419)、pHS19、pHS15等が挙げられる 。
 プロモーターとしては、酵母中で発現でき� ��ものであればいずれのものでもよく、例え� ��、ADH1(アルコールデヒドロゲナーゼ)プロモ� ��ター、PHO5(酸性フォスファターゼ)プロモー� ��ー、PGK1(ホスホグリセリン酸キナーゼ)プロ� ��ーター、GAPDH(グリセルアルデヒド3-リン酸� �ヒドロゲナーゼ)プロモーター、GAL1(ガラキ� �ースキナーゼ)プロモーター、GAL10(UDPガラク� ��ース4-エピメラーゼ)プロモーター、MFα1(α� �ェロモン)プロモーター、CUP1(メタロチオネ� �ン)プロモーター等が挙げられる。
 宿主としては、例えば、Saccharomyces属、S.cere visiae種、Schizosaccharomyces属、S.pombe種、Kluyveromy ces属、K.lactis種、Trichosporon属、T.pullulans種、Sc hwanniomyces属、S.alluvius種及びPichia属、P.pastoris� ��等が挙げられる。
 組換えベクターの導入方法としては、宿主� ��DNAを導入する方法であればいずれも用いる� ��とができ、例えば、エレクトロポレーショ� ��法(Methods in Enzymology,194,182(1990).)、スフェロ プラスト法(Proceedings of the National Academy of� �Sciences USA,84,1929(1978).)、酢酸リチウム法(Journ al of Bacteriology,153,163(1983).及びProceedings of th e National Academy of Sciences USA,75,1929(1978).)記� �の方法等が挙げられる。

(iii)動物細胞を宿主として用いる場合
 宿主として動物細胞を用いる場合、発現ベ� ��ターとして、例えば、pcDNA1/Amp、pcDNA1、pCDM8� ��pREP4(インビトロジェン社製)、pAGE107(Cytotechno logy,3,133(1990).)、pAGE103(The Journal of Biochemistry, 101,1307(1987).)、pAMo、pAMoA(pAMoPRSA)(The Journal of  Biologycal Chemistry,268,22782-22787(1993).)、pAS3-3(特� �平2-22705)等を用いることができる。
 プロモーターとしては、宿主中で発現でき� ��ものであればいずれも用いることができ、� ��えば、ヒトサイトメガロウイルス(hCMV)のIE(I mediate-early)遺伝子のプロモーター、SV40の初期 プロモーター、モロニー・ミュリン・ロイケ ミア・ウイルス(Moloney Murine Leulemia Virus)の� �ング・ターミナル・リピート・プロモータ� �(Long Terminal Repeat Promoter)、レトロウイルス� ��プロモーター、HSPプロモーター、SRαプロモ ーター及びメタロチオネインのプロモーター 等を挙げることができる。また、ヒトCMVのIE� ��伝子のエンハンサーをプロモーターと共に� ��いてもよい。

 宿主に用いる動物細胞としては、ヒト由� ��株細胞のHEK293(ヒト胎児腎細胞、ATCC:CRL-1573)� ��Namalwa(バーキットリンパ腫、ATCC:CRL-1432)、HeL a(子宮頚部癌細胞、ATCC:CCL-2)HBT5637(白血病細胞 、特開昭63-299)、BALL-1(白血病細胞)及びHCT-15(� �腸癌細胞)、マウス由来株細胞のSp2/0-Ag14(マ� �ス骨髄種細胞、ATCC:CRL-1581)及びNSO(マウス骨� �種細胞)、サル由来株細胞のCOS-1(アフリカミ� ��リザル腎細胞(SV40形質転換細胞)、ATCC:CRL-1650 )及びCOS-7(アフリカミドリザル腎細胞(SV40形質 転換細胞)、ATCC:CRL-1651)、ハムスター由来株細 胞のCHO-K1(チャイニーズハムスター卵巣細胞� �ATCC:CCL-61)及びBHK-21(C-13)(シシリアンハムスタ� ��仔腎細胞、ATCC:CCL-10)、ラット由来株細胞のP C12(副腎褐色細胞腫、ATCC:CRL-1721)及びYB2/0(ラッ ト骨髄種細胞、ATCC:CRL-1662)等を例示すること� ��できる。

 組換えベクターの導入方法としては、宿� ��にDNAを導入する方法であればいずれも用い� ��ことができ、例えば、エレクトロポレーシ� ��ン法(Cytotechnology,3,133,(1990).)、リン酸カルシ� ��ム法(特開平2-22705)、リポフェクション法(Pro ceedings of the National Academy of Sciences,USA,84,74 13(1987).、Vilology,52,456(1973).)。

(iv)植物細胞を宿主として用いる場合
 宿主として植物細胞又は植物個体を用いる� ��合、公知の方法(組織培養,20(1994).、組織培� �,21(1995).、Trends in Biotechnology,15、45(1997).)に� �じてポリペプチドを生産することができる� �発現ベクターとしては、例えば、Tiプラスミ ド、タバコモザイクウイルスベクター等を挙 げることができる。遺伝子発現に用いるプロ モーターとしては、植物細胞中で発現できる ものであればいずれも用いることができ、例 えば、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)の 35Sプロモーター、イネアクチン1プロモータ� �等を挙げることができる。また、プロモー� �ーと発現させる遺伝子の間に、トウモロコ� �のアルコール脱水素酵素遺伝子のイントロ� �1等を挿入することにより、遺伝子の発現効� ��をあげることもできる。

 宿主としては、ポテト、タバコ、トウモロ� ��シ、イネ、アブラナ、大豆、トマト、ニン� ��ン、小麦、大麦、ライ麦、アルファルファ� ��亜麻等の植物細胞が例示される。
 組換えベクターの導入方法としては、宿主� ��DNAを導入する方法であればいずれも用いる� ��とができ、例えば、アグロバクテリウム(Agr obacterium)を用いる方法(特開昭59-140885、特開昭 60-70080、WO94/00977)、エレクトロポレーション� �(特開昭60-251887)、パーティクルガン(遺伝子� �)法(特許第2606856号、特許第2517813号)等を挙げ ることができる。

(v)昆虫細胞を宿主として用いる場合
 宿主として昆虫細胞を用いる場合、トラン� ��ファーベクターとしては、例えば、pVL1392、 pVL1393、pBlueBacIII(インビトロジェン社製)等が� ��感染用ウイルスとしては、例えば、ヨトウ� ��科昆虫に感染するバキュロウイルス(Baculovir us)Autographa california nuclear polyhedrosis virus(AcMN PV)Bac-N-Blue DNA等が挙げられる。昆虫細胞の形 質転換の方法は、例えば、Baculovirus Expression� �Vector:A Laboratory Manual(1992)(W.H.Freeman and Compan y)、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Editio n(1989)(Cold Spring Harbor Laboratory Press)、Current  Protocols in Molecular Biology(1994)(Wiley-Interscience)� ��BioTechnology,6,47(1988).等に記載の方法が用いら れる。

 昆虫細胞培養液に目的遺伝子を含むトラン� ��ファーベクター及び昆虫細胞への感染用の� ��キュロウイルスDNAを添加し、組換えにより� ��製された目的遺伝子を発現するウイルスが� ��虫細胞に感染することによりポリペプチド� ��発現することができる。
 宿主に用いる昆虫細胞としては、Spodoptera f rugiperda(ヨトウガ)由来株細胞、Trichoplusia ni(� �ラクサキンウワバ)由来株細胞等が挙げられ� ��具体的には、S.frugiperda由来細胞としては、S f9(ATCC:CRL-1711、卵巣細胞)、Sf21(卵巣細胞)等が� ��T.ni由来細胞株としては、High Five、BTI-TN-5B1- 4(卵細胞、インビトロジェン社製)等が例示さ れる。
 組換えベクターの導入方法としては、宿主� ��導入できる方法であればいずれも用いるこ� ��ができ、例えば、リン酸カルシウム法(特開 平2-22705)、リポフェクション法(Proceedings of t he National Academy of Sciences USA,84,7413(1987).)等� ��挙げることができる。また、動物細胞と同� ��に、エレクトロポレーション法(Cytotechnology, 3,133(1990).)等も用いることができる。

(vi)培養方法
 本発明のタンパク質をコードするDNAを組み� ��んだ組換え体ベクターを保有する形質転換� ��が、大腸菌、酵母、動物細胞あるいは植物� ��胞等の細胞の場合、各種宿主に適した通常� ��培養方法に従って培養し、該タンパク質を� ��生・蓄積させ、形質転換体又は培養液より� ��タンパク質を回収することにより、該タン� ��ク質を製造することができる。形質転換体� ��、動物個体又は植物個体の場合、各種宿主� ��適した通常の生育方法に従って飼育又は栽� ��し、該タンパク質を産生・蓄積させ、該動� ��個体又は植物個体より該タンパク質を回収� ��ることにより、該タンパク質を製造するこ� ��ができる。
 宿主が動物個体の場合、例えば、本発明の� ��伝子を保有する非ヒトトランスジェニック� ��物を飼育し、該組換え体DNAのコードする本� ��明のタンパク質を該動物中に産生・蓄積さ� ��、該動物個体中から該タンパク質を回収す� ��ことにより、本発明のタンパク質を製造す� ��ことができる。動物個体中の産生・蓄積場� ��としては、例えば、該動物のミルク、唾液� ��卵等を挙げることができる。
 宿主が植物個体の場合、例えば、本発明の� ��ンパク質をコードする遺伝子を保有するト� ��ンスジェニック植物を栽培し、該組換え体D NAのコードする本発明のタンパク質を該植物� ��体中に産生・蓄積させ、植物個体中から該� ��リペプチドを回収することにより、本発明� ��タンパク質を製造することができる。
 宿主が大腸菌等の原核生物又は酵母等の真� ��生物である場合、例えば、本発明のタンパ� ��質をコードする遺伝子を保有する形質転換� ��を培地中で培養し、該組換え体DNAのコード� ��る本発明のタンパク質を培養液に産生・蓄� ��させ、該培養液から該タンパク質を回収す� ��ことにより、本発明のタンパク質を製造す� ��ことができる。
 本発明のタンパク質をコードする遺伝子を� ��有する形質転換体を培地で培養する方法は� ��宿主の培養に用いられる通常の方法に従っ� ��行うことができる。
 大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核� ��物を宿主として得られた形質転換体を培養� ��る培地としては、該生物が資化し得る炭素� ��、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換� ��の培養を効率的に行える培地であれば天然� ��地、合成培地のいずれを用いてもよい。

 形質転換体が大腸菌等の原核生物あるい� ��酵母等の真核生物である場合、得られた形� ��転換体を培養する培地としては、宿主が資� ��し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有� ��、形質転換体の培養を効率的に行える培地� ��あれば天然培地、合成培地のいずれを用い� ��もよい。宿主が大腸菌である形質転換体を� ��養する際の培地としては、例えば、バクト� ��リプトン、イーストエクストラクト及び塩� ��ナトリウムを含むYT培地が好ましい。

 炭素源としては、それぞれの微生物が資化� ��得るものであればよく、グルコース、フラ� ��トース、スクロース、これらを含有する糖� ��、デンプンあるいはデンプン加水分解物等� ��炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸� ��エタノール、プロパノール等のアルコール� ��を用いることができる。
 窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ� ��ウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウ� ��、リン酸アンモニウム等の各種無機酸や有� ��酸のアンモニウム塩、その他含窒素物質、� ��びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、� ��ーンスチープリカー、カゼイン加水分解物� ��大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌� ��及びその消化物等を用いることができる。
 無機塩としては、リン酸第一カリウム、リ� ��酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫� ��マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一� ��、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム� ��を用いることができる。培養は、振盪培養� ��は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行� ��。

 培養温度は15~40℃がよく、培養時間は、通� �5時間~7日間である。培養中pHは、3.0~9.0に保� �する。pHの調整は、無機あるいは有機の酸、 アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アン モニア等を用いて行う。また培養中必要に応 じて、アンピシリンやテトラサイクリンやカ ナマイシン等の抗生物質を培地に添加しても よい。
 プロモーターとして誘導性のプロモーター� ��用いた発現ベクターで形質転換した微生物� ��培養するときには、必要に応じてインデュ� ��サーを培地に添加してもよい。例えば、lac� ��ロモーターを用いた発現ベクターで形質転� ��した形質転換体を培養するときにはイソプ� ��ピル-β-D-チオガラクトピラノシド等を、trp� ��ロモーターを用いた発現ベクターで形質転� ��した形質転換体を培養するときにはインド� ��ルアクリル酸等を培地に添加してもよい。� ��伝子を導入した植物の細胞や器官は、ジャ� ��ファーメンターを用いて大量培養すること� ��できる。培養する培地としては、一般に使� ��されているムラシゲ・アンド・スクーグ(MS) 培地、ホワイト(White)培地、又はこれら培地� �オーキシン、サイトカイニン等、植物ホル� �ンを添加した培地等を用いることができる� �

 本発明のタンパク質製造用形質転換体が動� ��細胞である場合、該細胞を培養する培地は� ��一般に使用されているRPMI1640培地(The Journal� �of the American Medical Association,199,519(1967).)、M EM培地(Science,130,432(1959).)、D-MEM培地(Virology,8,39 6(1959).)、199培地(Proceedings of the Society for th e Biological Medicine,73,1(1950).)又はこれら培地に 牛胎児血清(FCS)等を添加した培地等が用いら� ��る。
 培養は、通常pH6~8、25~40℃、5% CO ₂ 存在下等の条件で1~7日間行う。また培養中必 要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ス トレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加 してもよい。
 形質転換体が昆虫細胞である場合、培養す� ��培地としては、一般に使用されているTNM-FH� ��地(ファーミンジェン社製)、Sf-900II SFM培地( インビトロジェン社製)、ExCell400、ExCell405(JRH� ��イオサイエンシーズ社製)、Grace’s InsectMedi um(Nature,195,788(1962).)等を用いることができる� �

(vii)製造方法
 本発明のタンパク質は、形質転換体を培養� ��、培養液から本発明のタンパク質を単離・� ��製することにより製造することができる。� ��発明のタンパク質の単離・精製方法は、当� ��分野において周知慣用の常法により行うこ� ��ができ、例えば、酵素の単離・精製方法やS andlerらの糖転移酵素の精製方法(Methods in Enzy mology,83,458)を用いることができる。
 本発明のタンパク質が溶解性ポリペプチド� ��して産生・蓄積される場合、上記のように� ��質転換体を培養した培養液を、例えば、遠� ��分離等の方法で細胞又は菌体と培地に分離� ��る。本発明のタンパク質が宿主細胞内に存� ��する場合、採取した細胞又は菌体をSTE溶液� ��の適当な緩衝液で洗浄した後、超音波、フ� ��ンチプレス、マントンゴーリンホモジナイ� ��ー、ダイノミル等で細胞又は菌体を破砕し� ��遠心分離やろ過により無細胞溶液として得� ��ことができる。
 本発明のタンパク質の分離・精製に用いる� ��衝液には界面活性剤が適量含まれていても� ��く、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム(SDS)� �N-ラウロイルサルコシンナトリウム(サルコ� �ル)等を含んでいてもよい。
 得られた粗精製物に含まれる目的タンパク� ��の分離・精製方法は自体公知の各種分離・� ��製方法を組み合わせて行うことができる。� ��れらの公知の方法としては、例えば、溶媒� ��出法、硫酸アンモニウム等による塩析法、� ��析法、有機溶媒による沈殿法、限外濾過法� ��ゲル濾過、ジエチルアミノエチル(DEAE)-セフ ァロースクロマトグラフィー、DIAION HPA-75(三 菱化学社製)等のレジンを用いた陰イオンク� �マトグラフィーやイオン交換クロマトグラ� �ィー、S-Sepharose FF(ファルマシア社製)等のリ ジンを用いた陽イオンクロマトグラフィー、 ブチルセファロース等の疎水性クロマトグラ フィーやアフィニティークロマトグラフィー 等の各種クロマトグラフィー法、SDS-ポリア� �リルアミドゲル電気泳動法や等電点電気泳� �法等の各種電気泳動等が例示される。

 本発明のタンパク質が不溶性ポリペプチ� ��として産生・蓄積される場合、上記同様に� ��胞又は菌体を分離し、適当な方法により破� ��後、該ポリペプチドを含む分画を回収する� ��回収した試料は、ラウリル硫酸ナトリウム( SDS)やN-ラウロイルサルコシンナトリウム(サ� �コシル)等の界面活性剤等の可溶化剤で可溶� ��する。該可溶化液は、可溶化剤を含まない� ��殆ど含まれない濃度にまで希釈又は透析し� ��該ポリペプチドを正常な立体構造に構成さ� ��た後、上記と同様の分離・精製方法により� ��製標品を得ることができる。

 また、本発明のタンパク質を他のタンパ� ��質との融合タンパク質として生産し、融合� ��たタンパク質に親和性をもつ物質を用いた� ��フィニティークロマトグラフィーを利用し� ��精製することもできる(山川彰夫,実験医学,1 3,469-474(1995).)。融合タンパク質に使用する付� ��タンパク質としてはプロテインA、FLAG等が� �示される(Proceedings of the National Academy of S ciences USA,86,8227(1989).、GenesDevelopment,4,1288(1990). 、特開平5-336963、特開平6-823021)。プロテインA を使用する場合、本発明のタンパク質とプロ テインAの融合タンパク質を生産し、イムノ� �ロブリンGを用いてアフィニティークロマト� ��ラフィーを行うことにより精製することが� ��きる。FLAGペプチドを使用する場合、本発明 のタンパク質とFLAGの融合タンパク質を生産� �、抗FLAG抗体を用いてアフィニティークロマ� ��グラフィーを行うことにより精製すること� ��できる。

 本発明のタンパク質は、公知の方法に準じ� ��、in vitro転写・翻訳系を用いて生産するこ� ��ができる(Journal of Biomolecular NMR,6,129-134(1995 ).、Science,242,1162-1164(1988).、The Journal of Bioche mistry,110,166-168(1991).)。
 本発明のタンパク質は、そのアミノ酸配列� ��基に、Fmoc法(フルオレニルメチルオキシカ� �ボニル法)、tBoc法(t-ブチルオキシカルボニル 法)等の化学合成法や市販されているペプチ� �合成機器、例えば、APEX396(アドバンストケム テック社製)、433A(アプライドバイオシステム ズ社製)、PS3(プロテインテクノロジーズ社製) 、9050(パーセプティブ社製)、PSSM-8(島津製作� �製)等のペプチド合成機器をにより化学合成� ��ることができる。
 本発明のタンパク質の構造解析は、タンパ� ��質化学で通常用いられる方法、例えば、遺� ��子クローニングのためのタンパク質構造解� ��(平野久著、東京化学同人発行、1993年)に記� ��の方法により実施可能である。本発明のタ� ��パク質の水酸化活性は、アダマンタン骨格� ��有する化合物、例えば、基質であるN-(2-ア� �マンチル)―ベンズアミド誘導体に、本発明� ��タンパク質を作用させ、N-(5-ヒドロキシ-2-� �ダマンチル)-ベンズアミド誘導体の生産量で 検出することができる。より詳しくは、本発 明のタンパク質を発現可能な微生物を、好適 な培地で培養し、培地中に蓄積されたN-(5-ヒ� ��ロキシ-2-アダマンチル)-ベンズアミド誘導� �の蓄積量を検出する方法を用いることがで� �る。N-(5-ヒドロキシ-2-アダマンチル)-ベンズ� ��ミド誘導体の検出は、例えば、本発明によ� ��得られるN-(5-ヒドロキシ-2-アダマンチル)-ベ ンズアミド誘導体を標準品として用いたHPLC� �より、行うことができる。具体的には後述� �実施例に記載の方法を用いることができる� �

(vii)変異型ポリペプチドの作製方法
 本発明のタンパク質のアミノ酸の欠失又は� ��換は、出願前周知技術である部位特異的変� ��誘発法により実施することができる。1若し くは数個のアミノ酸が欠失又は置換は、Molecu lar Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition(1989)(Col d Spring Harbor Laboratory Press.)、Current Protocols� �in Molecular Biology(1994)(Wiley-Interscience)、Nucleic� �Acids Research,10,6487(1982).、Proceedings of the Nati onal Academy of Sciences USA,79,6409(1982).、Gene,34,31 5(1985).、Nucleic Acids research,13,4431(1985).、Proceed ings of the National Academy of Sciences USA,82,488(1 985).、Proceedings of the National Academy of Science s USA,81,5662(1984).、Science,224,1431(1984).、WO 85/008 17、Nature,316,601(1985).等に記載の方法に準じて� ��製することができる。

(b)本発明のタンパク質を発現可能な微生物
 本発明の製造方法において用いることので� ��る微生物は、基質と作用させる際に、基質� ��作用可能な状態で本発明のタンパク質を発� ��可能な微生物である限り、特に限定される� ��のではなく、例えば、本発明の遺伝子を導� ��した形質転換体、本発明のタンパク質を発� ��することが知られている天然の微生物、例� ��ば、バシルス属に属する微生物、好ましく� ��バシルス・サチルス(Bacillus subtilis)、シュ� �ドモナス属に属する微生物、ストレプトマ� �セス属に属する微生物等が挙げられる。微� �物中に含まれる本発明のタンパク質の量を� �為的に増加させることができる点で、形質� �換体であることが好ましい。

 本発明の製造方法に用いることのできる各� ��形質転換体を作成するために使用すること� ��できる宿主細胞は、基質と作用可能な状態� ��本発明のタンパク質を発現することができ� ��限り、特に限定されるものではなく、例え� ��、通常使用される公知の微生物、例えば、� ��腸菌又は酵母(Saccharomyces cerevisiae)、あるい� ��、公知の培養細胞、例えば、脊椎動物細胞( 例えば、CHO細胞又はCOS細胞)又は昆虫細胞を� �げることができる。増殖速度が速く、取り� �いが容易な点で、大腸菌が好ましい。また� �該形質転換体を作成するために使用するこ� �のできる発現ベクターは、基質と作用可能� �状態で本発明のタンパク質を発現すること� �できる限り、特に限定されるものではなく� �使用する宿主細胞の種類に応じて、適宜選� �することができる。
 宿主細胞、発現ベクター、形質転換体、形� ��転換体の培養方法等については上記「(2)本� ��明のタンパク質の作製方法」に詳述されて� ��る。

 本発明の製造方法において、基質と本発� ��のタンパク質を発現可能な微生物を作用さ� ��る際には、休止菌体反応を用いてもよいし� ��生育菌体反応を用いてもよい。それぞれ公� ��の方法を利用することができる。休止菌体� ��応とは、本発明のタンパク質を発現可能な� ��生物を培養後、菌体の増殖を止めて、基質� ��添加する方法である。例えば、後述の実施� ��1~6に記載の方法を利用することができる。� ��育菌体反応とは、本発明のタンパク質を発� ��可能な微生物を培養しながら基質を添加す� ��方法である。例えば、後述の実施例7又は8� �記載の方法を利用することができる。

 本発明の製造方法において、基質と
(a)本発明のタンパク質、又は該タンパク質及 び該タンパク質に電子を供給するフェレドキ シンと還元酵素からなる還元系、又は
(b)本発明のタンパク質を発現可能な微生物
の少なくとも1つを作用させる際の反応条件� �以下が好ましい。
 反応温度は、本発明のタンパク質の至適温� ��、並びに、基質及び生成物の安定温度等を� ��慮して適宜決定することができ、例えば、1 0~45℃、好ましくは15~40℃、更に好ましくは20~ 40℃、特に好ましくは25~35℃で実施すること� �できる。
 反応pHも、本発明のタンパク質の至適pH、並 びに、基質及び生成物の安定pH等を考慮して� ��宜決定することができ、例えば、4~10、好ま しくは5~9、更に好ましくは6~9、特に好ましく は7~8で実施することができる。
 反応時間は、前記各種条件(すなわち、使用 する溶媒、反応温度、又は反応pH)、あるいは 、使用する基質及び本発明のタンパク質又は 微生物の種類等に応じて適宜決定することが でき、例えば、1~100時間、好ましくは5~48時間 、より好ましくは12~36時間である。
 使用する本発明のタンパク質の量は、特に� ��定されるものではないが、例えば、0.5~20μmo l/Lの濃度で実施することができる。

 また、本発明の製造方法では、基質と本� ��明のタンパク質又は本発明のタンパク質を� ��現可能な微生物を作用させる際に、所望に� ��り、包接剤を添加してもよい。基質の化学� ��安定性や水への溶解性を増大させたり、酵� ��や微生物に対する基質阻害を低減させたり� ��ることができる。該包接剤としては、ヒド� ��キシプロピル-β-シクロデキストリン、α-シ クロデキストリン、β-シクロデキストリン、 γ-シクロデキストリン、メチル-β-シクロデ� �ストリン(Me-β-CD)が挙げられる。

 本発明の製造方法では、基質と本発明の� ��ンパク質又は本発明のタンパク質を発現可� ��な微生物を作用させる際に、所望により、� ��酵素(例えば、NADPH又はNADH、好ましくはNADPH) を共存させることができ、更に、前記補酵素 の再生系を共存させることができる。本発明 の製造方法では、使用する本発明のタンパク 質の種類に応じて、適当な補酵素を共存させ ることにより、その反応性を向上させること ができる。

 また、反応の進行に伴って、補酵素が消費� ��れる(例えば、NAD(P)Hが消費され、NAD(P) ⁺ に変換される)ため、更に、前記補酵素の再� �系を共存させることにより、その反応性を� �上させることができる。補酵素再生系とし� �は、各補酵素に種々の再生系が公知であり� �例えば、NAD(P)Hの再生系としては、例えば、� ��ルコースとグルコースデヒドロゲナーゼと� ��組み合わせ、ギ酸とギ酸デヒドロゲナーゼ� ��の組み合わせ、又はプロパノールとアルコ� ��ルデヒドロゲナーゼとの組み合わせ等を挙� ��ることができる。

 本発明の製造方法において共存させるこ� ��のできるこれらの補酵素、又は補酵素再生� ��の添加量は、使用する基質及び本発明のタ� ��パク質又は微生物の種類等に応じて適宜決� ��することができる。

 反応を停止し、その反応物から発酵生産� ��を採取する一般的な方法に準じて、アダマ� ��タン骨格を有する化合物の水酸化体、例え� ��、N-(5-ヒドロキシ-2-アダマンチル)-ベンズア ミド誘導体の分離を行うのがよい。具体的に は、例えば、溶媒抽出、イオン交換クロマト グラフィー、活性炭処理、結晶化、膜分離等 により、アダマンタン骨格を有する化合物の 水酸化体を培地から単離することができる。

 本発明は、上記反応を行うために利用され� ��酵素群も含有する。具体的には、以下のタ� ��パク質が挙げられる。
-配列番号:1記載のアミノ酸配列において1若� �くは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは� �加されたアミノ酸配列を含有し、かつ水酸� �活性を有するタンパク質。
-配列番号:1記載のアミノ酸配列において、I77 F、L357P、A362T、F41L、I77W、M105I、T234A、F232I、F2 32L及びF232Mからなる群より選ばれる1若しくは 数個の変異を持つアミノ酸配列からなるタン パク質。
-配列番号:3記載のアミノ酸配列からなるタン パク質又は該アミノ酸配列において1若しく� �数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加� �れたアミノ酸配列を含有し、かつ水酸化活� �を有するタンパク質。
-例えば、配列番号3記載のアミノ酸配列にお� ��て、I77F、I77W、M105I、A196D、F232I、F232L、F232M� ��T234A、T244A、V399E及びK702Eからなる群より選� �れる1若しくは数個の変異を持つアミノ酸配� ��からなるタンパク質。
 これらのタンパク質は上記「本発明のタン� ��ク質の作製方法」に記載の方法により、得� ��ことができる。

 また、本発明は以下の化合物も含有する。� ��れらの化合物は、機能性樹脂や医薬品の中� ��体として有用であるモノヒドロキシ-2-アダ� ��ンタナミンの原料となるN-(5-ヒドロキシ-2-� �ダマンチル)-ベンズアミド誘導体の製造に有 用である。
式:

で示される化合物、その塩又はそれらの溶媒 和物。

 また、本発明は以下の化合物も含有する。� ��れらの化合物は、機能性樹脂や医薬品の中� ��体として有用であるモノヒドロキシ-2-アダ� ��ンタナミンの製造に有用である。
式:

で示される化合物、その塩又はそれらの溶媒 和物。

 「塩」としては、例えば塩酸、硫酸、硝� ��又はリン酸等の無機酸の塩;パラトルエンス ルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸又は クエン酸等の有機酸の塩;アンモニウム、ト� �メチルアンモニウム又はトリエチルアンモ� �ウム等の有機塩基の塩;ナトリウム又はカリ� ��ム等のアルカリ金属の塩;及びカルシウム又 はマグネシウム等のアルカリ土類金属の塩等 を挙げることができる。

 「溶媒和物」とは、上記化合物に対し、� ��意の数の溶媒分子と配位していてもよい。� ��ましくは水和物である。

 以下に実施例を示し、本発明をさらに詳し� ��説明するが、これらは本発明を限定するも� ��ではない。
遺伝子操作的手法として、特に断らない限り Molecular Cloning :A Laboratpry Manual,2nd Edition(Cold  Spring Harbor Laboratory).に記載されている方法 を用いた。