La présente invention concerne un procédé de sépara¬ tion de pro téines e t d ' acides gras u t i l i s ab l e d an s un pr o- cédé de- ractionnement industriel de ces protéines en vue d'obtenir des protéines purifiées et concentrées. Le fractionnemen des protéines est une opération mise en oeuvre dans diverses industries à des fins de :

- valorisation de sous-produits (par exemple traite¬ ment de sang animal issu des abattoirs ; traitement du peti lait et sous-produits de l'industrie laitière). -production ^' de produits à usage thérapeutique : fractionnement du plasma humain.

-valorisation de produits d'origine végétale (pois, fèveroie, colza,...).

En fonction de ces applications et des critères d qualité demandés pour les protéines obtenues, différente techniques de séparation ont été développées.

La précipitation globale des protéines par "coagula tion" à chaud ne fractionne pas les différentes protéine mais permet, à faible coût, de récupérer un ensemble d produits destinés généralement à l'alimentation animale.

L' ultrafiltration permet de séparer les protéine selon leur taille mais elle est essentiellement utilisé pour concentrer et purifier des solutions protéiques.

Les méthodes chroma ographiques, encore au stade d développement industriel, permettent un fractionnement de protéines, selon leurs affinités, par un adsorbant soude Très sensible à "l'empoisonnement" des adsorbants, cett technique prometteuse doit encore faire ses preuves sur l plan économique. Les techniques industrielles de fractionnement le plus utilisées reposent sur une précipitation sélective de protéines, en fonction des conditions de pH, de force ioni que, de la nature et de la concentration des agents précipi tants. Le procédé le plus répandu dans le monde pour l'ob tention de protéines plasmatiques est basé sur l'utilisatio de l'éthanoi (méthode de C0HN) . Ce procédé présente l'avan tagé d'être bien au point et de limiter les risques de con tamination bactérienne. Il est toutefois onéreux du fait d

coût de i'éthanoi et de la nécessité de travailler à froid, en dessous de 4°c.

D'autres agents précipitants ont été testés, cer¬ tains à l'échelle industrielle, notamment les acides gras de 6 à 14-atomes de carbone et en particulier l'acide capryii- que, qui présente l'avantage de permettre une séparation a température ambiante et d'être un agent stabilisant de nom¬ breuses protéines. Toutefois, ia récupération des protéines précipitées par l'acide capryiique pose de nombreux probiè- mes limitant i ¹ utilisation de cet agent de précipitation. Une redissolution efficace des précipités nécessite des quantités importantes de sels qui peuvent dénaturer certai¬ nes protéines et conduit à des solutions diluées en protéi¬ nes, ce qui nécessite, pour ia plupart des applications, une étape de concentration supplémentaire.

Un but de ia présente invention est de fournir un procédé permettant de récupérer les protéines dans des con¬ ditions douces, c'est-à-dire sans les altérer, et de recy¬ cler les acides gras utilisés pour ie frac ionnement de ces protéines.

A cet effet ce procédé rie séparation de protéines et d'acides ^* gras utilisés pour ie frac ionnement de ces pro¬ téines en vue d'obtenir des protéines purifiées et concen¬ trées, est caractérisé en ce qu'on fait diffuser l'acide gras à travers un support poreux imbibé d'une solution for¬ mant une membrane iiquide non miscible, d'une part, avec ia charge à traiter, constituée d'une solution d'acide gras et de protéines, laquelle est alimentée d'un côté du support poreux imbibé de ia membrane iiquide, et, d'autre part, avec une phase réceptrice de l'acide gras laquelle est alimentée de l'autre côté du support poreux.

Le procédé a membrane iiquide supportée suivant l'invention permet de faciliter ia dissolution des précipi¬ tés protéines-acide capryiique même a bas pH (pH 4,5 à 6) , d'obtenir directement des solutions finaies concentrées en protéines et de récupérer facilement tout ou partie de l'a¬ cide capryiique en vue d'un recyclage ultérieur.

.Les solutions obtenues lors de ia mise en oeuvre du

dénaturées. Des rendements supérieurs à 90 % en protéines peuvent être obtenus.

On décrira ci-après,à titre d'exemple non limitatif, une forme d'exécution de la présente invention, en référence au des'sin annexé qui est une vue en coupe schématique d'un appareil à membrane iiquide mettant en oeuvre le procédé suivant l'invention.

L'appareil mettant en oeuvre le procédé suivant l'invention qui est représenté sur le dessin, est constitué par un module à deux compartiments 1 et 2 séparés par un support poreux 3, lequel est imbibé d'une solution appelée membrane liquide non miscible avec une charge 6 que l'on désire traiter et une phase 4 appelée phase réceptrice. La charge 6 est constituée, par exemple, d'une suspension de précipité d'acide capryiique et de protéines dans une solu¬ tion en générale aqueuse. La phase réceptrice 4 est destinée à accumuler l'acide capryiique qui a diffusé à travers la membrane iiquide : on préférera des phases réceptrices dans lesquelles 1.'acide capryiique est très fortement soluble (par exemple des solutions aqueuses basiques) ou bien dans lesquelles cet acide peut être fortement complexé par un agent complexant adéquat ou encore peut être précipité sou forme d'un sel insoluble (par exemple sel de calcium, magné- sium, fer, zinc, ...) . L'acide capryiique doit de plus êtr facilement récupéré dans la phase réceptrice soit par évapo- ration de celle-ci, soit par fiitration soit par tout autr moyen de séparation connu.

Les solutions sortant du module sont, d'une part, une solution 5, sortant du compartiment 2, riche en acid capryiique et qui est dirigée vers une unité de récupératio de cet acide et, d'autre part, une solution 7, sortant d compartiment 1, riche en protéines solubilisées.

Le support poreux 3 doit présenter les caractéristi ques suivantes :

-forte densité de pores (de préférence supérieure 7520;

-faible diamètre de pores (de préférence ne dépassan

pas e m cron ;

- épaisseur minimale (de préférence inférieure à 200 microns) ;

-être constitué d'au moins un matériau préférentiei- iement mouillé par la membrane liquide, tel que, par exem¬ ple, polytétrafluoroéthyiène, poiyfluorovinyiidène, polymè¬ res hydrophobes pour des membranes liquides organiques, polycarbonate , cellulose ou tout autre polymère hydrophile dans le cas de membranes liquides hydrophiles; -présenter une surface maximaie

Le procédé suivant l'invention présente l'avantage de permettre ia redissoiution des protéines dans le milieu même où elles ont été précipitées, c'est-à-dire sans change¬ ment de pH ni de salinité. Il permet le recyclage des acides gras et donc un gain important sur le coût du fractionne¬ ment. Il est de plus facilement automatisable.

On donnera ci-dessous, à titre d'illustration, quel¬ ques exemples non limitatifs de mise en oeuvre du procédé selon l'invention. Exemple 1

Le support poreux est une membrane en polytétrafiuo- roéthylène (diamètre de pore 0,5 micron, épaisseur 100 mi¬ crons) . La surface d'échange dans ie module utilisé est de 7cm2. La membrane liquide est constituée d'une paraffine fluide à usage médical : (viscosité 14 cP à 20°C, indice de réfraction 1,457, point éclair : 160 ⁿ c) . La phase réceptrice est constituée par 90cm ² d'une solution de soude 0,6 N.

La charge à traiter est constituée par 3g d'un pré- cipité d'acide capryiique et d'albumine humaine broyé pen¬ dant 5 secondes dans un broyeur ménager. La composition pondérale de ce précipité est approximativement :

- albumine 33S

- acide capryiique 33% -humidité 33?

Le précipité est maintenu en suspension dans 87cm3 d'une solution d'acétate de sodium 0,06 M à pH 4,90. Les phases des deux compartiments 1 et 2 sont agitées mécanique-

Le tableau 1 ci-dessous donne les évolutions des concentrations dans les deux compartiments 1 et 2 et permet de calculer un flux de production de protéine égal à 55g/m ² .h.

^** Le rendement en acide capryiique exrait est d'envi¬ ron 60% au bout de 6 heures.

TABLEAU 1

Compartiment 1 Compartiment 2

TEMPS (h) 4 24 24

Exemple ^' 2

Le support poreux est ici une membrane en fluorure de polyvinyiène (diamètre de pore 0,22 micron ,épaisseur 100 microns) .Cette membrane est prise en sandwich entre deux supports hydrophiies très poreux lui conférant de bonnes propriétés mécaniques, d'épaisseur voisine de 100 microns chacun .L' ense ble se présente sous la forme d'une cartouche cylindrique contenant 0,7m ² d _e membrane plissée.La membrane iiquide est constituée de paraffine fluide. La solution réceptrice est un lait de magnésie à 59,2g/l en magnésie, p 10,2 ; volume 294 cm ³ . La charge à traiter est constituée d 25g d'un précipité d'albumine broyé au broyeur ménager, e

suspension dans 575 cm d'une solution d'acétate de sodiu 0,06 N, glucose 1,2 g/i à pH 4,8. La température est mainte nue à 20°C.

Le tableau ^' 2 ci-dessous montre que 59 % de l'albu mine sont dissous au bout de 6h 30 et qu'il n'y a pas d perte en albumine vers la phase réceptrice. On observe pe d'acide capryiique libre en phase réceptrice puisque celui ci est précipité sous forme de sel de magnésium insoluble.

TABLEAU 2

Compartiment 1 Compartiment 2

Exemp le 3 :

Le support poreux est une membrane hydrophile en polycarbonate d'épaisseur 30 microns environ, de diamètre de pore 1 micron. La membrane iiquide est une paraffine fluide. La phase réceptrice est une solu ion de soude de 0,06. N ( 90cm^ ) . Le compartiment 1 contient une solu ion d'acétate de sodium 0,06 M, pH 4,9.

A. bou de cinq minu es les pH se sont égalisés dans les deux phases traduisant ia non étanchéité de la membrane iiquide et la mau aise adhérence de la phase huileuse sur ce type de support. Aucune dissolution de précipité n'est ob¬ servée . Exemple 4: Le support 3 est une membrane en polycarbonate hy- drophobe piissée de 4m ² (diamètre des pores 0,22 micron, épaisseur 30 microns) en sandwhich entre deux supports hy¬ drophiles poreux. L'ensemble constitue une cartouche cylin¬ drique. La phase réceptrice est une solu ion d'acétate de sodium 0,06 M dont ie pH est maintenu voisin de 9,5 par ajou de soude. La phase à traiter dans ie compartiment 1 est une solution d'acétate de sodium 0,06 M dont ie pH est régulé à 6 et dans laquelle sont ajou és 54g d'un précipité d'albumine et d'acide capryiique. La température est d

Le tableau 3 ci-dessous montre l'évolu ion des con centrations dans les deux compartiments. Pn ne constat pratiquement pas de fuite en albumine dans ie compartimen 2. On observe une concentration importante d'acide capry ii que dans le liquide organique qui sert de membrane.

TABLEAU 3

Compartiment 1 Compartiment 2

(

Exemple 5 :

Dans un premier temps on montre que, dans les condi¬ tions de l'expérience, il n'est pas possible de disssoudre 2g d'un précipité d'albumine et d'acide capryiique dans 50g d'une solution d'acétate de-sodium 0,06 M pH 4,9. Pour cela ie précipité est vigoureusement dispersé dans ia solu ion d'acétate de sodium pendant 2 heures. Aucune concentration d'albumine soluble ne peut être détectée après ce traitement alors que l'acide capryiique a att int une concentration d'équilibre voisine de 15 mmoie/1.

On met alors en contact cette charge avec un système membrane iiquide - phase réceptrice et on suit l'évolution des concentrations dans la charge (compartiment 1) et dans ia phase réceptrice (compartiment 2).

Dans cet exemple, le support poreux est une membrane de 9 cm ² en poly t tra iuoroéth lène sur trame de poiyéthylè- ne haute densité. Le diamètre des pores est de 0,5 micron l'épaisseur d'environ 125 microns. Il est imprégné par 0,2g d'une phase organique constituée d'un alcool gras fluoré de formule CgF^ 3-C2H4- H . La charge à traiter 6 est constituée de 2g d'un précipité (contenant 45% d'albumine plasmatique ; 31% d'acide capryiique ; 24% d'eau) mis en suspension dans

phase réceptrice 4 (80g) est une solution 0,2 molaire d glycine dont ie pH est régulé h 9 par de ia soude. Ell contient initialement 3 g/i de glucose.

Le tableau 4 ci-dessous indique les évolu ions de concentrations dans les deux phases.

TABLEAU 4

Compartiment 1

TEMPS (h)

Acide capry¬ iique (mmoie/i) 15,3 13,7 12,4 10,1 5,96 Albumine

(g/D 0 0 0,18 0,98 4,36 pH 4,72 5,07 4,82 5,10 5,52

% d ' a lbum i¬ ne so l ub i l i sé 24

Compartiment 2

TEMPS (h)

Acide capry 1 ique (mmoie/1) 10,5 16,4 21,1 24,5 lbumine

(g/i) 0 0,2

_P H 8,98 9, 10 % d'albumi¬ ne solubilisée

45% de l'acide capryiique introduit se retrouvent dans ia phase réceptrice au bout de 5 heures alors que 24% de l'al¬ bumine ont été dissous dans le compartiment 1.

Le flux d'acide capryiique arrivant dans ia phase réceptrice est égal à 64 g/h.m ² . Après un temps de retard, l'albumine se dissout avec une vitesse voisine de 0,18 g/h dans les conditions de l'expérience.

Exemple 6 : Le module expérimentai, le support 3, la charge à raiter et la phase réceptrice sont identiques à ceux dé¬ crits dans l'exemple 5.

La membrane iiquide est constituée par 0,14 g de "tridécanoi" , un mélange d'alcools ramifiés à 13 carbones. Le tableau 5 ci-dessous donne les résultats obser¬ vés.

Compartiment 1

TEMPS (h)

Acide capry¬ iique

(mmole/i) 14,0 8,8 6,2 4,4 3,66

Albumine

(g/i) 0,31 1,79 3,26 4,12

PH 4,82 5,32 5,1 5,6

% d'aibumi- ne dissou 10 18 23

Compartiment 2

Exemple 7 :

Le module expérimentai, ie support, la charge et ia phase réceptrice utilisés sont ceux décrits dans l'exemple 5. La membrane iiquide est constitu e par 0,14g d'huile de siiicone .

Le tableau 6 ci-dessous donne l'évolution des con¬ centrations avec le temps.

Compartiment 1

Compartiment 2

e ac e capry que son r cup r s ans a phase réceptrice

14% de l'albumine se retrouvent sous forme dissoute dans le compartiment 1 au bout de 5 heures dans ces condi- tions.

Exemple 8 :

Le module expérimental, le support, ia charge et la phase réceptrice sont ceux décrits dans l'exemple 5.

La membrane iiquide est constituée par 0,17g d'un alcane fluoré de formule

Les concen rations mesurées sont données dans le tableau 7, ci-dessous. 33% de l'acide initiai sont retrouvés en phase réceptrice mais seulement 2% de l'albumine sont solubilisés dans le compartiment 1 où une accumulation d'a- cide plus élevée que pour les exemples précédents peut éga¬ lement être observée.

TABLEAU 7

Compartiment 1

Compartiment 2

Exemple 9:

Le module expérimentai contient le support poreux 3 qui est une membrane en polytétrafluoro thylène de diamètre de pore 0,02 micron et d'épaisseur environ 400 microns. La membrane iiquide est constituée de paraffine fluide. La phase réceptrice est une solution 0,2 molaire de glycine

La charge est constituée d'un précipité de transfé¬ rine plasmatique et d'acide capryiique dispersé dans 101g d'une solution d'acétate de sodium 0,06 molaire à pH 4,97. Au bout de 20 heures, le précipité s'est entièrement dissous (100% de dissolution) et la concentration de la transférine dans la charge est de 10,7g/l.