Verfahren zur Herstellung substituierter Phenylacetylcarbinole

Beschreibung

Technnisches Gebiet der Erfindung:

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung substituierter Phenylacetylcarbinole durch biokatalytische Umsetzung der entsprechenden substituierten aromatischen Aldehyde in Gegenwart von Pyruvat und/oder Acetaldehyd und einer Pyruvatdecarboxylase. Die vorliegende Verbindung betrifft darüber hinaus (R)-1- Hydroxy-1-(4-tert.-butoxyphenyl)-2-propanon.

Phenylacetylcarbinol (PAC) stellt ein wichtiges Zwischenprodukt zur Herstellung des Pharmawirkstoffes Ephedrin und verwandter Verbindungen dar. In jüngerer Zeit wur- den auch pharmakologisch interessante Eigenschaften von am Phenylring substituierten Derivaten der genannten Verbindungen gefunden. Daher besteht ein hoher Bedarf an wirtschaftlich vorteilhaften und pharmakologischen Ansprüchen genügenden Synthesewegen der genannten Verbindungen bzw. deren fortgeschrittener Intermediate.

Stand der Technik:

Die WO 90/04631 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Phenylacetytcarbinol durch Fermentation von Benzaldehyd und Pyruvat in Gegenwart von Pyruvat- Decarboxylase produzierenden Mutanten der Spezies Saccharomyces cerevisiae oder Candida flareri. Die Fermentation wird dabei unter anaeroben Bedingungen bzw. unter Sauerstoffmangel in wässrigem Medium durchgeführt und liefert Phenylacetylcarbinol in einer Konzentration von mindestens 1 g/l.

WO 02/02791 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von R-Phenylacetylcarbinol durch Biotransformation von Benzaldehyd mittels filamentöser Pilze. Die Umsetzung wird in Gegenwart einer Acetaldehydquelle wie Acetaldehyd selbst oder Pyruvat vorgenommen. Als bevorzugte filamentöse Pilze werden Rhizopus, Neurospora, Polypo- rus, Fusarium, Monilia, Paecilomyces und Mucor genannt.

Die JP 10-269204 betrifft ein Verfahren zur Herstellung optisch aktiver α- Hydroxyketone vom Phenylacetylcarbinol-Typ, wobei der Phenylring auch substituiert sein kann, bzw. durch einen Alkyl-, Naphthyl-, Furyl- oder Thiophenyl ersetzt sein kann. Das Verfahren sieht vor, die den gewünschten Acetylcarbinolen entsprechenden Alde- hyde in einer Kulturlösung eines Pyruvat-produzierenden Mikroorganismus umzusetzen. Als geeignete Mikroorganismen werden Torulopsis oder Candida genannt.

J. Netrval et al. beschreiben in Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. (1982) 16: 35-37 die Herstellung von Phenylacetylcarbinol in verschiedenen Hefe-Spezies. Dazu werden Sucrose, Acetaldehyd und Benzaldehyd zu fertigen Kulturlösungen gegeben und die Menge an gebildetem Phenylacetylcarbinol nach 30 min bzw. nach Beendigung der Umsetzung bestimmt. Als besonders geeignet haben sich die Stämme Saccharomyces carlsbergensis sowie Candida und Hansenula erwiesen.

Die Herstellung von Acetoin und Phenylacetylcarbinol mittels Pyruvat-Decarboxylasen aus Zymomonas mobilis und Saccharomyces carlsbergensis beschreiben S. Bringer- Meyer et al. in Biocatalysis, 1988, Vol.1 , 321-331 ausgehend von Benzaldehyd und Acetaldehyd oder Benzaldehyd.

S. Bornemann et al. beschreiben in J. Chem. Soc, Perkin Trans. 1 425 (1996) die Herstellung optisch aktiver aromatischer Acyloine ausgehend von den entsprechenden Aldehyden und Pyruvat oder Acetaldehyd in gegenwart einer rekombinanten Pyruvat- decarboxylase aus Zymomonas mobilis. Als Ausgangsstoffe dienen speziell 2-, 3- oder 4-Fluor- bzw. Chlor-substituierte Benzaldehyde. Mit den genannten 4-substituierten Benzaldehyden wurden Ausbeuten von 35 % erzielt.

Die DE 197 36 104 offenbart eine Verfahren zur Herstellung von Enantiomerenreinen Phenylacetylcarbinolen aus Acetaldehyd und dem entsprechenden Benzaldehyd in Gegenwart eine Pyruvatdecarboxylase aus Zymomonas. Als Substrate kommen Benzaldehyd selbst oder Fluor-, Chlor- bzw. Brom-substituierte Derivate zum Einsatz. Im Verlauf der Biotransformation wird Acetaldehyd kontinuierlich oder diskontinuierlich dem Reaktionsmedium nachdosiert.

Die WO 03/020942 betrifft ein Verfahren zur Herstellung von R-Phenylacetylcarbinolen aus Acetaldehyd und aromatischen Aldehyden in Gegenwart einer Pyruvatdecarboxylase in einem zwei-Phasen-System. Dabei können die einzusetzenden Aldehyde einen Fluor-, Chlor- oder Bromsubstituenten aufweisen.

Die EP 0 322 973 offenbart ein Verfahren zur Herstellung optisch aktiver Cyanhydrine und deren Umsetzungsprodukte. Das Verfahren eignet sich u.a. zur Herstellung von Acyloinen, wie beispielsweise R-(-)1-Hydroxy-1-(4-methoxyphenyl)-2-propanon, das durch Umsetzung von R-(+)-α-(Trimethylsilyloxy)-4-methoxyphenylacetonitril mit Me- thylmagnesiumiodid und anschließender Säurebehandlung erhalten wird.

Aufgabe der Erfindung:

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war die Bereitstellung eines wirtschaftlich und verfahrenstechnisch vorteilhaften Verfahrens zur Herstellung optisch aktiver, Hydroxy-

bzw. Alkoxy-substituierter Phenylacetylcarbinole in hoher Ausbeute, Reinheit und hohem Enantiomerenüberschuß.

Beschreibung der Erfindung sowie der bevorzugten Ausführungsformen:

Die Ausgabe wurde erfindungsgemäß gelöst durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung substituierter R-Phenylacetylcarbinole der Formel (I)

wobei die Reste

R ¹ Wasserstoff, d- bis Ci ₂ -Alkyl oder Phenyl,

R ² jeweils unabhängig Hydroxy, d- bis Ci2-Alkyl, d- bis Cβ-Alkoxy, Phenyl, Benzyl, Halogen, Nitro oder Nitril bedeutet und

n Null, eins oder zwei

bedeutet,

durch Umsetzung von Aldehyden der Formel (II)

in denen R ¹ , R ² und der Index n die gleiche Bedeutung wie in Formel (I) besitzen,

in Gegenwart von Pyruvat und/oder Acetaldehyd und in Gegenwart einer Pyruvatde- carboxylase.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich zur Herstellung von substituierten R-

Phenylacetylcarbinole der Formel (I) in optisch aktiver Form, bevorzugt solcher die einen Enantiomerenüberschuss von etwa 90 bis etwa 99,9% ee, besonders bevorzugt etwa 94 bis etwa 99,5% ee und besonders bevorzugt etwa 97 bis etwa 99% ee aufwei-

sen. Dabei liegt das stereogene Kohlenstoffzentrum des Hauptenantiomeren in der R- Konfiguration vor.

Die erfindungsgemäß zugänglichen Phenylacetylcarbinole der Formel (I) weisen am Phenylring einen über ein Sauerstoffatom gebundenen Rest R ¹ auf, wobei R ¹ entweder für Wasserstoff oder einen d- bis Ci2-Alkyl- oder Phenylrest steht. Unter dem Begriff Cr bis Ci2-Alkyl sind geradkettige oder verzweigte oder ganz oder teilweise zyklische Alkylreste mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen zu verstehen, wie beispielsweise Methyl, Ethyl, Propyl, Cyclopropyl, Cyclopropylmethyl,1-Methylethyl, Butyl, Cyclobutyl, 1- Methyl-propyl, 2-Methylpropyl, 1 ,1-Dimethylethyl, Pentyl, Cyclopentyl, 1-Methylbutyl, 2- Methylbutyl, 3-Methylbutyl, 2,2-Di-methylpropyl, 1-Ethylpropyl, Hexyl, 1 ,1- Dimethylpropyl, 1 ,2-Dimethylpropyl, 1-Methylpentyl, 2-Methylpentyl, 3-Methylpentyl, 4- Methylpentyl, 1 ,1-Dimethylbutyl, 1 ,2-Dimethylbutyl, 1 ,3-Dimethylbutyl, 2,2- Dimethylbutyl, 2,3-Dimethylbutyl, 3,3-Dimethylbutyl, 1-Ethylbutyl, 2-Ethylbutyl, 1 ,1 ,2- Trimethylpropyl, 1 ,2,2-Trimethylpropyl, 1-Ethyl-1-methylpropyl und 1 -Ethyl-2- methylpropyl, Cyclohexyl, Heptyl, Methylcyclohexyl, Octyl, Dimethylcyclohexyl, Nonyl, Decyl, Undecyl oder Dodecyl.

Bevorzugt steht R ¹ für einen wie vorstehend beschriebenen d- bis Ci2-Alkylrest, be- sonders bevorzugt für d- bis Cβ-Alkyl und ganz besonders bevorzugt für d- bis C ₄ - Alkyl, beispielsweise für Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, 2-Methylpropyl oder 1 ,1-Dimethylethyl (tert. -Butyl), insbesondere für tert. -Butyl.

Die erfindungsgemäß zugänglichen Phenylacetylcarbinole der Formel (I) können am Phenylring zusätzlich einen oder zwei gleiche oder verschiedenen Reste R ² aufweisen. Der bzw. die Reste R ² können dabei Hydroxy, wie vorstehend beschriebenes d- bis Ci2-Alkyl, bevorzugt d- bis Cβ-Alkyl, d- bis Cδ-Alkoxy, Phenyl, Benzyl, Halogen, Nitro (-NO ₂ ) oder Nitril (-CN) bedeuten.

Der Index n steht im Rahmen der vorliegenden Erfindung für die Zahlen Null, eins oder zwei, bevorzugt für Null oder eins, besonders bevorzugt für Null.

Cr bis Cβ-Alkoxy steht dabei für einen über ein Sauerstoffatom gebundenen d- bis Cδ-Alkylrest wie beispielsweise Methoxy, Ethoxy, Propoxy, 1-Methylethoxy, Butoxy, 1- Methylpropoxy, 2-Methylpropoxy und 1 ,1-Dimethylethoxy, Pentoxy, Cyclopentyloxy, 1- Methylbutoxy, 2-Methylbutoxy, 3-Methoxylbutoxy, 1 ,1-Dimethylpropoxy, 1 ,2- Dimethylpropoxy, 2,2-Dimethylpropoxy, 1 -Ethyl propoxy, Hexyloxy, Cyclohexyloxy, 1- Methylpentoxy, 2-Methylpentoxy, 3-Methylpentoxy, 4-Methylpentoxy, 1 ,1- Dimethylbutoxy,1 ,2-Dimethylbutoxy, 1 ,3-Dimethylbutoxy, 2,2-Dimethylbutoxy, 2,3- Dimethylbutoxy, 3,3-Dimethylbutoxy, 1-Ethylbutoxy, 2-Ethylbutoxy, 1 ,1 ,2-

Trimethylpropoxy, 1 ,2,2-Trimethylpropoxy, 1 -Ethyl-1 -methylpropoxy oder 1 -Ethyl-2- methylpropoxy.

Halogen steht im Rahmen der vorliegenden Erfindung für Fluor, Chlor, Brom und Jod, bevorzugt Fluor, Chor, Brom, besonders bevorzugt Fluor und Chlor.

Als Ausgangsverbindungen zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens dienen die den gewünschten Produktverbindungen entsprechenden substituierten Benzaldehyde der Formel (II)

in denen R ¹ , R ² und der Index n die gleichen Bedeutungen bzw. die gleiche bevorzugten Bedeutungen wie in den entsprechenden Umsetzungsprodukten der Formel (I) besitzen.

Im Rahmen einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung para-Alkoxy-substituierter R-Phenylacetylcarbinole der Formel (Ia)

wobei der Rest R ¹ d- bis Ci2-Alkyl, bevorzugt d- bis Ci2-Alkyl und besonders bevorzugt wie vorstehend beschriebenes d- bis Cβ-Alkyl bedeutet. Derartige Verbindung der Formel (Ia) sind erhältlich durch erfindungsgemäße Umsetzung der entsprechenden para-Alkoxy-substituierten Aldehyde der Formel (lia)

in denen R ¹ die gleiche Bedeutung wie in Formel (Ia) besitzt.

Im Rahmen einer besonders bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von (R)-1-Hydroxy-1-(4-tert.-butoxyphenyl)-2- propanon der Formel (Ib)

durch erfindungsgemäße Umsetzung von para-tert.-Butoxy-benzaldehyd.

Die genannten Ausgangsverbindungen sind teilweise kommerziell erhältlich oder durch dem Fachmann bekannte Synthesemethoden, beispielsweise durch Deprotonie- rung/Formylierung der entsprechenden Aromaten wie beispielsweise in Tetrahedron 1978, Vol.34, 1651 oder in Methoden der Organischen Chemie (Houben-Weyl), 4th Ed. Vol.7/1 und E3 oder in Topics in Current Chemistry Springer-Verlag GmbH 1988 Vol.148, 1 und speziell für para-tert.-Butoxy-benzaldehyd in Journal of Organic Chemistry 1985, Vol. 50, 539 beschrieben gut zugänglich.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird in Gegenwart von Pyruvat und/oder Acetalde- hyd und in Gegenwart einer Pyruvatdecarboxylase (PDC) durchgeführt. Dabei dient die jeweils eingesetzte Pyruvatdecarboxylase als Enzymkatalysator zur Umsetzung des eingesetzten Aldehyds der Formel (II) mit dem Pyruvat und/oder dem Acetaldehyd. Pyruvatdecarboxylasen werden in verschiedenen Mikroorganismen gebildet. Beispielsweise eignen sich zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens Pyruvatdecarboxylasen aus Zymomonas wie beispielsweise Zymomonas mobilis, aus Aspergillus wie z.B. Aspergillus oryzae, Saccharomyces wie z.B. Saccaromyces cere- visiae, und aus Candida. Bevorzugt setzt man im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahren eine Pyruvatdecarboxylase aus Candida, insbesondere aus Candida utilis ein.

Die genannten Mikroorganismen sind allgemein bekannt und lassen sich leicht durch bekannte Techniken isolieren, wie beispielsweise beschrieben in Evans, I. H., Yeast Protocols, Totowa/NJ: Humana Press, 1996. oder lassen sich von öffeπiichen Aufbewahrungsorten erhalten. Daneben lassen sich im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens auch solche Pyruvatdecarboxylasen einsetzen, die rekombinant in einem Wirtsorganismus exprimiert werden bzw. wurden. Derartige Techniken sind beispielsweise beschrieben in Guthrie, C. Guide to Yeast genetics and Molecuiar Bioiogy, Amsterdam: Academic Press, 2005; Johnston, J. R, Moiecuiar Genetics of Yeast - ä practicai approach, Oxford/UK IRL Press, 1994; Kaiser, C. Methods in Yeast Genetics, NY CoId Spring Harbor Laboratory Press, 1994.

Die erfindungsgemäß einzusetzende Pyruvatdecarboxylase wird mit Vorteil in stabilisierter Form eingesetzt. Die Stabilisierung kann durch Zusatz geeigneter Stabilisatoren wie beispielsweise natürlichen Cofaktoren der Enzyme, Puffern, Salzen oder anderen Verbindungen mit stabilisierenden Eigenschaften wie beispielsweise Alkoholen wie z.B. Ethanol, Isopropanol, Isobutanol, Glyzerin, Ethylenglykol, 2-Butanon, Dimethylforma-

mid (DMF), Dimethylsulfoxid (DMSO), Dioxan, Tetrahydrofuran, 1-Aminopropanol, tert- Butanol, Methyl-tert.-butylether, bevorzugt Ethanol, erreicht werden.

Die genannten Pyruvatdecarboxylasen können in Form von Kulturlösungen vorkultivier- ten Zellkulturen der genannten Mikroorganismen in erfindungsgemäßer Weise eingesetzt werden. Dabei ist es in der Regel nicht von Bedeutung ob die eingesetzten Mikroorganismen in lebendiger oder abgetöteter Form in der jeweiligen Kulturlösung vorliegen.

Alternativ lässt sich das erfindungsgemäße Verfahren auch in Gegenwart einer Pyru- vatdecarboxylase durchführen, die in Form eines Extraktes aus der die Pyrovatdecar- boxylase produzierenden Zellkultur vorliegt. Derartige zellfreie Extrakte beinhalten die jeweilige Pyruvatdecarboxylase in löslicher oder solubilisierter Form.

Die erfindungsgemäß einzusetzenden Pyruvatdecarboxylasen lassen sich auch in immobilisierter Form, d.h. in auf einen Träger aufgebrachter Form einsetzen.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung, insbesondere unter Einsatz einer Pyruvatdecarboxylase aus Candida utilis, hat es sich als vorteilhaft erwiesen die jeweilige Zellkul- tur nach dem Fachmann bekannten Methoden vorzukultivieren. Besonders vorteilhaft ist dabei eine Vorkultivierung von Candida utilis unter anaeroben Bedingungen. Die so gewonnene Biomasse kann von dem Kulturmedium abgetrennt werden und dann dem umzusetzenden Reaktionsgemisch zugesetzt werden.

Die erfindungsgemäße Umsetzung wird in Gegenwart von Pyruvat und/oder Acetalde- hyd, bevorzugt Pyruvat, als zweitem Einsatzstoff durchgeführt. Unter dem Begriff Pyruvat sind dabei Salze der Brenztraubensäure wie beispielsweise Natriumpyruvat oder auch Brenztraubensäre selbst zu verstehen. Bevorzugt setzt man als Pyruvat Natriumpyruvat ein. Bevorzugt setzt man das gewählte Pyruvat als Acetaldehydquelle oder Acetaldehyd selbst in einer auf die molare Menge an eingesetztem Aldehyd der Formel (II) bezogenen Menge von etwa 1 bis etwa 2,5 äquivalenten, bevorzugt etwa 1 bis etw 2 äquivalenten ein.

Die erfindungsgemäße Herstellung der Phenylacetylcarbinole der allgemeinen Formel (I) führt man zweckmäßigerweise so durch, dass man den umzusetzenden Benzaldehyd der Formel (I) zusammen mit der gewählten Pyruvatquelle in einem geeigneten Rektionsmedium vorlegt und anschließend die Pyruvatdecarboxylase in der gewählten Form, d.h. z.B. in Form von getrockneter Biomasse oder einer Kulturlösung zusetzt.

Die Menge an einzusetzenden Pyruvatdecarboxylase bestimmt sich dabei nach der Form in der diese eingesetzt wird und nach der Aktivität die diese dann aufweist. Pro mol an umzusetzendem Aldehyd setzt man beispielsweise etwa 600 g Biofeuchtmasse

oder etwa 200 g getrocknete Biomasse des Pyruvatdecarboxylase enthaltenden Mikroorganismus, insbesondere von Candida utilis ein.

Als Reaktionsmedium zur Durchführung der erfindungsgemäßen Umsetzung eignen sich Wasser oder wässrige Pufferlösungen. Durch Zusatz geeigneter organischer Lösungsmittel wie beispielsweise Alkoholen wie etwa Ethanol oder Isopropanol lassen sich die Löslichkeiten der Edukte in den wässrigen Reaktionsmedien erhöhen und so die Reaktionsgeschwindigkeit positiv beeinflussen. Der pH-wert des Reaktionsgemisches wird bevorzugt auf einen Wert von etwa 4 bis etwa 8, bevorzugt etwa 5 bis etwa 7 eingestellt. Die Umsetzung wird vorteilhaft unter guter Durchmischung sowie unter Zusatz weiterer Hilfsstoffe wie beispielsweise dem Cofaktor Thiaminpyrophosphat oder Thiaminium-hydrochlorid oder Magnesiumionen, beispielsweise in Form von Magnesiumsulfat bei einer Temperatur im Bereich von üblicherweise etwa 10 bis etwa 40°C, bevorzugt etwa 20 bis etwa 30°C durchgeführt. Es hat sich darüber hinaus als vorteil- haft erwiesen, die Umsetzung unter aeroben Bedingungen, d.h. in Gegenwart von Sauerstoff bzw. Luftsauerstoff durchzuführen. Die Umsetzung ist üblicherweise nach etwa 24 h, oft nach etwa 12 h weitgehend abgeschlossen, wobei in der Regel ein auf den eingesetzten Aldehyd der Formel (I) bezogener Umsatz von etwa 90 bis etwa 95% erhalten wird.

Aus den so erhaltenen Reaktionsgemischen lassen sich durch dem Fachmann bekannten Methoden die hergestellten (R)-Phenylacetylcarbinole der Formel (I) isolieren, beispielsweise durch Filtration, anschließende Extraktion und schließlich Destillation. Das erfindungsgemäße Verfahren stellt einen leistungsfähigen Zugang zu den gewünschten (R)-Phenylacetylcarbinole der Formel (I) in hoher Ausbeute, Reinheit und hohem Enantiomerenüberschuss dar. Insbesondere eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von para-Alkoxy-substituierten (R)-Phenylacetylcarbinolen der Formel (Ia), ganz besonders zur Herstellung des (R)-1-Hydroxy-1-(4-tert- butoxyphenyl)-2-propanon der Formel (Ib), das in besonders hoher chemischer Ausbeute und besonders hohem Enantiomerenüberschuss von üblicherweise 97% und darüber erhalten wird. Dabei stellt die tert-Butylgruppe eine vorteilhafte Schutzgruppe für die para-ständige phenolische Hydroxygruppe dar, die unter sehr milden sauren Bedingungen gespalten werden kann jedoch gegen eine Vielzahl weiterer Bedingun- gen stabil ist. (R)-1-Hydroxy-1-(4-tert.-butoxyphenyl)-2-propanon stellt somit einen vielseitigen Synthesebaustein für eine breite Vielfalt möglicher Syntheseprodukte des pa- ra-Hydroxy-phenylacetylcarbinols dar. Die vorliegende Erfindung betrifft daher in einem weiteren Aspekt auch (R)-1-Hydroxy-1-(4-tert.-butoxyphenyl)-2-propanon.

Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung, ohne sie in irgend einer Weise zu beschränken:

Beispiele:

ODδoo- Werte wurden nach einem Standardverfahren mittels eines Pharmacia Biotech Ultraspec 300 UVA/isible Spectrometers bei 600 nm bestimmt.

Beispiel 1 :

Eine Impfkultur des Stammes Candida utilis wurden von Agarplatten in fünf separate mit MES-Puffer Spurenelementlösung und Glukose befüllte 200 ml Schüttelflaschen inokuliert und 24 h bei 30°C inkubiert.

Die Impfkulturen wurden in einen 10 I Fermenter (zusammen mit Phosphat-Puffer, GIu- kose, Ammonium- und Magnesiumphosphat und Spurenelementen) überführt und durch Zugabe von Natronlauge ein pH-Wert von 6,5 eingestellt. Die Fermentation wurde bei einem Sauerstoffpartialdruck von 0 und einer Rührgeschwindigkeit von 300 min- ¹ und einem konstanten Luftdurchfluss von 1 ,0 l/min 24 h durchgeführt bis ein ODδoo- Wert von 35 erreicht wurde.

Das so erhaltene Reaktionsgemisch wurde in einen 200 I Fermenter überführt, mit 160 I Phosphatpuffer aufgefüllt und zusätzlich mit 4 kg (2,5 % w/v) Hefeextrakt aufgefüllt. Der pH-Wert des Gemischs wurde durch Zusatz von Essigsäure oder Natronlauge konstant auf 6,0 eingestellt. Das Gemisch wurde wurde weiterhin mit 1 m ³ /h mit einem Druck von 0,1 bar belüftet und bei einer Rührgeschwindigkeit von 100 min ^~1 gerührt und so der Sauerstoffpartialdruck bei 0 gehalten. Nach 27 h betrug der ODδoo-Wert der Fermentationsbrühe konstant 29. Anschließend wurde die Biomasse durch Zentrifuga- tion (Zentrifuge MS-01 , Carl Padberg GmbH, Typ 61 G) abgetrennt. Man erhielt 5,75 kg feuchter Zellmasse (cell wet weight, cww) und nach dem Trocknen 1 ,9 kg getrock- neter Zellmasse (cell dry weight, cdw). Die so gewonnene Biomasse wies eine Pyru- vatdecarboxylase-aktivitat von 50 units/g cdw auf.

Beispiel 2:

1 kg (5,6 mol) 4-tert-Butoxybenzaldehyd wurden in 13,5 I Ethanol gelöst und zu einer Pufferlösung aus 1 ,2 kg (1 1 ,2 mol) Natriumpyruvat, 20 g (0,04 mol) Thiamin- pyrophosphat, 0,1 kg (0,4 mol) MgSO ₄ , 1 ,24 kg NaSO ₄ und 0,45 kg Zitronensäure in 82 I Wasser. Der pH-Wert des resultierenden Gemischs wurde durch Zugabe von Natron- lauge auf 6,5 eingestellt und anschließend 1 kg (cdw) Candida utilis zugegeben. Der pH-Wert wurde im Laufe der Reaktion konstant gehalten. Nach 4 h wurde eine Lösung von weiteren 0,46 kg (4,2 mol) Natriumpyruvat, 0,03 kg (0,13 mol) MgSO ₄ und 7 g

(0,013 mol) Thiaminpyrophosphat in 5 I Wasser mit einer Rate von 0,8 kg/h zugegeben. Nach 6 h wurde mittels HPLC-analyse ein Umsatz von 4-tert-Butoxybenzaldehyd von 95% zu (R)-1-Hydroxy-1-(4-tert.-butoxyphenyl)-2-propanon festgestellt. Anschließend wurde die Fermentationsbrühe durch Membranfiltration von der Biomasse befreit und die wässrige Produktlösung (138 I) mit 100 kg Methyl-tert.-butylether 30 min bei eienr Rührerdrehzal von 100 min- ¹ extrahiert. Anschließend wurden 4 I Ethanol zugegeben und die Phasen getrennt. Die organische Phase wurde abgetrennt und bei einem Druck von 500 mbar und einer Temperatur von 55°C vom Lösemittel befreit. Man erhielt 0,8 kg (3,6 mol) (R)-1-Hydroxy-1-(4-tert.-butoxyphenyl)-2-propanon entsprechend einer Ausbeute von 65% in Form eines gelben öls. Der Enantiomerenüber- schuss (ee) betrug 94 %. Er wurde bestimmt durch HPLC, wie nachfolgend beschrieben:

Methode zur quantitativen, chiralen Bestimmung von tert-butoxy-phenyl-2-propanon Meth. Kurzname: tB-PAC-C

Säule: Chiracel OD-RH , 150 ^* 4, 6mm (Daicel)

Vorsäule : C18 ODS

Temperatur: 40 ⁰ C

Flussrate: 0,50 ml/min

Injektionsvolumen: 5,0 μl

Delektion: UV 210nm

Stopzeit: 45,0 Minuten

Nachlaufzeit: 0,0 Minuten

Maximaldruck: 75 bar

Eluent A: 1 OmM KH2P04, pH2,5

Eluent B: Acetonitril

Gradient: Zeit [min] A [%] B [%] Fluss [ml/min]

0,0 75,0 25,0 0,50

25,0 73,0 27,0 0,50

27,0 40,0 60,0 0,50

37,0 40,0 60,0 0,50

40,0 73,0 27,0 0,50

45,0 75,0 25,0 0,50

Matrix: Fermentationsbrühen, Enzymansätze. Probe wird durch 0,22 μm filtriert

Kommentar: Kalibrierung: kein reines Standardmaterial vorhanden

Analyten: Retentionszeiten [min]

(-)-tert-butoxy-phenylacetcarbinol 23,85

(+)-tert-butoxy-phenylacetcarbinol 24,77

(R)-1 -Hydroxy-1 -(4-tert.-butoxyphenyl)-2-propanon:

1 -H-NMR (400MHz, CDCL3, δ in ppm): 1 ,35 ppm (s, 9 H), 2,1 (s, 3H), 4,25 (br, 1 H), 5,1 (s, 1 H), 7,0 (d, 2H), 7,2 (d, 2H).