способ одновременного обнаружения множества рнк- последовательностей в биологическом образце

область техники

изобретение относится к молекулярной биологии, биотехнологии, генной инженерии и медицине и может быть использовано в качестве универсального способа одновременного обнаружения различных рнк в анализируемых образцах, в том числе для диагностических целей при массовых анализах вирусных и вироидных инфекций организмов.

предшествующий уровень техники

актуальной проблемой современной молекулярной диагностики является одновременное выявление множества рнк-последовательностей в образце. в частности, особый интерес представляет дифференциальный анализ экспрессии различных транскриптов, например, в клетках одного и того же типа в норме и при патологии, при воздействии различных факторов окружающей среды, а также в ходе естественного цикла развития организма. еще одним важным аспектом является дифференциальный анализ транскриптов в клетках разного типа. наконец, с практической точки зрения чрезвычайно актуальной представляется задача обнаружения патогенов вирусной и вироидной природы сельскохозяйственных растений и животных.

наиболее эффективной технологией, способной анализировать одновременно (в одном анализе) множество нуклеотидных последовательностей, является сотовая технология или днк-чиповая (микрочиповая) технология (gепе аrrау tесhпоlоgу, аrrау tесhпоlоgу, DNA сhiр tесhпоlоgу). эта технология была развита для генотипирования, идентификации геномов и организмов, определения точечных мутаций, молекулярной диагностики инфекций, онкологических заболеваний путем сравнения экспрессии генов и т.п. наиболее широко она используется в медицине.

в настоящее время развито несколько вариантов днк-чиповой технологии, различающихся природой (нуклеиновой, белковой и т.п) чипов и мишени и способами детекции сигнала, начиная от обычной флуоресценции и кончая переносом энергии электронного возбуждения у флуорофоров (FRET). в общем виде достоинства днк-чиповой технологии состоят в автоматическом нанесении

множества олигонуклеотидов-зондов, автоматическом режиме анализа и определении соотношения сигнал/шум по флуоресценции.

для фундаментальной и прикладной медицины технологии днк-микрочипов в настоящее время применяются несколькими крупными компаниями - разработчиками и производителями диагностических наборов и днк-чипов (аgilепt, еррепdоrf, теlесhеm Iпtеrпаtiопаl, Suрегагrау вiоsсiепсе) и для коммерческих целей другими диагностическими компаниями, использующими наборы фирм- производителей.

днк-чип представляет собой плоский или объемный субстрат, на поверхности которого прочно закреплены в виде точек (как в сотах) множественные днк-зонды длиной от 8 до сотен нуклеотидов, полученные химическим синтезом или биохимическими (продукты пцр или генной инженерии) способами. эти днк являются днк-зондами, которые определяют избирательность связывания тех молекул днк или рнк, которые находятся в анализируемом препарате. специфичность связывания в свою очередь определяется комплементарностью гетероциклических оснований анализируемых нуклеиновых кислот и днк-чипа, которая выявляется путем гибридизации нуклеиновых кислот в анализируемом образце с днк-зондом.

в большинстве днк-чиповых технологий нуклеиновые кислоты в анализируемом препарате метят флуоресцентной меткой, которая помогает определить, с каким конкретно зондом связалась тa(тe) или инaя(ыe) нyклeинoвaя(ыe) киcлoтa(ы).

очевидное достоинство днк-чиповой технологии в диагностическом анализе состоит в одновременном определении сразу нескольких целевых патогенов, первичная структура генома которых известна. другое достоинство днк-чипов состоит в возможности детекции даже одиночных (в один нуклеотид) различий в полинуклеотидах. таким образом, диагностическая специфичность комбинации олигонуклеотидов, перекрывающих последовательность детектируемого линейного полинуклеотида, выше, чем специфичность гибридизации этого полинуклеотида.

настоящая заявка относится к применению днк-чиповой технологии и конкурирующих технологий для одновременного обнаружения множества специфических рнк-последовательностей в образце, в частности для диагностики различных вирусных и вироидных инфекций сельскохозяйственных пород животных

и культур растений, главным образом, для диагностики различных вирусных и вироидных инфекций картофеля.

впервые днк-чип для смешанной инфекции картофеля вирусами а, X, Y и S был использован T. воопhаm , к. Wаlsh, P. Smith, к. маdаgап, I. Grаhаmапd and I. ваrkеr «Detectioп оf роtаtо virиsеs иsiпg тiсrоаrrау tесhпоlоgу: tоwаrds а gепеriс теthоd fоr рlапt virаl disеаsе diagпosis» J. Virоl. Meth.108, JN° 2, 181-187 (2003). авторы вначале подобрали необходимые праймеры для клонирования кднк вышеуказанных вирусов iп vitrо с помощью технологии от-пцр, затем амплифицированные днк, одна нить которых представляет собой кднк целевого вируса, рекомбинировали с плазмидами-векторами методами генетической инженерии, рекомбинантные днк размножали iп vivо в е.соli. чтобы создать днк- чип, эти плазмиды с помощью робота наносили в ячейки (соты) на поверхность стекла, покрытого полилизином. для обнаружения вирусов в зараженном растении авторы экстрагировали суммарную рнк из листовой ткани опытных и контрольных растений. затем с помощью случайной затравки и меченного флуоресцентным цианиновым красителем нуклеозидтрифосфата (суз-dстр) получали меченую суммарную кднк, которую гибридизовали с рекомбинантными днк, фиксированными на днк-чипе. появление флуресценции в ячейке, комплементарной вирусной кднк, говорило об инфекции анализируемого образца картофеля.

днк-чип, в ячейках которого были фиксированы синтетические олигодезоксинуклеотиды (40-мepы), комплементарные рнк вирусов картофеля PVA, PVS, PVM, PVX, PVY, PLRV , а также способные различить штаммы вируса Y картофеля - PVY ^N ™ и PVY°, был разработан в работе D. вуstriсkа, о. Lепz, I. мrаz, L. рihеrоvа, S. кmосh, M. Siр "оligописlеоtidе-bаsеd тiсrоаrrау: а пеw iтрrоvетепt iп тiсrоаrrау dеtесtiоп оf рlапt virиsеs" J. Virоl. меth. 128 (2005) 176-182. для каждой вирусной рнк было синтезировано 4 независимых олигомера, всего 34 олигонуклеотида. олигонуклеотиды затем наносили с помощью робота на предметное стекло микроскопа, покрытое полилизином, и фиксировали их уф- светом и прогреванием. суммарную рнк из анализируемых образцов растений авторы выделяли, используя коммерческий набор. меченые в две стадии флуоресцентной меткой кднк вирусных рнк получали технологией от-пцр суммарного препарата рнк с помощью вирус-специфических праймеров (отдельно

для каждого вируса) и меченых дезоксинуклеозидтрифосфатов. полученные препараты меченых днк гибридизовали с олиго днк-чипом. авторы успешно диагностировали как инфекции картофеля одним вирусом, так и двумя штаммами рγγNтN _и ру γθ _{oднoгo и TOгQ жg ви} py _C a.

специфичность детекции мишени определяется сразу по нескольким олигодезоксинулеотидам-зондам. чувствительность определения целевой нуклеиновой кислоты в стандартной (изложенной выше) днк-чиповой технологии невысока (сотни-тысячи копий), но может быть увеличена до десятков копий с помощью специальной аппаратуры (мощный фотоумножитель) или биохимического усиления сигнала (с помощью ифа). более высокую чувствительность (реimап M, хiе с. Dеvеlортепt апd еvаlиаtiоп оf а тиltiрlех RT-PCR fоr dеtесtiпg таiп virиsеs апd а virоid оfроtаtо. асtа Viгоl. 2006;50(2): 129-33) и специфичность (Rigоtti S, Gugеrli P. Rарid idепtifiсаtiоп оfроtаtо virиs Y strаiпs ъу опе-stер triрlех RT-PCR, J Viгоl меthоds. 2007 Mar;140(l-2):90-4) можно получить с помощью мультиплексной пцр (или OT- пцр) технологии в растворе (аgiпdоtап во, Shiеl PJ, вегgег PH. Siтиltапеоиs dеtесtiоп оf роtаtо virиsеs, PLRV, PVA, PVX апd PVY frот dоrтапt роtаtо tиbеrs ъу таqмап rеаl-timе RT-PCR. J Viгоl меthоds. 2007 Jun;142(l-2):l-9; Niе X, Singh RP. а поvеl иsаgе оf rапdоm рrimеrs fоr тиltiрlех RT-PCR dеtесtiоп оf virиs апd virоid iп арhids, lеаvеs, апd tиbеrs. J Viгоl меthоds. 2001 Jan;91(l):37-49), которая, однако, имеет значительно меньшую диагностическую емкость (меньшее число одновременно определяемых патогенов).

раскрытие изобретения

авторы настоящего изобретения обнаружили, что диен-платина, применявшаяся ранее для мечения днк, способна в мягких условиях прочно и количественно связываться с рнк. такая меченная диен-платиной рнк способна специфически гибридизоваться с иммобилизованными на чипе днк-зондами. поскольку авторы обнаружили, что антитела к диен-платинированной днк узнают с примерно такой же чувствительностью любую диен-платинированную рнк, то образовавшиеся гетеродуплексы меченых рнк и соответствующих днк-зондов могут быть детектированы с помощью антител к диен-платинированной днк.

таким образом, в своем первом аспекте настоящее изобретение относится к способу одновременного обнаружения множества рнк-последовательностей в

биологическом образце, включающему следующие стадии: а) обеспечение днк-чипа, представляющего собой подложку с иммобилизованными на ней днк-зондами, специфичными в отношении указанных рнк-последовательностей ; б) выделение суммарной рнк из образца; в) введение диен-платиновой метки в молекулы рнк; г) гибридизацию меченной диен-платиновой меткой рнк с днк-чипом в условиях, обеспечивающих селективное образование специфических гетеродуплексов между указанными рнк-последовательностями и соответствующими днк-зондами; д) детекцию образовавшихся специфических гетеродуплексов с помощью антител к днк- диен-платине, причем образование специфического гетеродуплекса указывает на присутствие соответствующей рнк-последовательности в образце. в одном из воплощений способ предусматривает, что в качестве днк-зондов для иммобилизации на биочипе используют рекомбинантные плазмиды, содержащие вставки кднк-фрагментов указанных рнк-последовательностей. в еще одном из воплощений способ предусматривает, что в качестве днк-зондов для иммобилизации на биочипе используют синтетические олигодезоксирибонуклеотиды, специфичные в отношении указанных рнк- последовательностей.

в своем следующем аспекте настоящее изобретение относится к способу одновременного обнаружения множества возбудителей вирусных и/или вироидных инфекций в биологическом образце, включающему следующие стадии: а) обеспечение днк-чипа, представляющего собой подложку с иммобилизованными на ней днк-зондами, специфичными в отношении рнк указанных возбудителей вирусных и/или вироидных инфекций; б) выделение суммарной рнк из указанного образца; в) введение диен-платиновой метки в молекулы рнк; г) гибридизацию меченной диен-платиновой меткой рнк с днк-чипом в условиях, обеспечивающих селективное образование специфических гетеродуплексов вирусных и/или вироидных рнк и соответствующих днк- зондов;

д) детекцию образовавшихся специфических гетеродуплексов с помощью антител к диен-платине, причем образование специфического гетеродуплекса указывает на присутствие соответствующего возбудителя вирусной и/или вироидной инфекции в образце.

в одном из воплощений способ предусматривает, что в качестве днк-зондов для иммобилизации на биочипе используют рекомбинантные плазмиды, содержащие вставки кднк-фрагментов диагностируемых возбудителей вирусных и/или вироидных инфекций. в другом воплощении способ предусматривает, что в качестве днк-зондов для иммобилизации на биочипе используют синтетические олигодезоксирибонуклеотиды, специфичные в отношении диагностируемых возбудителей вирусных и/или вироидных инфекций

в еще одном воплощении способа биологический образец представляет собой образец ткани картофеля, а возбудителями являются вирус мозаики люцерны, вирус Y картофеля, вирус M картофеля, вирус S картофеля, вирус а картофеля, вирус Y картофеля, вирус скручивания листьев картофеля, вироид веретеновидности клубней картофеля, вирус X картофеля. в предпочтительном воплощении днк-зонды, иммобилизованные на днк-чипе, представляют собой рекомбинантные плазмиды, содержащие вставки кднк-фрагментов рнк указанных возбудителей вирусных и вироидных инфекций картофеля, полученные путем реакции обратной транскрипции и пцр с использованием набора праймеров SEQ ш NO: 1-16.

в следующем аспекте настоящее изобретение относится к днк-чипу для одновременного обнаружения множества возбудителей вирусных и вироидных инфекций картофеля, где возбудителями являются вирус мозаики люцерны, вирус Y картофеля, вирус M картофеля, вирус S картофеля, вирус а картофеля, вирус Y картофеля, вирус скручивания листьев картофеля, вироид веретеновидности клубней картофеля, вирус X картофеля. днк-чип согласно настоящему изобретению представляет собой подложку с иммобилизованными на ней днк-зондами, представляющими собой рекомбинантные плазмиды, содержащие вставки кднк- фрагментов рнк указанных возбудителей вирусных и вироидных инфекций картофеля, полученные путем реакции обратной транскрипции и пцр с использованием набора праймеров SEQ ш NO: 1-16.

в еще одном аспекте настоящее изобретение относится к набору праймеров

для получения кднк-фрагментов рнк вируса мозаики люцерны, вируса Y картофеля, вируса M картофеля, вируса S картофеля, вируса а картофеля, вируса Y картофеля, вируса скручивания листьев картофеля, вироида веретеновидности клубней картофеля и вируса X картофеля, последовательности которых представлены в SEQ ID NO: 1-16, для изготовления днк-чипа согласно настоящему изобретению.

поскольку производители сельскохозяйственной продукции специализированы по объектам производства и сбыта, экономически целесообразно готовить диагностический днк-чип на местные, районированные инфекции конкретной культуры растений или породы животных.

на практике для данной сельскохозяйственной культуры в конкретном районе/области/крае (или даже стране) опасность представляет небольшое число (10- 20) патогенов вирусной, бактериальной или грибковой природы. в частности для культуры картофеля на территории рф наибольшую опасность представляют всего 7 вирусных и одна вироидная инфекции. очевидно, что в этом случае выгодно использовать достоинства днк-чиповой технологии молекулярной диагностики, когда в одном анализе можно получить практически полную информацию о зараженности опасными вирусами анализируемого образца.

в простейшем воплощении способ может быть представлен следующим образом: на полупроницаемую нитратцеллюлозную мембрану (прототип днк-чипа) в ячейки в виде точек наносят растворы клонированных рекомбинантных днк, содержащих раздельно вставки кднк семи ранее упомянутых вирусов и вироида (см. фиг. 1) и фиксируют ультрафиолетовым светом. из анализируемых образцов, которые, как правило, представляли собой пробирочное растение или листовую ткань растения (с одинаковым успехом были использованы такие растения, как картофель, томаты, табак), выделяли суммарную клеточную рнк из незараженных (контроль) и зараженных фитопатогенами растений. для выделения суммарной рнк подходит любой известный специалистам в данной области способ, например с использованием гуанидинтиоцианата в смеси с фенолом (в англоязычной литературе тRгZоL Rеаgепt (U.S.раtепt No.5346994)), горячего водонасыщенного фенола, фенола с 0,5-4% додецилсульфатом натрия, хлороформа с хлористым натрием в концентрации IM и выше (используется диагностической фирмой «Agdia», сша). предпочтительно для выделения рнк использовать разработанный авторами

настоящего изобретения простой, экономически выгодный и дружественный по отношению к окружающей среде способ с использованием трихлорацетата аммония, раскрытый в патентной заявке PCTуRU2007/000310).. суммарную рнк метили диен-платиной. ранее эту метку авторы настоящего изобретения (кондакова о.а. , дрыгин ю.ф. диагностика вироидного заболевания картофеля зондами (диeн)Pt- днк, биотехнология, N°4, с. 83-90 (1999); дрыгин ю.ф., кондакова O.A., атабеков и. г., мусин см., бойко в.в, бабоша а.в. «пpoблeмa вироида в семеноводстве картофеля: диагностика, формирование генобанка, производство исходного материала)), картофель и овощи (2000), 2, 38-40; мусин см., бойко в. в., бабоша а. в., кондакова O.A., дрыгин ю.ф., атабеков и.г. «диaгнocтикa и контроль вироидного заболевания картофеля в растениях)), защита и карантин растений, 10, 22-23 (2001); Yu. F. Drуgiп, S. N. сhirkоv, о. а. копdаkоvа, R. а. Ziпоvkш, P. а. Ivапоv, а.N. вliпtsоv, E. S. Gаvrуushiпа, а. V. Zhеrdеv, N. а. вуzоvа, в. в. Dzапtiеv, J. G. аtаbеkоv «High-sensitive tесhпоlоgiеs fоr mоlесulаr diаgпоstiсs оf роtаtо virus апd virоid infections». "роtаtо ргоduсtiоп апd Iппоvаtivе Tесhпоlоgiеs" (еds. AJ. наvеrkогt, в.V. апisimоv), Wаgепiпgеп асаd.рublishеrs, 2007, pp.274-285) и наши предшественники (киселева B.и., турчинский M.ф., колесник T.б., поверенный а.м. биоорган, хим. (1994) т. 29. N°l, с.14-20) использовали для мечения днк. это ключевой момент в этой технологии, и авторами впервые было установлено, что диен-платина прочно и количественно связывается с рнк в мягких условиях (см. фиг. 2,3). далее меченые рнк гибридизуются с рекомбинантными днк, нанесенными на мембрану. образовавшиеся специфические гетеродуплексы меченых вирусных рнк и соответствующих рекомбинантных днк определяются с помощью антител к диен-платинированной днк (см. фиг. 4) - это второй ключевой момент технологии, поскольку антитела к диен-платинированной днк узнают с примерно такой же чувствительностью любую диен-платинированную рнк. в свою очередь для обнаружения связавшихся антител авторы использовали ранее применявшуюся (кондакова о.а. , дрыгин ю.ф. диагностика вироидного заболевания картофеля зондами (диeн)Pt-дHK, биотехнология, N°4, с. 83-90 (1999); Yu. F. Drуgiп, S. N. сhirkоv, о. а. копdаkоvа, R. а. Ziпоvkiп, P. а. Ivапоv, а.N. вliпtsоv, E. S. Gаvrуushiпа, а. V. Zhегdеv, N. а. вуzоvа, в. в. Dzапtiеv, J. G. аtаbеkоv «High-seпsitive tесhпоlоgiеs fоr mоlесulаr diаgпоstiсs оf роtаtо virus апd virоid iпfectioпs». "роtаtо ргоduсtiоп апd Iппоvаtivе Tесhпоlоgiеs" (еds. AJ. наvеrkоrt, в.V.

апisimоv), Wageningen асаd.рublishеrs, 2007, pp.274-285) в технологии мга-ифа систему детекции с хемилюминисцентным субстратом. на этой стадии происходит усиление диагностического сигнала за счет катализируемой ферментом реакции.

как было установлено (D. вуstriсkа, о. Lепz, I. мrаz, L. рihеrоvа, S. кmосh, M. Siр "оligописlеоtidе-bаsеd тiсrоаrrау: а пеw iтрrоvетепt iп тiсrоаrrау dеtесtiоп оf рlапt virиsеs" J. Viгоl. меth. 128 (2005) 176-182), в случае одигонуклеотидного днк- чипа с длиной олигонуклеотидных зондов 40 дезоксинуклеотидов необходимо минимум 4 независимых, не перекрывающихся олигонуклеотида, узнающих свою мишень. при этом необходима предварительная тщательная компьютерная выборка олигнуклеотидов для чипа (гибридизация iп siliсό). для обнаружения шести вирусов картофеля авторы использовали чип из 34 ячеек. при гомологии вирусных рнк более 75% такой чип может давать перекрестные (ложноположительные) реакции. очевидно, что в случае детекции ограниченного (10-20) числа фитопатогенов, вполне конкурентным будет подход, когда в ячейках днк-чипа фиксированы более протяженные днк. в этом случае специфичность при меньшем числе ячеек днк- чипа будет выше, а диагностика более точной.

авторы провели сравнение чувствительности диагностического анализа с днк-зондами разной длины, фиксированными в днк-чипе (см. фиг. 4). оказалось, что и чувствительность определения патогенов была выше для более протяженных днк, фиксированных в ячейках днк-чипа.

таким образом, настоящее изобретение позволяет проводить экспресс-анализ множественных инфекций картофеля в одном эксперименте, значительно ускоряя его в сравнении с традиционным методом молекулярной диагностики вироидной и вирусных инфекций днк-зондами.

без намерения быть ограниченными какой-либо научной теорией или доктриной, авторы настоящего изобретения предполагают, что, как и в днк (N.р. Jоhпsоп, J.р. масquеt, J.L. Wiеbегs апd в. мопsаггаt, "Struсturеs оf thе аdduсts fоrmеd bеtwееп [Pt(dien)Cl]Cl апd DNA iп vitrо", Nuсl. асids Rеs., 1982, VoI. 10, No. 17, 5255- 5269), диен-платина реагирует, главным образом, с N ⁷ -aтoмoм гуанина, и в значительно меньшей степени с атомом N ⁷ аденина, и поэтому такая модификация практически не влияет на гибридизационные свойства рнк.

краткое описание фигур

фиг. 1. фрагменты (затемнены) геномов фитопатогенов картофеля: вируса мозаики люцерны (BMJI, AMV), вируса F картофеля (FBK), вируса а картофеля (ABK), вируса M картофеля (MBK) и вируса S картофеля (SBK), использованные для получения кднк с помощью от-пцр.

фиг. 2. модификация диен-платиной не изменяет электрофоретической подвижности рнк (электрофорез препарата рнк BTM, меченной диен-платиной, в 1% агарозном геле). в лунку геля наносили примерно 1 мкг вирусной рнк).

образец 1 - контроль, неплатинированная рнк BTM. образец 2 - платинированная рнк BTM. 1 мкг рнк в объеме 10 мкл денатурировали 3 мин при 70 ⁰ C , добавляли 3 мкл тридистиллированной воды, 2 мкл 0,01 M NaClO ₄ и 5 мкл 0,1 M диен-платины. смесь инкубировали 2 часа при температуре 45°C. образец 3 - то же самое, что и в образце 2, только смесь инкубировали при 0°C.

фиг. 3. антитела к диен-платинированным вирусным рнк узнают рнк, модифицированную диен-платиной, но не узнают не модифицированную рнк.

столбцы- количество нанесенной рнк в пг: а- 500; б- 50; в- 5; г- 0,5. ряды - вирусные рнк 1-4, модифицированные диен-платиной: 1,3 - в соотношении 1 атом платины на 10 нуклеотидов рнк (1 : 10); 2,4 - в соотношении 1 : 5. 1,2 - рнк XBK. 3,4 - рнк BTM. 5A - немодифицированная рнк XBK, нанесено 5 нг.

фиг. 4. определение рнк XBK с помощью днк-микрочипа. столбец 1 строки а, б - рекомбинантная плазмида, содержащая вставку полноразмерной кднк XBK; столбец 2 строки а, б - двухцепочечный (ds) продукт пцр длиной 614 нуклеотидов; столбец 3 строки а, б - ds продукт пцр длиной 470 нуклеотидов; столбец 4 строки а, б - ds продукт пцр длиной 321 нуклеотид; столбец 5 строки а, б - одноцепочечный (ss) продукт пцр длиной 614 нуклеотидов; столбец 6 строки а, б - ss продукт пцр длиной 470 нуклеотидов; столбец 7 строки а, б - ss продукт пцр длиной 321 нуклеотид; столбец 1 строка в, столбец 2 строка в - отрицательный контроль - рекомбинантная плазмида, содержащая кднк вироида веретеновидности клубней картофеля (BBKK). количество нанесенных в ячейку продуктов - 500 нг (строка а и столбец 1 строка в) или 50 нг (строка б и столбец 2 строка в).

фиг. 5. влияние количества рекомбинантной плазмиды, нанесенной на мембрану, на чувствительность определения вируса с помощью днк-микрочипа. столбец 1 - 50 нг; столбец 2 - 100 нг; столбец 3 - 150 нг. панель а - растение, зараженное вирусом X картофеля (XBK); панель б - растение, зараженное вирусом

M картофеля (MBK); панель в - растение, зараженное вирусом Y картофеля (YBK); панель г - здоровое растение.

фиг. 6. повторное использования днк-микрочипа для определения вирусных рнк на примере кднк XBK различной длины. вверху - первое использование микрочипа, внизу - повторное использование. столбец 1 строки а, б - рекомбинантная плазмида, содержащая вставку кднк XBK; столбец 2 строки а, б - ds продукт пцр длиной 614 нуклеотидов; столбец 3 строки а, б - ds продукт пцр длиной 470 нуклеотидов; столбец 4 строки а, б - ds продукт пцр длиной 321 нуклеотид; столбец 5 строки а, б - ss продукт пцр длиной 614 нуклеотидов; столбец 6 строки а, б - ss продукт пцр длиной 470 нуклеотидов; столбец 7 строки а, б - ss продукт пцр длиной 321 нуклеотид; столбец 1 строка в, столбец 2 строка в - отрицательный контроль - рекомбинантная плазмида, содержащая кднк вироида веретеновидности клубней картофеля (BBKK). количество нанесенных в ячейку продуктов - 500 нг (строка а и столбец 1 строка в) или 50 нг (строка б и столбец 2 строка в).

фиг. 7. диагностика вирусных и вироидных инфекций картофеля с помощью днк-микрочипа. BMJl - вирус мозаики люцерны; YBK - вирус Y картофеля; MBK - вирус M картофеля; SBK - вирус S картофеля; ABK - вирус а картофеля; BCJIK - вирус скручивания листьев картофеля; BBKK - вироид веретеновидности клубней картофеля; XBK - вирус X картофеля.

варианты осуществления изобретения

в настоящее время в сельском хозяйстве и медицине используется несколько технологий молекулярной диагностики вирусных инфекций для практических целей. широкое распространение получил высокочувствительный метод иммуноферментного анализа (ифа, ELISA). метод высокопроизводителен, одновременно на одной иммунологической плашке можно детектировать несколько вирусов. в последнее время его вытесняет метод экспресс- диагностики иммунохроматографии на тест-полосках как более простой и быстрый, время анализа занимает 2-5 мин, и не уступающий ифа в чувствительности и производительности. метод настолько прост, что диагностический анализ на тест-полосках из набора доступен рядовому потребителю, он пригоден для применения его в полевых условиях. однако для многих экономически важных вирусных инфекций применение

ифа и иммунохроматографии ограничено недоступностью вирусных антигенов, получение которых дорого и связано подчас с непреодолимыми трудностями. в таких случаях часто помогают диагностические технологии, в основе которых лежит принцип комплементарности гетероциклических оснований нуклеиновых кислот, используемый в процессе их молекулярной гибридизации. к ним относятся технологии дHK(PHK)-зoндoв, пцP(OT-пцP, обратная транскрипция в комбинации с пцр) и технология днк-чипов.

геномы вироидов, вирусов и живых организмов представлены протяженными полинуклеотидами (от 246 до десятков миллиардов нуклеотидов). технология днк- (микpo)чипoв является наиболее эффективной для разностороннего анализа геномов высших организмов, состоящих из миллиардов нуклеотидов и сотен тысяч генов, будь-то анализ мутаций, делеций или вставок нуклеотидов, или спектра экспрессии генов, сравнительный популяционный анализ или анализ генетических и инфекционных заболеваний. в настоящее время днк-микрочипы могут содержать десятки тысяч днк-зондов для одновременного анализа тысяч генов или целевых нуклеотидных последовательностей.

настоящее изобретение предлагает новый способ одновременного обнаружения множества различных рнк-последовательностей в образце. в одном из предпочтительных воплощений настоящее изобретение обеспечивает способ одновременного обнаружения множества возбудителей различных вироидных и вирусных заболеваний организмов с помощью днк-чипа. диагностические возможности способа настоящего изобретения продемонстрированы на примере восьми экономически опасных для рф вирусных и одной вироидной инфекций важной сельскохозяйственный культуры - картофеля.

получение днк-зондов

в зависимости от решаемой задачи размер днк в днк-зондах может значительно варьировать: для поиска точечной мутации достаточно днк-зондов длиной в 20 нуклеотидов, а для надежной диагностики инфекционного заболевания может оказаться недостаточным и длиной в 40 нуклеотидов. более того, для достоверного диагноза одного инфекционного агента даже с самым простым геномом необходимо несколько зондов, перекрывающихся по последовательности нуклеотидов.

выбор олигодезоксирибонуклеотидных зондов может быть осуществлен на

основании нуклеотидных последовательностей вирусов и вироидов, которые являются общедоступными, например, из базы данных Gепвапk. доступ к последовательностям наиболее удобно осуществлять через систему поиска епtrеz на сайте httр ://www.ncbi.nlm.nih. gоv. при конструировании олигодезоксирибонуклеотидных зондов для иммобилизации на днк-чипе учитывают такие показатели, как специфичность, наличие вторичных структур типа шпилек, наличие неспецифических сайтов отжига на последовательности-мишени, отжиг праймеров на себя и друг друга.

существуют разнообразные химические подходы к синтезу олигонуклеотидных праймеров, например, фосфодиэфирный, фосфотриэфирный метод, фосфитный метод и т.д., но наибольшее распространение в настоящее время имеет фосфитамидитный метод. синтез праймеров осуществляют, используя автоматические днк/рнк синтезаторы, например производства фирмы аррliеd вiоsуstеms (сша). необходимые мономеры-синтоны, активированные смолы, приборы выпускают фирмы аррliеd вiоsуstеms, Glеп Rеsеаrсh, Iпvitгоgеп, синтол и

^д P-)

в соответствии с настоящим изобретением, однако, при создании днк-чипа предпочтительно использовать днк-зонды, представляющие собою рекомбинантные днк, содержащие вставки полноразмерных кднк или протяженных фрагментов кднк вироидов и/или вирусов — возбудителей заболевания сельскохозяйственных культур или пород животных, а не короткие синтетические олигодезоксирибонуклеотиды. такой выбор оправдан в случае одновременной диагностики относительно небольшого количества патогенов и особенно в том случае, когда уже имеются необходимые клонированные рекомбинантные днк. очевидно, что при небольшом количестве днк-зондов специфичность днк-чипа выше, если зонды представляют собой протяженные днк.

при молекулярной диагностике конкретной вирусной инфекции может быть достаточно и одного зонда (см., например: кондакова о.а. , дрыгин ю.ф. диагностика вироидного заболевания картофеля зондами (диeн)Pt-дHK, биотехнология, N°4, с. 83-90 (1999)]. оптимальным размером в этом случае является днк-зонд длиной не менее 300 нуклеотидов. известно, что начиная с этой длины (в. D. наmеs and S. J. нiggiпs (еditоrs), Nuсlеiс асid нуbridizаtiоп: а рrасtiсаl аррrоасh,. охfоrd-Wаshiпgtоп DC, 1985, IRL ргеss) температуры плавления и образования

дуплексов не зависят (мало зависят) от длины полинуклеотидов.

при синтезе днк-зонда методами пцр (полимеразной цепной реакции) и генной инженерии для клонирования фрагмента днк, комплементарного нуклеиновой кислоте вируса, пробуют 2-3 пары праймеров при определении лучшей для амплификации фрагмента днк длиной 300 и более нуклеотидов. как правило, фрагменты днк от 300 до 1500 нуклеотидов хорошо амплифицируются и вставляются в векторные плазмиды. для выбора праймеров разработаны алгоритмы, которые доступны в интернете на сайтах: http://www.invitrogen.comλ http://www.clcbio.com/.

руководствуясь этими соображениями, авторы разработали набор праймеров для реакции обратной транскрипции вирусных рнк и полимеразной цепной реакции, которые являются оптимальными при осуществлении способа. последовательности праймеров приведены в таблицах 1 и 2. следует однако отметить, что данные последовательности не являются единственно возможными, и специалистом в данной области с учетом приведенных выше наставлений может быть сконструирован набор праймеров с иными последовательностями, пригодный для осуществления способа согласно настоящему изобретению.

таблица 1. специфические праймеры, использованные для реакции обратной транскрипции вирусных рнк и пцр.

таблица 2. праймеры для несимметричной от-пцр для получения кднк разной длины на матрице рнк XBK.

заменяющий лист (правило 26)

все рекомбинантные днк были получены стандартными методами генетической инженерии, используемыми для реакций обратной транскрипции, пцр и клонирования днк (J. Sаmbrооk, D. Russеll "моlесulаr сlопiпg: а Lаbогаtоrу мапuаl", з ^d еditiоп, CSHL рrеss, 2001). праймеры, необходимые для реакции обратной транскрипции вирусных рнк и клонирования кднк iп vitrо, представлены в таблице 1. в качестве векторов использовали разные плазмиды: рGем-зZ, вluеSсriрt II SK+ и др. (фиг. 1). трансформацию клеток е.соli, получение биомассы бактерий с плазмидами, выделение и очистку плазмид выполняли как это описано (мапiаtis, т., Fritsсh, е.F. апd Sаmbrооk, J. 1989. моlесulаr сlопiпg, а Lаbогаtоrу мапuаl (2 ^пd еd.), CoId Sрriпg наrbоr Lаbогаtоrу, CoId Sрriпg наrbоr, N. Y.).

приготовление днк-микрочипа

в качестве подложки, материала днк-чипа могут быть использованы синтетические мембраны, гели, активированное стекло, золото при анализе методом плазмонного резонанса, поверхности зондов атомно-силовых микроскопов. также для изготовления днк-чипов могут быть использованы активированные подложки, коммерчески доступные от различных производителей (см., например, Rаmаkrishпап R, Dоrris D, Lublinsky A, Nguyen A, Domanus M, рrоkhоrоvа а, Giеsеr L, тоumа E, Lockner R, таtа M, Zhu X, Patterson M, Shiрру R, Sendera TJ, маzumdеr A. 2002.An аssеssmепt оf моtоrоlа соdеLiпk miсrоаrrау реrfоrmапсе fоr gепе ехрrеssiоп рrоfiliпg аррliсаtiопs. Nисlеiс асids Rеs. 30: езо).

в случае использования олигодезоксирибонуклеотидов в качестве зондов днк-чипы могут быть изготовлены путем создания на поверхности стеклянной подложки матрицы из ячеек полиакриламидного геля, активации ячеек и ковалентной иммобилизации в ячейках модифицированных олигонуклеотидов, несущих активные группы (мirzаbеkоv а. & Kolchinsky A. маGIсhiр: рrореrtiеs апd аррliсаtiопs iп gепоmiс studiеs. (2002) In Gепотiс тесhпоlоgiеs : рrеsепt апd Fиtиrе. еds. Gаlаs D. J., S. J. мссоrmасk. саistеr асаdеmiс рrеss, рр.163-196). также днк-чипы могут быть изготовлены методом химически индуцируемой или фотоиндуцируемой сополимеризации олигонуклеотида в акриламидном геле, как описано ранее (Vаsiliskоv, V., тimоfееv E., Surzhikоv S., Drоbуshеv, а., Shiсk, V. & мirzаbеkоv, а. 1999. Fаbriсаtiоп оf miсrоаrrау оf gеl-immоbilizеd соmроuпds on а сhiр bу

заменяющий лист (правило 26)

сороlуmеrizаtiоп. вiотесhшquе, 27, 592-606; мирзабеков A.д., рубина A.ю., паньков св., чернов б.к патент на изобретение N 2175972 «Cпocoб иммобилизации олигонуклеотидов, содержащих непредельные группы, в полимерных гидрогелях при формировании микpoчипa».). также биочипы могут быть изготовлены любыми другими известными специалисту в данной области способами (Sеligег H., нiпz M., нарр E. "аrrауs оf immоbilizеd оligопuсlеоtidеs - сопtributiопs tо пuсlеiс асids tесhпоlоgу" сurrепt рhаrmасеutiсаl вiоtесhпоlоgу, 2003, 4, 379-395), а в качестве подложки помимо стекла может быть использован другой материал (пластик, металл, гибкие мембраны и т.д.).

выбор плоской основы для днк-чипа зависит от количества размещаемых на нем зондов: чем их больше, тем дороже чип, тем надежнее, прочнее должна быть основа.

поскольку авторы в качестве примера осуществления изобретения сконструировали днк-чип для диагностики всего 7 вирусных и одной вироидной инфекции с высокоспецифичными днк-зондами, была использована не самая прочная, но широко используемая при гибридизации нуклеиновых кислот нитратцеллюлозная мембрана. нитратцеллюлозную мембрану (Sсhlеiсhег & Sсhuеll, рrоtrап BA-85 0,45 мкм или BA 83 - 0,22 мкм ) вымачивали в 10 х SSC в течение 10 мин, подсушивали на фильтровальной бумаге.

рекомбинантные плазмиды, содержащие вставку кднк, денатурировали нагреванием на кипящей водяной бане в течение 3 мин, быстро охлаждали во льду и наносили на мембрану по 0,8 — 1,0 мкл днк-зонда. нанесенную днк фиксировали на мембране облучением ультрафиолетовым светом (254 нм, 7 см, 45 вт) в течение 3-4 мин. в таком виде днк-микрочипы могут продолжительно храниться при +4°C.

выделение рнк и введение диен-платиновой метки в рнк.

вирусные и суммарные рнк из инфицированных и неинфицированных клеток выделяли разработанным авторами способом с использованием нетоксичного водорастворимого хаотропного агента трихлорацетата аммония (см. патентную заявку PCT/RU2007/000310). для мечения рнк, выделенной с помощью хаотропного агента, 1 мкг рнк в объеме 10 мкл денатурировали 3 мин при 70 ⁰ C, добавляли 3 мкл тридистиллированной воды, 2 мкл 0,01 M NaClO ₄ и 5 мкл 0,1 M диен-платины. смесь инкубировали 2 ч при температуре 45 ⁰ C.

следует заметить, что эффективные условия мечения рнк существенно менее

жесткие, чем те, которые используются для мечения диен-платиной днк (6O ⁰ C, 2 час) [в.и. киселева, м.ф. турчинский, т.б. колесник, а.м. поверенный, биоорг. химия, т. 20, с. 14-20 (1994); дрыгин ю.ф., мусин см., кондакова O.A., савенков E.и., соломатин C.B.,Moжaeвa K.A., акад. PACXH атабеков и.г. «Moлeкyляpнaя диагностика зараженности оздоровленных сортообразцов картофеля российской федерации вироидом веретеновидности клyбнeй», доклады PACXH, 6, 24-25 (1996); кондакова о.а. , дрыгин ю.ф. диагностика вироидного заболевания картофеля зондами (диeн)Pt-дHK, биотехнология, N°4, с. 83-90 (1999)]. это важно, поскольку стабильность молекул рнк значительно меньше, чем молекул днк, при нагревании в водных растворах.

в определенных авторами условиях модификации вирусные рнк (на примере рнк BTM) не деградируют и сохраняют практически неизменной электрофоретическую подвижность (фиг. 2) .

гибридизация HK на микрочипе и детекция мишени.

днк-микрочип инкубировали в предгибридизационном растворе (5 х SSC, 2x раствор денхардта, 0,1% додецилсульфат натрия) в течение 2 ч при температуре 65°C. диен-платинированную рнк денатурировали 3 мин при 7O ⁰ C и добавляли в предгибридизационный раствор. гибридизацию проводили в герметично запечатанных чашках петри в течение 24 ч при температуре 65 ⁰ C.

по окончании гибридизации мембраны промывали Ix SSC с 0,1% додецилсульфатом натрия и затем 0,2 х SSC с 0,1% додецилсульфатом натрия. обе промывки осуществляли на качалке в течение 15 мин при температуре 65°C. для удаления остатков додецилсульфата натрия мембраны промывали трижды буферным раствором 0,1 M трис-нсl, рн 9,0, содержащим 0,14 M NaCl (TBS), в течение 5 мин при комнатной температуре.

для обнаружения платинированной рнк, связавшейся с ячейкой микрочипа, использовали непрямой метод иммуноферментного анализа (ифа) на мембранах, в котором первичные антитела были против диен-платинированной днк, а в качестве вторичных использовали конъюгаты иммуноглобулинов с пероксидазой хрена.

во избежание неспецифической сорбции на мембране компонентов реакции при выполнении ифа мембрану блокировали в TBS, содержащим 1% Tвин-20, на качалке в течение 1 ч при комнатной температуре. избыток детергента удаляли, трижды споласкивая мембрану TBS.

для обнаружения метки мембрану инкубировали с кроличьими аффинно очищенными антителами к (диeн-Pt)дHK. реакцию проводили в TBS, содержащем 0,5% бычьего сывороточного альбумина (фракция V), на качалке в течение 2 ч при комнатной температуре или ночь при +4°C. несвязавшиеся антитела удаляли, трижды промывая мембрану TBS, содержащим 0,1% Tвинa-20, на качалке в течение 10 мин при комнатной температуре.

кроличьи антитела, связавшиеся с мишенью, выявляли с помощью конъюгата ослиных антител к иммуноглобулинам кролика, меченных пероксидазой хрена (аmеrshаm). реакцию проводили в TBS, содержащим 0,5% бычьего сывороточного альбумина (фракция V) на качалке в течение 50 мин при комнатной температуре. несвязавшийся конъюгат удаляли, трижды промывая мембрану TBS, содержащим 0,1% Tвинa-20, на качалке в течение 10 мин при комнатной температуре.

мембрану споласкивали дважды TBS и инкубировали 1-3 мин с хемилюминесцентным субстратом пероксидазы (Stаг-Glо сhеmilumiпеsсепt Substrаtе, ISN вiосhеmiсаls, Iпс.) в соответствии с инструкцией фирмы-изготовителя. эмиссию регистрировали путем экспозиции мембраны с рентгеновской пленкой (коdаk MXB FiIm) в течение 1 - 20 мин в зависимости от интенсивности хемилюминесценции. пленку обрабатывали в проявителе для рентгеновских пленок, промывали, высушивали и сканировали на сканере ерsоп регfесtiоп 1650 (фиг. 4-7).

влияние нагрузки днк-микрочипа днк-зондами на чувствительность детекции мишени.

экономически важно знать, какие количества днк-зонда должны быть фиксированы в ячейке микрочипа для максимально чувствительного определения рнк мишени. были выполнены эксперименты, в которых в ячейках днк-микрочипа фиксировали различное количество рекомбинантных плазмид, содержащих кднк- копию рнк нескольких вирусов картофеля и вироида веретеновидности клубней картофеля. как показывают результаты, приведенные на фиг. 5, чувствительность выявления платинированной рнк с помощью днк-микрочипа зависит от количества днк, фиксированной в ячейке. максимальная чувствительность достигается при иммобилизации 150 нг рекомбинантной плазмиды в ячейке, однако в случае сильно зараженного картофеля 50 нг днк-зонда может быть достаточным для выявления вирусной инфекции. далее во всех случаях в ячейках микрочипа иммобилизовали 150 нг днк-зондов.

проверка эффективности днк-микрочипа для одновременной диагностики множественных инфекций картофеля.

в результате проведенных исследований удалось создать днк-микрочип для одновременного обнаружения множественных инфекций картофеля в анализируемом образце (фиг. 7). коллекционные растения картофеля, зараженные различными патогенами, выращивали в теплице. их зараженность предварительно определяли непрямым методом (сэндвич-вариант) иммуноферментного анализа с помощью диагностических тест-систем фирмы «Agdia» (сша) согласно инструкции фирмы- производителя.

данные, приведенные на фиг. 7, показывают полное соответствие результатов обнаружения вирусов методами ифа и с помощью днк-микрочипа. кроме того, днк-микрочип позволяет одновременно выявлять и вироид, обнаружить наличие которого методом иммуноферментного анализа было невозможно в силу природных особенностей этого патогена.

примеры

следующие далее примеры раскрывают наиболее предпочтительные воплощения данного изобретения и приведены исключительно с целью лучшего пояснения его сущности. специалисту в данной области будет понятно, что можно осуществить множество модификаций как в отношении используемых средств и материалов, так и в отношении используемых способов без отступления за рамки изобретения.

авторы настоящего изобретения задались целью показать пригодность разработанного диагностического микрочипа (прототипа днк-чипа) для определения вирусных и вирой дных инфекций организмов.

пример 1. платинирование вирусной рнк и исследование ее способности к специфической гибридизации с днк зондом.

для изучения гибридизационных свойств «плaтиниpoвaннoй» рнк была использована следующая методика. к препарату суммарной рнк, выделенной из листовой ткани здорового растения картофеля, подмешивали различной количество очищенной рнк XBK. смесь рнк платинировали по описанной выше методике и использовали в гибридизации с днк-микрочипом.

в ячейках днк-микрочипа иммобилизовывали рекомбинантную плазмиду,

содержащую вставку кднк XBK, а также однонитевые (ss) и двунитевые (ds) фрагменты кднк XBK различной длины, полученные полимеразной цепной реакцией. для этого на матрице тотальной рнк XBK проводили реакцию обратной транскрипции (AMV RT, рrоmеgа) с рассеянной затравкой (в присутствии случайных гептамеров). на матрице полученной кднк проводили стандартную пцр с использованием сенс-праймера (PVX5755+ ссGGатGGGGатттстттаGта, соответствующего нуклеотидам 5755-5776 рнк XBK) и с одним из антисенс- праймеров (таблица 2). для получения dsпцр продуктов праймеры использовали в равной концентрации 0,4 мкм (брали 1 мкл 20 нм раствора праймера на 50 мкл пцр смеси). для получения ssпцр продуктов (с преимущественным содержанием днк, комплементарной вирусной рнк) в пцр смесь (50 мкл) добавляли 1 мкл 2 нм раствора сенс-праймера и 1 мкл 20 нм антисенс-праймера.

гибридизацию платинированной рнк с днк зондами, специфичными для вируса X картофеля, и выявление продуктов гибридизации проводили, как это описано выше (мга-ифа технология).

результаты этого модельного эксперимента показывают, что рнк XBK эффективно платинируется в указанных выше условиях и может быть с высокой специфичностью выявлена в гибридизации с днк-микрочипом в концентрации, по крайней мере, 10 пг/мкл. (фиг. 4). очевидно, что чувствительность выявления платинированной рнк зависит от концентрации и природы продукта, иммобилизованного в ячейке микрочипа. наиболее эффективно платинированная рнк выявляется в гибридизации с рекомбинантной плазмидой (ряд IA, б): совершенно очевидно, что даже при количестве плазмиды 50 нг предел детекции находится значительно ниже достигнутого в данном эксперименте (10 пг/мкл).

пример 2. исследование влияния длины днк зондов на чувствительность диагностического анализа.

как отмечалось ранее, сравнительное генотипирование организмов по множеству генов предполагает большой объем (число ячеек) днк-чипа. в случае определения инфекций число ячеек в чипе определяется необходимой чувствительностью и специфичностью диагностического анализа. известно, что чувствительность анализа в этом случае определяется количеством и свойствами метки в мишени и системы усиления сигнала ее детекции, а специфичность гибридизации мишени с зондом резко увеличивается в интервале длин днк-зондов

от 6 до 300 и более нуклеотидов. мы провели сравнение чувствительности диагностического анализа с днк-зондами разной длины, фиксированными в днк- чипе (фиг. 4 и 6). вставки или фрагменты кднк вируса X картофеля разной длины получали клонированием iп vitrо симметричной (для двунитевых днк) или асимметричной (для однонитевых днк) полимеразной цепной реакцией. длину вирусной кднк задавали положением праймеров на матрицах. как и следовало ожидать (см. ряд б на фиг. 4 и 6), существенно большая чувствительность детекции рнк мишени получается с днк зондами, содержащими полноразмерную кднк XBK.

вместе с тем, полученные результаты свидетельствуют, что в ячейках микрочипа могут быть фиксированы и продукты пцр; наилучшие результаты, как следует из фиг. 4, были получены при использовании самого длинного фрагмента длиной 614 нуклеотидов, что, по-видимому, объясняется большей эффективностью гибридизации меченой рнк с более длинной кднк, фиксированной на днк- микрочипе.

пример 3. исследование возможности повторного использования днк- микрочипа для определения вирусных рнк на примере кднк XBK различной длины.

важным результатом наших исследований явилось установление возможности повторного использования днк-микрочипа (фиг. 6). мембрану «Pгotгan BA-85» после проведения диагностического анализа отмывали от зонда 5 мин в 0,05 M NaOH при комнатной температуре, 2 раза по 1 мин 0,5 M трис-нсl, рн 7,5, 3 мин водой, высушивали и хранили при +4 ⁰ C в течение 6 мес, после чего использовали для повторного анализа. сравнение результатов диагностического анализа показало, что результаты диагностического анализа на однажды уже использованном и «oтмытoм» днк-микрочипе аналогичны результатам первичного анализа на этом же микрочипе.

пример 4. множественная экспресс-диагностика экономически опасных для рф вирусных и вироидных инфекций картофеля с помощью днк- микрочипа.

на фиг. 7 приведены результаты одновременной молекулярной диагностики семи наиболее экономически опасных для рф вирусных и вироидной инфекций картофеля. вирус мозаики люцерны распространен в природе по всему миру на широком круге видов растений, в том числе и на картофеле.

предварительно все анализируемые пробирочные образцы картофеля были тестированы независимым методом иммуноферментного анализа (ифа). по данным ифа исследуемые образцы были заражены смешанно вирусами M и X и раздельно вирусом M картофеля. сравнение результатов диагностического анализа днк- чиповой и ифа технологиями было явным в пользу днк-чипа. днк-чиповая технология не только подтвердила результаты иммуноферментного анализа, но и выявила вироидную инфекцию образцов, которая недоступна определению с помощью ифа.

заключение

одна из главных целей настоящего изобретения состояла в разработке диагностического днк-микрочипа, позволяющего одновременно обнаруживать вирусы и вироид картофеля в одном образце. эта технология диагностики вирусных и вироидных заболеваний растений основана на молекулярной гибридизации вирусной рнк, меченной диен-рt, с комплементарной днк, иммобилизованной на нитратцеллюлозной мембране, с последующим выявлением гетеродуплексов с помощью ифа. днк-микрочип позволяет определять вирусную рнк с чувствительностью 5 пг рнк вируса или вироида и более в анализируемой пробе суммарного препарата рнк, полученного из 10-20 мг листовой ткани картофеля. продолжительность анализа (одновременно до 5 образцов вручную) составляет не более 3 суток. срок годности препаратов рнк, меченных диен-платиной, и днк- микрочипов составляет не менее 6 мес при -20°C.

днк-микрочип может быть использован для одновременной диагностики инфекций основных вирусов и вироида картофеля в уникальных (например, коллекционных) сортообразцах для определения их фитосанитарного статуса, для контроля эффективности оздоровления от вирусов и вироида и т.п. следует подчеркнуть, что использование днк-микрочипа позволяет повысить эффективность диагностического анализа пропорционально количеству ячеек, содержащих соответствующую рекомбинантную днк со вставкой кднк вироида или вируса. такая работа может представлять собой особую важность в связи с началом работ по созданию в рф генобанка здоровых сортов картофеля.

поскольку многие вироиды содержат консервативные нуклеотидные последовательности, применение разработанных авторами настоящего изобретения

днк-зондов и днк-микрочипа позволяет не только диагностировать известные вироиды, но и с высокой вероятностью выявлять новые, еще неизвестные, которые обладают сходством нуклеотидных последовательностей, достаточным для специфической гибридизации. в частности, разработанные условия могут быть использованы при создании днк-микрочипов для детекции многих вироидов в процессах получения, поддержания и сертификации здорового посадочного материала картофеля, хмеля, цитрусовых, винограда, косточковых (персик, слива, абрикос), семечковых (яблоня, груша), овощных и цветочно-декоративных культур.

разработанный днк-микрочип для обнаружения возбудителей вирусных и вироидных заболеваний картофеля может рассматриваться в качестве прототипа днк-микрочипа для диагностики вироидных и вирусных заболеваний любого экономически важного сельскохозяйственного растения. помимо этого, днк- микрочипы, подобные раскрытому выше микрочипу, могут быть использованы для диагностики вирусных инфекций животных.

все патенты, публикации, научные статьи, и другие документы и материалы, цитируемые или упоминаемые здесь, включены в настоящее описание путем отсылки в такой степени, как если бы каждый из этих документов был включен путем отсылки индивидуально или приведен здесь в его полном виде.

конкретные гены, векторы, вирусы и вироиды, клетки, виды растений и животных, применения, используемые материалы и методы, описанные здесь, относятся к предпочтительным вариантам осуществления, приведены в качестве примеров и не предназначены для ограничения объема данного изобретения. при изучении этого описания другие объекты, аспекты и воплощения будут приходить в голову специалистам в данной области, и они охватываются рамками данного изобретения. специалистам в данной области будет понятно, что различные замены и модификации могут быть произведены в отношении описанного здесь изобретения без отклонения от его объема и рамок, которые определяются прилагаемой формулой изобретения.