Campo de la Invención

La presente invención solicita protección sobre compuestos derivados lineales de geranilorcinol, sobre los compuestos derivados acetilados de los mismos, sobre el procedimiento de síntesis de obtención de dichos compuestos y sobre el uso de dichos compuestos como antifúngicos frente a Botrytis cinérea.

Antecedentes de la Invención

Los geranilfenoles lineales son una interesante subclase de metabolitos secundarios encontrados principalmente en organismos marinos. Son biosintetizados en forma mixta desde la ruta metabólica del ácido shikímico y del ácido mevalónico. La porción terpénica puede tener una longitud de hasta nueve unidades de isopreno, cadena que proviene de la ruta biosintética del mevalonato mientras que la porción aromática deriva de la ruta biosintética del ácido shikimico. Entre los organismos marinos en los cuales se ha podido aislar este tipo de compuestos se encuentran, algas pardas (Faulkner, D. J. Natural Product Reports 1986, 3, 1 -33; Ochi, M.; Kotsuki, H.; Inoue, S.; Taniguchi, M. Chemistry 1979, 831 -832; Capón, R. J.; Ghisalberti, E. L.; Jefferies, P. R. Phytochemistry 1981 , 20, 2598-2600; Gerwick, W. H.; Fenical, W. The Journal of Organic Chemistry 1981 , 46, 22-27), esponjas (Rosa, S. De; Crispino, A.; i Giulio, A. De Journal of Natural 1995, 58, 1450-1454; Bifulco, G.; Bruno, I.; Mínale, L; Riccio, R.; Debitus, C; Bourdy, G.; Vassas, A.; Lavayre, J. Journal of Natural Products 1995, 58, 1444-1449), alcyonaceas (Bowden, B. F.; Coll, J. C. Australian Journal of Chemistry 1981 , 34, 2677-2681), gorgonaceas (Ravi, B. N.; Wells, R. J. Australian Journal of Chemistry 1982, 35, 105-112), ascidias (Howard, B. M.; Clarkson, K.; Bernstein, R. L. Tetrahedron Letters 1979, 20, 4449-4452; Targett, N. Journal of Natural Products 1984, 1696, 1975-1976; Guella, G.; Mancini, I.; Pietra, F. Helvética Chimica Acta 1987, 70, 621-626; Faulkner, D. J. Natural product reports 1993, 10, 497-539; Fu, X.; Hossain, M. B.; Helm, D. Van Der; Schmitz, F. J.; Van der Helm, D. Journal of the American Chemical Society 1994, 116, 12125-12126; Fu, X. ; Hossain, M. B.; Schmitz, F. J.; Helm, D. Van Der The Journal of Organic Chemistry 1997, 62, 3810-3819). Desde las algas pardas se han aislado compuestos con cadenas de tipo mono-, sesqui- y di-terpeno mientras que desde esponjas se han obtenido estructuras con largas cadenas lineales. Para esta familia de compuestos se ha informado potentes actividades biológicas las que incluyen anti-inflamatorias (Quang, D. N.; Hashimoto, T.; Arakawa, Y.; Kohchi, C; Nishizawa, T.; Soma, G.-l.; Asakawa, Y. Bioorganic & medicinal chemistry 2006, 14, 164-8; Bauer, J.; Koeberle, A.; Dehm, F.; Pollastro, F.; Appendino, G.; Northoff, H.; Rossi, A.; Sautebin, L; Werz, O. Biochemical pharmacology 20ΛΛ, 81, 259-68), antifúngica (Danelutte, A. P.; Lago, J. H. G.; Young, M. C. M.; Kato, M. J. Phytochemistry 2003, 64, 555-559), anti-VIH (Manfredi, K. P.; Vallurupalli, V.; Demidova, M.; Kindscher, K.; Pannell, L. K. Phytochemistry 2001, 58, 153-7), antioxidante (Yamaguchi, L. F.; Lago, J. H. G.; Tanizaki, T. M.; Mascio, P. Di; Kato, M. J. Phytochemistry 2006, 67, 1838-43), siendo la más frecuente de las actividades reportadas la actividad antineoplásica (Han, Q.-B.; Qiao, C.-F.; Song, J.-Z.; Yang, N.- Y.; Cao, X.-W.; Peng, Y.; Yang, D.-J.; Chen, S.-L.; Xu, H.-X. Chemistry & biodiversity 2007, 4, 940-6.; Liu, Q.; Shu, X.; Wang, L; Sun, A.; Liu, J.; Cao, X. Cellular & molecular immunology 2008, 5, 271 -8).

Síntesis de Geranilfenoles lineales

Como hemos visto este tipo de compuestos cuya estructura combina una unidad de terpeno lineal con una porción fenólica y que han sido aislados desde variados organismos, han demostrado poseer un gran número de propiedades biológicas. Sin embargo el gran problema para el estudio de este grupo es su bajo rendimiento de obtención desde sus fuentes naturales. Claramente este importante grupo estructural necesita una estrategia general para la preparación de los productos naturales que contengan este farmacóforo como también sistemas con otros residuos aromáticos (Osorio, M.; Aravena, J.; Vergara, A.; Taborga, L; Baeza, E.; Catalán, K.; González, C; Carvajal, M.; Carrasco, H.; Espinoza, L. Molecules (Basel, Switzerland) 2012, 77, 556-70).

La más recurrente de las estrategias sintéticas usadas para la preparación de terpenilfenoles, consiste como primer paso, la preparación por separado de los fragmentos terpeno y aromático apropiados para la síntesis. El segundo paso es crucial para el éxito de la síntesis y consiste en el acoplamiento del equivalente sintético terpenilo al núcleo aromático. Los métodos más usados para el anclaje de las dos porciones están numerados en la siguiente lista:

1 . Condensación del terpeno y el fenol (alilación de Friedel-Crafts) catalizada por un ácido de Brónsted.

2. Terpenilación directa con terpeniltrialquilestaño en presencia un ácido de Lewis

3. Reordenamiento de terpenilariléter catalizado por un ácido de Lewis.

4. Sustitución nucleofílica de derivados arillitio sobre halogenuros de alquilo. 5. Sustitución nucleofílica de derivados alquillitio sobre halogenuros de arilo.

6. Adición nucleofílica de derivados arillitio a carbonilos de la unidad terpenilo y posterior reducción en presencia de un ácido de Lewis.

7. Condensación de geraniol e hidroquinona (alilación de Friedel-Crafts) catalizada por un ácido de Lewis.

Condensación de geraniol con hidroquinona y fenoles (alilación de Friedel- Crafts) catalizada por un ácido de Lewis.

El más común de los esquemas de geranilación directa involucra compuestos aromáticos "π excedente" en una alilación de Friedel-Crafts bajo condiciones ácidas (Keinan, E.; Eren, D. The Journal of Organic Chemistry 1987, 18, 3872-3875; Syper, L.; Kloc, K.; Mz.xl;lochowski, J. Tetrahedron 1980, 36, 123-129; Eisohly, H. N.; Turner, C. E.; Clark, A. M.; Eisohly, M. A. Journal of Pharmaceutical Sciences 1982, 71, 1319— 23). A pesar del número de modificaciones, estos enfoques están limitados por la inestabilidad inherente al alcohol alílico en las condiciones ácidas empleadas y a las reacciones colaterales no deseadas (Stevens, K. L.; Jurd, L.; Manners, G. Tetrahedron 1972, 28, 1939-1944). No obstante cuando la catálisis ácida, como por ejemplo la reacción con ácido oxálico, es reemplazada por el ácido de Lewis BFs Et2O, los rendimientos de reacción aumentan considerablemente, además de usar solventes no acuosos como éter, dioxano, CH2CI2 y CCI ₄ . Para esta estrategia de síntesis se obtienen rendimientos cercanos al 60% (Fedorov, S.; Radchenko, O.; Shubina, L. Pharmaceutical 2006, 23, 70-81 ; Shubina, L. K.; Fedorov, S. N.; Radchenko, O. S.; Balaneva, N. N.; Kolesnikova, S. a.; Dmitrenok, P. S.; Bode, A.; Dong, Z.; Stonik, V. a. Tetrahedron Letters 2005, 46, 559-562). Sin embargo, en publicaciones recientes en donde se ha utilizado esta estrategia de síntesis para acoplar hidroquinona con geraniol los rendimientos de reacción se encuentran entre 28 y 34% (Takenaka, K.; Tanigaki, Y.; Patil, M. L; Rao, C. V. L.; Takizawa, S.; Suzuki, T.; Sasai, H. Tetrahedron: Asymmetry 2010, 21, 767-770; Baeza, E.; Catalán, K.; Peña-Cortés, H.; Espinoza, L. Quim. Nova 2012, 35, 523-526), por otra parte al acoplar 2,4,5-trimetoxifenol con geraniol se obtiene una mezcla de compuestos mono-acoplados con rendimientos de 13 y 15% (Baeza, E.; Catalán, K.; Villena, J.; Carrasco, H.; Cuellar, M.; Espinoza, L. Journal of the Chilean Chemical Society 2012, 57, 1219-1223) .

Por tanto aún existe la necesidad de disponer de un procedimiento de síntesis que permita obtener compuestos derivados lineales de geranilorcinol con buen rendimiento.

Resumen de la Invención

La presente invención describe un procedimiento de síntesis para obtener compuestos derivados lineales de geranilorcinoles, dichos compuestos derivados lineales de geranilorcinol, los compuestos derivados acetilados de los mismos, el procedimiento de encapsulamiento de los compuestos en una matriz polimérica y el uso de dichos compuestos encapsulados como antifúngicos contra Botrytis Cinérea.

Descripción Detallada de la Invención

La presente invención describe un procedimiento de síntesis para obtener compuestos derivados lineales de geranilorcinoles, dichos compuestos derivados lineales de geranilorcinol, los compuestos derivados acetilados de los mismos, el procedimiento de encapsulamiento de los compuestos en una matriz polimérica y el uso de dichos compuestos encapsulados como antifúngicos contra Botrytis Cinérea. El procedimiento de síntesis comprende la condensación de geraniol con orcinol (alilación de Friedel-Crafts) catalizada por un ácido de Lewis. El procedimiento comprende utilizar la técnica de alilación directa catalizada por ácido de Lewis BF3 Et2O y la utilización de un catalizador secundario de AgNO3, utilizado por primera vez en este tipo de reacciones. El procedimiento de síntesis permitió obtener los compuestos derivados diacoplados representados con las fórmulas 1 a 4, de los cuales los compuestos de fórmula 2 y 4 corresponden a compuestos reivindicados en la presente invención. Las estructura de los geranilorcinoles lineales, obtenidos por el método de acoplamiento de la presente invención, utilizando el catalizador secundario de AgNO3, están representados en las fórmulas 1 a 4.

Fórmula 1 Fórmula 2

Fórmula 3 Fórmula 4

Los compuestos derivados de las fórmulas 1 y 3, fueron sintetizados previamente por otros autores (Manners, G.; Jurd, L; and Stevens, K.; Tetrahedron, 1972, 28, 2949-2959; Eisohly, H. N.; Turner, C. E.; Clark, A. M.; and Eisohly, M. A.; J. Pharmaceutical Sciences, 1982, 71 , 1319-1323) con rendimientos comprendidos entre 2-18% y también previamente descritos por nuestro grupo de investigación, con rendimientos de 12,6% y 27,6% para el compuesto derivado 3 y 1 , respectivamente (Taborga, L; Vergara, A.; Fernández, M. J.; Osorio, M.; Carvajal, M.; Madrid, A.; Marilaf, F.; Carrasco, H.; and Espinoza, L; Journal of the Chilean Chemical Society, 2013, 58, 1790-1796).

Adicionalmente, se prepararon los compuestos derivados acetilados de los cuatro compuestos representados en las fórmulas 1 a 4, los cuales han sido representados con las fórmulas 5 a 8, respectivamente. Las fórmulas 5 a 8, corresponden a las siguientes estructuras:

Fórmula 5 Fórmula 6

Fórmula 7 Fórmula 8

Los compuestos derivados acetilados 5 a 8 corresponden a estructuras reivindicadas en la presente invención. Estos compuestos derivados fueron obtenidos desde los respectivos compuestos derivados de geranilorcinoles de fórmulas 1 a 4, por reacción de acetilación bajo condiciones estándares; es decir por acetilación con anhídrido acético, 4-A/,A/-dimetilaminopiridina (DMAP) como catalizador y diclometano (CH2CI2) como solvente.

Procedimiento experimental:

Procedimiento de síntesis de los compuestos derivados de geranilorcinol de las fórmulas 1 , 2, 3 y 4. A una solución de orcinol (1 ,22 g, 9,8 mmol) y geraniol (1 ,51 g, 9,8 mmol) se le agregaron 2 mL de acetonitrilo, posteriormente se procedió a adicionar una solución de acetonitrilo saturada en AgNO3 (400 mg en 2 mL), y luego se colocó en agitación a temperatura ambiente bajo atmósfera de nitrógeno. A esta mezcla se le inyectó lenta (gota a gota) y directamente BF3 Et2O (0,46 g, 3,2 mmol). Se dejó en agitación durante 48 horas. El término de la reacción fue monitoreado por cromatografía en capa fina (CCF). Para dar fin a la reacción se agregó hielo molido (aproximadamente 30 g) y abundante sal (aproximadamente 50g de NaCI), luego se filtró al vació y se extrajo la fase orgánica con AcOEt (3 ^χ 20 mL), fase que luego fue lavada con una solución de NaHCO3 (15 mL, 5%) y agua (2 x 1 5 mL), para posteriormente ser secada sobre Na2SO ₄ anhidro, posteriormente esta solución fue filtrada y evaporada a sequedad. La reacción fue realizada en cuadruplicado y la suma de crudos de reacción fue purificado por cromatografía en columna (CC) usando como fase estacionaria sílica gel (Sílica gel 60 para cromatografía en columna, 0,040-0,063 mm) y como fase móvil una mezcla de acetato de etilo/hexano en gradiente de polaridad creciente (0:20→6: 14: se comienza con una primera adición con un volumen total de 20 mL de hexano y 0 mL de acetato de etilo, la segunda adición del mismo volumen total, pero ahora con 18,8 mL de hexano y 0,2 mL de acetato de etilo, y así sucesivamente aumentando la cantidad de acetato de etilo en 0,2 mL y disminuyendo la cantidad de hexano en 0,2 mL, en cada fracción, hasta llegar a la última adición de 6 mL de hexano y 14 mL de acetato de etilo, siempre manteniendo un volumen total y constante de 20 mL). Se colectaron un total de 108 fracciones en frascos colectores de 10 mL. Luego para identificar las fracciones que contenían los productos se realizó un análisis cualitativo por Cromatografía en Capa Fina (CCF) en las cuales las fracciones de la 18-28 contenían el compuesto 2. Estas se combinaron y fueron etiquetadas como F-l 1 .554,8 mg (9,9% de rendimiento) de un aceite viscoso color amarillo oscuro (compuesto fórmula 2). Las fracciones de la 38-49 fueron combinadas y contenían el compuesto 3, etiquetado como F-ll 1281 ,8 mg (12,5% de rendimiento) de un aceite viscoso color amarillo (compuesto fórmula 3). Las fracciones de la 67-73 fueron combinadas y contenían el compuesto 4, etiquetado como F-lll 955,3 mg (6,1 % de rendimiento) de un aceite viscoso color amarillo oscuro (compuesto fórmula 4). Las fracciones de la 74-76 fueron combinadas y contenían la mezcla de compuestos 1 y 4, etiquetada como F-IV 415,4 mg de un aceite viscoso color amarillo oscuro (mezcla de los compuestos de fórmula 1 y 4, en proporción de 0,125:1 respectivamente). Las fracciones de la 77-87 fueron combinadas y contenían el compuesto 1 , etiquetada como F-V 2816,2 mg (27,6% de rendimiento) de un aceite viscoso color amarillo (compuesto fórmula 1 ). Desde las fracciones 88-108, se recuperó el material de partida (orcinol) que no reaccionó (78,6 mg).

Caracterización espectroscópica compuesto fórmula 1 :

RMN de ¹ H: 6,26 (s, 1 H, H-6); 6,22 (s, 1 H, H-2); 5,60 (s. ancho, 2H, OH); 5,13 (t, J = 6,8 Hz, 1 H, H-2 ^' ); 5,05 (t, J = 6,7 Hz, 1 H, H-6 ^' ); 3,28 (d, J = 6,7 Hz, 2H, H-1 ^' ); 2,21 (s, 3H, H-7); 2,09-2,06 (m, 2H, H-5 ^' ); 2,04-2,00 (m, 2H, H-4 ^' ); 1 ,78 (s, 3H, CH ₃ -C3 ^' ); 1 ,67 (s, 3H, H-8 ^' ); 1 ,58 (s, 3H, CH ₃ -C7 ^' ); RMN de ¹³ C: 155,2 (C-3); 154,1 (C-1 ); 138,6 (C- 5); 137,2 (C-3 ^' ); 131 ,8 (C-7 ^' ); 123,9 (C-6 ^' ); 122,2 (C-2 ^' ); 1 18,1 (C-4); 109,7 (C-6); 101 ,0 (C-2); 39,6 (C-4 ^' ); 26,4 (C-5 ^' ); 25,6 (C-8 ^' ); 25,0 (C-1 ^' ); 20,0 (C-7); 17,6 (CH ₃ - C7 ^' ); 16,1 (CH ₃ -C3 ^' ); IR (crn ^-1 ): 3.393, 2.975, 2.925, 2.859, 1 .602; EM (m/z, %): M ⁺ 260 (21,7), 137 (100), 191 (26,9), 177 (13,9), 123 (10,5).

Caracterización espectroscópica compuesto fórmula 2:

RMN de ¹ H: 6,30 (s, 1H, H-6); 5,50 (s, 1H, OH); 5,44 (s. ancho, 1H, OH); 5,32 (t, J = 6,9 Hz, 1 H, H-2 ^' ); 5,19 (t, J= 6,6 Hz, 1 H, H-2 ^" ); 5,11 (t, J= 6,6 Hz, 2H, H-6 ^' y H-6 ^" ); 3,46 (d, J= 6,9 Hz, 2H, H-1 ^' ); 3,35 (d, J= 6,6 Hz, 2H, H-1 ^" ); 2,25 (s, 3H, CH ₃ -Ar); 2,16-2,15 (m, 4H, H-5 ^' y H-5 ^" ); 2,12-2,09 (m, 4H, H-4 ^' y H-4 ^" ); 1 ,86 (s, 3H, CH ₃ -C3 ^' ); 1,84 (s, 3H, CH3-C3 ^" ); 1,73 (s, 6H, CH ₃ -C7 ^' y CH ₃ -C7 ^" ); 1,64 (s, 6H, H-8 ^' y H-8 ^" ); RMN de ¹³ C: 153,4 (C-3); 152,5 (C-1); 138,3 (C-3 ^' ); 137,0 (C-3 ^" ); 135,1 (C-5); 131,8 ( ⁺ C-7 ^' ); 131,6 ( ⁺ C-7 ^" ); 123,9 ( ⁺⁺ C-6 ^' ); 123,8 ( ⁺⁺ C-6 ^" ); 122,5 (C-2 ^" ); 122,0 (C-2 ^' ); 118,1 (C-4); 111,5 (C-2); 109,7 (C-6); 39,6 (C-4 ^' ); 39,5 (C-4 ^" ); 26,4 ( ⁺⁺⁺ C-5 ^' ); 26,3 ( ⁺⁺⁺ C-5 ^" ); 25,6 (C-8 ^' y C-8 ^" ); 25,4 (C-1 ^" ); 22,5 (C-1 ^' ); 19,7 (CH ₃ -Ar); 17,6 (C-10 ^' y C- 10 ^" ); 16,1 (C-9 ^' ); 16,0 (C-9 ^" ); IR (crn ^-1 ): 3.454, 2.967, 2.917, 2.855, 1.747, 1.621, 1.592, 1.448, 1.377.

Caracterización espectroscópica compuesto fórmula 3:

RMN de ¹ H: 6,26 (s, 2H, H-6 y H-4); 5,66 (s. ancho, 2H, OH); 5,29 (t, J= 6,6 Hz, 1 H, H-2 ^' ); 5,08 (t, J= 6,1 Hz, 1H, H-6 ^' ); 3,42 (d, J= 7,0 Hz, 2H, H-1 ^' ); 2,20 (s, 3H, CH ₃ - Ar); 2,13-2,10 (m, 2H, H-5 ^' ); 2,09-2,07 (m, 2H, H-4 ^' ); 1,83 (s, 3H, CH ₃ -C3 ^' ); 1,70 (s, 3H, H-8 ^' ); 1 ,61 (s, 3H, CH ₃ -C7 ^' ); RMN de ¹³ C: 154,8 (C-1 y C-3); 138,6 (C-3 ^' ); 137,3 (C-5); 131 ,9 (C-7 ^' ); 123,7 (C-6 ^' ); 121 ,8 (C-2 ^' ); 110,6 (C-2); 109,0 (C-4 y C-6); 39,6 (C- 4 ^' ); 26,3 (C-5 ^' ); 25,6 (C-8 ^' ); 22,1 (C-1 ^' ); 21,0 (CH ₃ -Ar); 17,6 (CH ₃ -C7 ^' ); 16,0 (CH ₃ - C3 ^' ); IR(cm- ¹ ): 3.455, 2.966, 2.922, 2.852, 1 .772.

Caracterización espectroscópica compuesto fórmula 4:

RMN de ¹ H: 6,25 (s, 1 H, H-2); 5,12 (t, J= 6,4 Hz, 2H, H-2 ^' ); 5,05 (t, J= 6,6 Hz, 2H, H- 6 ^' ); 3,33 (d, J = 6,6 Hz, 4H, H-1 ^' ); 2,21 (s, 3H, CH ₃ -Ar); 2,09-2,06 (m, 4H, H-5 ^' ); 2,03- 2,00 (m, 4H, H-4 ^' ); 1 ,78 (s, 6H, CH ₃ -C3 ^' ); 1 ,66 (s, 6H, H-8 ^' ); 1 ,58 (s, 6H, CH ₃ -C7 ^' ); RMN de ¹³ C: 152,9 (C-1 y C-3); 136,7 (C-3 ^' ); 136,4 (C-5); 131 ,7 (C-7 ^' ); 124,0 (C-6 ^' ); 122,6 (C-2 ^' ); 1 18,5 (C-4 yC-6); 101 ,4 (C-2); 29,6 (C-4 ^' ); 26,5 (C-5 ^' ); 25,7 (C-8 ^' ); 25,6 (C-1 ^' ); 17,6 (CH ₃ -C7 ^' ); 16,2 (CH ₃ -C3 ^' ); 15,8 (CH ₃ -Ar); IR(cm- ¹ ): 3.404, 2.967, 2.922, 2.855, 1 .649, 1 .599, 1 .445, 1 .376.

Procedimiento de síntesis de los compuestos derivados acetilados de geranilorcinol de las fórmulas 5, 6, 7 y 8.

De cada compuesto se tomó una porción (362 mg del compuesto de fórmula 1 ,; 170 mg del compuesto de fórmula 2; , 74 mg del compuesto de fórmula 3, y 245 mg del compuesto de fórmula 4,) las que fueron colocadas en forma independiente en cuatro balones de reacción con 50 mL de CH2CI2, posteriormente a cada balón se le agregó 1 ,0 mL de anhídrido acético y 2 cristales de 4-A/,A/-dimetilaminopiridina (DMAP). Luego cada mezcla se dejó en agitación por aproximadamente una hora. Terminada la reacción la solución de cada balón fue evaporada a sequedad y re- suspendida en 50 mL de acetato de etilo, la que fue lavada con 30 mL de una solución de bicarbonato de sodio (al 5%) y agua (2 ^χ 20 mL), posteriormente secada sobre sulfato de sodio anhidro (20 g), filtrada y evaporada a sequedad. Finalmente, se obtuvieron los cuatro compuestos representados por las fórmulas 5 a 8, con los siguientes rendimientos: Compuesto 5: 444,6 mg (92,8% de rendimiento) de un aceite viscoso color amarillo oscuro. Compuesto 6: 185 mg (90,5% de rendimiento) de un aceite viscoso color amarillo oscuro. Compuesto 7: 93,3 mg (96,4% de rendimiento) de un aceite viscoso color amarillo oscuro. Compuesto 8: 267,5 mg (89,8% de rendimiento) de un aceite viscoso color amarillo oscuro.

Caracterización espectroscópica compuesto fórmula 5: RMN de ¹ H: 6,80 (s, 1 H, H-6); 6,70 (s, 1 H, H-2); 5,04 (t, J = 6,3 Hz, 1 H, H-6 ^' ); 4,97 (t,

J = 6,4 Hz, 1 H, H-2 ^' ); 3,21 (d, J = 6,4 Hz, 2H, H-1 ^' ); 2,28 (s, 6H, COCH ₃ ^χ 2); 2,26 (s,

3H, CHs-Ar); 2,06-2,02 (m, 2H, H-5 ^' ); 1 ,99-1 ,95 (m, 2H, H-4 ^' ); 1 ,73 (s, 3H, CH ₃ -C3 ^' );

1 ,65 (s, 3H,H-8 ^' ); 1 ,58 (s, 3H, CH ₃ -C7 ^' ); RMN de ¹³ C: 169,3 (COCH ₃ ); 169,2 (COCH ₃ );

149,0 (C-3);148,3 (C-1 ); 139,2 (C-5); 135,7 (C-3 ^' ); 131 ,4 (C-7 ^' ); 129,7 (C-4); 124,1 (C- 6 ^' ); 121 ,2 (C-2 ^' ); 120,8 (C-6); 1 13,5 (C-2); 39,5 (C-4 ^' ); 26,5 (C-5 ^' ); 25,8 (C-8 ^' ); 25,6

(C-1 ^' ); 21 ,1 (COCH ₃ ); 20,9 (COCH ₃ ); 19,7 (CH ₃ -Ar); 17,6 (CH ₃ -C7 ^' ); 16,2 (CH ₃ -C3 ^' ).

IR (crn ^-1 ): 2.968, 2.927, 2.851 , 1 .774, 1 .752, 1 .367; EM (m/z, %): 274 (10,8), 259 (4,1 ),

192 (12,3), 191 (100), 176 (8,3).

Caracterización espectroscópica compuesto fórmula 6:

RMN de ¹ H: 6,79 (s, 1 H, H-6); 5,08-5,04 (m, 3H, H-6 ^' , H-6 ^" y H-2 ^' ); 5,00 (t, J = 7,0 Hz, 1 H,H-2 ^" ); 3,17 (s. ancho, 4H, H-1 ^' y H-1 ^" ); 2,28 (s, 3H, COCH ₃ ); 2,26 (s, 6H, COCHs y CHs-Ar); 2,08-2,04 (m, 4H, H-5 ^' y H-5 ^" ); 2,00-1 ,96 (m, 4H, H-4 ^' y H-4 ^" ); 1 ,73 (s, 3H, ^* CH ₃ -C3 ^' ); 1 ,71 (s, 3H, ^* CH ₃ -C3 ^" ); 1 ,67 (s, 6H, H-8 ^' y H-8 ^" ); 1 ,59 (s, 6H, CH ₃ -C7 ^' y CH ₃ -C7 ^" );RMN de ¹³ C: 169,3 (COCH ₃ ); 169,0 (COCH ₃ ); 148,1 (C-3); 147,2 (C-1 ); 136,2 (C-5); 135,4( ⁺ C-3 ^' ); 135,2 ( ⁺ C-3 ^" ); 131 ,3 (C-7 ^' y C-7 ^" ); 130,2 (C-4); 124,1 (C-6 ^' y C-6 ^" ); 123,9 (C-2);121 ,8 (C-6); 121 ,5 ( ^{+ +} C-2 ^' ); 121 ,4 ( ^{+ +} C-2 ^" ); 39,5 (C-4 ^' y C-4 ^" ); 26,5 (C-5 ^' y C-5 ^" ); 26,4(C-1 ^" ); 25,6 (C-8 ^' y C-8 ^" ); 24,2 (C-1 ^' ); 20,8 (COCH ₃ ); 20,5 (COCH3); 19,4 (CHs-Ar); 17,6(CH ₃ -C7 ^' y CH ₃ -C7 ^" ); 16,1 ( ⁺⁺⁺ CH ₃ -C3 ^" ); 16,0 ( ⁺⁺⁺ CH ₃ -C3 ^' ).

Caracterización espectroscópica compuesto fórmula 7: RMN de ¹ H: 6,77 (s, 2H, H-4 y H-6); 5,06 (t, J= 6,3 Hz, 1 H, H-6 ^' ); 5,02 (t, J = 6,9 Hz, 1 H,H-2 ^' ); 3,14 (d, J = 6,9 Hz, 2H, H-1 ^' ); 2,32 (s, 3H, CH ₃ -Ar); 2,27 (s, 6H, COCH ₃ ); 2,07-2,01 (m, 2H, H-5 ^' ); 1 ,97-1 ,93 (m, 2H, H-4 ^' ); 1 ,71 (s, 3H, CH ₃ -C3 ^' ); 1 ,66 (s, 3H, H-8 ^' ); 1 ,58 (s, 3H, CH ₃ -C7 ^' ); RMN de ¹³ C: 169,1 (COCH ₃ x 2); 149,4 (C-1 y C-3); 137,0 (C-5); 135,5 (C3 ^' ); 131 ,3 (C-7 ^' ); 124,0 (C-6 ^' ); 123,3 (C-2); 121 ,2 (C-2 ^' ); 120,8 (C-4 - C-6); 39,5 (C-4 ^' );26,5 (C-5 ^' ); 25,6 (C-8 ^' ); 23,6 (C-1 ^' ); 20,9 (CH ₃ -Ar); 20,8 (COCH ₃ ^χ 2); 17,6 (CH ₃ -C7 ^' ); 16,1 (CH ₃ -C3 ^' ).

Caracterización espectroscópica compuesto fórmula 8:

RMN de ¹ H: 6,70 (s, 1 H, H-2); 5,06 (t, J= 6,2 Hz, 2H, H-6 ^' ); 5,01 (t, J= 5,6 Hz, 2H, H- 2 ^' ); 3,26 (d, J = 6,2 Hz, 4H, H-1 ^' ); 2,28 (s, 6H, COCH ₃ ); 2,22 (s, 3H, CH ₃ -Ar); 2,08- 2,05 (m, 4H,H-5 ^' ); 2,01 -1 ,98 (m, 4H, H-4 ^' ); 1 ,75 (s, 6H, CH ₃ -C3 ^' ); 1 ,67 (s, 6H, H-8 ^' ); 1 ,60 (s, 6H, CH ₃ -C7 ^' ); RMN de ¹³ C: 169,2 (COCH ₃ ^χ 2); 146,8 (C-1 y C-3); 137,9 (C- 5); 135,3 (C-3 ^' ); 131 ,2 (C-7 ^' ); 130,0 (C-4 y C-6); 124,0 (C-6 ^' ); 121 ,6 (C-2 ^' ); 1 13,9 (C- 2); 39,4 (C-4 ^' ); 26,4 (C-5 ^' );26,2 (C-1 ^' ); 25,5 (C-8 ^' ); 20,7 (COCH ₃ ^χ 2); 17,5 (CH ₃ -C7 ^' ); 16,0 (CH ₃ -C3 ^' ); 5,4 (CH ₃ -Ar).

Evaluación de la actividad antifúngica de los compuestos sintetizados frente a botrytis cinérea en estado libre y sistema encapsulado. > Preparación de la solución stock de cada compuesto sintetizado sin encapsular.

20-40 miligramos de cada uno de los compuestos 1 a 8, fueron disueltos en 500 microlitros de Etanol para tener una solución stock propia de cada compuesto de acuerdo a su peso molecular. La solución stock fue diluida en 5mL de agua para obtener una nueva solución stock de 5.000 ppm; de la cual se tomaron las alicuotas correspondientes para alcanzar una concentración final en cada placa con medio de cultivo agar papa dextrosa (APD) de 50, 150 y 250 ppm.

> Preparación de la solución stock de cada compuesto sintetizado en una solución polimérica Pluronic F-127.

El método empleado para la preparación de micelas poliméricas, en base a Policaprolactona (PM:3.409 g/mol) o Pluronic® F-127 (PM: 12.500 g/mol), corresponde al método de disolución directa que consiste en la adición del polímero a agua con agitación y a temperatura ambiente, hasta que el polímero se disuelve obteniéndose una solución acuosa transparente. La cantidad de polímero y agua se eligen de modo de tener una disolución de concentración 1 x10 ³ M de cadenas poliméricas.

Para la preparación de una solución de 50 mL de Pluronic F-127 se utilizan 0,63 g y para e caso de policaprolactona se ultilizan 0,17 g.

El encapsulamiento físico de los compuestos en las micelas poliméricas (1 x10 ^{" 3} M) se realiza mediante el método de emulsión, el compuesto se disuelve en un disolvente volátil (diclorometano) y se agrega a 10 mL de la disolución polimérica en alícuotas de 100 μΙ_ hasta completar los 400 μΙ_ llegando a una concentración de 0,101 M de compuesto. Agitando en un vortex y aplicando ultrasonido se forma una emulsión lechosa muy homogénea. Enseguida el solvente orgánico se elimina por evaporación al calentar la emulsión a 50 °C en un sistema abierto al aire. Al eliminares el disolvente queda una disolución transparente que contiene el polímero formando micelas y los compuestos no polares que han sido encapsulados en el microdominio hidrofóbico porporcionado por el núcleo de estas micelas poliméricas..

Posteriormente, la disolución se diluye agregando disolución del polímero correspondiente a una concentración 1 x 10 ³ M, hasta que el compuesto de interés alcance una concentración stock en un rango de 625-1 .250 ppm en la micela para ser aplicado en la placa. Esta dilución debe hacerse agregando solución de polímero de modo de mantener la misma concentración de micelas y variar solo la concentración de principio activo.

> Test de Actividad Antifitopatógena contra B. cinérea.

Para determinar la inhibición del crecimiento micelial de B. cinérea, tanto para los compuestos en estado libre y encapsulados se utilizó el método de crecimiento radial en medio de cultivo agar papa-dextrosa (APD). Los compuestos de interés tanto en forma libre como encapsulada fueron adicionados en el APD a distintas concentraciones de 50, 150 y 250 ppm a una temperatura de 50°C. Una vez solidificado el APD se sembró un disco de 4 mm de diámetro con micelio del patógeno en el centro de la placa petri. El experimento consta de un control negativo el cual consiste en una placa petri donde se le adicionó medio de cultivo APD y Etanol 1 %, en el caso del Control Negativo para compuestos encapsulados consiste en adicionar sólo la micela (policaprolactona o Pluronic F-167) libre en APD. Además, se incluye un control positivo que contiene el fungicida comercial Captan en medio de cultivo APD a las mismas concentraciones ensayadas tanto en su forma libre como también un control positivo de Captan en su forma encapsulada. Cada tratamiento fue constituido por tres réplicas (n=3 réplicas/compuesto/concentración).

Después de 48 (estado libre) y 72 (sistema encapsulado) horas de incubación a 23°C bajo un fotoperiodo de 16 horas luz/8 horas oscuridad se calculó el porcentaje de inhibición del crecimiento micelial (PICM) evaluando la medición del diámetro de crecimiento del hongo alrededor del disco para calcular el área de inhibición del crecimiento micelial. De esta forma se determinó el porcentaje de inhibición micelial que fue comparado con los controles correspondientes posterior a 48 horas de incubación.

Resultados

La tabla 1 muestra que todos los compuestos derivados de las fórmulas 1 a 8 en su estado libre afectan el crecimiento micelial del hongo patógeno B. cinérea in vitro entre un 51 -97 % a concentraciones entre 150 y 250 ppm, comparado al control negativo después de 48 horas de incubación. El compuesto 6 resultó ser el más activo inhibiendo el crecimiento micelial en un 97% a 250 ppm. El resultado de inhibición es directamente dependiente de la concentración en que se aplica contra el patógeno.

La capacidad de inhibición se incrementa cuando los compuestos son encapsulados en micelas poliméricas de distinto origen. En el caso de los

compuestos derivados de fórmulas 2, 4, 6 y 8 la actividad biológica in vitro se incrementa cuando se encuentran encapsulados en micelas formadas por Pluronic F-127, obteniendo un porcentaje de inhibición micelial a 50 ppm entre 81 -99 % en comparación al control negativo después de 72 horas. Sin embargo, cuando estos compuestos se encapsulan en micelas de policaprolactona solo el compuesto de fórmula 4 mejora su actividad biológica en un 93% a 50 ppm, en cambio los compuestos derivados de fórmulas 2, 6 a 8 no producen un efecto de inhibición en el micelio del patógenoal estar encapsulados en micelas de caprolactona.

En el caso del compuesto monoacoplado de fórmula 1 (anteriormente descrito en bibliografía) también mejora levemente su actividad a concentraciones menores cuando se encuentra encapsulado en policaprolactona en comparación al control. A diferencia del compuesto monoacoplado de fórmula 3 (anteriormente descrito en bibliografía) que resultó inactivo frente al micelio del hongo cuando se encuentra encapsulado en policaprolactona.

Los resultados indican que la actividad biológica de inhibición micelial mejora al encapsular los compuestos en micelas poliméricas; dependiendo de su estructura se podría inferir que para los compuestos derivados diacoplados de fórmulas 2, 4, 6 y 8 resulta más efectivo utilizar una micela polimérica de Pluronic F-127, ya que su actividad llega a igualar se a la actividad del control positivo.

En el caso de compuestos derivados monoacoplados de las fórmulas 1 , 3, 5 y 7 su efectividad dependerá de su conformación estructural cuando se encuentran encapsulados en una micela de dibloque policaprolactona.

Tabla 1 : Porcentaje de Inhibición micelial de los compuestos Fórmula 1-8 tanto en sistema libre y en forma encapsulada en Policaprolactona y Pluronic F-127 a distintas concentraciones in vitro.

(-): No testeado.