Titel

Mikrofluidische Vorrichtung und Verfahren zu ihrem Betrieb

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Betreiben einer mikrofluidischen Vorrichtung. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung eine mikrofluidische Vorrichtung, die eingerichtet ist, um mittels des Verfahrens betrieben zu werden.

Stand der Technik

In der Diagnostik werden je nach Anwendung und Nachweismethode verschiedene sogenannte Transportmedien für biologische Proben als klinische Standards etabliert, die es möglich machen, Patientenabstriche oder Patientenproben zu einem Diagnostiklabor zu transportieren. Für molekularbiologische oder biochemische Analysen der Proben werden Transportmedien eingesetzt, deren Hauptaufgabe darin besteht, eine stabilisierende Umgebung für Nukleinsäuren und weitere Analyten zu gewährleisten, um die Probe nicht zu verändern. In diesen Medien werden außerdem Pathogene ganz oder teilweise zerstört, Nukleinsäuren freigesetzt und abbauende Proteine gehemmt. Für mikrobiologische oder zellbiologische Analysen dürfen die Transportmedien hingegen nicht lysierend sein, weil für verschiedenste Nachweise intakte lebende Zellen benötigt werden.

Bei Verwendung eines nicht-lysierenden Transportmediums wird zunächst eine Akkumulation von Zellen, die beispielsweise Erreger enthalten, auf einem Rückhalteelement, wie einer Filterfritte, durchgeführt. Auf diese Weise erfolgt eine Akkumulation von Zellen, die intrazelluläre Pathogene, wie Bakterien (beispielsweise Mycoplasmen), Parasiten (beispielsweise Trichomonas oder Plasmodium sp.) oder Viren (beispielsweise Influenza oder SARS-CoV-2) enthalten können. Auf die Akkumulation folgt eine mechanische, chemische oder thermische Lyse direkt am Ort der Akkumulation, also auf der Filterfritte, um eine Konzentration in der im nächsten Schritt molekularbiologisch oder biochemisch nachzuweisenden Pathogene vorzunehmen. Dabei ist es wichtig, dass die akkumulierten Zellen auf dem Rückhalteelement vor der Lyse intakt bleiben.

In dem Artikel S. J. Tan, H. Phan, B. M. Gerry, A. Kuhn, L. Z. Hong et al., A microfluidic device for preparing next generation DNA sequencing libraries and for automating other laboratory protocols that require one or more column chromatography steps, PLoS ONE, 8 (2013) e64084 wird beschrieben, dass bei der chromatographischen Gewinnung von DNA in mikrofluidischen Vorrichtungen eine niedrige Flussrate einer Probe vorteilhaft ist, um eine hohe DNA-Gewinnung zu erreichen.

Offenbarung der Erfindung

Das Verfahren zum Betreiben einer mikrofluidischen Vorrichtung sieht vor, dass ein Medium, welches humane Zellen enthält, mit einer Flussrate durch einen Filter transportiert wird, die so gewählt oder eingestellt wird, dass eine Schädigung der Zellen vermieden wird. Dabei wird die Flussrate vorzugsweise über zumindest eine Saugkammer und/oder Pumpe eingestellt.

Unter einem Medium kann ein Fluid, insbesondere eine Flüssigkeit verstanden werden. Beispielsweise kann es sich bei dem Medium um eine Körperflüssigkeit, insbesondere Sputum, Urin oder Blut handeln. Ferner kann es sich bei dem Medium vorzugsweise um ein Transportmedium, insbesondere ein nichtlysierendes Transportmedium, beispielsweise eine phosphatgepufferte Salzlösung oder UTM®, handeln, wobei das Transportmedium abhängig von einer Probennahme auch Körperflüssigkeit enthalten kann.

Diesem Verfahren liegt die Erkenntnis zugrunde, dass humane Zellen tendenziell bereits bei geringem Scherstress lysieren. Eine niedrige Flussrate oder ein niedriger Flussratenbereich verringert diesen Scherstress, sodass eine Schädigung der Zellen vermieden werden kann. Die Flussrate wird somit derart gewählt oder eingestellt, insbesondere zumindest über eine Einstellung der Saugkammer und/oder Pumpe, dass ein möglichst hoher Anteil der Zellen intakt auf dem Filter akkumuliert wird. Die Wahl oder Einstellung der Flussrate kann dabei vorzugsweise unter Berücksichtigung der mikrofluidischen Gegebenheiten der mikrofluidschen Vorrichtung erfolgen, also insbesondere unter Berücksichtigung des fluidischen Widerstands des Filters, der Viskosität des Mediums und/oder eines fluidischen Widerstands eines Kanals, durch welchen das Medium mit den Zellen zum Filter transportiert wird. Der fluidische Widerstand des Kanals kann dabei insbesondere von der Geometrie, insbesondere einer Breite und Länge des Kanals, und/oder von einer inneren Oberfläche des Kanals abhängen. Durch die erfindungsgemäße Anpassung der Flussrate an die mikrofluidischen Gegebenheiten ist es möglich, ein sanftes Pumpen oder Saugen der in dem Medium enthaltenen Zellen auf den Filter zu realisieren, so dass vorteilhafterweise ein hoher Anteil der Zellen durch den Transport auf den Filter nicht geschädigt werden und für eine nachfolgende Bearbeitung oder Analyse intakt bleiben.

Unter einer Vermeidung einer Schädigung der Zellen kann somit insbesondere verstanden werden, dass zumindest 30%, bevorzugt mindestens 40%, besonders bevorzugt mindestens 50%, ganz besonders bevorzugt mindestens 60% der in dem Transportmedium enthaltenen Zellen intakt auf dem Filter akkumuliert werden. Dabei ist vorzugsweise berücksichtigt, dass aufgrund einer Beschaffenheit, insbesondere einer Porengröße des Filters und aufgrund eines durch die Flussrate auf den Filter wirkenden Drucks ein Anteil intakter Zellen auch durch den Filter hindurchtreten kann und dass ein weiterer Anteil intakter Zellen aufgrund der mikrofluidischen Beschaffenheit der mikrofluidischen Vorrichtung beim Transport verloren gehen kann.

Unter einer Vermeidung einer Schädigung der Zellen kann ferner in vorzugsweiser Ausgestaltung des Verfahrens verstanden werden, dass die Flussrate derart gewählt wird, dass im Wesentlichen keine Schädigung der Zellen erfolgt. Unter „im Wesentlichen keine Schädigung“ kann vorzugsweise verstanden werden, dass weniger als 40%, bevorzugt weniger als 30%, ganz bevorzugt weniger als 20% der Zellen durch den Transport zum Filter geschädigt werden.

Die Flussrate beträgt bevorzugt maximal 300 pl/s und besonders bevorzugt maximal 200 pl/s. Diese Flussrate ist besonders geeignet, um eine Schädigung humaner Zellen möglichst zu verhindern. Außerdem wird bei solchen Flussraten möglichst vermieden, dass Zellen durch den Filter hindurchgedrückt werden und damit für die spätere Analyse nicht mehr zur Verfügung stehen.

Das Transportieren erfolgt vorzugsweise durch ein Saugen des Mediums. Während mikrofluidische Vorrichtungen, die ein Medium mittels Überdruckes durch einen Filter pressen, üblicherweise mit hohen Drücken, wie beispielsweise einem Druck von 260 kPa arbeiten und damit hohe Flussraten von beispielsweise 500 pl/s erzeugen, sind mikrofluidische Vorrichtungen in der Regel dazu eingerichtet, ein Saugen mit nur geringem Unterdrücken vorzunehmen, wodurch geringere Flussraten realisiert werden können. Grundsätzlich kann das Verfahren aber auch durch ein Pumpen Mediums realisiert werden, wenn das Pumpen mit einem so geringen Überdruck erfolgt, dass die erforderlichen geringen Flussraten realisiert werden können.

Das Saugen erfolgt bevorzugt durch Einstellen eines Drucks auf einer stromabwärtigen Seite des Filters, welcher maximal 90 kPa beträgt. Besonders bevorzugt liegt der Druck im Bereich von 30 kPa bis 40 kPa. Da in einer mikrofluidischen Vorrichtung, in der keine aktiven Pump- oder Saugvorgänge ablaufen, üblicherweise Atmosphärendruck herrscht, bewirken diese Druckbereiche einen nur geringen Unterdrück während des Saugvorgangs, der ein schonendes Filtrieren der im Medium, insbesondere im Transportmedium enthaltenen Zellen ermöglicht.

Das Saugen erfolgt vorzugsweise mittels einer Saugkammer, die stromabwärts des Filters angeordnet ist. Besonders bevorzugt ist sie unmittelbar stromabwärts des Filters angeordnet. Unter „unmittelbar stromabwärts“ wird dabei verstanden, dass der Filter und die Saugkammer nur durch eine Leitung miteinander verbunden sind, ohne dass in dieser Leitung weitere mikrofluidische Elemente angeordnet sind. Das Verwenden einer solchen Saugkammer ermöglicht das sehr präzise Anlegen eines Unterdrucks stromabwärts des Filters und somit ein genaues Steuern der Flussrate. Bei der Saugkammer kann es sich auch um eine Pumpe handeln, welche so betrieben werden kann, dass sie Fluide, insbesondere Flüssigkeiten, ansaugt.

Die mikrofluidische Vorrichtung ist eingerichtet, um mittels des Verfahrens betrieben zu werden. Diese Einrichtung erfolgt insbesondere dadurch, dass die Verfahrensschritte auf einer Recheneinheit oder Steuereinheit der mikrofluidischen Vorrichtung als Computerprogramm implementiert sind. Die mikrofluidische Vorrichtung weist einen Filter auf, der insbesondere als Filterfritte ausgeführt ist. Ein zahlenmittlerer Porendurchmesser des Filters liegt vorzugsweise im Bereich von 0,5 pm bis 10,0 pm. Da humane Zellen üblicherweise einen Durchmesser von mehr als 10 pm bis 20 pm aufweisen, wird hiermit ein sicheres Zurückhalten der Zellen gewährleistet, während gleichzeitig weitere im Transportmedium enthaltene Partikel von den Zellen abgetrennt werden können.

Eine Saugkammer ist vorzugsweise stromabwärts des Filters angeordnet. Besonders bevorzugt ist sie unmittelbar stromabwärts des Filters angeordnet. Die Saugkammer weist dabei eine Membran auf, die sie in einen ersten Teil und einem zweiten Teil unterteilt. Der erste Teil liegt in einer Fluidikschicht der mikrofluidischen Vorrichtung, durch welche das Medium transportiert wird. Der zweite Teil liegt in einer Pneumatikschicht, in welcher ein Überdruck oder ein Unterdrück erzeugt werden kann. Eine Saugkammer unterscheidet sich von einer Pumpkammer dadurch, dass ihr zweiter Teil mit einem Kanal der Pneumatikschicht verbunden ist, welcher eingerichtet ist, damit darin ein Unterdrück erzeugt wird, während der zweite Teil einer Pumpkammer mit einem Kanal der Pneumatikschicht verbunden ist, welcher eingerichtet ist, damit darin ein Überdruck erzeugt wird. Wird im zweiten Teil der Saugkammer ein Unterdrück erzeugt, so wird die Membran in die Pneumatikschicht hinein ausgelenkt, wodurch auch im ersten Teil der Saugkammer ein Unterdrück entsteht.

Um ein einfaches Auslenken der Membran zu ermöglichen, besteht diese vorzugsweise aus einem Elastomer. Besonders bevorzugte Elastomere sind thermoplastisches Polyurethan oder Polydimethylsiloxan (PDMS).

Um der Membran eine gute mechanische Stabilität zu verleihen und gleichzeitig ihre Elastizität zu erhalten, liegt die Dicke der Membran vorzugsweise im Bereich von 50 pm bis 300 pm. Besonders bevorzugt liegt sie im Bereich von 75 pm bis 125 pm. Weiterhin ist bevorzugt, dass der Radius der Membran im Bereich von 1 mm bis 10 mm liegt. Besonders bevorzugt liegt er im Bereich von 2,5 mm bis 3,5 mm.

Die Saugkammer ist mit dem Filter über einen Kanal verbunden, dessen Kanalquerschnitt bevorzugt im Bereich von 0,1 mm ² bis 0,4 mm ² und besonders bevorzugt im Bereich von 0,22 mm ² bis 0,26 mm ² liegt. Dieser Querschnitt ermöglicht vorteilhaft die Einstellung der gewünschten Flussraten durch den Kanal.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in den Zeichnungen dargestellt und werden in der nachfolgenden Beschreibung näher erläutert.

Fig. 1 zeigt schematisch Elemente einer mikrofluidischen Vorrichtung gemäß dem Stand der Technik.

Fig. 2 zeigt schematisch Elemente einer mikrofluidischen Vorrichtung gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung.

Fig. 3 zeigt schematisch eine Saugkammer einer mikrofluidischen Vorrichtung gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung.

Fig. 4 zeigt in einem Diagramm einen Vergleich einer RNA-Rückgewinnung aus humanen Zellen in einem Vergleichsbeispiel und einem erfindungsgemäßen Beispiel des Verfahrens.

Fig. 5 zeigt in einem Diagramm einen Vergleich der RNA-Rückgewinnung in drei erfindungsgemäßen Beispielen des Verfahrens.

Ausführungsbeispiele der Erfindung

Eine mikrofluidische Vorrichtung (beispielsweise Vivalytic®, Robert Bosch GmbH, Deutschland) gemäß dem Stand der Technik, die in Fig. 1 dargestellt ist, weist eine Fluidikschicht 100 und eine Pneumatikschicht 200 auf. In der Fluidikschicht 100 ist ein Einlass 110 angeordnet, über den ein Medium, insbesondere ein Transportmedium in ein Kanalsystem eingeführt werden kann. Bei dem Transportmedium handelt es sich beispielsweise um das UTM®-RT-Medium (Universal Transport Medium Room Temperature, COPAN Diagnostics, USA). Dieses zellstabilisierende Transportmedium enthält Salze zur Pufferung eines neutralen pH-Werts und Zuckerverbindungen zur Stabilisierung von humanen Zellen. Das Transportmedium, welches im vorliegenden Ausführungsbeispiel humane Zellen enthält, wird mittels einer Pumpkammer 210 mit einem Druck von 260 kPa durch das Kanalsystem gepumpt. Die Pumpkammer 210 weist hierzu eine Membran 211 auf, welche sie in einen ersten Teil in der Fluidikschicht 100 und einen zweiten Teil in der Pneumatikschicht 200 unterteilt. Zwischen dem Einlass 110 und der Pumpkammer 210 zweigt ein erstes Reservoir 120, das ein Ventil 121 aufweist, vom Kanalsystem ab. Stromabwärts der Pumpkammer 210 zweigt ein zweites Reservoir 130, welches ein Ventil 131 aufweist, vom Kanalsystem ab. Aus den beiden Reservoirs 120, 130 können Reagenzien in das Kanalsystem eindosiert werden. Ein Filter 140 ist stromabwärts der Pumpkammer 210 und des zweiten Reservoir 130 im Kanalsystem angeordnet. Er ist als Filterfritte mit einem zahlenmittleren Porendurchmesser von 5 pm ausgeführt. Stromabwärts des Filters 140 zweigt ein drittes Reservoir 150 mit einem Ventil 151 vom Kanalsystem ab, durch welches ebenfalls Reagenzien in das Kanalsystem eindosiert werden können. Ein Sammelgefäß 160, welches ein Ventil 161 aufweist, sammelt stromabwärts des dritten Reservoir 150 das Transportmedium, welches durch den Filter 140 gepumpt wurde. Bei diesem Pumpvorgang treten Flussraten von bis zu 500 pl/s auf.

Fig. 2 zeigt ein Ausführungsbeispiel einer mikrofluidischen Vorrichtung gemäß der Erfindung. Diese Vorrichtung unterscheidet sich von der Vorrichtung gemäß Fig. 1 dadurch, dass stromabwärts des Filters 140 und stromaufwärts des dritten Reservoirs 150 eine Saugkammer 220 mit einer Membran 221 im Kanalsystem angeordnet ist. Das Transportieren des Mediums, insbesondere des Transportmediums durch den Filter 140 erfolgt nicht unter Verwendung der Pumpkammer 210, welcher einen Überdruck stromaufwärts des Filters 140 erzeugt, sondern unter Verwendung der Saugkammer 220, welcher einen Unterdrück stromabwärts des Filters 140 erzeugt.

In Fig. 3 sind Details der Saugkammer 220 dargestellt. Die Membran 221 der Saugkammer 220 weist eine Dicke d von 100 pm auf. Ihr Radius r beträgt 3,0 mm. Der kreisförmigen Kanalquerschnitt a in einem Kanal 222 des Kanalsystems zwischen dem Filter 140 und der Saugkammer 220 beträgt 0,24 mm ² . Fig. 4 zeigt den Vergleich eines Vergleichsbeispiels VB1 und eines erfindungsgemäßen Beispiels Bl des Akkumulierens humaner Zellen auf dem Filter 140. In beiden Fällen wurden jeweils 10.000 Zellen mittels des Transportmediums in ein Ausführungsbeispiel der mikrofluidischen Vorrichtung gemäß Fig. 2 eingegeben. Nach Beenden der Akkumulation wurden diese lysiert und die Masse m der zurückgewonnenen RNA wurde ermittelt. Diese Masse m stellt ein Maß für die Anzahl intakt akkumulierter Zellen dar. Im Vergleichsbeispiel VB1 wurde die Vorrichtung gemäß Fig. 1 verwendet und das Transportmedium mittels der Pumpkammer 210 mit einem Druck von 260 kPa gepumpt. Im erfindungsgemäßen Beispiel Bl wurde die Vorrichtung gemäß Fig. 2 verwendet und das Transportmedium wurde mittels der Saugkammer 220 mit einem Druck von 35 kPa gesaugt. Während im Vergleichsbeispiel VB1 nur 1,8 ng RNA zurückgewonnen werden konnte, gelang es im erfindungsgemäßen Beispiel Bl 10,1 ng RNA zurückzugewinnen. Dies zeigt, dass das erfindungsgemäß Saugen zu einer geringen Flussrate und einem geringen Scherstress auf die humanen Zellen führte, wodurch nur wenige Zellen auf dem Filter 140 zerstört wurden.

Fig. 5 zeigt die Rückgewinnung von RNA aus jeweils 10.000 humanen Zellen in drei weiteren erfindungsgemäßen Beispielen B2 bis B4. In allen Beispielen wurde ein anderes Ausführungsbeispiel der mikrofluidischen Vorrichtung gemäß Fig. 2 verwendet und das Transportmedium wurde mittels der Saugkammer 220 gesaugt. Dabei betrug der mittels der Saugkammer 220 eingestellte Druck stromabwärts des Filters 140 im zweiten Beispiel B2 70 kPa, im dritten Beispiel B3 50 kPa und im vierten Beispiel B435 kPa. Es ist erkennbar, dass die in diesen erfindungsgemäßen Beispielen B2 bis B4 eingestellten Drücke zwar zu einer geringeren RNA-Rückgewinnung als im ersten erfindungsgemäßen Beispiel Bl führen, diese jedoch immer noch höher ist als im Vergleichsbeispiel VB1. Je geringer der eingestellte Druck ist, desto geringer ist die RNA-Rückgewinnung. Geringere Drücke in der Saugkammer 220 führen zu einer größeren Druckdifferenz gegenüber dem Eingang des Filters 140, an dem Umgebungsdruck herrscht, sodass die Flussrate durch den Filter 140 steigt und damit mehr Zellen zerstört werden. Auch ein Druck von 35 kPa stellt jedoch sicher, dass im Vergleich zur Verwendung der nicht erfindungsgemäßen Vorrichtung nur wenige Zellen zerstört werden. Weiterhin wurde bei diesem Druck im Beispiel B4 zwar im Mittel eine geringere RNA-Rückgewinnung erzielt, diese war allerdings reproduzierbarer und zeigte eine geringere Streuung als in den Beispielen B2 und B3.