D'ADSORPTION SUR HYDROXYAPATITE , FRACTION ACTIVE DE COLOSTRUM

OBTENUE ET MILIEU CELLULAIRE CONTENANT LADITE FRACTION ACTIVE

DOMAINE TECHNIQUE La présente invention concerne le traitement du colostrum , notamment en vue d'obtenir une fraction de colostrum particulièrement riche en facteurs de croissance et dépourvue de protéases. Elle concerne le procédé de traitement proprement dit ainsi que la fraction de colostrum spécialement obtenue au cours du traitement. Elle concerne également l'utilisation dans des milieux de culture d'une fraction de colostrum riche en facteurs de croissance et pauvre en protéases, dénommée fraction active

TECHNIQUE ANTERIEURE Dans le domaine de la culture cellulaire, le sérum est l'additif le plus utilisé pour stimuler la prolifération cellulaire. Ce liquide biologique renferme les facteurs nécessaires à la nutrition, à la croissance et au développement des cellules de l'organisme. Son action est imparfaitement connue et sa composition très variable d'un lot à l'autre. De plus c'est un produit soumis à des fluctuations d'approvisionnement et coûteux. On recherche donc des substituts du sérum, aptes au développement de milieux de culture cellulaire parfaitement définis

On a proposé de remplacer le sérum par des produits laitiers, tels que des fractions de lait ou de lactosérum de vache, par exemple dans le document FR.A.2.586699 des fractions de lait formées de constituants ayant un poids moléculaire d'au moins environ 27.000 et dépourvues de lipides insolubles du type de ceux éliminables par ultracentrifugation. De telles fractions sont obtenues en soumettant une phase limpide de lait renfermant les protéines solubles du lait, obtenue par ultracentrifugation et séparation, à une ultrafiltration avec une membrane à seuil de coupure de 50 à 27.000 daltons environ.

Parmi les produits laitiers, on a proposé de remplacer le

2 sérum par le colostrum, qui est le liquide sécrété par la glande mammaire dans les quelques jours qui suivent une naissance.Dans le document US.A.4,440,860 il est décrit une fraction du colostrum comme facteur de croissance particulièrement actif, cette fraction a un poids moléculaire inférieur à 20.000 et un point isoelectrique compris entre 4,4 et 4,8. Cette fraction est obtenue par un écrémage , suivi d'une mise en contact du colostrum écrémé avec de l'acide acétique pH 4,3 pendant 2 heures et centrifugation pour éliminer le précipité, puis par purification basée sur le point isoélectrique , filtration sur un gel et éventuellement concentration par êlectrophorèse.

Les procédés précités concernent une sélection de composants basée sur le poids moléculaire.

D'autres procédés visent à isoler le facteur de croissance principal du colostrum. De tels procédés sont décrits par Yuen Shing et Michael Klagsbrum dans l'article intitulé "Purification and Characterization of a Bovine Colostru -Derived Growth Factor" paru dans Molecular Endocrinology 87/0335 et par Yuen Shing , Susan Davidson et Michael Klagsbrum dans l'article intitulé "Purification of Polypeptide Growth Factors from Mil " paru dans Methods in Enzy ology - 1987 - volume 146 - pages 42-48 .Selon ces auteurs , le facteur de croissance principal est le BCGF (Bovine Colostrum Growth Factor) dans le cas du colostrum de vache, ayant un poids moléculaire d'environ 30.000, et le PDGF (human platelet-derived growth factor) dans le cas du colostrum humain, ayant un poids moléculaire d'environ 20.000. Pour isoler le facteur de croissance principal du colostrum bovin, les procédés en question comportent une succession d'opérations : écrémage, précipitation par voie acide et par ébullition, chromatographie d'échange d'ions, chromatographie d'isoélectrofocalisation ou bien écrémage, filtration, chromatographie d'échange d'ions, chromatographie d'isoélectrofocalisation , cette opération étant suivie dans les deux cas par une séparation du type HPLC reverse phase . Dans ces procédés le rendement obtenu en facteurs de croissance est de

l'ordre de 1%, c'est-à-dire qu'au cours des différentes opérations mises en oeuvre, 99% de l'activité en facteurs de croissances du colostrum initial ont été perdus.

EXPOSE DE L'INVENTION Le but que s'est fixé le demandeur est différent de ceux poursuivis par les procédés précités. Il cherche dans un premier temps à obtenir une fraction du colostrum, qui soit enrichie en facteurs de croissance, mais sans qu'il y ait une particulière purification du facteur de croissance principal, et qui de plus soit pauvre en protéases.

Le demandeur a , en effet, constaté que la présence des protéases , qui sont des enzymes hydrolysant les protides , empêchait une bonne conservation dans le temps des fractions de colostrum enrichies en facteurs de croissance et de plus entraînait une baisse progressive de l'activité desdites fractions.

Le but visé est parfaitement atteint par le procédé de l'invention. Ce procédé de traitement du colostrum comprend de manière connue au moins une opération de chromatographie d'échange de cations. Selon l'invention, on soumet la partie du colostrum qui a été déplacée par elution de l'échangeur de cations à une chromatographie, d'adsorption sur hydroxyapatite et on récupère par elution la fraction retenue sur l'hydroxyapatite.

On sait que l'hydroxyapatite est un phosphate tricalcique cristallisé et qu'il est utilisé comme support d'adsorption pour le fractionnement des protéines.

C'est le mérite de l'invention que d'avoir expérimenté et vérifié que l'utilisation de l'hydroxyapatite permettait non seulement de parfaire l'enrichissement en facteurs de croissance mais aussi d'éliminer les protéases de la fraction ainsi enrichie. Plus particulièrement on récupère la fraction retenue sur 1'hydroxyapatite par lavage par un tampon phosphate à une concentration au plus de 500mM.

Par exemple, on procède à un premier lavage de 1'hydroxyapatite par un tampon phosphate pH 6,8 environ à une

concentration au plus de 50mM puis à un second lavage par un tampon phosphate pH 6,8 environ à une concentration de l'ordre de lOOmM. C'est ce second lavage qui constitue la fraction du colostrum enrichie en facteurs de croissance et pauvre en protéases. De préférence cette fraction est dessalée , concentrée et congelée ou séchée par exemple par lyophilisation ou par atomisation.

Avantageusement , l'échangeur de cation étant à fonctions sulfoniques, on obtient la partie du colostrum déplacée dudit échangeur, après un premier lavage de l'échangeur avec une solution au plus 0,1M d'acétate de sodium , par lavage de l'échangeur par une solution environ 0,5M d'acétate de sodium.

Avantageusement on ne procède , préalablement à la chromatographie d'échange de cations, qu'à une seule opération qui est un écrémage portant la teneur en matière grasse du colostrum à

2g/l au plus.

Selon le mode préféré de réalisation du procédé de l'invention , on procède sur le colostrum aux opérations successives suivantes : a. écrémage, portant la teneur en matière grasse à 2g/l au plus b. passage du colostrum écrémé sur un échangeur à fonctions sulfoniques c. premier lavage de l'échangeur avec une solution au plus 0,1M d'acétate de sodium d. second lavage de l'échangeur avec une solution d'acétate de sodium 0,5M environ e. passage de la partie correspondant au second lavage (d) , dessalée et concentrée, sur de l'hydroxyapatite équilibrée à lOmM environ f. premier lavage de l'hydroxyapatite par un tampon phosphate pH6,8 environ à 50mM au plus g. second lavage de l'hydroxyapatite par un tampon phosphate pH6,8 environ à lOOmM environ h. dessalage, concentration et congélation ouséchage de la partie correspondant au second lavage (g)

La fraction de colostrum ainsi obtenue , dite fraction active, comporte plus de 50% de l'ensemble des facteurs de croissance du colostrum initial et est pratiquement exempte de protéases. C'est un autre objet de l'invention que de protéger des milieux de culture cellulaire comportant de la fraction active comme additif pour stimuler la prolifération cellulaire. Les types cellulaires concernés sont des cellules d'eucaryotes, entre autres fibroblastes, hybridomes, cellules épithéliales, cellules endothéliales, hépatocytes, lymphocytes, macrophages, adipocytes,cellules hématopoïétiques, cellules granulo-monocytaires, cellules cardiaques, cellules nerveuses, cellules musculaires, cellules cutanées, kératinocytes, melanocytes, chondrocytes, cellules d'insecte. Un milieu de culture cellulaire particulièrement intéressant comporte du sérum de veau foetal et de la fraction active. L'action combinée de la fraction active et du sérum permet de diminuer de façon très importante la quantité de sérum mise en oeuvre pour une croissance cellulaire équivalente.La fraction active peut trouver son utilité dans d'autres secteurs, nota mmeπt pharmaceutique ou cosmétologique.

MEILLEURE MANIERE DE REALISER L'INVENTION D'autres avantages et caractéristiques de l'invention ressortiront plus clairement de la description qui va être faite d'un exemple de traitement du colostrum sur hydroxyapatite.

Le terme colostrum désigne le mélange de sécrétions lactées et de constituants du sérum sanguin, obtenu dans les 7 jours suivant la mise-bas (post-partu ) . Il provient de la vache ou d'autres mammifères. On part d'un colostrum de vache , auquel on fait subir un écrémage par centrifugation à 7900 tours par minute de manière à éliminer la plupart des matières grasses . Sans autre traitement préalable, un litre de colostrum écrémé , ayant une teneur en matières grasses inférieure à 2g/l, est mis en contact avec 15g d'une résine echangeuse de cations, à fonctions sulfoniques,

6 commercialisée par la société PHARMACIA sous la référence

SP-SEPHADEX C-50. Le pH est de 6,3 . La mise en contact a lieu sous agitation pendant une durée d'au moins 4 heures et à 4°C.

La partie du colostrum écrémé restant dans le bain contient tous les composants qui n'ont pas été retenus par les fonctions sulfoniques de la résine. Cette partie du colostrum est pratiquement exempte de facteurs de croissance ; cependant elle présente un intérêt du fait qu'elle est riche entre autres composants en immunoglobulines colostrales , en sucres, en enzymes et en proteose-peptones. Elle pourra être utilisée telle quelle ou après séparation desdits composants.

Après élimination du bain, la résine est d'abord lavée à l'aide d'une solution 0,1 molaire d'acétate de sodium. Ce premier lavage a pour but d'enlever de la surface de la résine les composants qui ne sont pas à proprement parler retenus par échange ionique sur les fonctions sulfoniques.

On procède ensuite à un deuxième lavage de la résine à l'aide d'une solution 0,5 molaire d'acétate de sodium. Ce lavage a pour effet de déplacer une partie des composants du colostrum qui étaient retenus par échange ionique sur les fonctions sulfoniques de la résine. Ce déplacement est fonction de différents paramètres tels l'affinité respective des composants pour les fonctions sulfoniques , la cinétique d'échange , l'effet stérique.

On procède enfin à un troisième lavage de la résine à l'aide d'une solution 1,0 molaire d'acétate de sodium.

Les deux solutions de lavage à 0,5 et 1,0M d'acétate de sodium sont respectivement dessalées par ultrafiltration, dialyse, électrodialyse, ou tamisage moléculaire , puis concentrées par ultrafiltration avec un seuil de coupure de 5.000 de masse moléculaire.

Une analyse comparative du colostrum écrémé initial, et des deux fractions correspondant l'une au lavage 0,5M et l'autre au lavage 1,0M fait apparaître d'une part que plus de 80 % des facteurs de croissance contenus dans le colostrum écrémé se trouvent dans les deux fractions, et d'autre part que la fraction

correspondant au lavage 0,5M, contient 73,2% des facteurs de croissance contenus dans le colostrum écrémé. Cette fraction contient également entre autres composants de la lactoperoxydase, de la lactotransferrine , du lyzozyme et des protéases. Le tableau I ci-dessous donne les résultats comparés entre le colostrum écrémé (A) et la fraction éluée à 0,5M.

Tableau I

La teneur en protéines a été dosée par la technique L0WRY, modifiée par PETERSON. L'unité U de facteur de croissance, encore appelée activité mitogène, est égale à la quantité de protéines nécessaires pour provoquer une incorporation de méthyl-thymidine tritiée égale à la moitié de l'incorporation maximale.

Cette fraction (B) est dessalée et concentrée, puis injectée sur une colonne d'hydroxyapatite préalablement équilibrée dans un tampon phosphate pH6,8 à lOmM. La quantité d'hydroxyapatite , qui a la forme d'un gel, est déterminée en fonction de la quantité de protéines présentes dans la fraction, de façon à ce qu'il y ait au plus 40mg de protéines par millilitre de gel d'hydroxyapatite. On élue ensuite la colonne d'hydroxyapatite successivement

8 par trois solutions tampons phosphates pH 6,8 à des concentrations de plus en plus concentrées , respectivement 50mM pour le premier, lOOmM pour le deuxième et 500mM pour le troisième.

Chacune des fractions obtenues est dessalée , concentrée et lyophilisée. Les fractions 50 et 500mM renferment quasiment la totalité des protéases. Seule la fraction lOOmM est quasiment exempte de protéases.

La deuxième fraction, correspondant à l'elution par la solution à lOOmM , dite fraction active, est la seule enrichie en facteurs de croissance.

Dans le tableau II ci-dessous , on a complété les résultats donnés dans le tableau I à l'aide des informations relatives à ladite fraction active (C) .

Tableau II

Par rapport au colostrum écrémé (A) , la fraction active (C) se distingue par une très forte activité spécifique. Une comparaison a été faite entre la fraction active et le sérum de veau foetal qui est l'additif le plus répandu pour stimuler la prolifération cellulaire. Pour cela on a utilisé un test d'incorporation de thymidine tritiée pour détecter les activités itogènes respectives sur la souche de fibroblastes CCL39. Il ressort de cette comparaison que l'activité spécifique

de la fraction active (117,6U/mg de protéines)est nettement plus importante que celle du sérum de veau foetal (15 U/mg de protéines) . Ceci est un réel avantage pour la fraction active dans la mesure où il est souvent nécessaire d'éliminer ultérieurement du milieu de culture les protéines qui ont été introduites avec l'additif ; dans le cas de la fraction active la quantité de protéines à éliminer est faible.

La fraction active est utile en remplacement ou en combinaison avec le sérum de veau foetal, dans les milieux de culture cellulaire, par exemple dans un milieu MEM (Milieu Essentiel Minimum de Eagle) additionné de 2,2g/l de bicarbonate de soude, de 1% en volume de glutamine, 0,4 % en volume de pénicilline, de 0,4% de streptomycine, de 0,5% en volume de fungizone. La fraction active a été utilisée comme additif de croissance dans un milieu de culture pour des fibroblastes CCL 39 en complément du sérum de veau foetal. Les plaques de culture, préalablement traitées ou non à la fibronectine, ont été ensemencées à raison de 160 000 cellules et 2 ml de milieu par puits, ledit milieu comprenant une certaine quantité de fraction active.

Par exemple l'addition de 1 % en volume de sérum de veau foetal et de 1 % en volume de la fraction active (contenant 1 g/1 de protéines) dans un milieu de culture de fibroblastes permet d'obtenir une croissance cellulaire correspondant à celle obtenue avec environ 9 % en volume de sérum de veau foetal dans le même milieu.

L'invention n'est pas limitée au mode de réalisation qui a été décrit à titre d'exemple non exhaustif , mais en couvre toutes les variantes. En particulier les conditions du traitement revendiquées ne sont pas limitées à ce qui a été décrit, d'autres types d'échangeurs de cations, autres que la résine, peuvent être mis en oeuvre, de même que des échangeurs ayant une autre fonction que la fonction sulfonique ; le déplacement de la partie du colostrum retenue sur l'échangeur de cation peut être obtenu par toute voie habituelle de régénération dudit échangeur, et le fonctionnement approprié sera déterminé au cas par cas.