本発明は、エステル化反応に使用した固� ��化脂質分解酵素と溶剤を混合し、固定化脂� ��分解酵素中の油分残存量が固定化担体100質� ��部に対して50質量部以下になるように洗浄� �、次いでアルカリ溶液を接触させた後固定� �担体を回収し、当該固定化担体に脂質分解� �素を吸着させる固定化脂質分解酵素の製造� �法を提供するものである。

 本発明は、エステル化反応に使用した使� ��済み固定化酵素の固定化担体を有効利用し� ��使用前と同等の性能を有する固定化脂質分� ��酵素を製造する方法を提供することに関す� ��。

 ここで、固定化脂質分解酵素を用いてジ� ��シルグリセロール(以下、「DAG」と記載する )を製造する場合、上記の従来技術による再� �固定化酵素を使用すると、DAG含有油脂のDAG� �度が低下することが判明した。そこで、本� �明者は、DAGの純度が低下する原因について� �々検討したところ、再生した固定化酵素中� �活性が低下した酵素が残存していることに� �因があることを見出した。すなわち、脂質� �解活性が低下しても転移活性が残っている� �め、1,3-DAGから1,2-DAGへの転位を経てトリアシ ルグリセロール(以下、「TAG」と記載する)が� ��成し、DAGの純度が低くなっていたのである� ��そこでさらに検討したところ、固定化酵素� ��溶剤で洗浄した後、アルカリ溶液によって� ��理すれば、エステル化反応に使用された固� ��化担体から活性が低下した酵素をほぼ完全� ��脱離できることを見出した。そして、その� ��、回収した固定化担体に新たな脂質分解酵� ��を吸着させることによって、目的とする固� ��化脂質分解酵素を製造することができるこ� ��を見出した。

 本発明によれば、エステル化反応におけ� ��使用済み固定化酵素の固定化担体を有効利� ��し、使用前と同等の活性を有する固定化脂� ��分解酵素とすることができる。そして、本� ��明の方法により製造された固定化脂質分解� ��素を用いれば、DAG純度の高いDAG含有油脂を� ��造することができる。

 本発明の製造方法の対象となる固定化酵� ��(使用済み固定化酵素)は、エステル化反応� �使用され、脂質分解活性が低下した固定化� �質分解酵素である。エステル化反応として� �、例えば後記に示すグリセリンと脂肪酸又� �その低級アルキルエステルとのエステル化� �応が挙げられる。

 本発明の製造方法の対象となる固定化酵� ��における固定化担体としては、セライト、� ��イソウ土、カオリナイト、シリカゲル、モ� ��キュラーシーブス、多孔質ガラス、活性炭� ��炭酸カルシウム、セラミックス等の無機担� ��、セラミックスパウダー、ポリビニルアル� ��ール、ポリプロピレン、キトサン、イオン� ��換樹脂、疎水吸着樹脂、キレート樹脂、合� ��吸着樹脂等の有機高分子等が挙げられるが� ��特にイオン交換樹脂が好ましい。

 イオン交換樹脂としては、多孔質の陰イ� ��ン交換樹脂が好ましい。このような多孔質� ��体は、大きな表面積を有するため、酵素の� ��り大きな吸着量を得ることができる。樹脂� ��粒子径は100~1000μmが好ましく、細孔径は10~15 0nmが好ましい。

 陰イオン交換樹脂については、特許文献1に 、疎水性に基づく吸着が強いので担体から酵 素が脱離しにくく、使用することにより失活 した酵素を脱着して担体を再利用することは 困難であることが記載されている。これに対 し、本発明は、固定化酵素を溶剤で洗浄した 後、アルカリ溶液で処理すれば、酵素が疎水 性吸着した担体においても酵素が容易に脱離 し、また新しい酵素も吸着するため、担体を 再利用できることを見出したものである。
 本発明において、陰イオン交換樹脂の材質� ��しては、フェノールホルムアルデヒド系、� ��リスチレン系、アクリルアミド系、ジビニ� ��ベンゼン系等が挙げられ、特に本発明の効� ��を良好に発揮する点からフェノールホルム� ��ルデヒド系樹脂(例えば、Rohmand Hass社製Duoli te A-568)が好ましい。

 本発明において、脂質分解酵素としてはリ� ��ーゼが挙げられる。リパーゼの種類は、任� ��に選択することができるが、DAG純度の高いD AG含有油脂を製造する点から、1,3位選択性リ� ��ーゼが好ましい。
 リパーゼは、動物由来、植物由来のものは� ��とより、微生物由来の市販リパーゼを使用� ��ることもできる。微生物由来リパーゼとし� ��は、リゾプス(Rhizopus)属、アスペルギルス(As pergillus)属、ムコール(Mucor)属、リゾムコール( Rhizomucor)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、ジ オトリケム(Geotrichum)属、ペニシリウム(Penicill ium)属、キャンディダ(Candida)属等の起源のも� �が挙げられる。

 使用済み固定化酵素の洗浄に使用する溶剤� ��しては、n-ヘキサン、アセトン、クロロホ� �ム、エタノール、メタノール、酢酸エチル� �アセトニトリル、酢酸、ペンタン、オクタ� �等が挙げられ、酵素の油分の除去性の点か� �n-ヘキサン、アセトン、エタノールが好まし く、特に酵素の油分の除去性の点と溶剤の除 去性の点からn-ヘキサンが好ましい。
 洗浄方法は、バッチ式混合、連続式接触等� ��挙げられるが、操作性の点からバッチ式混� ��が好ましい。洗浄後、固定化酵素から溶剤� ��濾過・減圧留去等の方法により除去するこ� ��が好ましい。

 洗浄は、洗浄後の油分付着量が少なくなり� ��アルカリ処理工程で油分とアルカリとのケ� ��化が低減し、操作性が良くなる点から、洗� ��後の固定化脂質分解酵素中の油分残存量が� ��定化担体100質量部(以下、単に「部」で表す )に対して50部以下になるように行う。洗浄後 の固定化脂質分解酵素中の油分残存量は、同 様の点から、更に1~50部、特に同様の点及び� �理コストの点から10~40部が好ましい。洗浄操 作は、一回だけ行ってもよく、数回繰り返し 行ってもよい。
 油分残存量は、固定化担体質量に対して残� ��する油分の質量を測定し、下記式(1)より固� ��化担体100部に対する質量比として求めるこ� ��とする。
   油分残存量=(a-b)/b×100(a:固定化酵素質量� �b:固定化担体質量)  (1)

 溶剤により洗浄した後、アルカリ溶液を接� ��させて使用済み固定化酵素から酵素を脱離� ��せる。本発明においてアルカリ溶液に使用� ��るアルカリとしては、例えば水酸化ナトリ� ��ム、水酸化カリウム、炭酸カルシウム、炭� ��カリウム等が挙げられるが、使用済み酵素� ��除去性の点から水酸化ナトリウムが好まし� ��。
 アルカリ溶液との接触方法は、バッチ式混� ��、連続式接触等が挙げられるが、操作性の� ��からバッチ式混合が好ましい。接触方法は� ��静置、攪拌、振とう等が挙げられる。

 使用済み固定化酵素から酵素を脱離させ� ��ために使用するアルカリ溶液の温度は、製� ��した固定化酵素の活性を有効に引き出し、D AG純度の低下を防止する点から、0~70℃が好ま しく、30~65℃がより好ましく、特に40~60℃が� �ましい。なお、ここでいう「DAG純度」とは� �DAG及びTAG中のDAGの質量%(以下、単に「%」で� �す)をいい、式で表すと、DAG/(TAG+DAG)×100であ� ��。

 また、アルカリ溶液の濃度は、製造した� ��定化酵素の活性を有効に引き出し、DAG純度� ��低下を防止する点から、0.25~2規定が好まし� ��、特に0.8~1.5規定が好ましい。

 アルカリ溶液との接触時間は、製造した固� ��化酵素の活性を有効に引き出し、DAG純度の� ��下を防止する点から、2~48時間が好ましく、 特に20~30時間が好ましい。
 アルカリ溶液を接触させた後、水洗、pH処� �等によりアルカリを除去するのが好ましい� �

 新たな脂質分解酵素を固定化する場合、� ��定化担体に酵素を直接吸着してもよいが、� ��活性を発現するような吸着状態にするため� ��酵素吸着前に予め固定化担体を脂溶性脂肪� ��又はその誘導体で処理することが好ましい� ��脂溶性脂肪酸又はその誘導体と固定化担体� ��接触法としては、水又は有機溶剤中にこれ� ��を直接加えてもよいが、分散性を良くする� ��め、有機溶剤に脂溶性脂肪酸又はその誘導� ��を一旦分散、溶解させた後、水に分散させ� ��担体に加えてもよい。この有機溶剤として� ��、クロロホルム、ヘキサン、エタノール等� ��挙げられる。脂溶性脂肪酸又はその誘導体� ��使用質量は、固定化担体100部に対して1~500� �、特に10~200部が好ましい。接触温度は0~100℃ 、特に20~60℃が好ましく、接触時間は5分~5時� ��程度が好ましい。この処理を終えた担体は� ��ろ過して回収するが、乾燥してもよい。乾� ��温度は室温~100℃が好ましく、減圧乾燥を行 ってもよい。

 予め担体を処理する脂溶性脂肪酸又はそ� ��誘導体のうち、脂溶性脂肪酸としては、炭� ��数4~24、好ましくは炭素数8~18の飽和又は不� �和の、直鎖又は分岐鎖の、水酸基を有して� �てもよい脂肪酸が挙げられる。具体的には� �カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、� �レイン酸、リノール酸、α-リノレン酸、リ� �ノール酸、イソステアリン酸等が挙げられ� �。また前記脂溶性脂肪酸の誘導体としては� �これらの脂溶性脂肪酸と一価若しくは多価� �ルコール又は糖類とのエステル、リン脂質� �及びこれらのエステルにエチレンオキサイ� �を付加したもの等が挙げられる。具体的に� �、上記脂肪酸のメチルエステル、エチルエ� �テル、モノグリセライド、ジグリセライド� �それらのエチレンオキサイド付加体、ポリ� �リセリンエステル、ソルビタンエステル、� �ョ糖エステル等が挙げられる。これら脂溶� �脂肪酸及びその誘導体はいずれも常温(20℃)� ��液状であることが酵素を担体に固定化する� ��程上好ましい。これら脂溶性脂肪酸又はそ� ��誘導体としては、上記2種以上を併用しても よく、菜種脂肪酸、大豆脂肪酸等の天然由来 の脂肪酸を用いることもできる。

 酵素の固定化を行う温度は、酵素の特性� ��よって決定することができるが、酵素の失� ��が起きない0~60℃、特に5~40℃が好ましい。� �た固定化時に使用する酵素溶液のpHは、酵素 の変性が起きない範囲であればよく、温度同 様酵素の特性によって決定することができる が、pH3~9が好ましい。このpHを維持するため� �は緩衝液を使用するが、緩衝液としては、� �酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝� �等が挙げられる。

 上記酵素溶液中の酵素濃度は、固定化効� ��の点から酵素の飽和溶解度以下で、かつ十� ��な濃度であることが望ましい。また、酵素� ��液は、必要に応じて不溶部を遠心分離で除� ��した上澄や、限外濾過等によって精製した� ��のを使用することもできる。また、用いる� ��素量は、固定化担体100部に対して5~1000部、� ��に10~500部が好ましい。

 固定化担体への酵素の吸着率は固定化酵� ��の活性を高める点、及び酵素コストの点か� ��高いほど好ましい。酵素吸着率は50%以上、� ��に80%以上、特に92%以上、殊更94~99%が好まし� ��。なお、ここでいう「酵素吸着率」とは、� ��素吸着前の酵素溶液の活性に対する酵素吸� ��後の酵素溶液(固定化酵素を除いた部分)の� �性の残存率をいう。

 本発明においては、脂質分解酵素を固定� ��担体に吸着固定化した後、乾燥せずに、脂� ��性脂肪酸、脂肪酸トリグリセライド又は脂� ��酸部分グリセライド等に接触させながら脱� ��することにより、残存水分量を調整するの� ��好ましい。

 残存水分量は、保存安定性の点から固定� ��担体100部に対して1~50部、特に1~30部になる� �うに調整されることが好ましい。

 残存水分量を調整するのに使用される脂� ��性脂肪酸としては、菜種油、大豆油、ひま� ��り油等の植物性の液状油脂若しくはイワシ� ��、マグロ油、カツオ油等の魚油から生成さ� ��た脂肪酸が好ましい。なお、使用する脂肪� ��、脂肪酸トリグリセライド又は脂肪酸部分� ��リセライドは、本発明方法により調製され� ��固定化酵素を用いた実際のエステル化反応� ��おいて、油相基質とするものを選択するこ� ��が好ましい。

 残存水分量を調整するのに使用される脂� ��酸、脂肪酸トリグリセライド又は脂肪酸部� ��グリセライドの量は、固定化酵素との接触� ��十分なものとし、かつ過剰量の使用による� ��駄を回避する点、及び流動性を高め脱水効� ��を向上させる点から、固定化担体100部に対� ��て20~3000部が好ましいが、100~1000部とするこ� ��がより好ましい。

 本発明方法により得られた固定化酵素(以 下、「本発明固定化酵素」という)を用いてDA Gを製造すれば、高純度のDAG含有油脂(DAG+TAG中 のDAGが高比率)を調製することができる。DAG� �有油脂のDAG純度は生理機能の点から50%以上� �好ましく、さらには65%以上、特に80~100%、殊� ��93~98%が好ましい。また、DAG含有油脂中のTAG� ��有量は20%以下が好ましく、更には10%以下、� ��に5%以下、殊更4%以下が好ましい。

 また、本発明固定化酵素を用いてDAGを製造� ��れば、未使用の固定化担体に酵素を吸着さ� ��て得られた固定化酵素(以下、「新規固定化 酵素」という)を用いてDAGを製造した場合と� �ぼ同等のDAG純度のDAG含有油脂が得られる。� �発明固定化酵素を用いた場合のDAG純度と、� �規固定化酵素を用いた場合のDAG純度との差� �すなわち下記式(2)で定義されるDAG含有油脂� �「DAG純度の差」は、-0.9%以上が好ましく、更 には-0.7%以上、特に-0.5%以上が好ましい。
   DAG純度の差=(本発明固定化酵素を用いた� ��合のDAG純度)-(新規固定化酵素を用いた場合� ��DAG純度)  (2)
 また、本発明固定化酵素を用いた場合のTAG� ��有量と、新規固定化酵素を用いた場合のTAG� ��有量との差、すなわち下記式(3)で定義され� ��DAG含有油脂中の「TAG含有量の差」は、0.6%以 下が好ましく、更には0.3%以下が好ましい。
   TAG含有量の差=(本発明固定化酵素を用い� ��場合のTAG含有量)-(新規固定化酵素を用いた� ��合のTAG含有量)  (3)

 本発明におけるDAGの製造方法としては、グ� ��セリンと脂肪酸又はその低級アルキルエス� ��ルとのエステル化反応が挙げられる。
 ここで、エステル化反応に用いる脂肪酸又� ��その低級アルキルエステルとしては、直鎖� ��は分岐鎖の炭素数4~22、好ましくは炭素数8~1 8の飽和又は不飽和脂肪酸が好ましく、例え� �酪酸、吉草酸、カプロン酸、エナント酸、� �プリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウ� �デカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パ� �ミチン酸、ゾーマリン酸、ステアリン酸、� �レイン酸、エライジン酸、リノール酸、リ� �レン酸、アラキドン酸、ガドレン酸、アラ� �ン酸、ベヘン酸、エルカ酸、エイコサペン� �エン酸、ドコサヘキサエン酸等を用いるこ� �ができる。また上記脂肪酸とエステルを形� �する低級アルコールとしては、炭素数1~6の� �の、例えばメタノール、エタノール、1-プロ パノール、2-プロパノール、n-ブタノール、2- ブタノール又はt-ブタノールなどが挙げられ� ��。これらの脂肪酸又はその低級アルキルエ� ��テルは、2種以上を併用することもできる。 また、上記脂肪酸の混合物、例えば大豆脂肪 酸などの天然由来の脂肪酸を用いることもで きる。

 この反応において、脂肪酸又はその低級ア� ��キルエステルとグリセリンの反応モル比R〔 R=脂肪酸又はその低級アルキルエステル(mol)/� ��リセリン(mol)〕は、1.5~3.0が好ましく、更に� ��1.6~2.8、特に1.8~2.6であるのが好ましい。
 また、エステル化反応の反応温度は、特に� ��定されないが、20~80℃、特に30~70℃が反応性 の点で好ましい。また反応時間は工業的な生 産性の観点から10時間以内が好ましい。

 エステル化反応により得られたDAG含有油� ��は、後処理を行うことにより製品とするこ� ��ができる。後処理は、脱酸(未反応の脂肪酸 及び副生したモノアシルグリセロールを除去 )、酸処理、水洗、脱臭の各工程を行うこと� �好ましい。脱酸工程は、エステル化反応に� �り得られたDAG含有油脂を減圧蒸留すること� �より、反応生成物から未反応の脂肪酸及び� �生したモノアシルグリセロールを除去する� �程をいう。酸処理工程は、前記脱酸油にク� �ン酸等のキレート剤を添加、混合し、必要� �応じて更に減圧脱水する工程をいう。また� �得られた酸処理油は、色相、風味を更に良� �とする点から、吸着剤との接触による脱色� �程を行っても良い。水洗工程は、前記酸処� �油に水を添加して強攪拌し、油水分離を行� �操作を行う工程をいう。水洗は複数回(例え� ��3回)繰り返し、水洗油を得るのが好ましい� �脱臭工程は、前記水洗油を減圧水蒸気蒸留� �る工程をいう。脱臭は、バッチ式、連続式� �半連続式等が挙げられ、薄膜脱臭装置また� �トレイ式脱臭装置の単独で行う方法の他、� �れら薄膜脱臭装置を用いた脱臭処理とトレ� �式脱臭装置を用いた脱臭処理とを組み合わ� �て行ってもよい。