Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen von Proteinen auf der Basis einer Stofffraktion aus der Nahrungsmittelindustrie.

Beim Brauen von Bier wird zunächst aus Gerste oder anderem Getreide Malz hergestellt. Durch Mälzen werden Enzyme freigesetzt, die aus der Stärke des Korns Malzzucker für die spätere Vergärung erzeugen. Hierzu ist der Maischprozess erforderlich. Beim Maischen werden das vermälzte und geschrotete Getreide mit Brauwasser unter Rühren vermischt und erhitzt, die Stärke durch die Enzyme in Malzzucker (Maltose) umgewandelt und die Malinhaltsstoffe als Extrakt gewonnen. Die flüssige Bierwürze wird durch Abläutern im Läuterbottich oder Maischefilter bei Temperaturen von 72° bis 80°C von den festen Bestandteilen der Maische getrennt, dem sogenannten Biertreber. Das Hauptprodukt für die Bierherstellung ist die Bierwürze. Diese wird gekocht und mit Hopfen versetzt, sodass sich dessen Aromastoffe lösen. Das Kochen bewirkt auch, dass die Bierwürze keimfrei wird. Nach Klärung der Bierwürze wird durch Abkühlen und Zusatz von Hefe der Gärprozess eingeleitet. Bei der Gärung wird Malzzucker in Alkohol und Kohlensäure umgewandelt. Die weitere Behandlung des bei der Bierherstellung in großen Mengen anfallenden Trebers stellt vor allem für kleine und mittelständische Brauereien ein Problem dar. Der aus dem Läuterbottich entnommene Biertreber weist eine kurze mikrobiologische Haltbarkeit von nur wenigen Tagen auf. Der Biertreber wird als Futtermittel in der Milchviehwirtschaft und der Rindermast, als Dünger, für die Strom- und Wärmegewinnung mittels Biogasanlagen und in getrocknetem Zustand für die Wärmeerzeugung durch Verbrennung in Kombination mit Holzhackschnitzeln genutzt. Bereits bekannt ist die Produktion von Proteinen für die menschliche Ernährung mithilfe von Pilzen. So wurden beispielsweise Hefen für die Proteinherstellung eingesetzt. Unter dem Handelsnamen Quorn™ wird ein aus dem fermentierten Mycel des Schimmelpilzes (Ascomyceten) Fusarium venenatum hergestelltes Fleischersatzprodukt vermarktet.

In Indonesien wird durch Beimpfung gekochter Sojabohnen mit verschiedenen Rh/zopus-Arten das traditionelle Fermentationsprodukt „Tempeh" erzeugt. Bei den Pilzen handelt es sich um Schimmelpilze aus der Abteilung der Jochpilze. Die fermentierte Masse wird in Stücke geschnitten, gebraten und verzehrt. Durch die Fermentation werden die Proteine der Sojabohnen aufgewertet und verdauungsschädliche Bestandteile abgebaut.

Seit einigen Jahren gibt es Bestrebungen, klassische Speisepilze aus der Klasse der Basidiomyceten für die Produktion von Proteinen und/oder Aromastoffen einzusetzen, da diese einen hohen Proteinanteil aufweisen, vielfältige Aromen ausbilden und das Pilzprotein eine hohe biologische Wertigkeit aufweist.

In einem Fachartikel ist die Herstellung von Proteinen durch Fermentation von Nebenströmen aus der Nahrungsmittelindustrie mittels Basidiomyceten beschrieben (Zorn, H. et al. Upcycling of Food Industry Side Streams by Basidiomycetes for Production of a Vegan Proteine Source, International Journal of Recycling of Organic Waste in Agriculture 2019, 8:447 - 445). Der Nährwert von Apfeltrester wurde durch Fermentation mit dem Pilz Pleurotus sapidus stark erhöht und die resultierende Biomasse wurde als geeignete alternative Proteinquelle angesehen. Der Aminosäureanteil wurde von ungefähr 5% beim Apfeltrester auf 24% beim fermentierten Apfeltrester erhöht und der fermentierte Apfeltrester wies eine hohe biologische Wertigkeit von 86 auf und hierdurch wird ein guter Nährwert für Menschen indiziert.

In einem weiteren Fachartikel (Zorn, H. et al. Characterization of the Nutritional Composition of a Biotechnologically Produced Oyster Mushroom and its Physiological Effects in Obese Zucker Rats, Mol. Nutr. Food Res. 2020, 64) sind physiologische (antisteatotische und entzündungshemmende) Effekte einer Nährstoffzusammensetzung eines biotechnologisch produzierten Austernpilzes bei Untersuchungen am Rattenmodell beschrieben.

In einem Fachartikel (Eliopoulos, C. et al. Conversion of brewers' spent grain into proteinaceous animal feed using solid state fermentation, Environmental Science and pollution research, Springer Berlin Heidelberg, Bd. 29, Nr. 20, 23. Juli 2021, Seiten 29562-29569) ist die Biokonversion von Biertreber in proteinhaltiges Tierfutter durch Fermentation mittels des Speisepilzes Pleurotus ostreatus beschrieben.

Die WO 2019/0164707 Al beschreibt in der Einleitung vegetarische proteinreiche Produkte, die auf Sojaprotein basieren. Diese weisen keinen fleischähnlichen Geschmack oder Textur auf, insbesondere wenn sie auf gepresstem Soja basieren. Das Imitieren der Faserstruktur erfolgt mithilfe von Weizengluten, welches jedoch als Allergen zu Unverträglichkeiten führen kann. In dieser Schrift wird als Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines vitamin- und proteinreichen Produktes angegeben, bei dem eine Art aus der Abteilung der Basidiomycota submers in einem Nährmedium, enthaltend zumindest einen kohlenhydrathaltigen Agrarnebenstrom oder Lebensmittelnebenstrom, kultiviert wird. Hierdurch wird ein erstes Kultivierungsprodukt erhalten, dem eine Vitamin B12 produzierende Art der Gattung Propionibacterium und/oder der Gattung Lactobacillus zugegeben wird, um ein vitamin- und proteinhaltiges zweites Kultivierungsprodukt zu erhalten. Das vitamin- und proteinreiche Produkt kann als Bestandteil eines Nahrungsmittels verwendet werden. Das Nahrungsmittel kann ein getreidehaltiges Erzeugnis sein, bei dem das vitamin- und proteinreiche Produkt als Ersatzstoff für Gluten eingesetzt wird und die Textur des Nahrungsmittels verbessert.

Ein weiterer Fachartikel (Wang, D. et al. Biological efficiency and nutritional value of Pleurotus ostreatus cultivated on spent beer grain, Bioresource Technology, Bd. 78, 1. Januar 2001, Seiten 293-300) beschreibt die biologische Wirksamkeit und den Nährwert einer Kultur von Pleurotus ostreatus auf Biertreber.

In der WO 2013/034613 A2 ist ein Verfahren zur Herstellung eines Getränks oder einer Getränkebase beschrieben, bei dem in wenigstens einem Fermentationsprozess ein Medium fermentiert wird, das pumpbar ist, und bei dem der Fermentationprozess aerob durchgeführt wird, wobei das Medium durch Mycel von wenigstens einem Basidiomyceten fermentiert wird. Bei einem Ausführungsbeispiel wird ungehopfte Bierwürze mit dem Mycel der Basidiomyceten Ischnoderma benzoinum, Tyromyces chioneus und Wolfiporia cocos fermentiert. Das Mycel des Basidiomyceten wird durch Zentrifugieren abgetrennt und die restliche Probe sensorisch beurteilt. Es wird festgestellt, dass nach aerober Fermentation von ungehopfter Bierwürze ansprechend riechende und gut schmeckende Getränke erhalten werden, die sich deutlich von nicht fermentierter Bierwürze unterscheiden. Diese Verwendung der Bierwürze für die Getränkeherstellung konkurriert mit ihrer Verwendung für die Bierherstellung.

Davon ausgehend liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Herstellen von Proteinen mit hoher biologischer Wertigkeit zu schaffen, das ein Nährmedium enthaltend eine Stofffraktion aus der Nahrungsmittelindustrie verwendet.

Die Aufgabe wird durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1 gelöst. Vorteilhafte Ausführungsarten des Verfahrens sind den Unteransprüchen und in der nachfolgenden Beschreibung angegeben.

Das erfindungsgemäße Verfahren zum Herstellen von Proteinen umfasst die folgenden Schritte:

• Bereitstellen eines Nährmediums (Umsetzungsmediums, Mediums), enthaltend einen Treber aus der Herstellung von Bier oder eines anderen Getränkes auf der Basis von Getreide,

• Zusammenbringen des Nährmediums mit mindestens einem Pilz aus der Abteilung der Ständerpilze (Basidiomyceten), der imstande ist, auf dem Umsetzungsmedium eine Mischung von Proteinen zu bilden,

• Umsetzung des Trebers zu der Mischung von Proteinen mithilfe des Pilzes.

Mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens wird erstmals eine Stofffraktion mit hohem Feststoffgehalt aus der Maische eines Brauprozesses oder eines anderen Verfahrens zum Herstellen von Getränken auf der Basis von Getreide für die Herstellung eines protein- und/oder aromastoffhaltigen Produktes mit Hilfe von Pilzen aus der Klasse der Basidiomyceten herangezogen. Bei den herkömmlichen Verfahren zum Herstellen von Bier oder anderen Getränken über eine Maische aus vermälztem und/oder unvermälztem Getreide wird das Getreide nur teilweise zu für den Menschen verwertbaren Stoffen verarbeitet. So bauen die beim Bierbrauen verwendeten Hefen das vermälzte Getreide nur teilweise in für den Menschen verdaubare Stoffe um. Die Erfindung macht sich zu Nutze, dass die beim Bierbrauen nicht von den Hefen verwertbaren Bestandteile wie Zellulose und Hemizellulose mit Hilfe von Basidiomyceten zu vom Menschen verdaubaren Proteinen umgewandelt werden können. Dabei ist von Vorteil, dass die dem Verfahren zugeführten Ausgangsstoffe von einer für die Herstellung von Bier oder anderen Getränken geeigneten Qualität sind, sodass sie sich grundsätzlich auch für die Herstellung von Lebensmitteln und von anderen vom Menschen zu konsumierenden Produkten eignen. Bei dem Verfahren wird die Maische in eine erste Stofffraktion mit geringem Feststoffgehalt (z.B. Bierwürze) und in eine zweite Stofffraktion mit hohem Feststoffgehalt (z.B. Biertreber) fraktioniert, die erste Stofffraktion für die Herstellung von Bier oder anderen Getränken und die zweite Stofffraktion für die Herstellung von proteinreichem Pilzmycel eingesetzt. Das proteinreiche Pilzmycel enthält verschiedene Proteine als Bestandteil der Zellen. Bei der herkömmlichen Bierherstellung wird die beim Abläutern der Bierwürze anfallende Stofffraktion mit hohem Feststoffgehalt als Biertreber in großen Silos zwischengelagert und überwiegend zur Verwendung als Tierfutter an die Agrarwirtschaft abgegeben. Die Stofffraktion mit hohem Feststoffgehalt ist jedoch aufgrund ihrer Herstellung unter Verwendung von für die Erzeugung von Nahrungsmitteln geeigneten Einsatzstoffen, ihrer stofflichen Zusammensetzung, ihres großen Mengenanteils und ihrer einheitlichen Zusammensetzung und grundsätzlich hohen Qualität besonders für die Herstellung von Proteinen für die Aufnahme durch den Menschen geeignet.

Basidiomyceten (Ständerpilze) umfassen die für den Menschen zum Verzehr geeigneten essbaren Ständerpilze. Sie verfügen über ein sehr breites biochemisches Transformationspotential und unterscheiden sich hierdurch von niederen Pilzen und Bakterien. Erfindungsgemäß wird dieses Potential dafür genutzt, Proteine mit einer hohen biologischen Wertigkeit zur Verfügung zu stellen.

Basidiomyceten sind in der Lage, proteinreiche Pilzmycelien zu bilden, deren Proteine eine hohe biologische Wertigkeit aufweisen können. Untersuchungen im Rahmen der Erfindung haben gezeigt, dass mittels Basidiomyceten fermentierter Treber eine besonders hohe biologische Wertigkeit von über 90 aufweist und deshalb besonders gut vom Menschen verwertet werden kann. Die biologische Wertigkeit der Pilzproteine ist mit der von Rindfleisch vergleichbar und weitaus größer als bei pflanzlichen Proteinen oder fermentiertem Apfeltrester.

Die biologische Wertigkeit ist ein Maßstab für die Beurteilung der Proteinqualität und gibt an, wie viel g Körperprotein durch 100 g des betreffenden Nahrungsproteins aufgebaut werden können.

Ein weiterer Vorteil des Verfahrens ist, dass es Biokonversionsraten von mindestens 10% aufweist. Es wird erwartet, dass Biokonversionsraten von bis zu 90 % erreicht werden können. Die Biokonversionsrate gibt den Anteil des Kultursubstrats an, der mit Hilfe des Pilzes aus der Abteilung der Basidiomycota zu dem proteinreichen Pilzmycel verstoffwechselt wird. Zudem können die Fermentationsprodukte von Basidiomyceten Aromastoffe mit vielfältigen Geschmacks- und/oder Geruchsaromen enthalten, beispielsweise Aromastoffe z.B. mit Frucht-, Beeren-, Kräuter-, Gewürz-, fleischigen und/oder fischigen Aromanoten. Untersuchungen im Rahmen der Erfindung haben gezeigt, dass bei der Fermentation von Treber mittels Basidiomyceten besonders ansprechende Aromastoffe erzeugt werden. Darüber hinaus können die Fermentationsprodukte für die Ernährung des Menschen wichtige Vitamine enthalten, die im Getreide nicht vorkommen.

Als Aromastoffe werden flüchtige Verbindungen in Lebensmitteln bezeichnet, die mit den Geruchsrezeptoren wahrgenommen werden können. Die Aromastoffe gelangen entweder direkt durch die Nase (Riechen, nasale Wahrnehmung) oder über den Rachenraum beim Essen oder Trinken (retronasale Wahrnehmung) zu den Rezeptoren. Die Aromastoffe sind zusammen mit definitionsgemäß nicht flüchtigen Geschmacksstoffen (sauer, süß, bitter, salzig oder umami schmeckende Verbindungen) maßgeblich am Aroma eines Lebensmittels beteiligt. Die Textur trägt ebenfalls zum sensorischen Gesamteindruck („Flavour") bei. Infolge moderner Methoden zur Isolierung und Identifizierung flüchtiger Verbindungen in Lebensmitteln sind inzwischen in der Literatur über 7.000 Aromastoffe beschrieben (vgl. Hartmann-Schreier J., Aromastoffe, RD-01-03286 [2003] in Böckler F., Dill B., Eisenbrand G., Faupel F., Fugmann B., Gämse T., Matissek R., Pohnert G., Rühling A., Schmidt S., Sprenger G., Römpp (Online), Stuttgart, Georg Thieme-Verlag, [März 2023]). Durch das Verfahren werden wertvolle Rohstoffe für die Herstellung von Bier oder anderen Getränken auf der Basis von Getreide zusätzlich für die Herstellung von ernährungsphysiologisch, gustatorisch und olfaktorisch besonders wirksamen und interessanten Produkten genutzt. Neben den vorgenannten vorteilhaften Effekten können mittels Basidiomyceten hergestellte protein- und/oder aromastoffhaltige Pilzmycele entzündungshemmende oder andere gesundheitsfördernde Wirkungen haben.

Untersuchungen im Rahmen der Erfindung haben ergeben, dass der Glutengehalt des mittels Basidiomyceten fermentierten Trebers stark gegenüber dem Glutengehalt des Trebers abgebaut wurde. Aufgrund von Untersuchungen über das Ausmaß der Biokonversion verschiedener Substrate durch Pilze aus der Klasse der Basidiomyceten ist zu erwarten, dass Basidiomyceten generell die Eigenschaft haben, in einem Nährsubstrat (Nährstoffquelle) enthaltenes Gluten in erheblichem Ausmaß abzubauen. Insbesondere ist zu erwarten, dass Basidiomyceten, die in einem Biertreber enthaltenden Nährmedium oder auf Biertreber als Nährmedium wachsen, Gluten in erheblichem Maße abbauen. Diese Basidiomyceten sind offenbar in der Lage, das Gluten aus dem Nährsubstrat für den Aufbau des proteinreichen Pilzmycels zu verwerten.

Der CO2-Fußabdruck der Proteinherstellung ist weitaus kleiner als bei der Fleischerzeugung. Die Ökobilanz des Gesamtverfahrens ist besser als die Gesamtbilanz der herkömmlichen Herstellung von Bier oder anderer Getränke auf der Basis von Getreide und der Herstellung von bekömmlichen Produkten, die von den protein- und/oder aromastoffhaltigen Produkten substituiert werden. Gemäß einer Ausführungsart ist der Ständerpilz ausgewählt aus der nachfolgenden Gruppe von Pilzen: Cyclocybe aegerita, Pholiota nameko, Pleurotus eryngii.

Untersuchungen haben ergeben, dass die vorgenannten Basidiomyceten gut submers in Nährmedien wachsen, die Treber auf Basis von glutenhaltigem Getreide als Kohlen- und Stickstoffquelle enthalten. Da der Treber auf der Verarbeitung von glutenhaltigem Getreide (z.B. Roggen oder Weizen) beruht, enthält er Gluten in erheblichem Ausmaß. Deshalb ist davon auszugehen, dass für sämtliche obigen Pilze gilt, dass diese bei der Verstoffwechslung des Trebers zu proteinreichem Pilzmycel Gluten in erheblichem Ausmaß abbauen.

Ein Fachmann ist in der Lage, anhand des allgemeinen Fachwissens und ohne unzumutbaren Aufwand Basidiomyceten zu finden, die in Nährmedien oder auf Nährmedien wachsen, die eine Stofffraktion aus der Herstellung von Bier oder einem anderen Getränk auf der Basis von glutenhaltigem Getreide (z.B. Treber) enthalten und Gluten des Nährmediums abbauen. Für die Feststellung, dass Basidiomyceten Gluten abbauen, kann sich der Fachmann insbesondere der am Ende der Beschreibung beschriebenen Methoden zur Bestimmung des Glutengehaltes bedienen.

Gemäß einer Ausführungsart ist der Ständerpilz ausgewählt aus derselben Gattung, derselben Familie oder derselben Ordnung wie Cyclocybe aegerita, Pholiota nameko oder Pleurotus eryngii. Für Pilze derselben Gattung, Pilze derselben Familie oder Pilze derselben Ordnung ist zu erwarten, dass sie in der Lage sind, in Nährmedien enthaltend Treber oder ein anderes Nährsubstrat auf der Basis von Getreide zu wachsen und Gluten aus dem Nährsubstrat abzubauen. Mit diesen Basidiomyceten können Proteinmischungen mit hoher biologischer Wertigkeit, attraktiven Aromaprofilen und geringen Glutenanteilen erreicht werden.

Gemäß einer Ausführungsart ist der Ständerpilz ein Ständerpilz mit der Eigenschaft, bei der Verstoffwechselung zu proteinreichem Pilzmycel eines Nährsubstrats bestehend aus oder bestehend im Wesentlichen aus mindestens einer Stofffraktion aus der Herstellung von Bier oder einem anderen Getränk auf der Basis von glutenhaltigem Getreide, insbesondere Treber, Gluten in erheblichem Maße abzubauen. Das Nährsubstrat enthält Gluten, da es auf glutenhaltigem Getreide basiert.

Gemäß einer weiteren Ausführungsart ist der Treber ein Treber aus der Herstellung von Bier (Biertreber) oder einem anderen Getränk auf der Basis von Getreide, insbesondere ein Treber aus der Whiskyherstellung.

Gemäß einer weiteren Ausführungsart weist die Mischung von Proteinen eine biologische Wertigkeit von mindestens 94, vorzugsweise mindestens 97 auf.

Gemäß einer weiteren Ausführungsart enthält die Mischung von Proteinen mindestens einen Aromastoff oder Mischung von Aromastoffen, der mindestens eine Verbindung enthält, die aus der Stoffklasse der Terpene (z.B. Linalool, Linaloooxid, (E)-Nerolidol), der Carbonyle (z.B. l-Octen-3-on, Zimtaldehyd), der Lactone (z.B. gamma-Nonalacton) und der Alkohole (z.B. 1-Hexanol, 2-Methyl-3- buten-2-ol) ausgewählt ist. Gemäß einer weiteren Ausführungsart ist der Ständerpilz ausgewählt aus einer Gruppe von Ständerpilzen mit der Eigenschaft, Gluten des Nährmediums abzubauen. Gemäß einer weiteren Ausführungsart ist der Ständerpilz ausgewählt aus einer Gruppe von Ständerpilzen mit der Eigenschaft, den Glutenanteil des Nährmediums um mindestens 90% abzubauen. Gemäß einer weiteren Ausführungsart ist der Ständerpilz ausgewählt aus einer Gruppe von Ständerpilzen mit der Eigenschaft, den Glutenanteil des Nährmediums abzubauen, sodass der Glutenanteil im durch Fermentation erhaltenen Produkt geringer ist als im Nährsubstrat vor der Fermentation. Der Abbau des Glutens bezieht sich auf den Glutenanteil im durch Fermentation erhaltenen Produkt im Vergleich zum Glutenanteil im nicht fermentierten Nährsubstrat.

Gemäß einer weiteren Ausführungsart ist der Ständerpilz ausgewählt aus einer Gruppe von Ständerpilzen mit der Eigenschaft, den Glutenanteil des Nährmediums abzubauen, sodass der Glutenanteil im Pilzmycel geringer als im Treber vor der Fermentation ist. Gemäß einer weiteren Ausführungsart ist der Ständerpilz ausgewählt aus einer Gruppe von Ständerpilzen mit der Eigenschaft, den Glutenanteil des Nährmediums abzubauen, dass der Glutenanteil im Pilzmycel um mindestens 90% geringer als im Treber vor der Fermentation ist.

Gemäß einer weiteren Ausführungsart enthält das flüssige oder feste Nährmedium ausschließlich Treber auf Basis von Getreide als Nährstoffquelle. Untersuchungen haben ergeben, dass der Glutenanteil des fermentierten Trebers um mindestens 90% geringer als im Treber vor der Fermentation ist. Gemäß einer weiteren Ausführungsart enthält das Nährmedium im Wesentlichen Treber auf Basis von Getreide als Nährsubstrat. Für ein Nährmedium, das im Wesentlichen Treber als Nährsubstrat enthält, ist zu erwarten, dass der Glutenanteil des durch Fermentation erhaltenen Produkts in einem ähnlichen Ausmaß reduziert ist, wie wenn Nährmedium, das ausschließlich Treber als Nährstoffquelle enthält. Gemäß einer weiteren Ausführungsart ist der Treber ein Biertreber. Gemäß einer weiteren Ausführungsart enthält das Nährmedium als Nährsubstrat Treber auf Basis von glutenhaltigem Getreide und mindestens eine weitere Stofffraktion, die beim Mälzen, Brauen von Bier oder Herstellen eines anderen Getränks auf der Basis von glutenhaltigem Getreide anfällt, z.B. vermälztes und/oder unvermälztes Getreide, Bierwürze, Prozessbier, Schlempe. Da die weitere Stofffraktion ebenfalls auf glutenhaltigem Getreide basiert, ist davon auszugehen, dass diese ebenfalls einen Glutenanteil aufweist, der durch Fermentieren mittels der Basidiomyceten in ähnlichem Ausmaß abgebaut wird, wie beim Fermentieren von Treber auf Basis von glutenhaltigem Getreide. Gemäß einer weiteren Ausführungsart wird dem Nährmedium Prozesswasser und/oder Bierhefe zugesetzt.

Gemäß einer weiteren Ausführungsart weist die Mischung von Proteinen einen Gliadingehalt von maximal 0,5 g/100 g auf. Dies entspricht nach Codex Alimentarius einem Glutengehalt von maximal 1 g/100 g. Gliadin ist ein wesentlicher Bestandteil des Glutens und kann zum quantitativen Nachweis von Gluten mittels standardisierter Tests (Assays) herangezogen werden. Messungen haben ergeben, dass der Gliadingehalt des Trebers durch die Fermentation stark abgebaut wurde. Erreicht wurde ein Glutenabbau von über 98% bezogen auf die Trockenmasse. Durch Verarbeitung der Proteinmischung in einer Lebensmittelzusammensetzung ist es möglich, den Grenzwert für Glutenfreiheit von 20 mg/kg zu unterschreiten. Es ist zu erwarten, dass durch Optimierung des Herstellungsverfahrens der Glutenabbau noch gesteigert werden kann. Gemäß einer weiteren Ausführungsart besteht das Nährmedium aus Treber oder im Wesentlichen aus Treber. In der Regel weist unter den für die Herstellung von Proteinen und/oder Aromastoffen geeigneten Stofffraktionen bei der Herstellung von Bier oder anderen Getränken auf der Basis von Getreide die beim Maischen anfallende Stofffraktion mit dem hohen Feststoffgehalt (Treber) den größten Anteil auf, sodass ihre Biokonversion zu protein- und/oder aromastoffhaltigem Pilzmycel besonders effizient ist. Für die Umsetzung zu einer Proteinmischung können aber auch weitere Stofffraktionen aus der Getränkeherstellung zusätzlich verwendet werden.

Gemäß einer weiteren Ausführungsart umfasst das Nährmedium neben dem Biertreber einen weiteren Nebenstrom aus einem Verfahren der Herstellung von Bier oder eines anderen Getränks. Gemäß einer weiteren Ausführungsart wird zusätzlich vermälztes und/oder unvermälztes Getreide aus dem Mälzereiprozess für die Proteinherstellung eingesetzt. Beispielsweise können Überschussmengen von vermälztem und/oder unvermälztem Getreide eingesetzt werden.

Gemäß einer weiteren Ausführungsart wird für die Herstellung der Proteinmischung zusätzlich mindestens eine der Stofffraktionen Bierwürze, Prozessbier oder Schlempe eingesetzt. Das hierfür eingesetzte Prozessbier ist beispielsweise verdünnte Würze oder verdünntes Bier. Gemäß einer weiteren Ausführungsart wird dem Nährmedium Bierhefe und/oder Prozesswasser zugesetzt. Die hierfür eingesetzte Bierhefe ist beispielsweise überschüssige Hefe oder Althefe. Gemäß einer weiteren Ausführungsart ist das Nährmedium flüssig oder fest. Gemäß einer weiteren Ausführungsart ist in einem flüssigen Nährmedium die Stofffraktion aus der Herstellung von Bier oder einem anderen Getränk auf der Basis von glutenhaltigem Getreide in Wasser oder in einem wässrigen Medium enthalten. Ein flüssiges Nährmedium ist beispielsweise durch eine Dispersion von Biertreber in Wasser oder einem wässrigen Medium gebildet. Gemäß einer weiteren Ausführungsart ist ein festes Nährmedium durch mindestens eine feste Stofffraktion aus der Herstellung von Bier oder einem anderen Getränk auf der Basis von glutenhaltigem Getreide gebildet. Die feste Stofffraktion kann auch einen mehr oder weniger hohen Wasseranteil umfassen. Beispielsweise ist das feste Nährmedium ein Biertreber.

Gemäß einer weiteren Ausführungsart wird die Umsetzung in einer Submers-Kultur durchgeführt. Hierbei wird die Fermentation innerhalb der Dispersion aus der eingesetzten Stofffraktion und dem Inokulat in der wässrigen Phase durchgeführt. Diese Submers-Fermentation ist vorteilhaft für die Kombination mit einem Brauprozess, weil dieser im industriellen Maßstab überwiegend mit flüssigen bzw. pumpfähigen Medien in Misch-, Reaktions- und Lagerbehältern und diese verbindenden Rohrleitungen, in Pumpen und sonstigen Fördereinrichtungen durchgeführt wird. Alternativ wird das inokulierte Nährmedium emers fermentiert.

Gemäß einerweiteren Ausführungsart wird das Nährmedium vor der Umsetzung mit Wasser verdünnt, vorzugsweise mit Prozesswasser aus der Herstellung des Getränks. Hierdurch wird die Pumpfähigkeit des Nährmediums verbessert und das Prozesswasser kann einer Verwertung zugeführt werden. Das Prozesswasser muss für den vorliegenden Pilz-Prozess zwingend Lebensmittel- bzw. Trinkwasserqualität haben.

Gemäß einer weiteren Ausführungsart wird das Proteine und/oder Aromastoffe enthaltende Pilzmycel als Endprodukt verwendet, beispielsweise als Lebensmittel oder Nutraceutical, d.h. als Lebensmittel mit pharmazeutischem Zusatznutzen.

Gemäß einerweiteren Ausführungsart werden die Proteine zumindest teilweise vom Pilzmycel abgetrennt, vorzugsweise durch Extraktion. Die abgetrennten Stoffe werden beispielsweise direkt als Endprodukt verwendet oder mit anderen Stoffen zu Endprodukten verarbeitet.

Ferner betrifft die Erfindung eine proteinreiche Zusammensetzung herstellbar nach dem Verfahren eines der vorhergehenden Ansprüche. Der Zusammensetzung kommen die zu dem Verfahren angegebenen Vorteile entsprechend zu. Dies gilt auch für die nachfolgenden Ausführungsarten der Zusammensetzung.

Gemäß einer weiteren Ausführungsart weist die Zusammensetzung eine biologische Wertigkeit von mindestens 94, vorzugsweise von mindestens 97 auf.

Gemäß einer weiteren Ausführungsart umfasst die Zusammensetzung einen Aromastoff oder eine Mischung von Aromastoffen, die zumindest eine Verbindung enthält, die aus der Stoffklasse derTerpene (z.B. Linalool, Linaloooxid, (f)-Nerolidol), der Carbonyle (z.B. l-Octen-3-on, Zimtaldehyd), der Lactone (z.B. gamma- Nonalacton) und der Alkohole (z.B. 1-Hexanol, 2-Methyl-3-buten-2-ol) ausgewählt ist ausgewählt ist. Gemäß einer weiteren Ausführungsart enthält die Zusammensetzung maximal 0,5 g/100 g Gliadin.

Ferner betrifft die Erfindung eine der Ernährung, dem Genuss oder der Gesundheitsförderung dienende Zubereitung umfassend oder bestehend aus einer Zusammensetzung einer der vorbeschriebenen Arten. Der Zubereitung kommen die für die Zusammensetzung beschriebenen vorteilhaften Wirkungen entsprechend zu. Die biologische Wertigkeit, die Aromastoffe und der Gliadingehalt der Zubereitung setzen sich aus den Werten der Zusammensetzung und gegebenenfalls weiterer Komponenten der Zubereitung zusammen.

Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung einer Zusammensetzung als eine der vorbeschriebenen Arten in einer der Ernährung, dem Genuss oder der Gesundheitsförderung dienenden Zubereitung, vorzugsweise als Protein- oder Aromastoffmischung. Der Verwendung kommen die für die Zubereitung beschriebenen Vorteile entsprechend zu.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsart wird die Zusammensetzung zur Herstellung eines Fleischersatzproduktes verwendet.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand einer experimentellen Untersuchung mit ausgewählten Basidiomyceten unter Bezug auf die anliegenden Diagramme (Abb. 1 bis 8) näher erläutert. Die Angaben zur Kultivierung (Pilzstämme, Stammhaltung, Vorkulturen, Hauptkulturen) können mit den entsprechenden Anpassungen für die Übertragung des Verfahrens vom Labormaßstab auf den technischen Maßstab verwendet werden.

Material und Methoden

Organismen

Die für die Arbeiten verwendeten Basidiomyceten sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Tabelle 1: Verwendete Basidiomyceten.

Substrate

Die Treber von Weizen- und Pilsener Bier wurden von der Störtebeker Braumanufaktur zur Verfügung gestellt. Die Treber wurden im Thermomix® homogenisiert und bis zur Verwendung bei -20 °C gelagert. Die Trockenmasse der Biertreber betrug ca. 20%, für die Medien wurde dieser feucht eingesetzt.

Der Lupinenklarlauf 1 sowie Lupinenklarlauf S4 wurden von der Firma PROLupin geliefert, gefroren, bei -20 °C gelagert und vor der Verwendung durch Schütteln homogenisiert. Der Trockenmassegehalt des Lupinenklarlaufs 1 betrug 2,8 g/L, der von S40,12 g/L.

Kultivierung

Die Kultivierung erfolgte unter sterilen Bedingungen. Alle im Folgenden beschriebenen Medien wurden vor der Verwendung für 20 min bei 121 °C autoklaviert. Die Kulturführung fand unter Lichtausschluss bei 24 °C statt. Submerskulturen wurden bei 150 rpm geschüttelt.

Stammhaltung

Die Stammhaltung der verwendeten Basidiomyceten erfolgte in Emerskulturen auf Malzextrakt-Agar-Platten (MEA; 20 g/L Malzextrakt und 15 g/L Agar-Agar in vollentsalztem Wasser (VE-Wasser)). Es wurden jeweils 0,25 cm ² frisches Mycel aus einer zu 80% bewachsenen Agarplatte ausgestochen und auf eine neue Platte transferiert. Dieser Vorgang wurde jeweils bei einem Bewuchs von 80% der Agarplatten wiederholt.

Vorkulturen

Die Vorkulturen wurden in Malzextraktmedium angesetzt. Als Medium diente 20 g/L Malzextrakt in VE-Wasser. Die Kulturen wurden in Erlenmeyerkolben kultiviert, welche zu 40% ihres Volumens mit flüssigem Medium gefüllt wurden. Es wurden 0,25 cm ² frisches Mycel einer zu 80% bewachsenen Agarplatte ausgestochen, in das Medium überführt und mittels Ultra-Turrax Dispergiergerät für 30 s homogenisiert. Die Vorkultur wurde für sieben Tage kultiviert.

Hauptkulturen

Die Hauptkulturen wurden ebenfalls in Erlenmyerkolben mit 40 Vol.-% Medium gezüchtet. Die Zusammensetzung der Fed-Batch Medien für P. eryngii ist in Tabelle 2 aufgeführt. Für diese Medien wurde Weizenbiertreber in den angegebenen Mengen verwendet und das Medium anschließend mit Lupinenklarlauf 1 ad 40 Vol.- % aufgefüllt. Die Trockenmasse des Lupinenklarlaufs wurde hierbei nicht beachtet.

Tabelle 2: Zusammensetzung der Fed-Batch Medien für die Kultivierung von P. eryngii.

Für die Kultivierung von P. nameko in Weizenbier- und Pilsener-Treber-Medien wurden jeweils 20 g/L Trocken masse der homogenisierten Treber eingesetzt und mit Trinkwasser ad 40 Vol.-% im Kolben aufgefüllt.

C. aegerita wurde in 20 gTrockenmasse Pilsener-Treber pro Liter mit Lupinenklarlauf S4 ad 40 Vol.-% des Kolbens kultiviert und nach einer Woche geerntet. Die Inokulation der Hauptkulturmedien erfolgte nach zweimaligem Waschen der homogenisierten Vorkulturen. Die Homogenisierung erfolgte analog zur Inokulation der Vorkulturen mittels Ultra-Turrax Dispergiergerät. Die Vorkulturen von P. eryngii wurden mit VE-Wasser gewaschen, die von P. nameko mit Trinkwasser.

Ernte des Mycels

Nach Ende der jeweiligen Kultivierungsdauer wurde der Inhalt der Erlenmeyerkolben in ausgewogene Zentrifugenröhrchen überführt und für 10 min bei 3.500 g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Zentrifugenröhrchen erneut gewogen, um die Biofeuchtmasse zu bestimmen. Diese wurde anschließend gefriergetrocknet. Die Zentrifugenröhrchen wurden erneut gewogen, um die Biotrockenmasse zu ermitteln. Für die weiteren Analysen wurden die Mycelien mittels RETSCH-Kugelmühle gemahlen und zu Pulver weiterverarbeitet.

Analytik

Bestimmung der Biomasse

Die Biotrockenmasse der Kulturen wurde aus der Differenz des getrockneten Mycels im Zentrifugenröhrchen und dem leeren Zentrifugenröhrchen gebildet.

Bestimmung der Restfeuchte

Das gefriergetrocknete Mycel wurde mittels IR-Feuchtebestimmer analysiert, um die Restfeuchte zu bestimmen. In der Regel wurde die Bestimmung nach Herstellerangaben im Duplikat durchgeführt, wenn nicht genug Mycel vorhanden war, wurde eine Einfachbestimmung durchgeführt.

Glutenanalyse

Für die Glutenanalysen wurden je eine Probe des Pilsener-Trebers und der geernteten Masse von Kulturtag sieben von C. aegerita gefriergetrocknet und mittels RETSCH Kugelmühle homogenisiert. Die Gluten-Analytik erfolgte mittels eines kompetitiven ELISA-Kits. Die Probe des Trebers wurde 1:10.000, die des Mycels 1:1.000 verdünnt.

Bestimmung des Aminosäureprofils

Die Hydrolyse der Proben zur Aminosäureanalytik erfolgte auf drei unterschiedliche Weisen. Zum einen mittels saurer Total hydrolyse, bei der Tryptohan, Cystein und Methionin nicht erfasst werden. Für die Bestimmung von Cystein und Methionin wurde ein oxidativer Aufschluss durchgeführt, damit diese als Cysteinsäure und Methioninsulfon bzw. Methioninsulfoxid analysiert werden können. Für die Bestimmung von Tryptophan wurde eine basische Hydrolyse durchgeführt. Bestimmung von Cystein und Methionin nach Oxidation

Zu Beginn wurde die Oxidationslösung für eine Stunde bei Raumtemperatur und anschließend für 15 min im Eisbad inkubiert. Von der Oxidationslösung wurden pro Probe 0,5 mL benötigt, welche sich aus 0,05 mL Wasserstoffperoxid (wt=30%) und 0,45 mL Ameisensäure (889 g Ameisensäure, 111 mL VE-Wasser und 4,73 g Phenol) zusammensetzt. Die Proben wurden in ein Zentrifugenröhrchen eingewogen und im Eisbad gekühlt. Je 0,5 mL der Oxidationslösung wurden zu den Proben gegeben und diese anschließend für 16 h im Eisbad bei 4 °C inkubiert.

Die Oxidation wurde durch die Zugabe von 84 mg Natriumdisulfit gestoppt. Anschließend wurden 2,5 mL phenolhaltige Salzsäure (6 M, 0,1% Phenol) hinzugegeben und die Proben wurden weitere 24 h inkubiert.

Bestimmung der Gesamtaminosäuren nach saurer Hydrolyse

Die Proben wurden in Zentrifugenröhrchen eingewogen und mit 2,5 mL Salzsäure (6 M, 0,1% Phenol) versetzt. Die Inkubation erfolgte analog zur Bestimmung von Cystein und Methionin nach der Oxidation. Die Hydrolyse wurde durch Zugabe von Natronlauge (7,5 M) gestoppt und der pH-Wert auf 2,2 eingestellt. Anschließend wurden die Proben ad 20 mL mit dem Citratpuffer aufgefüllt, filtriert und vermessen. Bestimmung von Tryptophan nach alkalischer Hydrolyse

Die Proben wurden in Zentrifugenröhrchen eingewogen und mit 2,5 mL phenolischer Natronlauge (5 M, 0,1% Phenol) versetzt. Die Inkubation erfolgte analog zur sauren Hydrolyse bei 110 °C für 24 h, davon die erste Stunde mit leicht geöffnetem Deckel und 23 h mit fest verschlossenem Deckel. Nach dem Abkühlen der Proben wurde 1 mL Phosphorsäure (0,5 M) hinzugefügt, der pH-Wert auf 2,2 eingestellt und die Proben ad 20 mL in Messkolben mit Citratpuffer aufgefüllt. Vor der Analyse wurden die Proben membranfiltriert.

Aminosäureanalysator

Die freigesetzten Aminosäuren wurden an einer Kationenaustauschersäule getrennt und mittels Nachsäulenderivatisierung mit Ninhydrin bei 570 nm beziehungsweise 440 nm für Prolin detektiert (Tabelle 3 - 4). Die Analyse erfolgt mittels Aminosäureanalysator S433 (SYKAM Vertriebs GmbH). Die Kalibration erfolgte über eine Einpunktkalibration.

Tabelle 3: Geräteparameter der Aminosäureanalytik. Software Chromstar 7.14

Tabelle 4: Geräteparameter der Tryptophananalyse.

Gaschromatographie

Für die Bestimmung des Aromaprofils der Kulturen von P. nameko in Weizen- und Pilsener-Treber wurde an den jeweiligen Kulturtagen ein Aliquot von 4 mL des Kulturüberstandes steril in eine 20 mL Vial überführt, mittels Solid Phase Microextraction (SPME) extrahiert und mittels Gaschromatographie- Massenspektrometrie-Olfaktometrie (GC-MS-O) vermessen. Für die Aromaprofile der Referenz-Medien wurde ein Erlenmeyerkolben mit sterilem Medium parallel inkubiert und ebenfalls an den jeweiligen Kulturtagen aliquotiert. Die Bedingungen der gaschromatographischen Analyse sind in Tabelle zusammengefasst. Tabelle 5: Geräteparameter der SPME-GC-MS-0 Analytik.

Ergebnisse

Biotrockenmassen

Die Biotrockenmassen der Kulturen von P. eryngii in den unterschiedlichen Fed Batch Medien (vgl. Tabelle 2) nach sieben Tagen sind in Tabelle 6 aufgeführt.

Tabelle 6: Biotrockenmassen der Fed-Batch Kulturen von P. eryngii in Weizenbiertreber und Lupinenklarlauf.

C. aegerita produzierte in 20 g/L Pilsener-Treber und Lupinenklarlauf S4 nach sieben Kulturtagen eine Trockenmasse von 18,88 ± 1,67 g/L.

Die Biotrockenmassen der kinetischen Reihe von P. nameko sind in Tabelle 7 gezeigt.

Tabelle 7: Biotrockenmasse der kinetischen Reihe von P. nameko in Weizenbier- und Pilsener-Treber

Glutenanalytik

Der Gliadingehalt des Pilsener-Trebers betrug 20,93 g/100 g. Der Gliadingehalt des fermentierten Trebers wurde zu 0,294 g/100 g bestimmt. Dies entspricht einem Glutenabbau von > 98%.

Aminosäureprofil von P. eryngii kultiviert in Lupinenklarlauf und Weizenbiertreber

Die Aminosäureprofile der Kulturen von P. eryngii sind in Tabelle 8 aufgeführt. Die Angaben sind in g/100 g Trockenmasse Probe dargestellt und die Masse bezieht sich jeweils auf den Aminoacidresidual, also den Wert, den man erhält, wenn man berücksichtigt, dass die Aminosäuren im Protein gebunden vorliegen und bei deren Bindung ein Wassermolekül abgespalten wird. Die Ansätze beziehen sich auf die Medienzusammensetzung (vgl. Tabelle 2) und die zusätzliche Beschriftung A und B bezieht sich auf eine biologische Doppelbestimmung. Tabelle 8: Aminosäureresidual [g/100 g DM], in biologischem Duplikat kultiviert (A und B) und in Vierfachbestimmung analysiert

SUM: Summe

EAAI : essential Amino Acid Index

BV: Biological Value Limit. AA: Limitierende Aminosäure

Im Durchschnitt wurde für die Mycelien ein EAAI von 98,4 sowie eine biologische Wertigkeit von 95,5 bestimmt. Damit wurde die Wertigkeit des Proteins im Vergleich zum nicht fermentierten Treber (EAAI 88 bzw. BV 84) signifikant verbessert.

Aromaanalytik

Die Kulturen von P. nameko wurden ebenfalls in biologischer Doppelbestimmung kultiviert und mittels SPME-GC-MS-0 analysiert. Die Ergebnisse wahrgenommenen Geruchseindrücke zusammen mit Substanzvorschlägen sind in den Tabellen 9 - 14 aufgeführt, die zugehörigen Chromatogramme in den Abbildungen 1 - 6. Es sind jeweils die Chromatogramme des nicht inokulierten Mediums als Vergleich dargestellt.

Tabelle 9: Aromaprofil von P. nameko kultiviert in Pilsener-Treber für drei Tage (Probe 1); RI: Retentionsindex.

Tabelle 10: Aromaprofil von P. nameko kultiviert in Weizenbiertreber für drei Tage (Probe 2); RI: Retentionsindex. Tabelle 113.' Aromaprofil von P. nameko kultiviert in Pilsener-Treber für fünf Tage (Probe 1); RI: Retentionsindex.

Tabelle 12: Aromaprofil von P. nameko kultiviert in Weizenbiertreber für fünf Tage (Probe 2); RI: Retentionsindex.

Tabelle 13: Aromaprofil von P. nameko kultiviert in Pilsener-Treber für sieben Tage (Probe 1); RI: Retentionsindex. Tabelle 14: Aromaprofil von P. nameko kultiviert in Weizen-Treber für sieben Tage (Probe 2); RI: Retentionsindex. Nachfolgend sind weitere Untersuchungen zum Glutenabbau durch Pholiota nameko beschrieben:

Bestimmung des Glutengehalts mittels kompetitivem ELISA

Zur Bestimmung der Glutengehalte der Fermentate wurden 0,1 g Probe (getrocknet, homogenisiert) in 15 mLZentrifugenröhrchen auf 0,1 mg genau eingewogen und mit 10 mL einer Lösung von Fischgelatine in 60%igem Ethanol (10% (w/w), pH 8,5) versetzt. Die Lösung wurde für 30 s auf einem Kreisschüttler und anschließend für 10 min an einem Test Tube Rotator (50 rpm) homogenisiert. Im Anschluss wurde die Probe bei 3.360 g für 10 min zentrifugiert und der Überstand membranfiltriert (0,45 pm). Das Filtrat wurde 1:10 mit 60%igem Ethanol verdünnt.

Die Lösungen des Kits (vgl. Tabelle 15) wurden nach Herstellerangaben verdünnt und die extrahierte Probe anschließend nach der Vorschrift des Kits vorbereitet und für die photometrische Messung des ELISAs eingesetzt.

Tabelle 15: Zur Glutenanalytik verwendetes Kit.

Ergebnisse

Die Auswertung erfolgte anhand eines Kalibriergraphen 3. Grades mit den Standards des Ridascreen®-ELISA-Kits. Die Extinktionen der Standards wurden prozentual zum Standard mit der Gliadin-Konzentration O ng / mL berechnet und gegen die Konzentration aufgetragen. Die Kalibrierung ist in Abbildung 7 dargestellt.

Die Glutengehalte wurden von PNA kultiviert mit Weizenbiertreber an den Tagen 3, 5, 7, 9, 12 und 14 bestimmt. Als Referenzwert (Blindwert) diente der Glutengehalt des Trebers nach dem Autoklavieren des Mediums nach siebentägiger Inkubation (ohne Pilz).

In Tabelle 16 ist der Glutengehalt der Fermentate in Weizenbiertrebermedium mit 20 g L-l Trockenmasse aufgeführt. Tabelle 16: Glutengehalte der Fermentate von P. nameko in Weizenbiertreber- medium.

Abbildung 8 zeigt den Glutenabbau von P. nameko in Weizenbiertrebermedium. An Kulturtag 14 betrug der Glutengehalt < 1 g / kg.

Für die Auswertung der Glutengehalte wird ein Verhältnis von 1:1 zwischen Gliadinen und Gluteninen angenommen. Die Gliadinkonzentration wird nach dem Codex Alimentarius mit dem Faktor zwei multipliziert. Es wurden in der Literatur allerdings bereits unterschiedliche Faktoren von Gliadinen zu Gluteninen in verschiedenen Weizenmehlsorten bestimmt. Diese lagen zwischen 1,74 und 3,14.