"MÉTODO PARA TRANSFORMAR UMA CÉLULA DE PLANTA OU TECIDO DE PLANTA USANDO AGROBACTERIUM, PLANTA TRANSGÊNICA, CÉLULA TRANSGÊNICA OU TECIDO TRANSGÊNICO, MEIO DE CULTURA, E, USO DE UM MÉTODO PARA TRANSFORMAR UMA CÉLULA DE PLANTA OU TECIDO DE PLANTA."

Campo da invenção

[0001] A presente invenção refere-se de forma geral à biotecnologia de plantas. Mais especificamente, a invenção refere-se a métodos de transformação de plantas mediados por Agrobacterium.

Antecedentes da Invenção

[0002] A cana-de-açúcar (Saccharum spp.) é planta gramínea que pertence à família botânica Poaceae, sendo originária do Sudeste Asiático, da grande região central da Nova Guiné e Indonésia (Daniels & Roach, 1987, Sugarcane improvement through breeding p. 7-84). Ela é uma das mais importantes espécies vegetais cultivadas nas regiões tropicais e subtropicais, com uma área maior que 23 milhões de hectares distribuídos em 121 países (FAO Statistical Yearbook 2012 p. 233).

[0003] A área de plantio de cana-de-açúcar está aumentando e ela é fonte de matéria prima para a produção de açúcar, vinho, melaço, rum, cachaça (o destilado nacional do Brasil) e etanol para combustível. O bagaço que permanece após a moagem da cana-de-açúcar pode ser utilizado para enfardamento e fornecimento de energia calorífica, empregada no moinho, e eletricidade, que é tipicamente vendida para a grade elétrica do consumidor, e como base de produção de etanol. Desta forma, a agroindústria canavieira, responsável por gerar milhões de empregos na área, tem uma grande importância social, com geração de divisas através da exportação de açúcar e etanol e pelo aproveitamento racional da biomassa vegetal.

[0004] Mais recentemente, com o advento do tema aquecimento global e uso de fontes alternativas a combustíveis fósseis (biocombustíveis), o interesse mundial por cana-de-açúcar tem aumentado de maneira significativa.

[0005] Devido à importância económica e social da cana-de-açúcar, observa-se um grande esforço em pesquisas com o objetivo de definir melhores práticas agrícolas para o seu cultivo e de melhorar a qualidade das variedades cultivadas.

[0006] A este respeito, os métodos tradicionais de melhoramento têm se mostrado limitados para a introdução de genes e traços de interesse em diferentes variedades de interesse comercial.

[0007] Devido a esta dificuldade e à necessidade crescente de incorporar traços desejáveis, como por exemplo, aumento de produtividade, tolerância a insetos, patógenos e herbicidas, resistência a estresses abióticos, etc, os métodos de biologia molecular têm sido utilizados para a manipulação de cana-de-açúcar.

[0008] A engenharia genética de plantas envolve a transferência de genes de interesse para dentro de células vegetais, de tal maneira que uma progénie fértil e agronomicamente superior que mantenha e expresse de forma estável o gene exógeno possa ser obtida. Para tanto, uma das opções é a utilização de técnicas de cultivo in vitro.

[0009] Um dos caminhos do cultivo in vitro é a embriogênese somática, que consiste na produção de embriões a partir de uma célula isolada ou um pequeno grupo de células que, por meio de cultivo in vitro darão origem a embriões somáticos. Neste caso, estruturas semelhantes a embriões zigóticos se desenvolvem a partir de células somáticas, seguindo uma sequência de estágios característicos da embriogênese zigótica, dando origem a uma planta, sem que ocorra a fusão de gâmetas (Jimenez. 2001. Regulation of in vitro somatic embryogeneis with emphasis on the role of endogenous hormones. Revista Brasileira de Fisiologia Vegetal, v. 13, p. 196-223).

[00010] Segundo Guerra et al., Embriogênese somática e sementes sintéticas. In: Torres et al. (Eds.). 1999. Cultura de tecidos e transformação genética de plantas. Brasília: Embrapa, v.2, p. 533-568, uma característica marcante dos embriões somáticos é a presença de um sistema vascular fechado, sem conexão vascular com os tecidos do explante inicial. Esta característica aliada a sua bipolaridade (presença de ápices caulinar e radicular), permite a distinção entre os processos de embriogênese e organogênese (Falco et al. 1996. Histological characterization of in vitro regeneration of Saccharum sp. Revista IBrasileira de Fisiologia Vegetal, v.9, p. 93-97).

[00011] De acordo com Suprasanna et al. (2005. Regulation of somatic embryogenesis by plant growth regulators in sugarcane. Sugar tech, v. 7, p. 123-128), o emprego da embriogênese somática na cultura de cana-de-açúcar tem dois objetivos principais: o desenvolvimento de um método reprodutível para a propagação rápida de plantas e a obtenção de um eficiente sistema de regeneração de embriões somáticos utilizados para a transformação genética.

[00012] Diversos tipos de explantes têm sido empregados no processo embriogênico em cana-de-açúcar. De acordo com Lakshmanan et al. (2006. Developmental and hormonal regulation of direct shoot organogenesis and somatic embryogenesis in sugarcane (Saccharum spp. Interspecific hybrids) leaf culture. Plant Celi Reports, v. 25, p. 1007-1015), praticamente todas as partes da planta produzem calos embriogênicos, porém as folhas mais jovens (Chengalrayan & Gallo-Meagher. 2001. In vitro Cellular and Developmental Biology-Plant, Oxon, v. 37, p. 434-439; Lakshmanan et al. 2006. Developmental and hormonal regulation of direct shoot organogenesis and somatic embryogenesis in sugarcane (Saccharum spp. Interspecific hybrids) leaf culture. Plant Cell Reports, v. 25, p. 1007-1015; Snyman et al. 2011. Applications of in vitro culture systems for commercial sugarcane production and improvement. In vitro Cellular and Developmental Biology Plant, v. 47, p. 234-249, 2011) e inflorescências em desenvolvimento (Gallo-Meagher et al. 2000. Thidiazuron stimulates shoot regeneration of sugarcane embryogenic callus. In vitro Cellular and Developmental Biology Plant, v. 36, p. 37-40); Desai et al. 2004. Current Science, Bangalore, v. 87, p. 764-768), são muito prolíficos e são tecidos-alvos preferidos para uma produção rápida de calos embriogênicos.

[00013] A iniciação da embriogênese somática se dá através da adição de reguladores de crescimento ao meio de cultura e, dentre estes, as auxinas destacam-se como a classe de reguladores de crescimento mais utilizados no processo embriogênico (Cooke et al. 1993. The role of auxin in plant embryogenesis. The Plant Cell, v. 5, p. 1494-1495, 1993). O 2,4D (ácido 2,4- diclorofenoxiacetico) é o regulador de crescimento mais empregado no processo de indução de embriogênese somática em cana-de-açúcar.

[00014] A conversão dos embriões somáticos em plantas é a fase final do processo de embriogênese somática. A regeneração geralmente ocorre em meio desprovido de reguladores de crescimento e na presença de luz (Garcia et al. 2007. In vitro morphogenesis patterns from shoot ápices of sugarcane are determined by light and type of growth regulator. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, v. 90, p.181-190; Watt et al. 2009. In vitro minimal growth storage of Saccharum spp. Hybrid (genotype 88H0019) at two stages of direct somatic embryogenic regeneration. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, v. 96, p. 263-271 ; Suprasana, et al. 2010. Profiling of culture-induced variation in sugarcane plants regenerated via direct and indirect somatic embryogenesis by using transposon-insertion polymorphism. Sugar Tech, v.12, p. 26-30; Van Der Vyver, C. 2010. Genetic transformation of the euploid Saccharum officinarum via direct and indirect embryogenesis. Sugar tech, v. 12, p. 21-25; Basnayake et al. 2011. Embryogenic callus proliferation and regeneration conditions for genetic transformation of diverse sugarcane cultivars. Plant Celi Reports, v. 30, p. 439-448), porém, este processo pode ser potencializado pela utilização de diferentes reguladores (Ali et al. 2008. An efficient protocol for large scale production of sugarcane through micropropagation. Pakistan Journal of Botany, v.40, p. 139-149; Nieves et al. 2008. Effect of exogenous arginine on sugarcane (Saccharum sp.) somatic embryogenesis, free polyamines and the contents of the soluble proteins and proline. Plant Celis, Tissue and Organ Culture, v. 95, p. 313-320; Kaur & Gosal. 2009. Desiccation of callus enhances somatic embryogenesis and subsequent shoot regeneration in sugarcane. Indian Journal of Biotechnology, v. 8, p. 332-334; Goel et al. 2010. In vitro morphogenesis in leaf sheath explants of sugarcane hybrid var. CoS 99259. Sugar Tech, v. 12, p. 172-175; Wamaitha et al. 2010. Thidiazuron-induced rapid shoot regeneration via embryo-like structure formation from shoot tip-derived callus culture of sugarcane. Plant Biotechnology, v. 27, p. 365-368).

[00015] A tecnologia do DNA recombinante possibilitou o isolamento de genes e a inserção estável em um genoma hospedeiro (Quecini & Vieira.2001. Plantas transgênicas. In: Serafini et al. (Ed.). Biotecnologia na agricultura e na agroindústria. Guaíba: Agropecuária, p. 278-331). Esta técnica, também chamada de transformação genética, pode ser definida como a introdução controlada de ácidos nucleicos (DNA) em um genoma receptor, excluindo-se a introdução por fecundação. E um processo mais controlado, onde normalmente apenas o fragmento definido de DNA é introduzido no genoma do hospedeiro, ou genoma receptor, devendo ser a ele integrado (Brasileiro & Dusi. 1999. Transformação genética de plantas. In: Torres et al. (Ed.) Cultura de tecidos e transformação genética de plantas. Brasília: EMBRAPA- SPI/EMBRAPA-CNPH, 863p, v.2). A inserção estável dessas moléculas em um genoma hospedeiro dá origem a um indivíduo igual ao receptor da molécula recombinante, porém acrescido de uma característica nova e particular (Quecini & Vieira, 2001, supra).

[00016] Existem diversas técnicas de transformação genética de plantas agrupadas em duas categorias: transferência indireta e direta de genes. A indireta é aquela em que o DNA exógeno é inserido no genoma pela ação de um vetor biológico, enquanto que a direta é baseada em processos físico- bioquímicos.

[00017] A transformação indireta baseia-se principalmente no sistema mediado por bactérias do género Agrobacterium e tem sido o método mais utilizado para obtenção de plantas transgênicas. Agrobacterium tumefaciens e A. rhizogenes são bactérias fitopatogênicas de solo, gram negativas, pertencentes à família Rhizobiaceae, que causam doenças em dicotiledôneas, conhecidas como galhas da coroa e raiz em cabeleira, respectivamente. Nesta interação planta-patógeno ocorre um processo de transferência natural de genes entre a agrobactéria e a célula vegetal, quando fragmentos de DNA bacteriano (T-DNA) são transferidos para dentro da célula vegetal, integrando-se ao genoma nuclear (Ream & Gelvin. 1996. Crow gall: Advances in understanding interkingdon gene transfer. Saint Paul: APS Press, 148p). Em sua forma natural, a bactéria transfere o T-DNA ("transferred DNA"), que é parte do plasmídeo bacteriano denominado Ti ("tumour- inducing"), e este se integra ao genoma das células de plantas infectadas. No fragmento de T-DNA que é transferido para a célula vegetal estão os genes envolvidos na bios síntese constitutiva de fitohormônios (auxinas e citocininas) que alteram o programa de desenvolvimento normal do tecido infectado, ocasionando a formação do tumor. Além disso, contém também oncogenes para a síntese de açúcares e aminoácidos denominados de opinas, que são responsáveis pela sobrevivência da bactéria, que os utilizam como fonte de carbono e nitrogénio (Oger et al. 1997. Genetically engineered plants producing opines alter their biological environment. Nature Biotechnology, New York, v. 15, p. 369-372).

[00018] Extremidades repetidas de 25 pares de base (pb) nas bordas direita e esquerda delimitam o T-DNA e imprescindíveis para a transferência do mesmo (Wang et al. 1984. Celi, Cambridge, v. 38, p. 455-462). Compostos fenólicos liberados pelos tecidos vegetais lesionados ativam regiões especificas (vir), iniciando o processo de transferência do T-DNA para a célula vegetal (Stachel et al. 1985. Identification of the signal molecules produced by wounded plant cells that activate T-DNA transfer in Agrobacterium tumefaciens. Nature, London, v. 318, p. 624-629). A Agrobacterium possui também genes cromossomais (chv) que garantem a ligação entre as células bacteriana e hospedeira, permitindo a formação do poro de passagem do complexo contendo a fita - T (Sheng & Citovsky. 1996. Agrobacterium-plant cell DNA transport: have virulence proteins, will travei. The Plant Cell, Baltimore, v.8, p. 1699-1710).

[00019] A região de virulência, denominada região vir é responsável pelo processo de transferência, sendo que o processo de indução e transferência da fita - T é controlado pela expressão coordenada dessa região. O locus virA codifica uma proteína de membrana que percebe a presença de metabólitos da planta injuriada (acetoseringona). Ao se ligar a acetoseringona, a proteína VirA "ativada" modifica a proteína VirG, que também é expressa constitutivamente, mas em menor escala através da fosforilação da mesma. A proteína VirG fosforilada é responsável pela indução da transcrição de toda região vir. Para formar a fita - T, o operon virD codifica endonucleases capazes de reconhecer e clivar dentro dos 25 pb que delimitam a região-T. A transferência da fita - T é polar, sempre da direita para a esquerda. A fita-T é transferida para a célula vegetal na forma de fita simples, protegida na porção 5' da molécula pela proteína VirD2, ao longo da fita - T, pela proteína VirE2 (Zambryski. 1992. Chronicle from the Agrobacterium-plant cell DNA transfer story. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, Palo Alto, v. 43, p. 465-490). O T-DNA liberado é protegido por ligações ao longo da fita simples pela proteína VirE2, que também seria responsável pela organização estrutural da fita durante o trajeto entre a célula bacteriana e a célula vegetal. Proteínas codificadas pelos locus virB garantiriam a passagem pela membrana da bactéria, pela formação de poro de passagem entre a membrana e a parede celular (Zambryski, 1992, supra).

[00020] O processo de transferência pode ser dividido em duas etapas principais: uma etapa bacteriana e uma etapa eucariótica que ocorre na célula vegetal (Zupan & Zambryski. 1995. Plant Physiology, Rockville, v. 107, p. 1041-1047). A etapa bacteriana inclui a produção e exportação de um vetor funcional contendo a informação genética do T-DNA (Tinland. 1996. The integration of T-DNA into plant genomes. Trend in Plant Science, Kidlington, v. 1, p. 178-183). A etapa eucariótica inclui o reconhecimento entre a Agrobacterium e a célula hospedeira, a transdução de sinais vegetais de patogênese e a ativação dos genes vir (Sheng & Citovsky. 1996, supra). Uma vez que o segmento a ser transferido é definido por suas bordas, a região codificadora do T-DNA do tipo selvagem pode ser substituída por qualquer outra sequência de DNA sem que sua transferência da Agrobacterium para a planta seja prejudicada. A substituição dos oncogenes por genes de interesse, flanqueados pelas bordas do T-DNA, fornece um sistema eficiente de obtenção de plantas transgênicas (Brasileiro & Dusi. 1999, supra).

[00021] Os vetores utilizados para a transformação via A. tumefaciens são chamados de "desarmados", isto é, não possuem os oncogenes em seu plasmídeo, mas retém os genes de virulência (região vir), localizados no plasmídeo Ti (Ream & Gelvin. 1996. Crow gall: advances in understanding interkingdon gene transfer. Saint Paul: APS Press, 148p). Estas construções de plasmídeos possuem promotores de plantas e genes bacterianos que conferem resistência a antibióticos, fazendo com que estes marcadores sejam eficientes para a seleção de células ou plantas transformadas. Assim, a A. tumefaciens é utilizada como vetor de transformação, onde o fragmento de T- DNA é eliminado e substituído por um gene de interesse (Saciloto. 2003. Inserção do gene PR5K em cana-de-açúcar visando induzir resistência ao fungo da ferrugem Puccinia melanocephala. 74p. Dissertação de Mestrado apresentada na Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz", Universidade de São Paulo, Piracicaba), perdendo a capacidade de causar tumores, porém sendo capaz de transferir o DNA exógeno. Explantes inoculados com as linhagens desarmadas têm capacidade regenerativa e grande porcentagem de produção de plantas transgênicas (Brasileiro. 1998. Manual de transformação genética de plantas. Brasília: EMBRAPA, CENARGEN, 309p).

[00022] A complexidade do genoma poliplóide e aneuplóide das variedades de cana-de-açúcar (D 'Hont & Glaszmann. 2005. Unravelling the genome structure of polyploids using FISH and GISH; examples of sugarcane and banana. Cytogenetic and Genome Research, Basel, v. 109, n. 1-3, p. 27- 33), somada a sua base genética relativamente restrita, impõem grandes dificuldades à aplicação de técnicas do melhoramento tradicional. Diante desta situação, a biotecnologia pode ser aplicada nos programas de melhoramento para superar ou reduzir algumas das limitações às abordagens convencionais, assim como aumentar a produtividade de biocombustível de cana. Para isto, algumas características podem ser incorporadas à cultura por meio da engenharia genética através da transformação genética de plantas, para reduzir as perdas com estresses bióticos associados com pragas, plantas daninhas e doenças, e estresses abióticos relacionados à seca, frio, salinidade entre outros. A biotecnologia também pode fazer mudanças para otimizar o conteúdo e a qualidade do açúcar (Melotto-Passarin. (2009). Tese de Doutorado em Fisiologia e Bioquímica de Plantas apresentada na Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz", Universidade de São Paulo, Piracicaba, 148p.).

[00023] A cana-de-açúcar apresenta características que a tornam uma excelente planta para o melhoramento através da transformação genética, como a sua facilidade para regeneração de plantas a partir de calos in vitro (Heinz et al. 1997. Celi, tissue and organ culture in sugarcane improvement. In: Reinert & Bajaj (Ed.). Applied and fundamental aspects of plant cell, tissue and organ culture. Berlin: Springer Verlag, p.3-17; Irvine 1984. The frequency of marker change in sugarcane plants regenerated from callus culture. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Dordrecht, v. 3, n. 3, p. 201- 209; Chen et al. 1988. Control and maintenance of plant regeneration in sugarcane callus cultures. Journal of Experimental Botany, Oxford, v. 39, p. 251-261) e, ao seu modo de multiplicação em escala comercial por propagação vegetativa que possibilitaria a distribuição de transformantes estáveis aos produtores através de mudas (Gallo-Meagher & Irvine. 1996. Herbicide resistant transgenic sugarcane plants containing the bar gene. Crop Science, Madison, v. 36, n. 5, p. 1367-1374) . Por outro lado, não permite usar embrião zigótico como tecido alvo na transformação, ao contrário de milho, arroz, trigo e outros cereais comerciais.

[00024] Na última década, várias pesquisas foram realizadas para desenvolver eficientes métodos de transformação genética de cana-de-açúcar (Chen et al. 1987. Transformation of sugarcane protoplasts by direct uptake of a selectable chimeric gene. The Plant Celi Reports, New York, v.6, p. 297- 301 ; Bower & Birch. 1992. The Plant Journal, Oxford, v. 2, n. 3, p. 409-416; Rathius & Birch, R. G. 1992. Stable transformation of callus from electroporated sugarcane protoplasts. Plant Science, Amsterdam, v. 82, p. 81- 89; Smith et al. 1992. Transient expression of the coat protein of sugarcane mosaic virus in sugarcane protoplasts and expression in Escherichia coli. Archives of Virology, Vienna, v. 125, p. 15-23; Birch & Maretzki, A. 1993. Transformation of sugarcane. In: Bajaj, Y. P. S. (Ed.). Plant protoplasts and genetic engineering IV. Biotechnology in Agriculture and forestry. Heidelberg: Springer- Verlag, v. 23, p. 348-360; Gambley et al. 1993. Microprojetile transformation of sugarcane meristems and regeneration of shoots expressing β-glucuronidase. The Plant Celi Reports, New York, v. 12, p. 343-346; Gambley et al. 1994. Australian Journal of Plant Physiology, Melbourne, v. 21, p. 603-612; Birch. 1997. Plant transformation: problems and strategies for practical application. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, Palo Alto, v. 48, p. 297-326; Arencibia. 1998. An efficient protocol for sugarcane (Saccharum spp. L.) transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens. Transgenic Research, New York, v. 7, p. 213-222; Elliott et al. 1998. Australian Journal of Plant Physiology, Melbourne, v. 25, p. 739-743; Enriquez-Obregon et al. 1998. Planta, Berlin, v. 206, p. 20-27; Manickavasagam et al. 2004. Agrobacterium-mediated genetic transformation and development of herbicide-resistant sugarcane (Saccharum species hybrids) using axillary buds. The Plant Celi Reports, New York, v. 23, n. 3, p. 134-143). Diferentes técnicas de transformação usando eletroporação (Rathius & Birch. 1992. Stable transformation of callus from electroporated sugarcane protoplasts. Plant Science, Amsterdam, v. 82, p. 81- 89), tratamento com polietilenoglicol (PEG) (Chen et al. 1987. Transformation of sugarcane protoplasts by direct uptake of a selectable chimeric gene. The Plant Celi Reports, New York, v.6, p. 297-301), bombardeamento de micropartículas (Franks & Birch 1991. Gene transfer into intact cells using microprojectile bombardment. Australian Journal of Plant Physiology, Melbourne, v. 18, p. 471-480) e Agrobacterium tumejaciens (Arencibia. 1998. An efficient protocol for sugarcane (Saccharum spp. L.) Transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens. Transgenic Research, New York, v. 7, p. 213-222; Elliott et al. 1998. Agrobacterium- mediated transformation of sugarcane using GFP as a screenable marker. Australian Journal of Plant Physiology, v. 25, p. 739-743) foram utilizadas para introduzir genes marcadores em células e calos de cana. As primeiras células de cana transgênicas forma obtidas seguindo a transferência de DNA para protoplastos mediada por PEG (Chen et al. 1987. Transformation of sugarcane protoplasts by direct uptake of a selectable chimeric gene. The Plant Celi Reports, New York, v.6, p. 297-301).

[00025] As primeiras tentativas de transformar cana-de-açúcar utilizando Agrobacterium tumefaciens, com ou sem inibidores dos genes de virulência e outros tratamentos que melhoram a infecção, tiveram pouco sucesso (Birch & Maretzki. (1993). Transformation of sugarcane. In: Bajaj, Y.P.S. (Ed.). Plant protoplasts and genetic engineering IV. Biotechnology in agriculture and forestry. Heidelberg: Springer- Verlag, v. 23, p. 348-360). Entretanto, Arencibia (1998. An efficient protocol for sugarcane (Saccharum spp. L.) Transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens. Transgenic Research, New York, v. 7, p. 213-222) foi capaz de regenerar plantas de cana- de-açúcar transgênicas morfologicamente normais seguindo o co-cultivo de calos com Agrobacterium tumefaciens linhagens LBA4404 e EHAIOI . Quase simultaneamente, Enriquez-Obregon et al. (1998, Planta, Berlin, v. 206, p. 20- 27) relataram a produção de plantas de cana resistentes ao herbicida comercial BASTA (componente ativo fosfinotricina). Porém poucos laboratórios conseguiram repetir estes trabalhos pioneiros de agrobacteria em cana-de- açúcar na época seguida às publicações.

[00026] Com a manipulação e o controle adequados das condições de cultura in vitro, considerando a melhor idade, tipo e estágio da cultura embriogênica, e também o melhoramento da virulência da linhagem de A. tumefaciens demonstraram aumentar a eficiência de transformação. Este modelo natural de transformação apresenta vantagens de transferir segmentos de DNA relativamente longos com nenhum rearranjo, integrar baixo número de copias dos transgenes em locais com alta taxa de expressão no genoma, ser uma metodologia simples e de baixo custo (Melotto-Passarin, 2009, supra).

[00027] Além de produzir bons produtos agrícolas, a tecnologia de transformação genética oferece também a possibilidade de estudar os milhares de genes de plantas (com funções conhecidas e desconhecidas) que foram identificados pelos inúmeros programas genomas conduzidos em todo o mundo nos últimos anos (Dong et al. 2005. Plant Physiology, Rockville, v. 139, p. 610-618).

[00028] Apesar de métodos de transformação mediada por Agrobacterium serem utilizados para a manipulação genética de cana-de- açúcar, é amplamente reconhecido pelos técnicos no assunto que a eficiência e reprodutibilidade das metodologias ainda constituem desafios a serem transpostos. Em qualquer tecnologia para transformação de plantas, existem múltiplos fatores que influenciam o sucesso da transferência de um gene de interesse em plantas, e a sua integração estável e expressão subsequentes. Um dos aspectos que podem afetar o sucesso de transformação é o crescimento de Agrobacterium com relação às células vegetais transformadas. Sabe-se que se houver crescimento exarcebado de Agrobacterium, as chances de regeneração de plantas a partir de células transformadas diminuem. Isto pode dever-se à necrose induzida por Agrobacterium, em um processo em que o tecido primeiramente sofre um processo de oxidação e amarronzamento ("browning") e subsequentemente morre.

[00029] A inoculação de um tecido vegetal com Agrobacterium é, em si, um processo que desencadeia respostas de hipersensibilidade, que resultam em baixa taxa de sobrevivência do tecido. Portanto, o planejamento de um ambiente artificial adequado para minimizar os danos devido à interação do tecido vegetal com Agrobacterium é crítico para o sucesso dos experimentos de transformação genética.

[00030] O documento WO 200109302 relata o controle do crescimento de Agrobacterium como forma de melhorar a eficiência de transformação, através do uso de agentes inibidores durante a inoculação e co-cultura de Agrobacterium com o tecido vegetal. Agentes inibidores preferenciais são compostos contendo metais pesados, como nitrato de prata ou tiossulfato de prata, antibióticos como carbenicilina e uma combinação de antibióticos e um ácido clavulânico, como augmentina ou timetina.

[00031] O documento US 6,323,396 relata um processo para obter plantas transgênicas usado Agrobacterium mutantes deficientes na biossmtese de biomoléculas vitais específicas. Isso permitiria manter uma infecção sistémica controlada do tecido a ser transformado por longos períodos, aumentando a probabilidade de sucesso na infecção. A Agrobacterium é eliminada pela omissão daqueles nutrientes do meio de incubação.

[00032] O documento WO2010151634 relata o co-cultivo em condições dessecantes, na ausência de meio de cultura, mencionando que isto reduz de forma benéfica a necrose / apoptose do tecido vegetal inoculado, além de melhorar a sobrevivência celular subsequente durante as etapas de seleção e regeneração que tipicamente seguem-se após a etapa de co-cultivo.

[00033] O documento WO 98/54961 relata tratamentos antinecróticos incluindo cultivo em meio inibidor de necrose contendo um inibidor de etileno ou de biossíntese de etileno, tratamento de "heat shock" das células ou tecidos antes do co-cultivo com Agrobacterium e transformação das células de gramíneas, principalmente milho, com sequências genéticas tais como p35, iap e dad-1.

[00034] O documento WO 01/44459 descreve agentes que inibem a atividade ou produção enzimas associadas com o amarronzamento de tecidos vegetais durante a transformação mediada por Agrobacterium, como a polifenol oxidase (PPO) e peroxidase (POD), quelantes de metais necessários para atividade enzimática, e agentes contendo sulfidrila (ex. L-cisteína, cisteína, DTT, ácido ascórbico, tiossulfato de sódio e glutationa). Dentre as enzimas inibidas, estão a polifenol oxidase (PPO) e peroxidase.

[00035] Em vista deste problema do estado da técnica, a presente invenção provê um método de transformação genética que contribui para os programas de melhoramento genético e de estudos de funções de novos genes, incluindo aqueles com características multigênicas complexas, através do estabelecimento de novas condições de cultura durante a co-cultura de Agrobacterium com o tecido vegetal a ser transformado, que resultam em um melhoramento comparado com os métodos existentes. Os inventores acreditam que o método aqui apresentado, pelas vantagens e efeitos inesperados obtidos, pode contribuir para minimizar as limitações intrínsecas do melhoramento genético de plantas de interesse, incluindo, mas não limitadas, a cana-de-açúcar.

Sumário da Invenção

[00036] Em um aspecto, a invenção provê um método para transformar uma célula de planta ou tecido de planta usando Agrobacterium compreendendo as etapas de:

(a) contactar uma célula ou tecido de planta com Agrobacterium contendo pelo menos uma sequência de nucleotídeos de interesse a ser transferido para a célula ou tecido de planta;

(b) co-cultivar a célula ou tecido de planta em um meio de co- cultivo capaz de suportar o crescimento da célula ou tecido de planta e inibir o crescimento de Agrobacterium;

(c) cultivar a célula ou o tecido da etapa (b) em um meio compreendendo um agente capaz de inibir o crescimento de Agrobacterium, e um agente de seleção para a célula vegetal transformante;

(d) selecionar pelo menos uma célula transformante compreendendo a sequência de interesse.

[00037] Em uma concretização, o método compreende adicionalmente regenerar plantas transgênicas.

[00038] Em uma concretização adicional, as plantas transgênicas são superiores agronomicamente, em comparação à planta não transgênica de mesmo genótipo.

[00039] Em uma concretização, o meio de co-cultivo compreende o uso de concentrações de agente geleificante acima das indicadas pelo fabricante, de ágar, Agargel™, Phytablend™, Agargellan™, Phytagel™ , Gelzan™, carragenana e goma gelana.

[00040] Em uma concretização adicional, a concentração de agente geleificante é de acima de pelo menos lOg/L para ágar ou acima de pelo menos 5g/L Agargel™ ou acima de pelo menos 5 g/L Agargellan ou acima de pelo menos 9g/L de Phytablend™ ou acima de pelo menos 2,5g/L de Phytagel™ ou acima de pelo menos 4g/L de Gelzan™ ou acima de pelo menos 4g/L de goma gelana ou acima de pelo menos lOg/L de carragenana.

[00041] Em uma outra concretização, a célula ou tecido de planta a ser transformada é de uma planta monocotiledônea ou de uma planta dicotiledônea, em que a planta monocotiledônea selecionada pode ser arroz, milho, trigo, sorgo, aveia, Miscanthus, cevada, outras gramíneas e cana-de- açúcar.

[00042] Em um outro aspecto, a invenção provê uma planta transgênica, célula transgênica ou tecido transgênicoproduzida(o) através de um método como definido acima. Em uma concretização, a planta transgênica é uma cana-de-açúcar.

[00043] Em um outro aspecto adicional, a invenção provê um meio de cultura compreendendo o uso de concentrações de agente gelificante acima das indicadas pelo fabricante. Em uma concretização, o meio de cultura compreende uma concentração maior de agente gelificante que a usualmente utilizada na técnica. Em uma concretização adicional, o agente gelificante selecionado é ágar, Agargel™, Phytablend™, Agargellan™, Phytagel™, Gelzan™, carragenana e goma gelana, em que a concentração de agente gelificante é de acima de pelo menos lOg/L para ágar ou acima de pelo menos 5 g/L para Agargel™ ou acima de pelo menos 5 g/L para Agargellan ou acima de pelo menos 9g/L para Phytablend™ ou acima de pelo menos 2,5g/L para Phytagel™ ou acima de pelo menos 4g/L para Gelzan™ ou acima de pelo menos 4g/L para goma gelana ou acima de pelo menos lOg/L para carragenana. Em uma outra concretização, o meio de co-cultivo é capaz de inibir o crescimento exacerbado de Agrobacterium e a morte do tecido, e/ou de proporcionar maior frequência de transformação.

[00044] Em um outro aspecto, a invenção provê o uso do método de transformação como provido acima, para obtenção de plantas transgênicas agronomicamente superiores em comparação com uma planta não transgênica de mesmo genótipo.

Breve Descrição das Figuras

[00045] Figura 1 : Crescimento da Agrobacterium sobre os calos de cana- de-açúcar após três dias de co-cultivo. A: co-cultivo em 7 g/L de Agargel™; B: co-cultivo em 28 g/L de Agargel™.

[00046] Figura 2: Material submetido ao sistema de co-cultivo da presente invenção (28g/L de Agargel™). A: trinta dias em meio de regeneração 1 com seleção de 50 mg/L de geneticina. B: plantas sendo regeneradas com rastreabilidade de eventos sessenta dias em meio com seleção de 50 mg/L de geneticina.

[00047] Figura 3: Resultado da avaliação histoquímica de GUS para a variedade CTC15. Colunas CC7: co-cultivo realizado em 7 g/L de Agargel™; Colunas CC14: co-cultivo realizado em 14g/L de Agargel™; Colunas CC28: co-cultivo realizado em 28 g/L de Agargel™.

[00048] Figura 4: Resultado da avaliação histoquímica de GUS para a variedade 9001. Colunas CC7: co-cultivo realizado em 7g/L de Agargel™; Colunas CC28: co-cultivo realizado em 28 g/L de Agargel™.

[00049] Figura 5: Resultado da avaliação de diferentes concentrações de Agargel™ no meio de co-cultivo nas variedades CTC15 e CTC20. Coluna CCO: co-cultivo realizado em meio líquido; CC7: co-cultivo realizado em 7g/L de Agargel™; CC14: co-cultivo realizado em 14 g/L de Agargel™; CC21 : co-cultivo realizado em 21 g/L de Agargel™; CC28: co-cultivo realizado em 28g/L de Agargel™; CC35: co-cultivo realizado em 35 g/L de Agargel™; CC42: co-cultivo realizado em 42 g/L de Agargel™; CC49: co- cultivo realizado em 49 g/L de Agargel™.

[00050] Figura 6: Resultado da eficiência de transformação (número de eventos positivos/ g de calo transformado) da variedade CTC15. Coluna CCO: co-cultivo realizado em meio líquido; CC7: co-cultivo realizado em 7g/L de Agargel™; CC14: co-cultivo realizado em 14 g/L de Agargel™; CC21 : co- cultivo realizado em 21 g/L de Agargel™; CC28: co-cultivo realizado em 28g/L de Agargel™; CC35: co-cultivo realizado em 35 g/L de Agargel™; CC42: co-cultivo realizado em 42 g/L de Agargel™; CC49: co-cultivo realizado em 49 g/L de Agargel™.

[00051] Figura 7: Resultado da eficiência de transformação (número de eventos positivos/ g de calo transformado) da variedade CTC20. Coluna CC0: co-cultivo realizado em meio líquido; CC7: co-cultivo realizado em 7g/L de Agargel™; CC14: co-cultivo realizado em 14 g/L de Agargel™; CC21 : co- cultivo realizado em 21 g/L de Agargel™; CC28: co-cultivo realizado em 28g/L de Agargel™; CC35: co-cultivo realizado em 35 g/L de Agargel™; CC42: co-cultivo realizado em 42 g/L de Agargel™; CC49: co-cultivo realizado em 49 g/L de Agargel™.

[00052] Figura 8: Resultado da eficiência de transformação (número de eventos positivos/ g de calo transformado) da variedade CTO 5. Colunas CC7: co-cultivo realizado em 7g/L de Agargel™; CC14: co-cultivo realizado em 14 g/L de Agargel™; CC28: co-cultivo realizado em 28 g/L de Agargel™.

[00053] Figura 9: Resultado da eficiência de transformação (número de eventos positivos/ g de calo transformado) da variedade 9001. Colunas CC7: co-cultivo realizado em 7g/L de Agargel™; CC28: co-cultivo realizado em 28g/L de Agargel™.

Descrição Detalhada da Invenção

[00054] A não ser que seja definido de maneira diferente, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado entendido por um técnico no assunto ao qual a invenção pertence. A terminologia utilizada na descrição da invenção tem finalidade de descrever concretizações particulares somente, e não tem a intenção de limitar o escopo dos ensinamentos. A não ser que seja indicado de forma diferente, todos os números expressando quantidades, porcentagens e proporções, e outros valores numéricos usados no relatório descritivo e nas reivindicações, devem ser entendidos como sendo modificados, em todos os casos, pelo termo "cerca de". Assim, a não ser que seja indicado o contrário, os parâmetros numéricos mostrados no relatório descritivo e nas reivindicações são aproximações que podem variar, dependendo das propriedades a serem obtidas.

[00055] São providos composições e métodos mediados por Agrobacterium para transformar plantas. As composições incluem meios de cultura compreendendo componentes conhecidos na área de cultura de tecidos, e altas concentrações de agente gelificante. O meio de cultura da presente invenção é usado nos métodos de transformação de plantas, resultando em melhores eficiências de transformação e necrose tecidual reduzida. Plantas transformadas, células, tecidos e sementes de plantas transformadas também são aqui descritas.

[00056] Foi verificado de forma inesperada pelos inventores da presente invenção que o uso de concentrações elevadas de agente gelificante no processo de transformação, notadamente na etapa de co-cultivo, resultam em menor crescimento bacteriano junto ao tecido vegetal inoculado e, consequentemente, menor taxa de morte celular e eficiências de transformação aumentadas.

[00057] Em um aspecto, um método para transformar plantas, tecidos de plantas ou células de plantas é provido. Os métodos providos aqui se baseiam na transferência de gene mediada por Agrobacterium para produzir células de plantas regeneráveis tendo a sequência de nucleotídeos de interesse. Como é bem entendido, os métodos de transformação mediados por Agrobacterium exploram a habilidade natural de bactérias do género Agrobacterium de transferir DNA para dentro de cromossomos vegetais.

[00058] Métodos de transformação de plantas mediada por Agrobacterium são conhecidas na arte. Qualquer método adequado para transformar plantas, mais preferencialmente cana-de-açúcar, pode ser usado no método da presente invenção. Vide, por exemplo, WO 2010151634; WO 2011163292; US 5,563,05; US 5,981,840; WO 94/00977; US 5,591,616, Negrotto et al. 2000. Plant Celi Reports 19: 798-803, Arencibia et al. 1998. Transgenic Res. 7: 123-222; Arencibia & Carmona "Sugar cane (Saccharum spp.). 2007, In Methods in Molecular Biology, Agrobacterium Protocols, Vol. 2, ed. Wang (2nd ed., Humana Press, Inc.), pp. 227-235; de la Riva et al. 1998. Electron. J. Biotechnol. 1 : 118-133; Manickavasagam et al. 2004. Plant Celi Rep. 23: 134-143; Opabode. 2006. Biotechnol. Mol. Biol. Rev. 1 : 12-20; e Zhang et al. 2006. J Integr. Plant Biol. 48:453-459.

[00059] O método da invenção representa um melhoramento na transformação de plantas e obtenção de plantas estavelmente transformadas, em especial, cana-de-açúcar, mas não limitada a ela, incorporando o uso de meios de cultura modificados na etapa de co-cultivo.

[00060] Assim, os métodos para produzir células de planta regeneráveis tendo uma sequência de nucleotídeo de interesse compreendem, em geral, as etapas de:

(a) contactar um tecido ou uma célula de uma planta com Agrobacterium compreendendo um vetor que compreende pelo menos um cassete de expressão compreendendo a sequência de interesse,

(b) co-cultivar o dito tecido ou a dita célula com dita Agrobacterium em um suporte na presença de um meio de cultura aqui provido;

(c) cultivar dito o tecido ou a dita célula da etapa (b) em um meio compreendendo um agente capaz de inibir o crescimento de Agrobacterium, e um agente de seleção para a célula vegetal transformante; e

(d) selecionar pelo menos uma célula transformante compreendendo a sequência de interesse.

Opcionalmente, o método pode adicionalmente compreender a etapa de regenerar plantas transgênicas.

[00061] Como usado aqui, "planta" refere-se tanto à planta inteira, um tecido de planta, uma parte de planta (tal como embrião), uma célula de planta, ou um grupo de células de planta. A classe de plantas que pode ser utilizada no método da invenção inclui plantas capazes de serem transformadas por Agrobacterium, incluindo tanto monocotiledôneas como dicotiledôneas. Mais preferencialmente, as plantas são monocotiledôneas, e ainda mais preferencialmente, são aquelas empregadas como alimentos ou geração de energia, tais como arroz, milho, trilho, cevada, milheto, sorgo, centeio, triticale, cana-de-açúcar e outras espécies tais como Erianthus, Miscanthus, Narenga, Sclerostachya, e Brachypodium. Inclusos estão todos os géneros das subfamílias Bambusoideae (p.ex., o género Bambusa), Andropogonoideae (p.ex .género Saccharum, Sorghum e Zea), Arundineae (p. ex, género Phragmites), Oryzoideae (p. ex. género Oryza), Panicoideae (p. ex. géneros Panicum, Pennisetum e Setaria), Pooideae (Festuciadeae) (p. ex. géneros Poa, Festuca, Lolium, Trisetum, Agrostis, Phleum, Dactylis, Alopecurus, Avena, Triticum, Secale, e Hordeum). Mais especificamente, a planta que pode ser transformada de acordo com a presente invenção é cana- de-açúcar. "Cana-de-açúcar" é entendido como uma planta do género Saccharum L, preferencialmente as espécies Saccharum officinarum, S. spontaneum, S. robustum, S. barberi, S. sinense, S. edule, S. aegyptiacum, S. esculentum, S. aenicol, S. arundinaceum, S. bengalense, S. bi fio rum, S.ciliare, S. cylindricum, S.elephantinum, S. exaltatum, S. fallax, S. floridulum, S. giganteum, S. japonicum, S. koenigii, S. laguroides, S. munja, S. narenga, S. paniceum, S. pophyrocoma, S. purpuratum, S. ravennae, S. roseum, S. sanguineum, S. sara, S. chinense, S. tinctorium, S. versicolor, S. violaceum . Ainda mais preferencialmente, trata-se de híbridos interespecíficos produzidos pelo cruzamento entre as espécies e variedades comerciais dos mesmos.

[00062] Um "controle" ou "planta controle" provê um ponto de referência para medir as mudanças no fenótipo na planta ou célula de planta alterada geneticamente. Pode compreender, por exemplo: (a) uma planta ou célula do tipo selvagem, isto é, tendo o mesmo genótipo que o material de partida para a alteração genética que resultou na planta ou célula alterada; (b) uma planta ou célula do mesmo genótipo que o material de partida mas que foi transformada com uma construção nula (isto é, com uma construção que não tem efeito conhecido com relação ao traço de interesse); (c) uma planta ou célula de planta que é um segregante não transformado dentre a progénie de uma planta ou célula de planta alterada; (d) uma planta ou célula de planta geneticamente idêntica à planta ou célula de planta mas que não foi exposta a condições ou estímulos que induziriam a expressão do gene de interesse; ou (e) planta ou célula de planta em si, sob condições em que o gene de interesse não é expresso.

[00063] Na etapa a) a célula ou o tecido de planta é colocado em contato com uma Agrobacterium. Esta é a fase de inoculação e pode ser por pelo menos cerca de um minuto até cerca de 12 horas, mais preferencialmente de cerca de 5 minutos a cerca de 2,5horas, ainda mais preferencialmente de cerca de 25 minutos a cerca de 40 minutos em temperatura ambiente e com ou sem agitação. Durante a inoculação, é possível aplicar alguns tratamentos para auxiliar a infecção, como por exemplo, infiltração à vácuo e sonicação da solução de Agrobacterium. Por exemplo, na infiltração à vácuo, o tecido ou a célula vegetal em contato com a suspensão bacteriana é submetido a uma pressão de vácuo, preferencialmente de -300 mmHg a -1000 mmHg, mais preferencialmente de 400 mmHg a 800 mmHg, ainda mais preferencialmente de -500 mmHg a -700 mmHg, usualmente por um período de 1 a 10 minutos, mais preferencialmente de 1 a 7 minutos, ainda mais preferencialmente de 1 a 5 minutos. Em outro exemplo não limitante, a infiltração à vácuo ocorre em pressão de vácuo de -700 mmHg por 5 minutos. Ainda nesta fase de inoculação, para melhorar a eficiência de transformação, é possível incorporar aditivos como acetoseringona e tensoativos dentro da suspensão de Agrobacterium.

[00064] De forma opcional, em algumas concretizações, antes da etapa a) acima descrita, a célula ou o tecido de planta a ser infectado pode ser submetido a um pré-tratamento de choque de temperatura, em que o dito tecido ou célula é colocado em um meio de cultura vegetal líquido, tais como Murashige e Skook, Gamborg's, Chu (N ₆ ), Schenk e Hildebrand, e outros conhecidos pelos técnicos no assunto, pré-aquecido na temperatura na qual o pré-tratamento de choque térmico será conduzido. O tecido ou célula vegetal é, então, incubado em estufa ou banho-maria em temperatura acima da temperatura em que a inoculação ocorrerá (por exemplo, temperatura ambiente). Assim, por exemplo, a temperatura do pré-tratamento de choque de temperatura pode ocorrer em uma temperatura cerca de 30°C a cerca de 55°C, preferencialmente de cerca de 35°C a cerca de 50°C, ainda mais preferencialmente de cerca de 40°C a 45°C, por um período de cerca de 1 minuto a cerca de 60 minutos, cerca de 1 minuto a cerca de 50 minutos, cerca de 1 minuto a cerca de 40 minutos, cerca de 1 minuto a cerca de 30 minutos, cerca de 1 minuto a cerca de 20 minutos, cerca de 1 minuto a cerca de 15 minutos, cerca de 1 minuto a cerca de 10 minutos, ou cerca de 1 minuto a cerca de 5 minutos. Em outro exemplo não limitante, o tratamento de choque de temperatura compreende colocar e manter o tecido ou célula vegetal em meio de cultura vegetal líquido pré-aquecido a uma temperatura de cerca de 45 °C por cerca de 5 minutos.

[00065] Após este período de tempo, o meio de cultura líquido é descartado e substituído pela suspensão de Agrobacterium preparada como descrito abaixo.

[00066] A concentração de Agrobacterium útil nos métodos da invenção, na etapa a) acima, pode variar dependendo da estirpe de Agrobacterium utilizada, do tecido ou célula a ser transformado, do genótipo a ser transformado, entre outros. Apesar da concentração de Agrobacterium poder variar, geralmente a OD ₆ oo utilizada varia entre cerca de 0,001 a cerca de 5, mais preferencialmente de cerca de 0,05 a cerca de 2, e ainda mais preferencialmente, de cerca de 0, 1 a cerca de 1 ,0.

[00067] Uma variedade de espécies de Agrobacterium é conhecida na arte, que podem ser usadas nos métodos da invenção. Vide por exemplo, Hooykaas. 1989. Plant Mol. Biol. 13:327; Smith, et al. 1995. Crop Science 35:301 ; Chilton. 1993. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:3119; Mollony et al. 1993. Monograph Theor Appl Genet NY, Springer Verlag 19: 148, lshida et al. 1996. Nature Biotechnol. 14:745; Komari, et al. 1996. The Plant Journal 10: 165. Em uma concretização preferida da presente invenção, exemplos de linhagens de Agrobacterium incluem, mas não estão limitados a LBA4404, EHAIOI, EHA105, AGLl, C58C1, GV3101, GV2260 e outros. A linhagem de Agrobacterium utilizada nos métodos da invenção é modificada para conter um gene ou genes de interesse, ou um ácido nucleico a ser expresso nas células transformadas. O ácido nucleico a ser transferido para a célula vegetal é incorporado na região-T e é flanqueado por sequências de borda do T-DNA. No plasmídeo Ti, a região é distinta da região vir, cujas funções são responsáveis pela transferência e integração. Sistemas de vetores binários têm sido desenvolvidos em que T-DNA desarmado manipulado para carregar o DNA estranho e as funções vir estão presentes em plasmídeos separados. Desta forma, um T-DNA modificado compreendendo DNA estranho (a sequência nucleotídica a ser transferida) é construída em um plasmídeo pequeno que se replica em E. coli. Este plasmídeo é transferido por conjugação triparental para A. tumefaciens , que contém um plasmídeo carreador de gene de virulência compatível. As funções vir são supridas em trans para transferência de T-DNA para o genoma vegetal. Tais vetores binários são úteis na prática da presente invenção.

[00068] Desta forma, é evidente que a transformação de plantas pode envolver a construção de um cassete de expressão ou de um vetor de expressão que irá funcionar em uma célula em particular. Tal cassete de expressão ou vetor pode compreender um DNA que inclui um gene sob o controle de, ou operacionalmente ligado a, um elemento regulatório (por exemplo, um promotor). O cassete de expressão ou vetor de expressão pode conter um ou mais genes tal como combinações de genes operacionalmente ligados e elementos regulatórios. O vetor pode ser um plasmídeo e pode ser usado sozinho ou em combinação com outros plasmídeos para prover células transformadas usando métodos de transformação para incorporar as sequências genéticas de interesse para dentro do material genético de uma célula de planta. Os termos DNA ou gene "heterólogo", "introduzido", "estranho" ou "transgênico" referem-se a uma sequência de DNA recombinante ou um gene que não ocorre naturalmente no genoma da célula ou planta alvo, ou que ocorre na planta alvo transformada em uma localização diferente ou em associação diferente no genoma em relação a uma planta não transformada.

[00069] Um vetor compreendendo o ácido nucleico de interesse é introduzido em uma Agrobacterium. O termo "introduzido" significa prover um ácido nucleico (p.ex. uma construção gênica, cassete de expressão) em uma célula eucariótica ou procariótica. "Introduzido" inclui referência à métodos de transformação estável ou transiente, assim como cruzamento sexual. Portanto, "introduzido" inclui a incorporação dentro do genoma da célula (ex. DNA de cromossomo, plasmídeo, plastídeo, ou mitocôndria), convertido em um replicon autónomo, ou expresso transientemente (ex. mRNA transfectado). Técnicas moleculares gerais usados na invenção são providas, por exemplo, por Sambrook et ai. (eds.). 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

[00070] Por meio de transformação genética, uma planta, preferencialmente uma planta de cana-de-açúcar, pode ser modificada para exibir características agronómicas melhoradas ou superiores, em relação às plantas não transformadas de mesmo genótipo. De forma exemplificativa, as plantas transgênicas podem ser modificadas de forma a expressar genes de resistência a doenças e insetos, de tolerância a herbicidas, que conferem valor nutricional, aumento de teor de sacarose, de fibras, influência no crescimento da planta, tolerância a estresses abióticos, aumento na produção de biomassa, modificação do conteúdo (composição/teor) de lignina, esterilidade, entre outros.

[00071] Quando apropriado, a sequência de interesse a ser transferido para a planta pode ser modificada para otimizar a expressão. Por exemplo, a sequência pode ser modificada para melhorar a expressão em uma planta monocotiledônea, mais preferencialmente, em cana-de-açúcar. Métodos para otimização sintética são disponíveis na técnica, por exemplo, US 5,380,831 ; US 5,436,391 e Murray, et al. 1989. Nucleic Acids Res. 17:477-498. Os códons preferidos da planta alvo podem ser determinados a partir dos códons de maior frequência nas plantas alvos de interesse. Outras modificações podem ser efetuadas a fim de aumentar a expressão gênica na planta alvo, incluindo, por exemplo, a eliminação de sinais de poliadenilação espúrias, de sinais de splice exon-intron, de repetições similares transposons, entre outros. O conteúdo de G-C da sequência pode ser ajustado para níveis médios para uma dada planta alvo, calculada tendo por referência os genes conhecidos expressos na planta alvo. Ainda, a sequência pode ser modificada de forma a evitar estruturas secundárias em grampo no mRNA.

[00072] O ácido nucleico a ser transferido pode estar contido dentro de construções de DNA ou cassetes de expressão. A construção ou cassete de expressão irá compreender uma região de início de transcrição ligada ao ácido nucleico do gene de interesse. Tal cassete de expressão é provido com uma pluralidade de sítios de restrição para inserção do gene ou genes de interesse, de forma que fiquem sob regulação transcricional das regiões regulatórias. Um ou múltiplos cassetes de expressão podem ser usados na prática da invenção. A região de iniciação de transcrição, o promotor, pode ser nativo ou homólogo ou estranho ou heterólogo ao hospedeiro. Como aqui usado, um gene quimérico compreende uma sequência codificadora operacionalmente ligada à região de iniciação de transcrição, que é heteróloga à região codificadora. O cassete incluirá na direção 5 '-3' de transcrição: uma região de início de transcrição e tradução, uma sequência de DNA de interesse, uma região de terminação de transcrição e tradução funcionais em plantas.

[00073] Além de promotores de plantas, promotores derivados de uma variedade de fontes podem ser usados de maneira eficiente em células vegetais para expressar genes de interesse. Por exemplo, promotores de origem bacteriana, tais como o promotor de octopina sintase, promotor da nopalina sintase, promotor de manopina sinase; promotores de origem virai, tais como os promotores 35S e 19S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV), promotor do vírus baciliforme de cana-de-açúcar, e semelhantes, podem ser usados. Promotores derivados de plantas incluem, mas não estão limitados a promotor da subunidade pequena da ribulose-l,6-bifosfato (RUBP) carboxilase, promotor da beta-conglicinina, promotor da faseolina, promotor da álcool desidrogenase (ADH), promotor de proteínas de choque de temperatura, promotor do fator de depolimerização da actina (ADF), e promotores tecido-específicos. Os promotores também podem conter certos elementos que atuem como "enhancers" que podem melhorar a eficiência de transcrição. "Enhancers" típicos incluem, mas não estão limitados ao intron 1 de álcool desidrogenase (ADH) e intron 6 da ADH-1. Promotores constitutivos também podem ser usados. Os promotores constitutivos direcionam a expressão gênica continua em quase todos os tipos celulares e durante quase todo o tempo. Exemplos incluem, mas não estão limitados a promotores da actina, da ubiquitina e o CaMV 35 S. Promotores tecido- específicos são responsáveis pela expressão gênica em células ou tipos teciduais específicos. Exemplos de promotores tecido-específicos que podem ser utilizados incluem aqueles que são ativos durante um determinado estágio do desenvolvimento vegetal. Exemplos de ditos promotores incluem, mas não estão limitados e, promotores que sejam específicos de raiz, de pólen, de folhas, de embrião, entre outros.

[00074] Em certas circunstâncias, pode ser desejável utilizar um promotor induzível. Um promotor induzível é responsável pela expressão de genes em resposta a um sinal específico, tais como estímulo físico (ex. genes de choque térmico), luz (ex. ribulose-bis-fosfato 1,5 carboxilase), hormônios (ex. glucocorticóide), antibiótico (ex. tetraciclina), metabólitos e estresse (ex. seca). Outros elementos de transcrição e tradução funcionais em plantas podem ser utlizados, como por exemplo, sequências líder 5' não traduzido, sequência de terminação de transcrição 3' e sequências sinais de adição de poliadenilato.

[00075] Os cassetes de expressão de plantas podem incluir pelo menos um marcador genético, operacionalmente ligado a um elemento regulatório (um promotor, por exemplo) que permite que as células transformadas contendo o marcador sejam tanto recuperadas via seleção negativa (isto é, inibindo o crescimento de células que não contêm o gene de marcador de seleção) ou via seleção positiva (isto é, triando para o produto produzido pelo marcador genético). Muitos genes de marcadores genéticos adequados para a transformação de plantas são conhecidos e incluem, por exemplo, genes que codificam para enzimas que detoxificam metabolicamente um agente químico seletivo que pode ser um antibiótico ou um herbicida, ou genes que codificam para um alvo alterado que pode ser sensível ao inibidor. Alguns métodos de seleção positiva são conhecidos na arte. O gene marcador de seleção pode, de acordo, permitir a seleção de células transformadas enquanto que o crescimento de células que não contêm o DNA inserido pode ser suprimido pelo composto de seleção. A preferência por um gene de marcador de seleção ocorre a critério do técnico, mas quaisquer uns dos seguintes marcadores de seleção podem ser usados, assim como qualquer outro gene que não esteja aqui listado. Exemplos de marcadores de seleção incluem, mas não estão limitados a resistência ou tolerância a canamicina, higromicina, bleomicina, G418, metotrexato, fosfinotricina (Bialaphos), imidazolinonas, glifosato, sulfoniluréias e herbicidas triazolopirimidina, como clorosulforon, bromoxinil, e DALAPON.

[00076] Além do marcador de seleção, pode ser desejável usar um gene repórter. Em alguns casos, um gene repórter pode ser usado sem o uso concomitante de marcador de seleção. Os genes repórteres são genes que tipicamente não oferecem nenhuma vantagem ao organismo ou tecido recepto, e tipicamente codificam para uma proteína que provê uma mudança fenotípica ou uma propriedade enzimática. Genes repórteres adequados incluem, mas não estão limitados a, gene da beta-glucuronidase (GUS), luciferase de vagalume, ou proteínas fluorescentes tais como proteína fluorescente verde (GFP) ou proteína fluorescente amarela (YFP), descrita na U.S. Pat. No. 7,951,923.

[00077] O tecido a ser contatado com Agrobacterium pode ser qualquer um, como por exemplo, secções ou fragmentos de tolete ou palmito, lâmina foliar, gemas axilares, caule, ápice caulinar, bainha da folha, entrenós, pecíolos, hastes florais, raiz ou inflorescência. Adequadamente, o explante é um segmento, uma fatia ou uma secção do tecido. Mais preferencialmente, o tecido a ser contactado com Agrobacterium é calo embriogênico. Mais preferencialmente, o calo embriogênico é do tipo II ou III. Calos embriogênicos podem ser formados a partir de qualquer tecido apropriado de uma planta, preferencialmente de uma planta de cana-de-açúcar. A cultura de tecidos em cana de açúcar é bem conhecida e segue um modelo convencional de produção de calos e regeneração de plantas descritas inicialmente por Ho & Vasil. 1983. Protoplasma, 118: 169-180; Brisibe et al. 1993. Plant Science, 89:85-92, e mais aprofundado por Falco et al. 1996. R. Bras. Fisiol. Veg., 8(2):93-97. Preferencialmente, utiliza-se um tecido imaturo para iniciar o calo, tal como o palmito ou meristemas. Em alguns casos, o tecido pode ser machucado ou picado antes de ou simultaneamente com o contato com Agrobacterium compreendendo um vetor ou cassete de expressão compreendendo a sequência de interesse.

[00078] Assim, células alvo incluem, mas não estão limitadas a, células meristemáticas, calos do tipo I, tipo II e tipo III, embriões imaturos e células gaméticas, como pólen, micrósporos, óvulos e megásporos. Os calos de tipo I, II e III podem ser iniciados a partir de tecidos incluindo, mas não limitados a, embriões imaturos, meristemas apicais, meristemas axilares, micrósporos e outros. Aquelas células capazes de proliferar como calos também são células alvo para transformação genética. Células alvo também podem ser células somáticas, que são aquelas células, durante o desenvolvimento normal da planta, não contribui para processos reprodutivos da mesma. Células meristemáticas (isto é, capazes de divisão celular contínua e caracterizada por uma aparência citológica desdiferenciada, normalmente encontradas em pontos de crescimento como pontas de raízes, meristemas axilares, ápices caulinares, brotos laterais e outros) podem representar outro tipo de célula alvo. Devido ao estado desdiferenciado e capacidade de diferenciação e totipotência, uma única célula meristemática transformada pode regenerar uma planta transformada inteira.

[00079] As culturas celulares adequadas podem ser iniciadas a partir de vários tipos de explantes. Por exemplo, para variedades de cana-de-açúcar, o explante pode ser obtido a partir de tecidos vegetais apropriados, incluindo o tolete ou palmito (conjunto de folhas jovens e enroladas, contendo o meristema apical), lâmina foliar, gemas axilares, caule, ápice caulinar, bainha da folha, entrenós, pecíolos, hastes florais, sementes, raiz ou inflorescência. Adequadamente, o explante é um segmento, uma fatia ou uma secção do tecido. Mais preferencialmente, o explante é uma secção da porção apical do palmito de plantas jovens de cana-de-açúcar. Os explantes podem ser obtidos de plantas cultivadas in vitro, em casas de vegetação ou em campo. Preferencialmente, as plantas têm menos cerca de 24 meses, menos do cerca de 23 meses, menos do cerca de 22 meses, menos do cerca de 21 meses, menos do cerca de 20 meses, menos do cerca de 19 meses, menos do cerca de 18 meses, menos do cerca de 17 meses, menos do cerca de 16 meses, menos do cerca de 15 meses, menos do cerca de 14 meses, menos do cerca de 13 meses, menos do cerca de 12 meses, menos do cerca de l lmeses, menos do cerca de 10 meses, menos do cerca de 9 meses, menos do cerca de 8 meses, menos do cerca de 7 meses, menos do cerca de 6 meses, menos do cerca de 5 meses, menos do cerca de 4 meses, menos do cerca de 3 meses, menos do cerca de 2 meses ou menos do cerca de 1 mês. Preferencialmente, as plantas têm preferencialmente cerca de 24-12 meses, mais preferencialmente cerca de 12-8 meses, ainda mais preferencialmente cerca de 4-6 meses. Dita cultura de tecidos é geralmente iniciada a partir de pedaços estéreis de uma planta, tais como acima apontadas. Muitas características do explante são conhecidas por afetar a eficiência da iniciação da cultura, no entanto, considera-se que geralmente tecidos jovens, de crescimento mais rápido, ou um tecido em uma fase mais precoce do desenvolvimento, são mais eficientes. Explantes cultivados em meios apropriados podem dar origem a uma massa desorganizada de células em divisão (calos), que podem, em cultura, ser mantidas de forma mais ou menos indefinida desde que sejam realizadas subculturas periódicas em um meio de cultura fresco.

[00080] A etapa de "co-cultivo" (etapa b, conforme definido acima) refere-se à incubação do tecido de planta infectado ou que entrou em contato com Agrobacterium sobre um suporte, de forma a permitir a transferência de T-DNA da Agrobacterium para as células de plantas. Esta etapa corresponde ao período entre o momento logo após a inoculação (contato da Agrobacterium com o tecido vegetal) até o momento em que a bactéria é retirada ou inativada. Em uma concretização, o co-cultivo do tecido de planta com Agrobacterium ocorre sobre um meio de cultura como provido pela invenção.

[00081] Para fins desta invenção, "meio de cultura" refere-se a qualquer meio usado na técnica para suportar a viabilidade e o crescimento de uma célula ou tecido de planta, ou o crescimento de uma planta inteira, como meio de Murashige e Skook, Gamborg's, Chu (N ₆ ), Schenk e Hildebrand, e outros conhecidos pelos técnicos no assunto. Tais meios comumente incluem componentes definidos, mas não limitados a: macronutrientes, provendo fontes nutricionais de nitrogénio, fósforo, potássio, enxofre, cálcio, magnésio e ferro; micronutrientes, como boro, molibdênio, manganês, cobalto, cloro, iodo e zinco; carboidratos, como maltose, sorbitol e sacarose; fitohormônios; vitaminas; agentes de seleção como antibióticos ou herbicidas para seleção das células ou tecidos transformados; compostos fenólicos (preferencialmente aqueles encontrados em exudatos de ferimentos em plantas, como acetoseringona, ácido sinapínico, ácido siríngico, ácido ferúlico, catecol, ácido gálico, entre outros), antioxidantes (por exemplo, ditiotreitol), e agentes gelificantes. Pode ainda incluir componentes complexos e não definidos, como hidrolisado de caseína, água de coco, extrato de levedura e carvão ativado.

[00082] Em um aspecto, os meios de cultura utilizados na etapa de co- cultivo é aqui denominado "meio de co-cultivo" e pode ser qualquer meio de cultura de tecidos vegetais conhecido na técnica e que compreende altas concentrações de agente gelificante. Por "agente gelificante" entende-se qualquer substância que aumente a viscosidade de uma solução sem substancialmente modificar suas propriedades, e incluem aqueles agentes gelificantes usualmente utilizados em cultura de tecidos vegetais, tais como ágar, Agargel™, Phytablend™, Agargellan™, carragenana e goma gelana (Gelzan™, Gelrite™, Phytagel™).

[00083] O meio de co-cultivo da invenção provê suporte, umidade, nutrição para as células de plantas, ao mesmo tempo em que previne o crescimento exacerbado de Agrobacterium e a morte do tecido vegetal. Para tanto, o meio de cultura da invenção compreende uma concentração maior que a usualmente utilizada na técnica de agentes gelificantes. Sem estarem limitados a quaisquer teorias ou mecanismos de ação, os inventores verificaram de forma surpreendente que submeter o tecido inoculado a uma etapa de co-cultivo em meio de co-cultivo compreendendo concentrações maiores que a usualmente utilizada na técnica de agentes gelificantes, que usualmente correspondem às quantidades indicadas pelos fabricantes, previne crescimento exacerbado de Agrobacterium, tendo como consequência positiva uma menor taxa de morte do tecido vegetal inoculado e maiores frequências de transformação. Para fins desta invenção, por "altas concentrações" entende-se que a composição compreende pelo menos quantidades de uso acima das indicadas pelo fabricante, definidas aqui como acima de pelo menos de lOg/L para ágar ou acima de pelo menos 5g/L Agargel™ ou acima de pelo menos 5 g/L Agargellan ou acima de pelo menos 9g/L de Phytablend™ ou acima de pelo menos 2, 5 g/L de Phytagel™ ou acima de pelo menos 4g/L de Gelzan™ ou acima de pelo menos 4g/L de goma gelana ou acima de pelo menos lOg/L de carragenana. Mais preferencialmente, a concentração de Agargel™ varia de 7 a 70 g/L, mais preferencialmente de 7 a 60 g/L, e ainda mais preferencialmente de 7 a 50 g/L.

[00084] O tecido inoculado pode ser co-cultivado por cerca de 1 a 30 dias, preferencialmente de 1 a 20, mais preferencialmente de 1 a 10, e ainda mais preferencialmente, de 1 a 5 dias.

[00085] Durante a etapa de co-cultivo, a temperatura pode ser qualquer temperatura adequada para a planta alvo conhecida na técnica. Ilustrativamente, para cana-de-açúcar, a temperatura pode variar entre cerca de 15°C a cerca de 30°C, de cerca de 16°C a cerca de 29°C, de cerca de 20°C a cerca de 25°C, de cerca de 21°C a cerca de 24°C, ou cerca de 22°C a cerca de 23°C. Em algumas concretizações, a etapa de co-cultivo ocorre na ausência de luz.

[00086] Opcionalmente, em algumas concretizações, após a etapa de co- cultura, as células transformadas podem ser submetidas a uma etapa de descanso. Como usado aqui, "descanso" refere-se a uma etapa em que as células de planta, por exemplo, calos embriogênicos, são incubados após a introdução da sequência de interesse pela infecção mediada por Agrobacterium. O descanso permite o crescimento preferencial de um calo a partir de células transformadas contendo a sequência de interesse, e é usualmente realizado na ausência de pressão seletiva. O tecido de planta transformado é submetido a um meio de descanso que tipicamente inclui um agente (p.ex. antibiótico) que inibe o crescimento de Agrobacterium. Tais agentes são conhecidos na técnica e incluem cefotaxime, timetin, vancomicina, carbenicilina, e similares. As concentrações de dito agente irão variar conforme o padrão para cada antibiótico. O técnico no assunto irá reconhecer que a concentração do agente inibidor de Agrobacterium pode ser otimizada para um protocolo de transformação em particular sem experimentação excessiva.

[00087] O período da etapa de descanso pode ser de cerca de 1 a cerca de 30 dias, preferencialmente de cerca de 1 a cerca de 20 dias, e ainda mais preferencialmente de cerca de 5 a cerca de 15 dias. Durante a etapa de descanso, a temperatura pode ser qualquer temperatura adequada para a planta alvo conhecida na técnica. Ilustrativamente, para cana-de-açúcar, a temperatura pode variar entre cerca de 15°C a cerca de 30°C, de cerca del6°C a cerca de 29°C, de cerca de 17°C a cerca de 28°C, de cerca de 21°C a cerca de 27°C, ou cerca de 26°C a cerca de 27°C. Em algumas concretizações, a etapa de descanso ocorre na ausência de luz.

[00088] Quando não houver etapa de descanso, é possível realizar uma etapa de co-cultivo estendida, antes da adição do agente seletivo para as células vegetais transformadas.

[00089] O método aqui provido ainda inclui selecionar as células compreendendo pelo menos uma cópia da sequência genética de interesse (etapa d). "Selecionar", como aqui utilizado, significa a situação em que é utilizado um agente seletivo para os transformantes, onde o dito agente seletivo irá permitir o crescimento preferencial de células de plantas contendo pelo menos uma cópia do gene marcador posicionado dentro do T-DNA e transferido pela Agrobacterium em detrimento daquelas células que não foram transformadas. Como indicado acima, qualquer marcador de seleção adequado pode ser utilizado. Em algumas concretizações, é adicionado também um agente que inibe o crescimento de Agrobacterium. A seleção pode ocorrer em condições de claro ou escuro, dependendo da espécie de planta sendo transformada, e do genótipo, por exemplo. Em alguns casos, os calos embriogênicos ou outros tecidos submetidos à transformação podem ser sub-cultivados em intervalos regulares ou irregulares no mesmo meio. No caso de transformação de calos, é possível manter calos individuais separados para garantir que apenas uma planta seja regenerada por calo e, portanto, todas as plantas regeneradas são derivadas de eventos de transformação independentes. Em uma concretização preferida, a etapa de seleção ocorre no escuro, por cerca de 1 a 10 semanas, mais preferencialmente de 2 a 5 semanas, ainda mais preferencialmente, de 2 a 4 semanas, e ainda mais preferencialmente, de 2 a 3 semanas.

[00090] Após o período de seleção, o tecido vegetal que continuou crescendo em presença do agente de seleção, e que, portanto, foi geneticamente modificado, pode ser manipulado e regenerado, colocando-o em meios de cultura e condições de crescimento adequados. As plantas transgênicas assim obtidas podem ser testadas para a presença do DNA de interesse. O termo "regenerar", para fins desta invenção, refere-se à formação de uma planta, que inclui uma parte aérea e raízes. A regeneração de várias espécies é bem conhecida na técnica. As plantas regeneradas podem ser plantadas em substrato adequado, como por exemplo, solo. Como aqui usado, "geneticamente modificado" ou "transgênico" ou "estavelmente transformado" significa uma célula de planta, parte de planta, tecido de planta ou planta que compreende uma sequência de DNA de interesse que é introduzida dentro do seu genoma por meio de transformação.

[00091] Para a presente invenção, a "eficiência de transformação" ou "frequência de transformação" pode ser mensurada pelo número de células transformadas (ou plantas transgênicas regeneradas, ou número de eventos positivos) que são recuperadas sob condições experimentais. Por exemplo, quando calos são usados como material de partida para a transformação, a frequência de transformação pode ser expressa como sendo o número de eventos positivos obtidos por grama de calo submetido à transformação.

[00092] A presente invenção é ilustrada pelos exemplos abaixo, que têm o intuito somente de exemplificar uma das inúmeras maneiras de se realizar a invenção, contudo, sem limitar o escopo da mesma. As várias modificações ou sugestões à luz dos mesmos que podem ser sugeridas por um técnico no assunto estão incluídas no espírito e no escopo das reivindicações.

EXEMPLOS

Exemplo 1 : Material Vegetal

[00093] A Cultura de Tecidos é geralmente utilizada para transformação de plantas por gerar células potencialmente transformáveis e aptas à regeneração de plantas. A manutenção da cultura de tecidos requer o uso de meios de cultura (mistura de nutrientes e fitorreguladores para crescimento e manutenção das células in vitro) e condições ambientais controladas. O tecido-explante utilizado no presente processo de transformação de cana-de- açúcar é o calo embriogênico.

[00094] Para obtenção dos calos embriogênicos, folhas jovens enroladas (palmitos) de cana-de-açúcar, desenvolvidas no campo ou casa de vegetação por 3- 12 meses, foram coletadas para isolamento dos explantes iniciais.

[00095] Após desinfecção superficial, secções transversais com cerca de 0,05 -5mm de espessura foram cortadas da região acima do meristema, em condições assépticas. As secções foram colocadas na superfície do meio de cultura SCIM. As culturas foram mantidas no escuro à temperatura de 26°C± 2°C, sendo subcultivado a cada 15 dias, por três a cinco cincos de 7-28 dias cada. Uma semana antes da transformação, os calos foram novamente selecionados para as características embriogênicas (nodular, compacto, opaco e ligeiramente amarelado, características ligeiramente variáveis entre os diferentes genótipos).

Exemplo 2: Preparo da Agrobacterium e Infecção dos calos

[00096] A cultura de Agrobacterium, compreendendo a cepa EHA105 (Hood et ai. 1993. New Agrobacterium helper plasmids for gene transfer to plants. Transgenic Research, v. 2, p. 208-218) com os genes UBIGUS/UBInptII, foi iniciada a partir de um estoque de glicerol mantido à -80°C em LB sólido acrescido dos antibióticos apropriados. Esta cultura foi mantida no escuro a 28°C por dois a três dias. A suspensão de Agrobacterium para infectar o material vegetal foi preparada ressuspendendo a cultura em meio líquido ½ MS acrescido de 200μΜ de acetoseringona, ajustando para uma ODÔOO final de 0,1-1,0.

[00097] Os calos com características embriogênicas foram selecionados visualmente e diretamente transferidos para a suspensão de Agrobacterium, onde permaneceram por 30 minutos, no escuro com agitação constante de 50 rpm.

[00098] Após esse período, os calos foram separados da Agrobacterium e o excesso da suspensão foi removido por meio de secagem em folhas de papel filtro.

[00099] De forma alternativa, antes da infecção, os calos podem ser submetidos a um tratamento em meio ½ MS líquido à cerca de 45°C por cerca de 5 minutos.

[000100] Outro tratamento opcional é a submissão do material vegetal infectado por cerca de 5 minutos à pressão de vácuo de cerca de -700 mmHg. Exemplo 3: Co-cultivo e descanso dos calos

[000101] Essa etapa foi realizada em meio de cultura SCIM (Tabela 1) líquido ou solidificado com 7; 14; 21 ; 28; 35; 42 ou 49g/L de Agargel™, com um peso entre 0,5- lOg de calos por placa (100 x 20mm). O co-cultivo foi realizado por um período de 1-5 dias a temperatura de 22°C no escuro.

[000102] Após o co-cultivo, os calos foram transferidos para meio de descanso DT (Tabela 1) acrescido do bacteriostático Timentim® numa concentração de 200mg/L, a fim de controlar o crescimento indesejado da Agrobacterium (Figura 1). O período de descanso foi de 5-14 dias a 26°C no escuro. Durante essa etapa, mais precisamente próximo a cinco dias de cultura, uma parte significativa dos calos (próximo a 50 unidades) foi submetida ao ensaio histoquímico de GUS, a fim de detectar a expressão transiente do gene repórter e o monitoramento do processo (Figuras 3-5).

Exemplo 4: Seleção e regeneração de plantas transgênicas

[000103] Os calos foram transferidos para meio de seleção SGT (Tabelai), suplementado com 200mg/L de Timentim® + 50mg/L do agente seletivo geneticina quando empregado o gene seletivo nptll. Os calos permaneceram nesta condição por 21 dias a 26°C no escuro. Em seguida, os calos foram transferidos para o meio de regeneração RG1, suplementado com 200mg/L de Timentim® + 30mg/L de geneticina, e para um fotoperíodo de 16 horas a 4.000 lux.

[000104] Após 30 dias de luz, os calos que apresentaram formação de plântulas sem aparente estresse à seleção por geneticina (Figura 2) foram transferidos para meio RG2, suplementado com 200mg/L de Timentim® + 30mg/L de geneticina. Quando as plantas atingiram a altura média de cinco centímetros foi realizada a coleta de um segmento foliar próximo de 20 mm para a análise de PCR quantitativo em tempo real. Esta metodologia de determinação de copy number é descrita como "Delta-Delta Ct" (Livak & Schmittgen. 2001. Analysis of relative gene expression data using Real-Time Quantitative PCR and the 2-AACT method. Methods 25: 402-408) que consiste num método usando como calibrador (controle) o CT médio de três plantas de uma cópia para os genes NPTII e GUS, confirmadas por Southern Blot. O gene endógeno usado como normalizador foi o poliubiquitina. As reações foram feitas em formato multiplex usando sonda TaqMan para a detecção do número de cópias. A eficiência de transformação foi calculada pela razão entre o número de eventos positivos pela quantidade (em gramas) de calos transformados em cada experimento (Figuras 6-9). Foi mantido o rastreamento das plantas para evitar a subclonagem de eventos. O conjunto de ensaios realizados para obtenção dos resultados apresentados produziram o total de 526 eventos independentes analisados pela técnica de qPCR.

Meios de cultura utilizados:

Tabela 1 : Meios de cultura

SCIM cc RG1 RG2 AGT

DT SGT

Reagentes Indução Co- Regeneração Regeneração Alongamento

^ Descanso Seleção

de calos cultivc 1 2

Sais MS

4,á 4,3 4,3 4,3 4,3

(g/L)

Vitaminas

lOOOx 1 1 1 1 1 1 1

[000105] E evidente que os exemplos acima foram apresentados apenas em caráter ilustrativo, e que modificações e variações dos mesmos, óbvias para os técnicos no assunto, são consideradas como inclusas no escopo da presente invenção, tal como definida nas reivindicações a seguir.