本发明属于基因工程技术领域， 具体涉及通过基因工程技术在植物中制备 人细胞生长因子的方法。 背景技术

成纤维细胞生长因子（FGF)是一类与肝素有高� �和力且生物活性相似的蛋 白家族。 至今已分离鉴别出 23个不同的成纤维细胞生长因子。 成纤维细胞生长 因子的原型， 即碱性成纤维细胞生长因子 （bFGF, basic fibroblast growth factor, bFGF or FGF-2 )是 20世纪 70年代首次在垂体和大脑发现的。它是一个单� ��的、 分子量为 17 kDa、 等电点为 9.6的蛋白质。 它可以促进 NIH/3T3细胞的增殖和 抑制干细胞的分化， 由于它可促进人气道平滑肌细胞的增殖、 迁移并在体外改 变其收缩表型从而引起气道重塑的衰减， 因此可能在哮喘治疗中发挥重要的作 用。 随后， 碱性成纤维细胞生长因子还被证实可促进小鼠 乳腺上皮细胞的生长。 此外， 它被广泛应用于烧伤治疗和伤口愈合的临床应 用， 因为碱性成纤维细胞 生长因子可显着加快伤口愈合速度。 用碱性成纤维细胞生长因子治疗创口发红、 伤口红肿及烫伤愈合比单纯用手术治疗更有效 并且皮肤表面的硬度较小。 因此， 碱性成纤维细胞生长因子常被用于心血管疾病 和神经退行性疾病中的组织修复 和伤口愈合。

碱性成纤维细胞生长因子最初分离自大脑和垂 体， 其来源十分有限， 体内 外对碱性成纤维细胞生长因子应用的大量需求 难以得到满足。 在过去的几十年 间， 科学家已作出了广泛的努力， 分别用大肠杆菌、 毕赤酵母、 大豆种子和蚕 来表达重组人碱性成纤维细胞生长因子。 然而， 由于收益率较低、 工艺复杂和 不溶性等问题， 结果都难以满足市场的需求， 特别是难以满足细胞治疗和转化 医学对人碱性成纤维细胞生长因子日渐增加的 应用需求。

最近， 已报道用水稻胚乳表达各种重组药物蛋白， 包括人乳铁蛋白、 人溶 菌酶、 rhIGF -1融合蛋白， 人粒细胞 -巨噬细胞群剌激因子和人血清白蛋白。 这 些结果表明， 水稻胚乳表达系统具有成本效益、 安全、 易于扩大生产规模且相 对于动物和其他植物细胞表达系统的生产工艺 更加简便等优点。 因此， 水稻胚 乳被认为是有利的大规模生产药用蛋白表达的 平台。 其优势对学术研究和工业 应用都具有相当的吸引力。

如今， 尚未有有关利用水稻胚乳系统表达碱性成纤维 细胞生长因子的报道。 发明内容

本发明的一个目的是提供一种水稻遗传密码子 优化的表达人碱性成纤维细 胞生长因子基因 f(¾rbFGF基因） ， 其具有如 SEQIDN0.1所示的序列。

进一歩地， 还提供了含有所述 O bFGF基因的载体， 优选水稻胚乳细胞 特异性表达载体， 更优选具有如图 3所示的结构的载体。

本发明另一个目的是提供含有所述 C^rbFGF基因的载体在制备 OsrbFGF 转基因水稻种子中的应用。

本发明的又一个目的是提供一种制备 C^rbFGF转基因水稻种子的方法， 包括以下歩骤：

(1) 制备具有如 SEQIDN0.1所示序列的 O rbFGF基因；

(2) 构建水稻胚乳细胞特异性表达的 C^rbFGF表达载体和选择性标记基 因载体；

(3) 将歩骤 2所获得载体共转化到水稻品种的愈伤再生组� �中；

(4) 培养所述愈伤再生组织， 经筛选和诱导获得 (¾rbK7F转基因水稻植 株；

(5) 培养 (¾rbFGF转基因水稻植株， 获得 (¾rbFGF转因水稻种子。

进一歩地， 上述方法中所的 C^rbFGF表达载体具有如图 3所示的结构。 进一歩地， 上述方法中所述的选择性标记基因载体具有如 图 4所示的结构。 本发明的再一个目的是提供一种从 C^rbFGF转基因水稻种子中分离纯化 OsrbFGF的方法， 包括以下歩骤：

( 1 ) 以 OsrbFGF转基因水稻种子为原料制备 OsrbFGF提取液；

(2) 用正压力过滤器对 OsrbFGF提取液进行过滤， 获得 OsrbFGF滤液；

(3) 以 Heparin 6 Fast Flow柱分离纯化 OsrbFGF滤液， 采用两歩洗杂法去 除结合在 Heparin 6 Fast Flow柱上 OsrbFGF滤液中的杂蛋白；

(4)用 OsrbFGF洗脱液对结合在 Heparin 6 Fast Flow柱上的 OsrbFGF进行 洗脱， 获得高纯度的 OsrbFGF。

具体地， 上述方法包括以下歩骤：

(1) 以 O rbFGF转基因水稻种子为原料， 以包括 50mMPB (pH7.5) 、 1 mMEDTA、 1 mML-还原型谷胱甘肽、 250 mMNaCl的提取缓冲液制备 OsrbFGF 提取液；

(2) 分别用 3μπι和 0.22μπι的正压力过滤器对 OsrbFGF提取液进行过滤， 获得 OsrbFGF滤液；

(3) 用 Heparin 6 Fast Flow柱分离纯化 OsrbFGF滤液， 并用包括 250mM NaCl和 ImML-还原型谷胱甘肽的 50mMPB(pH7.5)进行平衡；采用两歩洗杂法 去除 OsrbFGF滤液中的杂蛋白； 其中洗杂缓冲液 I包括： 50mMPB (pH7.5) 、 600mM NaCK 1 mM L-还原型谷胱甘肽， 洗杂缓冲液 II包括： 50mM PB (pH 7.5) 、 900mMNaCl、 1 mM L-还原型谷胱甘肽； (4 )用 OsrbFGF洗脱液对对结合在 Heparin 6 Fast Flow柱上的的 OsrbFGF 进行洗脱， 获得高纯度的 OsrbFGF , 所述 OsrbFGF 洗脱缓冲液包括： 10mM Tris-HCl (pH 7.5), 1.7mM NaCl、 1 mML-还原型谷胱甘肽。

本发明构建了利于水稻胚乳表达的人 bFGF基因并成功地在水稻中表达， 制备和分离纯化出 OsrbFGF蛋白，获得的 OsrbFGF 蛋白具有人碱性成纤维细胞 生长因子的活性， 为利用植物基因工程技术制备人细胞生长因子 蛋白奠定了基 础。 附图说明

图 1是质粒 pOsPMP2的结构示意图。

图 2是质粒 pOsPMP276的结构示意图。

图 3是质粒 pOsPMP277的结构示意图。

图 4是质粒 pOsPMP05的结构示意图。

图 5是 PCR扩增鉴别阳性转化植株的结果图；

其中， 从左到右第 1-8 泳道为阳性转化植株， Nc 为阴性对照即非转基因

TP309水稻基因组 DNA为模板， Pc为阳性对照即 pOsPMP276质粒为模板。

图 6是 Western杂交鉴定转基因水稻表达 OsrbFGF的结果图；

其中， 从左到右第 1-8泳道为阳性转化植株， Nc为非转基因 TP309水稻种 子提取液， Pc为 bFGF标准品。

图 7显示了 OsrbFGF的表达水平。

图 8显示了从转基因水稻种子中分离纯化 OsrbFGF的结果；

其中， a显示了 OsrbFGF的回收率； b显示了纯化过程中 SDS-PAGE的检 测结果； c显示了纯化过程中 Western杂交的鉴定结果。 其中， 图 b和 c中， 从 左到右的泳道 M为分子标记， UF-5为 5kDa超滤浓缩除盐， Elu为亲和洗脱， W2为第二次洗杂， W1为第一次洗杂， Extra为 bFGF粗提液。

图 9显示了 OsrbFGF在体外和体内的活性分析结果；

其中， a显示了 OsrbFGF对 NIH/3T3细胞增殖的影响； b显示了 OsrbFGF 处理伤口后第 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14的愈合率； c和 e分别显示了 OsrbFGF 处理伤口后第 3、 7、 14天 CD68和 PCNA的阳性数量； d和 f分别显示了 CD68 和 PCNA的免疫射线自动照相结果。 具体实施方式

以下通过结合附图详细说明本发明的特点和优 点。 所提供的实施例仅是对 本发明方法的举例说明， 而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

实施例中所用到的各种试剂和仪器， 除特别说明以外， 均为普通市售。 【实施例 1】水稻特异性表达重组人碱性成纤维细胞生� �因子载体的构建 及转基因水稻植株的制备

人 bK7F基因（Genbank登记号： NM002006 ) 由 Heron Blue 生物技术公司 合成并根据水稻偏好的遗传密码子， 将 bFGF基因中 61.54%的遗传密码子进行 优化并使人 bFGF基因中 21.65%的核苷酸发生改变， 优化后的人 bFGF基因序 列如 SEQ ID NO. l所示， 密码子优化前后的氨基酸序列没有变化。 本实施例选 用水稻特异性启动子 及其信号肽来介导重组人 bFGF基因在水稻胚乳细 胞中的表达， 用如图 1所示的质粒 pOsPMP2来构建水稻胚乳特异性表达盒。将 所述合成的经密码子优化的人 bFGF基因用 2/和^ 20/酶切后克隆到 pOsPMP2 中构建成质粒 pOsPMP276， 如图 2所示。 然后构建用于根癌农杆菌介导转化的 质粒， 用 Hindlll和 co ?/酶切 pOsPMP276， 将长度为 1983bp的含 Gi73i7启动 子及其信号肽序列还有经密码子优化的 bFGF基因以及 Nos终止子的整个表达 盒， 如 SEQ ID N0.2所示， 插入到双元表达载体 JH2600 , 所获得的双元质粒命 名为 pOsPMP277， 具体如图 3所示。 将双元质粒 pOsPMP277转化到根癌农杆 菌菌株 EHA105 (美国 Invitrogen 公司） ， 经根癌农杆菌介导共转化将所述 pOsPMP277质粒和如图 4所示的 pOsPMP05质粒共转化到水稻品种 TP309的愈 伤再生组织中， 具体方法参照（Daley, M.; Knauf, V.C.; Summerfelt, K.R.; Turner, J.C. Co-transformation with one agrobacterium tumefaciens strain containing two binary plasmids as a method for producing marker-free transgenic plants. Plant Cell Re。.1998. 17. 489-496. ) ， 经培养、 筛选和诱导后形成完整的植株， 总获得 58 株独立的转化植株；然后，通过 PCR扩增来鉴别阳性转化植株，用起始于 Gi7 信号肽的正向引物 （5'-GAGGGTGTGGAGGCTCTTGT-3')和起始于 终止子 的反向引物序列 (5 '-GCCAGTGAATTCCCGATCTAGTAAC-3 ')来进行 PCR扩增， 结果如图 5所示。

【实施例 2】 OsrbFGF的分析和鉴定

本实施例用 Western杂交来检测所获得的转基因水稻表达的 bFGF (本发明 称 OsrbFGF ) 是否聚集在水稻胚乳细胞中。 分别取经 PCR鉴定为阳性的转基因 水稻植株的 T1种子 lOOmg,用 1ml的提取缓冲液 (50 mM PB, pH 7.5, 1 mM EDTA _; 1 mM L-还原型谷胱甘肽， 250 mMNaCl)在 4°C下研磨 60分钟， 然后在 10620 x g的条件下离心 10分钟，获得蛋白粗提液。用 15 % SDS-PAGE分离 40μ1蛋白粗 提液和 350ng源于 Ecoli的重组 bFGF , 并将凝胶转移到硝酸纤维素膜上。 使用 碱性成纤维细胞生长因子的兔多抗（Abeam, 英国）和碱性磷酸酶山羊抗兔 IgG (ZSGB-BIO , 中国） ， 以氯化硝基四氮唑蓝 （NBT) 和 5-溴 -4-氯 -3-吲哚基磷 酸盐 （BCIP, BIOSHARP , 中国） 为底物进行目标蛋白的检测。 结果显示， 有 35株转基因水稻表达的 OsrbFGF积累在水稻胚乳中，结果图 6所示。用 Image-pro Plus软件对最终的 Western杂交结果进行分析， 结果显示 OsrbFGF的表达水平 为每公斤粗米生产 99.11-185.66mgOsrbFGF， 如图 7所示。

另外， 本实施例还进一歩采用 Southern杂交鉴定转基因水稻植株， 分别取 约 200mg转基因水稻的嫩叶， 用液氮研磨并用快捷型植物基因组 DNA提取系 统 （中国天根生物科技有限公司） 提取基因组 DNA。 分别用 ^o ^ HmdIII或 EcoRI和 Hmdin (新英格兰生物公司） 在 37°C过夜酶切所述基因组 DNA, 然后 0.8 %琼脂糖凝胶进行分离； 将凝胶转移到 MILLIPORE NY +膜后， 按照 罗氏 DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I的指示进行杂交， 用以下引物 (5，- GCATCCATAAATCGCCCCATAG -3，和 5，-

GCCAGTGAATTCCCGATCTAGTAAC -3') 扩增源自 bK7F编码区的长度为 824bp的探针。 结果显示： 当用 co ^/或 消化酶酶切时均检测到单个片 段， 该结果与遗传分析的结果一致； ¾o ?/和// 双酶切获得的单个条带与 整个表达盒相比较， 结果显示所述农杆菌双向载体存在于整个表达 盒中。

【实施例 3】 OsrbFGF的分离和纯化

在室温下，用提取缓冲液 (50 mM PB, pH 7.5, 1 mM EDTA, 1 mM L-还原型谷 胱甘肽， 250 mMNaCl)研磨并提取转基因水稻的种子 1小时，获得的提取液分别 通过 3μπι和 0.22μπι的正压力过滤器进行过虑澄清， 然后将滤液加到 Heparin 6 Fast Flow柱 (GE Healthcare, www. gelifesciences.com)， 并用含有 250mM NaCl禾口 ImM L-还原型谷胱甘肽的 50mM PB进行平衡； 采用两歩洗杂法去除杂蛋白并 增加 OsrbFGF的回收率，其中洗杂缓冲液 I为 (50mM PB (pH 7.5 ) , 600mM NaCl, 1 mML-还原型谷胱甘肽），洗杂缓冲液 II为 （ 50mM PB (pH 7.5 )， 900mM NaCl, 1 mML-还原型谷胱甘肽)； 洗杂后， 结合于 Heparin 6 Fast Flow柱上的 OsrbFGF 用洗脱缓冲液 （10mM Tris-HCl(pH 7.5), 1.7mM NaCl, 1 mML-还原型谷胱甘肽） 进行洗脱， 获得高纯度的 OsrbFGF蛋白， 其中 OsrbFGF的回收率如图 8a所示， 各洗脱歩骤的 SDS-PAGE检测结果及 Western杂交分析结果分别如图 8b和 8c 所示。 在冻干之前， 先将 OsrbFGF洗脱液进行浓缩并用 Pellicon XL (Millipore 公司） 5 kD的超滤过滤器进行部分脱盐， 然后用 Viva Flow 50 (Sartorius)lOOkD 的超滤过滤器去除内毒素， 所获得的 OsrbFGF最终纯度达 95%以上且内毒素含 量低于 1EU/ g。 最后， OsrbFGF在 OsrHSA的保护下进行冻干 (1 :50， w/w；)。

【实施例 4】 OsrbFGF对 NIH/3T3细胞增殖的影响

在含有 DMEM培养基并补以 1.5 % FBS和 1 %青霉素和链霉素 （P/S) 的 96孔平板中培养 NIH/3T3细胞， NIH/3T3细胞的初始浓度为 lxlO ⁵ - 5xl0 ⁵ 个 /ml， 于 37°C、 5 %C0 ₂ 下孵育 24小时。 然后除去培养基并用 PBS洗涤细胞， 在 37°C 下用 0.25 %的胰蛋白酶处理 3分钟。 将处理后的细胞重悬于 DMEM培养基中， 补以 1.5 % FBS和 1 %P/S , 然后在 800rpm下离心 3分钟。 除去上清液， 将细 胞重悬于含有 1.5 % FBS和 1 % P/S的 DMEM培养基中。 以 4000个 /ml的浓度 将 NIH/3T3细胞接种于 96孔平板中， 于 37 °C、 5 % C0 ₂ 下孵育 24小时。然后用 补以 0.75 % FBS的 DMEM培养基洗涤细胞并于 37 °C、 5 % C0 ₂ 下再孵育 24小 时。 最后， 细胞在含有不同 OsrbFGF浓度（200μ1/孔） 的 DMEM培养基孵育 48 小时， 加入 20μ1的 MTT (溴化噻唑蓝四氮唑)溶液并于 37 °C下再孵育 4小时， 将 微量滴定板置于 VersaMax (Molecular Devices , 美国） 中于 490nm处进行读数。 所有数据均用 GraphPadPnsm 5软件进行分析且所有实验均重复三次。结果� �示， 在 OsrbFGF浓度为 6pg-5ng/ml的范围内， 显示出浓度依赖性的 NIH/3T3细胞增 殖作用， 达到 1.15 x l0 ⁶ IU/mg， 如图 9a所示； 表明在体外 OsrbFGF 具有促进 NIH/3T3细胞增殖的活性。 说明本发明的 OsrbFGF具有与商业 rbFGF相同的生 物活性。

【实施例 5】 OsrbFGF对伤口愈合的影响

取体重为 200— 250克的雌性 SD大鼠（上海斯莱克实验动物有限责任公司）� �� 随机分成 4 组并制备成切除伤口夹板模型， 具体方法参考 （Galiano, R.D.; Michaels, V.; Dobryansky, M.; Levine, J.P.; Gurtner, G.C. Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing. Wound Repair Regen. 2004, 72, 485-492. ) 。 以三个 OsrbFGF剂量组： 2000ng/ml组 （n = 15 ) 、 500ng/ml ， (n = 15 ) 、 125ng/ml组 （n = 15 ) 和一个生理盐水阴性对照组 （n = 15 ) 对应 处理上述随机分组的 4组模型以测试伤口的愈合率。 分别在第 0天， 第 2天， 第 4天， 第 6天， 第 8天， 第 10天， 12天及 14天的观察伤口的闭合情况并按 ( Wu, Y.; Chen, L.; Scott, P.G.; Tredget, E.E. Mesenchymal stem cells enhance wound healing through differentiation and angiogenesis. Stem Cells 2007,25, 2648-2659. ) 所述的方法进行伤口愈合率 [ (原创面 -实际创面） /原创面 x 100]、 病理和免疫组化观察。 结果表示， 伤口愈合率对 OsrbFGF有剂量依赖性， 其中 在治疗的前 8天， 低剂量比高剂量如 500 ng和 2000 ng作用更为显著， 如图 9b 所示。通常， 当受伤的皮肤康复时能促进上皮形成和 CD68表达以及细胞核抗原 (PCNA)的增殖。因此本实施例还检测了治疗第 3天、第 7天和第 14天时 PCNA 和 CD68的表达， 结果显示， 与阴性对照组相比， 于治疗的第 3天和第 7天， OsrbFGF剂量组的 PCNA和 CD68表达显著增加，而在治疗第 14天时， OsrbFGF 剂量组的 PCNA和 CD68表达水平却低于阴性对照组， 如图 9c-9f所示。在治疗 的早期阶段， OsrbFGF可以通过剌激细胞的增殖和促进 CD68和 PCNA的增殖 从而加速伤口愈合， 然后， 通过降低细胞、 CD68和 PCNA的表达以防止在治疗 的后期阶段产生疤痕和伤口闭合时的细胞增殖 。