Zur Identifizierung neuer Liganden für diagnostische, biomedizinische und pharmazeutische Anwendungen können kombinatorische Bibliotheken, bestehend aus einer Population einer Vielzahl von Partikeln, z. B. Phagen, Zellen, Ribosomen etc., eingesetzt werden, wobei die einzelnen Partikel jeweils unterschiedliche Liganden präsentieren (siehe z. B. W090/02809 ; W092/15677 ; W092/15679 ; WO92/06204-, WO92/06176 ; W098/19162 ; W098/35232 ; W099/06839 und W099/5428). Zur Identifizierung von Liganden mit einer vorbestimmten Eigenschaft wird üblicherweise eine Musterung der zu untersuchenden Bibliothek durchgeführt, wobei ein markiertes Zielmolekül mit den einzelnen Partikeln der Bibliothek in Kontakt gebracht wird und das Auftreten einer Bindung zwischen dem Zielmolekül und einem bestimmten Partikel der Bibliothek bzw. dem von dem Partikel präsentierten Liganden bestimmt wird. Anschließend muss das Partikel mit der vorbestimmten Eigenschaft identifiziert werden. Bisherige Selektions- und Identifizierungsmethoden, z. B. die sogenannten"Penning"-oder "Selex"-Verfahren haben jedoch eine relativ geringe Effizienz, sodass ein bestimmtes Partikel mit gewünschten Eigenschaften oftmals nicht in der Bibliothek gefunden werden kann, obwohl es dort vorhanden ist, Ein direkter Nachweis von einzelnen Analytmolekülen ist mit dem im europäischen Patent 0 679 251 beschriebenen Verfahren zur Fluoreszenz- Korrelationsspektroskopie (FCS) beschrieben. Mittels FCS kann in einem

kleinen Messvolumen von beispielsweise < 10-'41 ein einziges oder nur wenige mit Fluoreszenzfarbstoffen markierte Moleküle nachgewiesen werden. Das Messprinzip der FCS beruht darauf, dass ein kleines Volumenelement der Probeflüssigkeit einem starken Anregungslicht, z. B. eines Lasers ausgesetzt wird, sodass nur die jenigen Fluoreszenzmoleküle, die sich in diesem Messvolumen aufhalten, angeregt werden. Das emittierte Fluoreszenzlicht aus diesem Volumenelement wird dann auf einen Detektor, z. B. einen Fotomultiplyer abgebildet. Ein Molekül, das sich im Volumenelement befindet, wird sich gemäß seiner charakteristischen Diffusionsgeschwindigkeit mit einer durchschnittlichen, aber für das betreffende Molekül charakteristischen Zeit wieder aus dem Volumenelement entfernen und dann nicht mehr zu beobachten sein.

Wird nun die Lumineszenz ein-und desselben Moleküls während seiner durchschnittlichen Aufenthaltsdauer in dem Messvolumen mehrmals angeregt, so lassen sich von diesem Molekül viele Signale erfassen.

Die Anwendung der Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie zur Sortierung und Identifizierung einzelner Moleküle ist bei Eigen und Rigler (Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 91 (1994), 5740-5747) und Rigler (J. Biotech. 41 (1995), 177-186) beschrieben. Es wird die Verwendung einer Quadrupol-Falle und elektrischer Feldgradienten in Verbindung mit Einzelphotonendetektoren zur Identifizierung von Einzelmolekülen vorgeschlagen. Obwohl dieses Verfahren gegenüber den klassischen Selektionierungsprozeduren eine erheblich höhere Effizienz aufweist, erfordert die Selektion von Einzelmolekülen die Verwendung extrem geringer Partikelkonzentrationen und ist zeitaufwendig.

Es besteht daher ein Bedürfnis, die Sensitivität und Effizienz bei der Selektionierung von Partikeln zu verbessern.

Diese Aufgabe wird gelost durch ein Verfahren zur Selektion eines Partikels mit einer vorbestimmten Eigenschaft aus einer Population einer Vielzahl unterschiedlicher Partikeln, umfassend die Schritte :

(a) Bereitstellen einer Population von unterschiedlichen Partikeln, (b) Markieren von Partikeln, die die vorbestimmte Eigenschaft aufweisen, (c) Leiten der Partikel in einem Mikrokanal durch ein Detektionselement, das zwischen markierten und nicht markierten Partikeln unterscheiden kann, (d) Abtrennen markierter Partikel, und (e) mindestens einmaliges Wiederholen der Schritte (c) und (d), wobei die Konzentration der Partikel in einem nachfolgenden Zyklus gegenüber einem vorhergehenden Zyklus verringert wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Selektion von einzelnen Partikeln aus sehr großen Partikelpopulationen, die beispielsweise mehr als 108 oder sogar 1012 oder mehr unterschiedliche Partikel umfassen. Die Partikel können Zellen, Teile von Zelloberflächen, Zellorganellen, z. B.

Ribosomen, Viren wie etwa Bakteriophagen, z. B. filamentöse Phagen oder in Phagenhüllen verpackte Plasmide (Phagemide), Nukleinsäuren wie Gene oder cDNA-Moleküle, Proteine wie etwa Enzyme oder Rezeptoren, oder niedermolekulare Substanzen sein. Vorzugsweise sind die Partikel Elemente einer kombinatorischen Bibliothek, z. B. einer Bibliothek von genetischen Packungen wie Phagen, Zellen, Sporen oder Ribosomen, die auf ihrer Oberfläche Peptidstrukturen, z. B. lineare oder zirkuläre Peptide, oder Proteine wie Antikörper, vorzugsweise fusioniert mit Oberflächenproteinen, z. B. Oberflächenproteinen von filamentösen Phagen, präsentieren.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht eine effiziente Selektion eines Partikels mit einer vorbestimmten Eigenschaft aus einer Vielzahl unterschiedlicher Partikel. Unter"vorbestimmte Eigenschaft"im Sinne der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise die Fähigkeit zur Bindung an eine Zielsubstanz zu verstehen. Die Bindung des Partikels an die Zielsubstanz kann eine Liganden-Rezeptor-Bindung, eine Enzym-Substrat-Bindung, eine Antikörper-Antigen-Bindung, eine Nukleinsäurehybridisierung, eine Zucker- Lectin-Bindung oder eine andere hochaffine biologische Wechselwirkung

umfassen. Andererseits kann die vorbestimmte Eigenschaft des Partikels auch darin bestehen, eine biologische Wechselwirkung, z. B. die Bindung an eine Zielsubstanz, zu verhindern.

Zur Selektion des Partikels mit der vorbestimmten Eigenschaft wird die Partikelpopulation vorzugsweise mit einer eine nachweisbare Markierung tragenden Zielsubstanz inkubiert, wobei die Inkubationsbedingungen derart gewährt werden, dass das Partikel mit der vorbestimmten Eigenschaft an eine Markierungsgruppe bindet und so von anderen Partikeln abgetrennt werden kann. Als Markierungsgruppen kommen insbesondere nicht radioaktive Markierungsgruppen und besonders bevorzugt durch optische Methoden nachweisbare Markierungsgruppen, wie etwa Farbstoffe, und insbesondere Fluoreszenzmarkierungsgruppen in Betracht. Beispiele für geeignete Fluoreszenzmarkierungsgruppen sind Rhodamin, Texas-Rot, Phycoerythrin, Fluorescein und andere in diagnostischen Verfahren oder Selektionsverfahrenübliche Fluoreszenzfarbstoffe.

Die markierte Zielsubstanz ist für das zu identifizierende Partikel spezifisch, d. h. die Zielsubstanz bindet unter den Testbedingungen mit ausreichend hoher Affinität und Selektivität an das Partikel mit der vorbestimmten Eigenschaft, um eine Selektion zu ermöglichen.

Gegebenenfalls kann die vorbestimmte Eigenschaft des zu selektionierenden Partikels auch eine biologische Aktivität, z. B. eine enzymatische Aktivität sein. In diesem Fall können die Partikel mit einem chromogenen oder fluoreszenten Enzymsubstrat inkubiert und in Vesikeln, z. B. Lipidvesiklen wie Liposomen, verkapselt werden. Sofern ein Partikel, z. B. ein Phage oder ein Ribosom, an seiner Oberfläche ein aktives Enzymmolekül präsentiert, erfolgt innerhalb des Vesikels eine Umsetzung des Substrats, wobei ein farbiges oder fluoreszentes Produkt gebildet wird,. welches nachgewiesen werden kann.

Zur Unterscheidung von markierten Partikeln, d. h. Partikeln mit der vorbestimmten Eigenschaft, und nicht markierten Partikeln, d. h. Partikeln ohne die vorbestimmte Eigenschaft, werden die Partikel in einem Mikrokanal durch ein Detektionselement geleitet. Das Leiten durch den Mikrokanal erfolgt vorzugsweise durch einen hydrodynamischen Fluss, beispielsweise durch Saug-oder Pumpwirkung. Der Fluss kann jedoch auch ein elektroosmotischer Fluss sein, der durch einen elektrischen Feldgradienten erzeugt wird. Weiterhin ist eine Kombination von hydrodynamischem Fluss und Feldgradienten möglich. Der Fluss durch den Mikrokanal weist vorzugsweise ein parabolisches Flussprofil auf, d. h. die Fließgeschwindigkeit ist maximal im Zentrum des Mikrokanals und nimmt in einer parabolischen Funktion zu den Rändern bis zu einer Minimalgeschwindigkeit ab. Die <BR> <BR> Flussgeschwindigkeit durch den Mikrokanal liegt im Maximum vorzugsweise im Bereich von 1 bis 50 mm/sec, besonders bevorzugt im Bereich von 5 bis 10 mm/sec. Der Durchmesser des Mikrokanals liegt vorzugsweise im Bereich von 1 bis 100, um, besonders bevorzugt von 10 bis 50, um.

Vorzugsweise wird die Messung in einem linearen Mikrokanal mit im Wesentlichen einem konstanten Durchmesser durchgeführt.

Die Identifizierung eines markierten Partikels kann mittels einer beliebigen Messmethode, z. B. mit einer orts-und/oder zeitaufgelösten Fluoreszenz- Spektroskopie erfolgen, die in der Lage ist, in einem sehr kleinen Volumenelement wie es in einem Mikrokanaf vorliegt, sehr geringe Signale von Markierungsgruppen, insbesondere Fluoreszenzsignale bis hinunter zur Einzelphotonenzählung zu erfassen. Wichtig ist dabei, dass die von markierten Partikein stammenden Signale sich deutlich von denen unterscheiden, die von den markierten Partikeln verursacht werden.

Beispielsweise kann die Detektion mittels Fluoreszenz- Korrelationsspektroskopie erfolgen, bei der ein sehr kleines konfokales Volumenelement, beispielsweise 0,1 bis 20 x 1 o-15 I der durch den Mikrokanal strömenden Probeflüssigkeit einem Anregungslicht eines Lasers

ausgesetzt wird, das die in diesem Messvolumen befindlichen Rezeptoren zur Emission von Fluoreszenzlicht anregt, wobei das emittierte Fluoreszenzlicht aus dem Messvolumen mittels eines Fotodetektors gemessen wird, und eine Korrelation zwischen der zeitlichen Veränderung der gemessenen Emission und der relativen Flussgeschwindigkeit der beteiligten Moleküle erstellt wird, sodass bei entsprechend starker Verdünnung einzelne Moleküle in dem Messvolumen identifiziert werden können. Auf Einzetheiten zur Verfahrensdurchführung und apparative Details zu den für die Detektion verwendeten Vorrichtungen wird auf die Offenbarung des europäischen Patentes 0 679 251 verwiesen.

Alternativ kann die Detektion auch durch eine zeitaufgelöste Abklingmessung, ein sogenanntes Time Gating erfolgen, wie beispielsweise von Rigler et al.,"Picosecond Single Photon Fluorescence Spetroscopy of Nucleic Acids", in :"Ultrafast Phenomenes", D. H. Auston, Ed., Springer 1984, beschrieben. Dabei erfolgt die Anregung der Fluoreszenzmoleküle innerhalb eines Messvolumens und anschließend-vorzugsweise in einem zeitlichen Abstand von Z ! : 100 ps-das Öffnen eines Detektionsintervalls am Fotodetektor. Auf diese Weise können durch Raman-Effekte erzeugte Hintergrundsignale ausreichend gering gehalten werden, um eine im Wesentlichen störungsfreie Detektion zu ermöglichen.

Besonders bevorzugt umfasst die Vorrichtung zum Nachweis von fluoreszenzmarkierten Partikeln in der den Mikrokanal durchströmenden Probeflüssigkeit einen Laser als Fluoreszenzanregungslichtquelle für die Moleküle, eine optische Anordnung zur Leitung und Fokussierung von Laserlicht des Lasers auf einen Fokalbereich des Mikrokanals und zur konfokalen Abbildung des Fokalbereichs auf eine Fotodetektoranordnung zur Erfassung von Fluoreszenzlicht, welches im Fokalbereich von einem oder gegebenenfalls mehreren optisch angeregten Molekülen emittiert wurde, wobei die optische Anordnung ein Beugungselement oder ein phasenmodulierendes Element im Strahlengang des Lasers aufweist,

welches gegebenenfalls in Kombination mit einem oder mehreren optischen Abbildungselementen dazu eingerichtet ist, aus dem Laserstrahl des Lasers ein Beugungsmuster in Form eines linearen oder zweidimensionalen Arrays von Fokalbereichen in dem Mikrokanal zu erzeugen, wobei die optische Anordnung dazu eingerichtet ist, jeden Fokalbereich konfokal für die Fluoreszenzdetektion durch die Fotodetektoranordnung abzubilden.

Alternativ kann die Detektionsvorrichtung zwei den Mikrokanal an einander gegenüberliegenden Seiten begrenzende Wände aufweisen, von denen eine ein Array von vorzugsweise integrierten, in den Mikrokanal emittierenden Laserelementen als Fluoreszenzanregungslichtquellen aufweist, und von denen die andere ein Array von vorzugsweise integrierten, den Laserelementen jeweils gegenüberliegend zugeordneten Fotodetektorelementen als Fluoreszenzlichtdetektoren aufweist, wobei die Laserelemente vorzugsweise Potenzialtopflaserelemente und die Fotodetektorelemente Avalanche-Dioden sind. Derartige Vorrichtungen sind beispielsweise in DE 100 23 423.2 beschrieben.

Die durch das Detektionselement identifizierten markierten Partikel werden von nicht markierten Partikeln abgetrennt. Dieses Abtrennen kann durch eine Sortierungsprozedur, wie in Holm et al. (Analytical Methods and Instrumentation, Special Issue juTAS 96,85-87), Eigen und Rig (er (Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994), 5740-5747) oder Rigler (J. Biotech 41 (1995), 177-186) beschrieben, erfolgen. Vorzugsweise erfolgt eine automatische Sortierungsprozedur, wobei markierte und nicht markierte Partikel in unterschiedliche Verzweigungen des Mikrokanals geleitetwerden.

Die Steuerung der Sortierungsprozedur erfolgt vorzugsweise dadurch, dass nach Erkennen eines markierten Partikels im Detektionselement ein externes oder in die Mikrostruktur integriertes Ventil umgeschaltet wird, sodass das markierte Partikel in die dafür vorgesehene Verzweigung des Mikrokanals geleitet wird und anschließend das Ventil wieder umgeschaltet wird, sodass nicht markierte Partikel in die andere Verzweigung des Mikrokanals geleitet werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist ein Kaskadenprozess, der eine gegebenenfalls mehrfache Wiederholung der Detektions-und Abtrennschritte umfasst. Während die aus dem Stand der Technik bekannte Prozedur zur Selektion von Einzelmolekülen nur bei extrem hohen Verdünnungen und somit sehr großen Volumina zuverlässig durchführbar ist, wird beim erfindungsgemäßen Verfahren die Konzentration der durch die Detektionsvorrichtung geleiteten Partikel ausreichend hoch eingestellt, sodass das zu untersuchende Gesamtvolumen an Probeflüssigkeit, welches die Gesamtpopulation der Partikel enthält, gering gehalten werden kann.

Vorzugsweise wird für den ersten Selektionszyklus eine Partikelkonzentration von 108 bis 1014 pro 100, ul Probevolumen und besonders bevorzugt 10'° bis 1012 Partikel pro 100, ul Probevolumen eingesetzt. Bei diesen Bedingungen nimmt man zwar in Kauf, dass neben dem markierten Partikel auch eine Anzahl weiterer negativer Partikel, üblicherweise 102 bis 103 Partikel zunächst als positiv eingestuft werden.

Durch nachfolgende Selektionszyklen, die mit jeweils verringerter Konzentration gegenüber einem vorhergehenden Zyklus durchgeführt werden, können jedoch schließlich einzelne Partikel, welche die vorbestimmten Eigenschaften aufweisen, isoliert werden. Die Verringerung der Partikelkonzentration wird vorzugsweise so gewählt, dass in einem weiteren Selektionsschritt ein positiver Partikel eindeutig identifiziert werden kann. Beispielsweise kann die Partikelkonzentration pro Zyklus um mindestens den Faktor 104, vorzugsweise um den Faktor 106 bis 108 und besonders bevorzugt um ca. den Faktor 10'verringert werden. Das Probenvolumen erhöht sich dabei im allgemeinen nicht wesentlich, da durch den ersten Selektionszyklus eine signifikante Verringerung der Partikelzahl erzielt wurde. Gegebenenfalls können nach dem zweiten Selektionszyklus noch ein oder mehrere weitere Zyklen durchgeführt werden.

Weiterhin umfasst das erfindungsgemäße Verfahren vorzugsweise das Identifizieren oder/und Charakterisieren der gefundenen Partikel mit der vorbestimmten Eigenschaft. Dieser Schritt kann beispielsweise eine

Amplifizierung, z. B. im Falle von Zellen und Viren, eine Vermehrung oder im Falle von Nukleinsäuren eine Amplifikationsreaktion wie PCR oder eine Sequenzierung umfassen. Das identifizierte bzw. charakterisierte Partikel bzw. dessen charakteristische Determinante, z. B. ein auf der Oberfläche präsentiertes Protein, kann anschließend dem jeweils dafür vorgesehenen Verwendungszweck zugeführt oder als Grundlage zur Herstellung einer weiteren kombinatorischen Bibliothek, z. B. durch Mutagenese, eingesetzt werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird nach dem Markieren der Partikel, aber vor dem Einbringen der Partikel in die Detektionsvorrichtung eine Affinitäts-Vorselektionsprozedur vorgenommen. Hierzu erfolgt nach der Markierung, z. B. einer Behandlung der Partikelpopulation mit einem markierten Bindemolekül, ein weiterer Behandlungsschritt mit unmarkierten Bindemolekülen, sodass bei Partikeln, die das markierte Bindemolekül nur schwach gebunden haben, durch Dissoziation ein Austausch des markierten Bindemoleküls gegen das unmarkierte Bindemolekül stattfinden kann. Diese schwach bindefähigen und somit unerwünschten Partikel werden in diesem Fall bei der Selektionsprozedur von vornherein nicht als positiv erkannt und scheiden daher aus. Durch Einstellung der Bedingungen bei der Behandlung von markierten Partikeln mit unmarkierten Bindemolekülen kann die"Stringenz" der Affinitäts-Vorselektion eingestelltwerden. Durch Erhöhung der Zeitdauer der Inkubation, der Temperatur und der Konzentration unmarkierter Bindemoleküle wird eine Erhöhung der Stringenz erreicht.

Falls die vorbestimmte Eigenschaft des Partikels darin besteht, selektiv an eine Zielsubstanz, aber möglichst nicht an eine mit der Zielsubstanz nahe verwandte Substanz zu binden, kann vor oder/und nach der Markierung der Zielsubstanz eine Inkubation mit der nahe verwandten Substanz erfolgen, sodass Partikel mit einer Affinität für die nahe verwandte Substanz bei der Selektionsprozedur von vornherein nicht erfasst werden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Vorrichtung zur Selektion eines Partikels mit einer vorbestimmten Eigenschaft aus einer Population umfassend eine Vielzahl von unterschiedlichen Partikeln umfassend : (a) einen optisch transparenten Mikrokanal, (b) Mittel zum Einbringen von Partikeln in den Mikrokanal, (c) Mittel zur Detektion einer Markierung auf einem durch den Mikrokanal geleiteten Partikel, (d) Mittel zum Abtrennen eines markierten Partikeln von nicht markierten Partikeln, welche dadurch gekennzeichnet ist, dass die Mittel (c) und (d) derart ausgebildet sind, dass sie eine mindestens einmalige Wiederholung der Detektions-/Abtrennprozedur vorsehen.

Die Vorrichtung enthält vorzugsweise weiterhin automatische Manipulationsvorrichtungen, Heiz-oder Kühleinrichtungen wie Peltier- Elemente, Reservoirs und gegebenenfalls Zufuhrleitungen für Probeflüssigkeit und Reagenzien sowie elektronische Auswertungsgeräte.

Die Vorrichtung ist insbesondere zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet.

Weiterhin soll die Erfindung durch die nachfolgenden Figuren erläutert werden. Es zeigen : Figur 1 einen Ausschnitt einer Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Durch einen Mikrokanal (2) werden markierte Partikel (4) und nicht markierte Partikel (6) zu einem Detektionselement (8) transportiert. Bei Erkennung eines markierten Partikels (4) durch das Detektionselement (8) werden Ventile (nicht gezeigt) aktiviert, die an der Verzweigungsstelle (10) des Mikrokanals betätigt werden, sodass die markierten Partikel (4) in die Verzweigung (2a) und

unmarkierte Partikel in die Verzweigung (2b) geleitet werden.

Die Partikelkonzentration oder/und die Durchflussgeschwindigkeit durch den Mikrokanal werden beim erfindungsgemäßen Verfahren derart groß gewährt, sodass auch ein Eintritt nicht markierter Partikel (6) in die für markierte Partikel vorgesehene Verzweigung (2a) erfolgt. Durch gegebenenfalls mehrfache Wiederholung der Selektions- /Abtrennprozedur werden schließlich nur markierte Partikel erhalten.

Figur 2 das Prinzip der kaskadenartigen Selektions-/Abtrennprozedur.

Die durch den Mikrokanal (20) geleiteten Partikel werden-wie in Figur 1 gezeigt-an einer ersten Verzweigung in einen für die markierten Partikel vorgesehenen Arm (24a) und einen für die nicht markierten Partikel vorgesehen Arm (22a) des Mikrokanals aufgetrennt. Die durch den Kanalarm (24a) geleiteten Partikel werden an einer weiteren Verzweigung erneut in einen für markierte Partikel vorgesehen Arm (24b) und einen für nicht markierte Partikel vorgesehenen Arm (22b) aufgetrennt. Gegebenenfalls kann noch eine weitere Auftrennung der durch den Mikrokanal (24b) strömenden Partikel in einen Arm (24c) und einen Arm (22c) erfolgen.

Figur 3 eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit multiplen Eingängen. Partikel aus unterschiedlichen Subbibliotheken (30a, 30b, 30c, 30d, 30f) können an einem Schaltventil (32) in einen Mikrokanal (34) eingeleitet und dort der in Figur 1 und Figur 2 gezeigten Kaskaden-Selektions- /Abtrennprozedur unterzogen werden.

Figur 4 eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit multiplen Ausgängen. Die durch einen Mikrokanal (40)

strömenden Partikel werden an der Verzweigungsstelle (42) in mehrere Arme (44a, 44b, 44c, 44d) aufgetrennt. Die Auftrennung in mehr als zwei Arme kann beispielsweise bei Verwendung mehrerer Markierungsgruppen zweckmäßig sein, um Partikel mit keiner, jeweils einer oder mehreren Markierungsgruppen voneinander zu trennen. Alternativ kann die Trennung auch aufgrund der Intensität der Markierung durch Einstellung entsprechender Cutoff-Werte am Detektor erfolgen.