Beschreibung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung primärer Alkohole ausgehend von Aldehyden. Die Reduktion wird durch cofaktorabhängige Oxidoreductasen bewerkstelligt, wobei der Cofaktor wiederum durch ein zweites enzymatisches System wieder regeneriert wird.

Die Herstellung primärer Alkohole ist von Interesse für die Nahrungsmittelindustrie aufgrund der Verwendung dieser Produkte als Aromachemikalien in direkter Form bzw. nach Überführung in entsprechende Esterverbindungen. Eine bevorzugte Herstellungsform ist die Gewinnung der primären Alkohole durch Reduktion von Aldehyden. Diese könnte prinzipiell durch den Einsatz nicht-natürlicher chemischer Reduktionsmittel erfolgen gemäß zahlreich vorhandener Literaturvorschriften, beispielsweise durch Einsatz von Metallhydriden. Allerdings würden auf diesem Wege lediglich „natur-identische" , nicht aber „natürliche" primäre Alkohole erhalten werden. Für die Nahrungsmittelindustrie ist aber gerade die Gewinnung natürlicher primärer Alkohole von hoher Bedeutung. Ein Weg zu deren Herstellung besteht in der enzymatischen Reduktion von Aldehyden.

Die enzymatische Reduktion von Aldehyden ist prinzipiell bereits eingehend in der Literatur beschrieben. Insbesondere sind dabei Beispiele zur Herstellung von trans-3-Hexenol, trans-2-Hexenol, Zimtalkohol und 2- Phenylethanol bekannt aufgrund deren Anwendung als Aromachemikalien bzw. als Zwischenprodukte für Aromachemikalien im Bereich der Nahrungsmittelindustrie. Allerdings werden die Reaktionen in sehr verdünnten Medien durchgeführt, was aus technischer Sicht den Nachteil damit verbundener niedriger Produktkonzentrationen mit sich bringt. Die Reduktion von Zimtaldehyd mit einer Substratkonzentration von 0.05 g pro L Reaktionsvolumen ist in Gegenwart von Botyris cinerea-Stämmen von G. Bock et al. beschrieben (G. Bock et al., Z. Lebensm. Unters. Forsch. 1988, 186, 33-35) . Die höchsten Ausbeuten lagen bei 0.019 bzw. 0.025 g pro L Reaktionsvolumen.

Die Nutzung von Alkoholdehydrogenasen zur Herstellung von 2-Phenylethanol durch Reduktionsreaktionen ist ebenfalls beschrieben. Typischerweise liegen die erhaltenen Produktkonzentrationen unter Standardbatchbedingungen lediglich bei <1 g/L (M. W. T. Etschmann, D. Seil, J. Schrader, Biotechnol. Lett. 2003, 25, 531-536.) . Eine Erhöhung auf 2 g/L konnte bei Anwendung einer in situ- Produktabtrennungstechnik erzielt werden, wobei hier mit Oleylalkohol als weiterer, zweiter Phase eine Hilfsverbindung benötigt wird (M. W. T. Etschmann, D. Seil, J. Schrader, Biotechnol. Lett. 2003, 25, 531-536.) . Unter Einsatz einer extraktiven Fedbatch-Bioumwandlung mit Ölsäure als weitere, organische Phase gelang mit einem solchen speziellen Reaktionssystem Stark et al., 2- Phenylethanol mit einer Produktkonzentration von 12.6 g/L, entsprechend einer Menge von ca. 100 mM, zu erhalten (D. Stark, T. Münch, B. Sonnleitner, I. W. Marison, U. von Stockar, Biotechnol. Prog. 2002, 18, 514-523) .

Für die Herstellung von trans-3-Hexenol und trans-2-Hexenol sind eine Reihe von enzymatischen Verfahren beschrieben, die als abschließenden Schlüsselschritt jeweils eine enzymatische Reduktion des entsprechenden Aldehyds beinhalten (S. K. Goers et al., US 4806379, 1989; B. Muller et al, Patent US 5464761, 1995; P. Brunerie et al. , US 5620879, 1997; M.-L. Fauconnier et al. , Biotechnology Lett. 1999, 21, 629-633; R. B. Holtz et al. , US 6274358, 2001) . Die höchsten Ausbeuten wurden dabei von Muller et al berichtet mit 4.2 g pro kg für trans-3-Hexenol und 1.5 g pro kg für trans-2-Hexenol (B. Muller et al, Patent US 5464761, 1995; siehe auch: J. Schrader et al., Biotechnology Letters 2004, 26, 463-472) . Nachteilig bei diesen Verfahren sind vor allem die niedrigen Substratkonzentrationen, bei denen gearbeitet wird und die daraus resultierenden niedrigen erhaltenen Produktkonzentrationen von <5 g pro kg Reaktionslösung.

Um diesen Nachteil zu vermeiden wurden entsprechende Enzymreaktionen mit trans-2-Hexenal bei Substratkonzentrationen von 100 mM durchgeführt (Beispiel 4 = Vergleichsbeispiel) . Hierbei kam als Enzym eine Alkoholdehydrogenase aus Rhodococcus erythropolis zum Einsatz, nachdem für diese Enzyme eine Aktivität für trans- 2-Hexenal festgestellt wurde. Die Cofaktorregenerierung erfolgte mit einer Formiatdehydrogenase, nachdem dieses cofaktorregenerierende Enzym in vielen Fällen erfolgreich bei der enzymatischen Reduktion von Ketonen eingesetzt wurde (M.-R. KuIa, U. Kragl, Dehydrogenases in the Synthesis of Chiral Compounds in: Stereoselective Biocatalysis (Hrsg. : R. N. Patel) , Marcel Dekker, New York, 2000, chapter 28, S. 839f.) . In Gegenwart der beiden Enzymkomponenten wurde allerdings die gewünschte Reaktion nur in geringem Umfang mit einem Umsatz von lediglich 16% nach 72 Stunden beobachtet (Beispiel 4) , vermutlich bedingt durch Inhibierungs und/oder Destabilisierungseffekte durch bereits geringe Konzentrationen an trans-2-Hexenal.

Über die Inhibierung von Alkoholdehydrogenasen beim Einsatz von Alkoholdehydrogenase-haltigen Mikroorganismen durch trans-3-Hexenal bereits bei sehr niedrigen Substratkonzentrationen berichten auch M.-L. Fauconnier et al. (M.-L. Fauconnier et al., Biotechnology Lett. 1999, 21, 629-633) . Typischerweise wurden die Reaktionen bei 0.67 mM (!) , entsprechend 0.066 g/L, durchgeführt. Der maximale Umsatz lag bei 82 %.

Zusammenfassend werden bislang somit bei allen enzymatischen Reduktionsverfahren von Aldehyden zur Herstellung primärer Alkohole lediglich niedrige, technisch nicht attraktive Produktkonzentrationen von < 15 g/L erhalten. Entsprechend werden auch nur bei niedrigen Substratkonzentrationen von maximal ~100 mM technisch sinnvolle Umsätze von > 80 % erzielt. Ursächlich kann dies mit einer durch die Aldehydkomponente hervorgerufenen Inhibierung als auch Deaktivierung der Enzyme erklärt werden. Da Aldehyde im Vergleich mit Ketonen weitaus reaktivere Komponenten darstellen, können in verstärktem Maße diese Verbindungen in unerwünschter Weise mit funktionellen Gruppen (insbesondere Aminen) der Enzyme reagieren und diese entsprechend deaktivieren.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war deshalb die Entwicklung eines schnellen, einfachen, kostengünstigen und effektiven enzymatischen Verfahrens zur Herstellung von primären Alkoholen aus Aldehyden. Insbesondere die Raum/Zeit-Ausbeute sollte gegenüber den bekannten Verfahren des Standes der Technik verbessert sein. Dies bedingt einerseits das Arbeiten bei hohen Substratkonzentrationen mit entsprechend guten Ausbeuten in einem robusten Arbeitsprozess. In ganz besonderem Maße sollte ein solches Verfahren zur Reduktion von ungesättigten Aldehyden einsetzbar sein.

Die Aufgabe wurde anspruchsgemäß gelöst. Anspruch 1 bezieht sich auf ein erfindungsgemäßes Verfahren, bei dem ein rec- Ganzzellkatalysator zum Einsatz kommt. Anspruch 2 umfasst eine bevorzugte Ausführungsform dieses Verfahrens. Anspruch 3 ist auf den Einsatz der freien Enzyme zum erfindungsgemäßen Zweck gerichtet. Ansprüchen 3 bis 9 stellen bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Schutz,

Dadurch, dass man in einem Verfahren zur Herstellung von primären Alkoholen durch Reduktion von Aldehyden diese Umsetzung in Gegenwart eines rekombinanten Ganzzellkatalysators, enthaltend eine Alkoholdehydrogenase sowie ein zur Cofaktorregenerierung befähigtes Enzym, durchführt, gelangt man völlig überraschend, dafür aber nicht minder vorteilhaft zur Lösung der gestellten Aufgabe. Überraschenderweise werden unter Anwendung dieses Verfahrens bei hohen Substratkonzentrationen von > 150 mM, insbesondere >250 mM und ganz bevorzugt > 500 mM, hohe bis sehr hohe Umsätze erzielt. Diese liegen typischerweise bei über 80% und insbesondere bei größer 90 - 95 % Ausbeute. Dies war aufgrund der niedrigen Umsätze bisheriger Verfahren selbst bei niedrigen Substratkonzentrationen nicht zu erwarten, und ist gerade auch vor dem Hintergrund der aus dem Stand der Technik bekannten starken Inhibierungen bzw. DeStabilisierungen von Dehydrogenasen durch die eingesetzten Substrate äußerst überraschend.

Prinzipiell eignen sich für den Aufbau des rec- Ganzzellkatalysators alle Alkoholdehydrogenasen, die dem Fachmann für die vorliegende Anwendung in den Sinn gekommen. Vorzugsweise erfolgte die erfindungsgemäße Umsetzung jedoch in Gegenwart eines rekombinanten (rec-) Ganzzellkatalysators, enthaltend eine Alkoholdehydrogenase sowie ein zur Cofaktorregenerierung befähigtes Enzym aus der Gruppe der Glucosedehydrogenasen bzw. Malatdehydrogenasen.

Eine weitere Lösung der oben gestellten Aufgabe wird dadurch erreicht, dass man die erfindungsgemäße Umsetzung in Gegenwart einer isolierten Alkoholdehydrogenase sowie einem zur Cofaktorregenerierung befähigten isolierten Enzym aus der Gruppe der Glucosedehydrogenasen bzw. Malatdehydrogenasen durchführt. Überraschend ist hier die spezielle Eignung der Kombination einer Alkoholdehydrogenase mit einem zur Cofaktorregenerierung befähigten Enzym aus der Gruppe der Glucosedehydrogenasen bzw. Malatdehydrogenasen als isoliert eingesetzte Enzyme, insbesondere unter Berücksichtigung der nicht zufriendenstellenden Ausbeuten bei der gleichen Anwendung der Formiatdehydrogenase (siehe auch Beispiel 4 = Vergleichsbeispiel) . Die deutlich verbesserte Performance bei der Kombination einer Alkoholdehydrogenase mit einem zur Cofaktorregenerierung befähigten Enzym aus der Gruppe der Glucosedehydrogenasen bzw. Malatdehydrogenasen gegenüber der analogen Kombination mit einer Formiatdehydrogenase wird beispielsweise durch Vergleich der bei der Reduktion von trans-2-Hexenal erhaltenen Umsätze verdeutlicht (siehe Beispiel 4 (= Vergleichsbeispiel) sowie Beispiele 5 bis 7) .

Vorzugsweise erfolgt die Umsetzung bei hohen Substratkonzentrationen von > 150 mM, insbesondere >250 mM und ganz bevorzugt > 500 mM an Aldehyd.

Erfindungsgemäß ist der Aussage „bei hohen Substratkonzentrationen von >150 mM" so zu verstehen, dass pro eingesetztem Ausgangsvolumen an wässrigem Lösungsmittel (inkl. Puffersystem) > 150 mM des Substrats mittels des dargestellten Verfahrens umgesetzt werden. Es kann dabei dahingestellt bleiben, ob die > 150 mM an Substrat als Konzentration in der Reaktionsmischung tatsächlich erreicht werden, oder ob insgesamt bezogen auf das Ausgangsvolumen an wässrigem Lösungsmittel eine Substratkonzentration von > 150 mM umgesetzt wird.

Ganz besonders bevorzugt ist jedoch die Variante, bei der für die Umsetzung eine Substratkonzentration von > 150 mM etc. an Aldehyd tatsächlich bereitgestellt wird. Die hier bezeichneten Konzentrationen beziehen sich auf im Ansatz tatsächlich erreichte auf das Ausgangsvolumen an wässrigem Lösungsmittel bezogene Konzentrationen des Substrats (Aldehyds) , wobei es unabhängig davon ist, wann im Laufe der Zeitdauer der Inkubation eines eingesetzten Ganzzellkatalysators bzw. isolierter Enzyme (in gereinigter oder partiell gereinigter Form bzw. als Rohextrakt) diese Ausgangskonzentration erreicht wird. Sie wird nur mindestens einmal erreicht.

Bei Anwendung eines Ganzzellkatalysators kann der Aldehyd in Form eines „Baten"ansatzes direkt am Anfang eines Ganzzeil-Ansatzes in diesen Konzentrationen eingesetzt werden, oder es kann zunächst ein Ganzzellkatalysator bis zu einer gewissen optischen Dichte herangezogen werden, bevor der Aldehyd zugegeben wird. Ebenso kann dieser zunächst in niedrigeren Konzentrationen eingesetzt werden und im Laufe der Inkubationsdauer des Zeilansatzes bis zu Konzentrationen wie angegeben zugegeben werden. Erfindungsgemäß kann vorzugsweise jedoch in dem Ansatz wenigstens einmal eine Konzentration an Substrat von >150 inM etc. während des Umsatzes des Substrats zu dem gewünschten Alkohol erreicht werden. Dies gilt für höhere Konzentrationen sinngemäß.

Als Aldehydkomponente können sämtliche Aldehyde eingesetzt werden. Vorzugsweise lässt sich die eingesetzte Aldehydkomponente unter folgende allgemeine Strukturformel subsumieren,

in der R bedeutet (C1-C2O)-AIkYl, (C2-C20) -Alkenyl, (C2-C20) -Alkinyl, (C1-C2Q)-AIkOXy, HO-(C1-C2Q)-AIkYl, (C2-C20) -Alkoxyalkyl, (C6-C18) -Aryl, (C7-C19) -Aralkyl, (C3-C18) -Heteroaryl, (C4-C19) -Heteroaralkyl, (C1-C20)-Alkyl- (C5-C18)-Aryl, (C1-C20) -Alkyl- (C3-C18) -Heteroaryl, (C3-C8) -Cycloalkyl, (C1-C30) -Alkyl- (C3-C8) -Cycloalkyl, (C3-C8) -Cycloalkyl- (C1-C20) -Alkyl, (C6-C18) -Aryl- (C2-C20) -Alkenyl. Besonders wird das Verfahren herangezogen zur Reduktion von Aldehyden, enthaltend mindestens eine C=C-Doppelbindung im Rest. Ganz bevorzugt kommen dabei 2-trans-Hexenal, 2-cis-Hexenal, 3-trans- Hexenal, 3-cis-Hexenal und/oder Zimtaldehyd zum Einsatz.

Für die vorliegende Erfindung ist eines der bevorzugt auszuwählenden Enzyme eine Alkoholdehydrogenase. Der Fachmann ist frei in der Auswahl der Alkoholdehydrogenase. Als bevorzugte Alkoholdehydrogenasen haben sich beispielsweise Alkoholdehydrogenasen aus einem Lactobacillus Stamm, insbesondere aus Lactobacillus kefir und Lactobacillus brevis, bzw. Alkoholdehydrogenasen aus einem Rhodococcus Stamm, insbesondere aus Rhodococcus erythropolis und Rhodococcus ruber, bzw. Alkoholdehydrogenasen aus einem Arthrobacter Stamm, insbesondere aus Arthrobacter paraffineus, erwiesen.

Als bevorzugte Dehydrogenasen zur Cofaktoregenerierung haben sich Glucosedehydrogenasen, vorzugsweise eine Glucosedehydrogenase aus Bacillus-, Thermoplasma- und Pseudomonas-Stämmen erwiesen. Glucosedehydrogenasen sind beispielsweise beschrieben in A. Bommarius in: Enzyme Catalysis in Organic Synthesis (Hrsg. : K. Drauz, H. Waldmann), Volume III, Wiley-VCH, Weinheim, 2002, Kapitel 15.3.

Malatdehydrogenasen sind dem Fachmann geläufig (S.-I. Suye, M. Kawagoe, S. Inuta, Can. J. Chem. Eng. 1992, 70, 306-312; S.-I. Suye, Recent Res. Devel. Ferment. Bioeng. 1998, 1, 55-64; Dissertation S. Naamnieh, Universität Düsseldorf; W02004/022764) . Auch hier wird der Fachmann die für seinen Zweck am effizientesten einsetzbare Dehydrogenase auswählen. Im Prinzip sind solche Malatdehydrogenasen bevorzugt, die das NAD(P)H in einem solchen Maße regenerieren, dass kein Engpass für den Reaktionsablauf des anderen eingesetzten Enzyms auftritt. Als Malatdehydrogenasen („malic enzyme") , wird vorzugsweise ein „malic enzyme" aus Sulfolobus-, Clostridium-, Bacillus- und Pseudomonas-Stämmen sowie aus E. coli, eingesetzt. Ganz bevorzugt ist die bekannte Malatdehydrogenase aus E. coli K12 in diesem Zusammenhang. Genisolierung und Klonierung sind beschrieben in S. Naamnieh, Dissertation, Universität Düsseldorf, S. 7Off.

Die Zugabe des Aldehyds kann in beliebiger Art und Weise erfolgen. Bevorzugt wird der Aldehyd in der Gesamtmenge von Anfang an („batch" Ansatz) bzw. alternativ dosiert zugegeben. Auch ein kontinuierliches Zugeben („kontinuierliches feed-in Verfahren") kann angewendet werden. Diese Verfahrensweisen sind dem Fachmann hinlänglich bekannt und werden vorliegendenfalls analog angewendet.

Gemäß der vorliegenden Erfindung ist unter einem "rekombinanten Ganzzellkatalysator" eine Zelle zu verstehen, in der wenigstens ein rekombinantes Gen exprimiert wird oder exprimiert wurde - sprich wenigstens ein rekombinantes Protein vorliegt, das den erfindungsgemäßen Umsatz (Reduktion des Aldehyds und/oder Regenerierung des Cofaktors) katalysieren kann. Die rekombinanten Proteine sind nicht auf ein Vorliegen in lebenden oder nicht lebenden Ganzzellkatalysatoren beschränkt, sondern können in jeglicher aktiver Form stehen. Unter "aktiver Form" ist dabei die Fähigkeit des rekombinanten Proteins zu verstehen, eine enzymatische Reaktion zu katalysieren. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt das rekombinante Protein ausschließlich in freier Form über das Cytosol der Zelle verteilt und nicht in Form von Einschlusskörperchen (inclusion bodies) vor. Erfindungsgemäß ist oder war die Zelle in der Lage eine Alkoholdehydrogenase und eine zur Cofaktorregenerierung befähigte Dehydrogenase zu exprimieren.

Für den Ganzzellkatalysator, enthaltend eine Alkoholdehydrogenase und ein zur Cofaktorregenerierung befähigtes Enzym, eignen sich sämtliche bekannte Zellen. Als Mikroorganismen sind diesbezüglich Organismen wie z.B. Hefen wie Hansenula polymorpha, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Prokaryonten, wie E. coli, Bacillus subtilis oder Eukaryonten, wie Säugerzellen, Insektenzellen oder Pflanzenzellen zu nennen. Die Verfahren zur Klonierung sind dem Fachmann wohlbekannt (Sambrook, J.; Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989) , Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., CoId Spring Harbor Laboratory Press, New York) . Vorzugsweise sind E. coli-Stämme für diesen Zweck zu benutzen. Ganz besonders bevorzugt sind: E.' coli XLl Blue, NM 522, JMlOl, JM109, JM105, RRl, DH5α, TOP 10- , HBlOl, BL21 codon plus, BL21 (DE3) codon plus, BL21, BL21 (DE3) , MM294. Plasmide, mit denen das die erfindungsgemäße Nukleinsäure aufweisende Genkonstrukt vorzugsweise in den Wirtsorganismus kloniert wird, sind dem Fachmann ebenfalls bekannt (s.a. PCT/EP03/07148; s.u.) .

Als Plasmide bzw. Vektoren kommen im Prinzip alle dem Fachmann für diesen Zweck zur Verfügung stehenden Ausführungsformen in Frage. Derartige Plasmide und Vektoren können z. B. von Studier und Mitarbeiter (Studier, W. F.; Rosenberg A. H.; Dünn J. J.; Dubendroff J. W.; (1990) , Use of the T7 RNA Polymerase to direct expression of cloned genes, Methods Enzymol. 185, 61-89) oder den Broschüren der Firmen Novagen, Promega, New England Biolabs, Clontech oder Gibco BRL entnommen werden. Weiter bevorzugte Plasmide und Vektoren können gefunden werden in: Glover, D. M. (1985) , DNA cloning: a practical approach, Vol. I-III, IRL Press Ltd. , Oxford; Rodriguez, R.L. und Denhardt, D. T (eds) (1988) , Vectors : a survey of molecular cloning vectors and their uses, 179-204, Butterworth, Stoneham; Goeddel, D. V. (1990) , Systems for heterologous gene expression, Methods Enzymol. 185, 3-7; Sambrook, J.; Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989) , Molecular cloning: a laboratory manual, 2πd ed., CoId Spring Harbor Laboratory Press, New York.

Plasmide, mit denen die die ins Auge gefassten Nukleinsäuresequenzen aufweisenden Genkonstrukte in ganz bevorzugter Weise in den Wirtsorganismus kloniert werden können, sind oder basieren auf: pUC18/19 (Roche Biochemicals) , pKK-177-3H (Roche Biochemicals) , pBTac2 (Roche Biochemicals) , pKK223-3 (Amersham Pharmacia Biotech) , pKK-233-3 (Stratagene) oder pET (Novagen) .

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der Ganzzellkatalysator vorzugsweise vor dessen Einsatz so vorbehandelt, dass die Permeabilität der Zellmembran für die Substrate und Produkte gegenüber dem intakten System gesteigert ist. Besonders bevorzugt ist dabei ein Verfahren, bei dem der Ganzzellkatalysator beispielsweise durch Einfrieren und/oder Behandlung mit einem organischen Solvens, insbesondere Toluol vorbehandelt wird.

In besonderer Weise ist dabei ein rekombinanter Ganzzellkatalysator, der eine Alkoholdehydrogenase aus R. erythropolis oder Lactobacillus kefir sowie eine Malatdehydrogenase (einschließlich sog. „Malic Enzymes") enthält, geeignet. Ebenso sind rekombinante Ganzzellkatalysatoren mit einer Alkoholdehydrogenase aus R. erythropolis oder Lactobacillus kefir und einer Glucosedehydrogenase aus Thermoplasma acidophilum oder Bacillus subtilis in allen möglichen Kombinationen geeignet. Als besonders geeignete rekombinante Ganzzellkatalysatoren sind die beiden im experimentellen Teil beschriebenen bevorzugt.

Die Konzentration dieses rekombinanten Ganzzellkatalysators liegt bevorzugt bei maximal 75 g/L, in einer weiter bevorzugten Ausführungsform bei bis zu 50 g/L, äußerst bevorzugt bei bis zu 25 g/L und besonders bevorzugt bei bis zu 15 g/L, wobei sich g auf g Biofeuchtmasse (BFM) bezieht.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann bei beliebigen, insbesondere für den verwendeten rekombinanten Ganzzellkatalysator geeigneten Reaktionstemperaturen durchgeführt werden. Als besonders geeignete Reaktionstemperatur ist eine Reaktionstemperatur anzusehen, die bei 10 bis 900C, bevorzugt 15 bis 500C und besonders bevorzugt 20 bis 350C liegt.

Auch bei dem pH-Wert der Reaktion ist der Fachmann frei in der Wahl, wobei die Reaktion sowohl bei einem festen pH- Wert, als auch unter Variation des pH-Werts in einem pH- Intervall durchgeführt werden kann. Der pH-Wert wird insbesondere unter Berücksichtigung der Bedürfnisse des eingesetzten Wirtsorganismus oder der eingesetzten isolierten Enzyme gewählt. Bevorzugt wird die Reaktion bei einem pH-Wert durchgeführt, der bei pH 5 bis 9, bevorzugt pH 6 bis 8 und besonders bevorzugt pH 6.5 bis 7.5 liegt.

Die Umsetzung des eingesetzten Substrates zu dem gewünschten Produkt erfolgt vorzugsweise in Zellkultur unter Einsatz eines geeigneten rekombinanten Ganzzellkatalysators. Hierbei wird je nach verwendetem Wirtsorganismus ein geeignetes Nährmedium verwendet. Die für die Wirtszellen geeigneten Medien sind allgemein bekannt und kommerziell erhältlich. Den Zellkulturen können außerdem übliche Zusätze zugegeben werden, wie z.B. Antibiotika, wachstumsfördernde Mittel, wie z.B. Seren (fötales Kälberserum usw.) und ähnliche bekannte Zusatzstoffe.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Umsatz des Aldehyds zu dem gewünschten primären Alkohol ohne Zusatz eines organischen Lösungsmittels durchgeführt. Dies soll heißen, dass dem Ansatz, der den Biokatalysator enthält, kein organisches Lösungsmittel zugegeben wird. Alternativ kann jedoch auch dem zur Durchführung der Reaktion notwendigen Wasserzusatz weitere organische Lösungsmittel vorzugsweise solche, die wasserlöslich sind, zugegeben werden. Als solche werden insbesondere wasserlösliche organische Lösungsmittel wie z.B. Alkohole, insbesondere Methanol oder Ethanol, oder Ether, wie THF oder Dioxan, verstanden.

Außerdem ist es bevorzugt die Umsetzung in einer Zellsuspension des geeigneten rekombinanten Ganzzellkatalysators durchzuführen, wobei der eingesetzte Aldehyd in der Zellsuspension. ebenfalls als Suspension vorliegen kann, oder in Form einer Emulsion oder Lösung in der Zellsuspension vorliegt.

Bei Verwendung isolierter Enzyme (in gereinigter bzw. partiell gereinigter Form oder als Rohextrakte oder in immobilisierter Form) wird in einer bevorzugten Ausführungsform der entsprechende Cofaktor in geeigneten Mengen zugesetzt. Typischerweise liegen die zugesetzten Cofaktoπnengen im Bereich von 0'.00001 bis 0.1 Äquivalenten, bevorzugt 0.0001 bis 0.01 und ganz bevorzugt 0.0001 und 0.001 Äquivalenten. Beim Einsatz eines Ganzzellkatalysators kann in einer bevorzugten Ausführungsform auf den Einsatz eines „externen" Cofaktorzusatzes verzichtet bzw. ein solcher „externer" Cofaktorzusatz im Mengenbereich von unter 0.0005 Äquivalenten verwendet werden.

Bei der gegenständlichen Reaktion geht man in einer bevorzugten Ausführungsform so vor, dass man den rekombinanten Ganzzellkatalysator bzw. die isolierten Enzyme und das Substrat in dem gewählten Lösungsmittelsystem vorlegt. Je nach Anforderung kann sodann eine bestimmte Menge an dem entsprechend benötigten Cofaktor (beispielsweise NADH bzw. NADPH bzw. deren oxidierte Formen NAD+ und NADP+) zur Reaktionsmischung zugesetzt werden. Die Zugabereihenfolge ist jedoch variabel. Die Aufarbeitung der Reaktionsmischung erfolgt nach dem Fachmann bekannten Verfahren. Im Batch-Prozess kann die Biomasse durch Filtration oder Zentrifugation leicht vom Produkt abgetrennt werden. Der erhaltene Alkohol kann dann nach gängigen Verfahren isoliert werden (z.B. Extraktion, Destillation, Kristallisation) .

Das gegenständliche Verfahren kann jedoch auch kontinuierlich durchgeführt werden. Dazu wird die Reaktion in einem so genannten Enzym-Membran-Reaktor durchgeführt, in dem hochmolekulare Stoffe - die Enzyme oder Biomasse - hinter einer Ultrafiltrationmembran zurückgehalten werden und niedermolekulare Stoffe - wie die produzierten Aminosäuren - die Membran passieren können. Eine derartige Verfahrensweise wurde im Stand der Technik schon mehrfach beschrieben (Wandrey et al. in Jahrbuch 1998, Verfahrenstechnik und Chemieingenieurwesen, VDI, S. 151ff; Kragl et al., Angew. Chem. 1996, 6, 684) .

Als (C1-C20) -Alkylreste sind insbesondere anzusehen Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, Isobutyl, sec-Butyl, tert-Butyl, Pentyl, Hexyl, Heptyl, Octyl, Nonyl, Decyl, Undecyl, Dodecyl samt aller ihrer Bindungsisomeren. Ein (Ci-C8)-Alkylrest ist sinngemäß einer, bei dem 1 bis 8 C- Atome in der Kette vorhanden sind. (C2-C20) -Alkenylrest bezeichnet einen wie oben dargestellten (Ci-C20) -Alkylrest mit mindestens einer C=C-Doppelbindung. (C2-C20) -Alkinylrest bezeichnet einen wie oben dargestellten (Ci-C20) -Alkylrest mit mindestens einer C≡C-Dreifachbindung. Der Rest (C1-C2O)-AIkOXy entspricht dem Rest (C1-C20) -Alkyl mit der Maßgabe, daß dieser über ein Sauerstoffatom an das Molekül gebunden ist. Entsprechendes gilt für einen (C1- C8) -Alkoxyrest.

Als (C2-C20) -Alkoxyalkyl sind Reste gemeint, bei denen die Alkylkette durch mindestens eine Sauerstoffunktion unterbrochen ist, wobei nicht zwei Sauerstoffatome miteinander verbunden sein können. Die Anzahl der Kohlenstoffatome gibt die Gesamtzahl der im Rest enthaltenen Kohlenstoffatome an.

Die eben beschriebenen Reste können einfach oder mehrfach mit Halogenen und/oder N-, 0-, P-, S-, Si-atomhaltigen Resten substituiert sein. Dies sind insbesondere Alkylreste der oben genannten Art, welche eines oder mehrere dieser Heteroatome in ihrer Kette aufweisen bzw. welche über eines dieser Heteroatome an das Molekül gebunden sind.

Unter (C3-C8) -Cycloalkyl versteht man Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl bzw. Cycloheptylreste etc. Diese können mit einem oder mehreren Halogenen und/oder N-, 0-, P-, S-, Si-atomhaltigen Resten substituiert sein und/oder N-, 0-, P-, S-Atome im Ring aufweisen, wie z. B. 1-, 2-, 3-, 4-Piperidγl, 1-, 2-, 3- Pyrrolidinyl, 2-, 3-Tetrahydrofuryl, 2-, 3-, 4-Morpholinyl.

Ein (C3-C8) -Cycloalkyl- (C1-C20) -Alkylrest bezeichnet einen wie oben dargestellten Cycloalkylrest, welcher über einen wie, oben angegebenen Alkylrest an das Molekül gebunden ist.

(Ci-C8) -Acyloxy bedeutet im Rahmen der Erfindung einen wie oben definierten Alkylrest mit max. 8 C-Atomen, welcher über eine COO-Funktion an das Molekül gebunden ist.

(C1-C8) -Acyl bedeutet im Rahmen der Erfindung einen wie oben definierten Alkylrest mit max. 8 C-Atomen, welcher über eine CO-Funktion an das Molekül gebunden ist.

Unter einem (C6-Ci8) -Arylrest wird ein aromatischer Rest mit 6 bis 18 C-Atomen verstanden. Insbesondere zählen hierzu Verbindungen wie Phenyl-, Naphthyl-, Anthryl-, Phenanthryl-, Biphenylreste oder an das betreffende Molekül annelierte Systeme der vorbeschriebenen Art, wie z.B. Indenylsysteme, welche ggf. mit (C1-C8) -Alkyl, (Ci-C8)- Alkoxy, NR1R2, (Ci-C8) -Acyl, (Ci-C8) -Acyloxy substituiert sein können. Ein (C7-C26) -Aralkylrest ist ein über einen (C1-C8) -Alkylrest an das Molekül gebundener (C6-C18) -Arylrest.

Ein (C3-C18) -Heteroarylrest bezeichnet im Rahmen der Erfindung ein fünf-, sechs- oder siebengliedriges aromatisches Ringsystem aus 3 bis 18 C-Atomen, welches Heteroatome wie z. B. Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel im Ring aufweist. Als solche Heteroaromaten werden insbesondere Reste angesehen, wie 1-, 2-, 3-Furyl, wie 1-, 2-, 3-Pyrrolyl, 1-, 2-, 3-Thienyl, 2-,, 3-, 4-Pyridyl, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-Indolyl, 3-, 4-, 5-Pyrazolyl, 2-, 4-, 5-Imidazolyl, Acridinyl, Chinolinyl, Phenanthridinyl, 2-, 4-, 5-, 6-Pyrimidinyl.

Unter einem (C4-C26) -Heteroaralkyl wird ein dem (C7-C26) -Aralkylrest entsprechendes heteroaromatisches System verstanden.

Als Halogene (HaI) kommen Fluor, Chlor, Brom und Iod in Frage.

Unter dem Begriff „isoliertes Enzym" wird erfindungsgemäß der Einsatz der Alkoholdehydrogenase sowie des zur Cofaktorregenerierung befähigten Enzyms aus der Gruppe der Glucosedehydrogenasen bzw. Malatdehydrogenasen als isolierte Enzyme (in gereingter bzw. partiell gereingter Form oder als Rohextrakt oder in immobilisierter Form) verstanden.

Die „malic enzyme" genannte Malatdehydrogenase (MDH) katalysiert die oxidative Decarboxylierung von Malat zu Pyruvat. Zahlreiche Malatdehydrogenasen aus verschiedenen Organismen sind bekannt, so u.a. aus höheren Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen. Es wird zwischen vier Arten von Malatdehydrogenasen unterschieden, die in den Enzymklassen E.C. 1.1.1.37 bis EC 1.1.1.40 klassifiziert sind (http://www.genome.ad.jp) . In Abhängigkeit vom Typ der Malatdehydrogenase wird NAD und/oder NADP als Cofaktor benötigt.

Der in den Beispielen verwendete E. coli wurde durch die Anmelderin unter der Nummer DSM 14459 bei der DSMZ GmbH, Mascheroder Weg Ib, D-38124 Braunschweig am 24.08.01 nach dem Budapester Vertrag hinterlegt.

Figuren:

Figur 1 zeigt die Plasmidkarte des Plasmids pNO5c

Figur 2 zeigt die Plasmidkarte des Plasmids pNO8c

Figur 3 zeigt die Plasmidkarte des Plasmids pN014c Experimenteller Teil:

Herstellung eines Ganzzellkatalysators, enthaltend eine (R) -Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir sowie eine Glucosedehydrogenase aus Thermoplasma acidophilum

Stanunherstellung

Chemisch kompetente Zellen von E. coli DSM14459 (beschrieben in Patent W003/042412) wurden mit dem Plasmid pNO5c transformiert (Sambrook et al. 1989, Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, CoId Spring Harbor Laboratory Press) .Dieses Plasmid kodiert für die Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir (Lactobacillus kefir alcohol dehydrogenase: a useful catalyst for synthesis. Bradshaw et al. JOC 1992, 57 1532-6, Reduction of acetophenone to R(+) -phenylethanol by a new alcohol dehydrogenase from Lactobacillus kefir. Hummel W. Ap Microbiol Biotech 1990, 34, 15-19) . Der rekombinante E. coli DSM14459 (pNO5c - Fig. 1) wurde chemisch kompetent gemacht und mit dem Plasmid pNO8c (Fig. 2) transformiert, welches das Gen einer codonoptimierten Glucosedehydrogenase aus Thermoplasma acidophilum codiert (Bright,J.R. et al., 1993 Eur. J. Biochem. 211:549-554) . Beide Gene stehen unter Kontrolle eines Rhamnosepromotors (Stumpp, Tina; Wilms, Burkhard; Altenbuchner, Josef. A new, L-rhamnose-inducible expression System for Escherichia coli. BIOspektrum (2000) , 6(1) , 33-36) . Sequenzen und Plasmidkarten von pN05c und pNO8c sind unten angegeben. Herstellung aktiver Zellen

Eine Einzelkolonie von E . coli DSM14459 (pN05c , pN08c) wurde in 2ml LB-Medium mit Antibiotikazusatz (50μg/l Ampicillin und 20 μg/ml Chloramphenical) 18 Stunden bei 37 °C , geschüttelt (250 upm) , inkubiert . Diese Kultur wurde 1 : 100 in frischem LB-Medium mit Rhamnose (2g/ 1) als Induktor , Antibiotikazusatz (50μg/l Ampicillin und 20 μg/ml Chloramphenical) und ImM ZnCl2 verdünnt und 18 Stunden bei 300C , geschüttelt (250 upm) , inkubiert . Zellen wurden zentrifugiert (10000g, 10min, 40C) , der Überstand verworfen und das Zellpellet direkt oder nach Lagerung bei -2O 0C in Biotransformationsversuchen eingesetzt .

Herstellung eines Ganzzellkatalysators , enthaltend eine (S) -Alkoholdehγdrogenase aus Rhodococcus erythropolis sowie eine Glucosedehydrogenase aus Bacillus subtilis

Stammherstellung

Chemisch kompetente Zellen von E . coli DSM14459 (beschrieben in Patent W003/042412 ) wurden mit dem Plasmid pN014c transformiert (Sambrook et al . 1989 , Molecular cloning : A Labor atory Manual , 2nd Edition , CoId Spring Harbor Laboratory Press) . Dieses Plasmid kodiert für eine Alkoholdehydrogenase aus Rhodococcus erythropolis (Cloning , sequence analysis and heterologous expression of the gene encoding a (S) -specific alcohol dehydrogenase from Rhodococcus erythropolis DSM 43297 . Abokitse , K . ; Hummel , W. Applied Microbiology and Biotechnology 2003 , 62 380-386) und einer Glucosedehydrogenase aus Bacillus subtilis (Glucose dehydrogenase from Bacillus subtilis expressed in Escherichia coli . I : Purification , characterization and comparison with glucose dehydrogenase from Bacillus megaterium. HiIt W; Pfleiderer G; Fortnagel P Biochimica et biophysica acta (1991 Jan 29), 1076(2), 298-304). Die Alkoholdehydrogenase steht unter der Kontrolle eines Rhamnosepromotors (Stumpp, Tina; Wilms, Burkhard; Altenbuchner, Josef. A new, L-rhamnose-inducible expression system for Escherichia coli. BIOspektrum (2000), 6(1), 33-36). Die Sequenz und Plasmidkarte von pN014c ist unten angegeben.

.

Herstellung aktiver Zellen

Eine Einzelkolonie von E.coli DSM14459 (pN014c - Fig. 3) wurde in 2ml LB-Medium mit Antibiotikazusatz (50μg/l Ampicillin und 20 μg/ml Chloramphenical) 18 Stunden bei 37° C, geschüttelt (250 upm) , inkubiert. Diese Kultur wurde 1:100 in frischem LB-Medium mit Rhamnose (2g/l) als Induktor, Antibiotikazusatz (50μg/l Ampicillin und 20 μg/ml Chloramphenical) und ImM ZnCl2 verdünnt und 18 Stunden bei 300C , geschüttelt (250 upm) , inkubiert. Zellen wurden zentrifugiert (10000g, 10min, 4°C) , der Überstand verworfen und das Zellpellet direkt, oder nach Lagerung bei -2O0C in Biotransformationsversuchen eingesetzt. Beispiele für die Herstellung von Zimtalkohol und trans-2- Hexen-1-ol:

Beispiel 1: Reduktion von Zimtaldehyd in einer 0.2 M Lösung unter Einsatz eines Ganzzellkatalysators, enthaltend eine Alkoholdehydrogenase und Glucosedehydrogenase

In einem Titrino-Reaktionsgefäß werden zu 40 mL eines Phosphatpuffers (eingestellt auf pH 7.0) bei Raumtemperatur der zuvor beschriebene Ganzzellkatalysator E.coli DSM14459 (pNO14c) mit einer Alkoholdehydrogenase (E. coli, (S)- Alkoholdehydrogenase aus R. erythropolis, Glucosedehydrogenase aus B. subtilis) in einer Zellkonzentration, die eine optische Dichte von OD = 24 ergibt, 1.05 Äquivalente Glukose (Äquivalente sind bezogen auf Menge an eingesetztem Zimtaldehyd) und 8 mmol Zimtaldehyd (entsprechend einer Substratkonzentration bezogen auf eingesetztem Phosphatpuffer von 0.2 M) zugegeben. Die Reaktionsmischung wird bei Raumtemperatur gerührt, wobei der pH durch Zugabe von Natronlauge (2M NaOH) konstant gehalten wird (auf pH 6.5) . In regelmäßigen Abständen werden Proben entnommen und der Umsatz des Zimtaldehyds zum Zimtalkohol mittels HPLC ermittelt. Die Umsätze lagen bei 93% nach 1 Stunde und 100% nach 2h.

Beispiel 2: Reduktion von Zimtaldehyd in einer 0.5 M Lösung unter Einsatz eines Ganzzellkatalysators, enthaltend eine Alkoholdehydrogenase und Glucosedehydrogenase

In einem Titrino-Reaktionsgefäß werden zu 40 mL eines Phosphatpuffers (eingestellt auf pH 7.0) bei Raumtemperatur der zuvor beschriebene Ganzzellkatalysator E.coli DSM14459 (pN014c) mit einer Alkoholdehydrogenase (E. coli, (S)- Alkoholdehydrogenase aus R. erythropolis, Glucosedehydrogenase aus B. subtilis) in einer Zellkonzentration, die eine optische Dichte von OD = 16 ergibt, 1.05 Äquivalente Glukose (Äquivalente sind bezogen auf Menge an eingesetztem Zimtaldehyd) und 20 mmol Zimtaldehyd (entsprechend einer Substratkonzentration bezogen auf eingesetztem Phosphatpuffer- von 0.5 M) zugegeben. Die Reaktionsmischung wird 25 h bei Raumtemperatur gerührt, wobei der pH durch Zugabe von Natronlauge (2M NaOH) konstant gehalten wird (auf pH 6.5). In regelmäßigen Abständen werden Proben entnommen und der Umsatz des Zimtaldehyds zum Zimtalkohol mittels HPLC ermittelt. Die Umsätze lagen bei 44% nach 1 Stunde, 91% nach 5h und 93% nach 25h.

Beispiel 3: Reduktion von Zimtaldehyd in einer 1.5 M Lösung unter Einsatz eines Ganzzellkatalysators, enthaltend eine (R)-selektive Alkoholdehydrogenase

In einem Titrino-Reaktionsgefäß werden zu 40 mL eines Phosphatpuffers (eingestellt auf pH 7.0) bei Raumtemperatur der zuvor beschriebene Ganzzellkatalysator E.coli DSM14459 (pNO5c,pNO8c) mit einer (R)-selektiven Alkoholdehydrogenase (E. coli, (R)-Alkoholdehydrogenase aus L. kefir, Glucosedehydrogenase aus T. acidophilum) in einer Zellkonzentration, die eine optische Dichte von OD = 30 ergibt, 1.05 Äquivalente Glukose (Äquivalente sind bezogen auf Menge an eingesetztem Zimtaldehyd) und 60 mmol Zimtaldehyd (entsprechend einer Substratkonzentration bezogen auf eingesetztem Phosphatpuffer von 1.5 M) zugegeben. Die Reaktionsmischung wird bei Raumtemperatur gerührt, wobei der pH durch Zugabe von Natronlauge (5M NaOH) konstant gehalten wird. In regelmäßigen Abständen werden Proben entnommen und der Umsatz des Zimtaldehyds zum Zimtalkohol mittels HPLC ermittelt. Die Umsätze lagen bei 15% nach 1 Stunde, 58% nach 5 Stunden und 98% nach 23.5 Stunden. Beispiel 4 (Vergleichsbeispiel) : Umsetzung von trans-2- Hexenal bei 100 mM unter Einsatz einer Formiatdehydrogenase zur Cofaktorregenerierung

Ein Reaktionsgemisch, bestehend aus trans-2-Hexenal (100 mM) , sowie NADH (3.5 mM, entsprechend 0.035 Äquivalente bezogen auf den Aldehyd) , Natriumformiat (455 mM, entsprechend 4.55 Äquivalente bezogen auf den Aldehyd) bei Enzymmengen von 20 U/mmol einer (S)-ADH aus R. erythropolis (expr. in E. coli) und 20 U/mmol einer Formiatdehydrogenase aus Candida boidinii, lässt man bei einer Reaktionstemperatur von 300C über einen Zeitraum von 72 Stunden in 1 mL eines Phosphat-Puffers (100 mM; pH 7.0) rühren. Es werden in diesem Zeitraum Proben genommen und der jeweilige Umsatz via HPLC ermittelt. Die Umsätze lagen bei 7% nach 5h und 16% nach 72 Stunden.

Beispiel 5: Umsetzung von traπs-2-Hexenal bei 100 mM unter Einsatz einer Glucosedehydrogenase zur Cofaktorregenerierung

Ein Reaktionsgemisch, bestehend aus trai-S-2-Hexenal (100 mM) , sowie NADH (1.4 mM, entsprechend 0.014 Äquivalente bezogen auf den Aldehyd) , Glucose (300 mM, entsprechend 3 Äquivalente bezogen auf den Aldehyd) bei Enzymmengen von 20 U/mmol einer (S)-ADH aus R. erythropolis (expr. in E. coli) und 150 U/mmol einer Glucosedehydrogenase aus Bacillus sp., lässt man bei einer Reaktionstemperatur von 300C über einen Zeitraum von 72 Stunden in 1 mL eines Phosphat-Puffers (100 mM; pH 7.0) rühren. Es werden in diesem Zeitraum Proben genommen und der jeweilige Umsatz via HPLC ermittelt. Die Umsätze lagen bei 64% nach 5h und 72% nach 72 Stunden. Beispiel 6: Umsetzung von. trans-2-Hexenal bei 100 mM unter Einsatz einer Glucosedehydrogenase zur Cofaktorregenerierung

Ein Reaktionsgemisch, bestehend aus trans-2-Hexenal (100 mM) , sowie NADPH (1 mM, entsprechend 0.01 Äquivalente bezogen auf den Aldehyd) , Magnesiumchlorid (5 mM) , Glucose (300 mM, entsprechend 3 Äquivalente bezogen auf den Aldehyd) bei Enzymmengen von 13 U/mmol einer (R) -ADH aus L. kefir und 60 U/mmol einer Glucosedehydrogenase aus Thermoplasma acidophilum, lässt man bei einer Reaktionstemperatur von 300C über einen Zeitraum von 72 Stunden in 1 mL eines Phosphat-Puffers (100 mM; pH 7.0) rühren. Es werden in diesem Zeitraum Proben genommen und der jeweilige Umsatz via HPLC ermittelt. Die Umsätze lagen bei 40% nach Ih, 79% nach 5h und 86% nach 72 Stunden.

Beispiel 7: Reduktion von trans-2-Hexenal in einer 0.5 M Lösung unter Einsatz eines Ganzzellkatalysators, enthaltend eine Alkoholdehydrogenase und Glucosedehydrogenase

In einem Titrino-Reaktionsgefäß werden zu 40 mL eines Phosphatpuffers (eingestellt auf pH 7.0) bei Raumtemperatur der zuvor beschriebene Ganzzellkatalysator E.coli DSM14459 (pNO5c,pNO8c) mit einer (R) -selektiven Alkoholdehydrogenase (E. coli, (R) -Alkoholdehydrogenase aus L. kefir, Glucosedehydrogenase aus T. acidophilum) in einer Zellkonzentration, die eine optische Dichte von OD = 27 ergibt, 6 Äquivalente Glukose (Äquivalente sind bezogen auf Menge an eingesetztem Zimtaldehyd) und 20 mmol trans-2- Hexenal (entsprechend einer Substratkonzentration bezogen auf eingesetztem Phosphatpuffer von 0.5 M) zugegeben. Die Reaktionsmischung wird 24 h bei Raumtemperatur gerührt, wobei der pH durch Zugabe von Natronlauge (2M NaOH) konstant gehalten wird. In regelmäßigen Abständen werden Proben entnommen und der Umsatz des trans-2-Hexenal zum trans-2-Hexen-l-ol mittels HPLC ermittelt. Die Umsätze lagen bei 24% nach 1 Stunde, 61% nach 5 Stunden und >99% nach 24 Stunden.