Morphometrisches Gewebe-oder Zellpräparat Beschreibung Die Erfindung betrifft ein morphometrisches Gewebe- oder Zellpräparat, welches erhältlich ist, indem die folgenden Verfahrenstufen ausgeführt werden : a) Zellen oder Gewebe werden über eine definierte Zeit unter definierten Bedingungen in einer Matrix kultiviert, b) nach Ablauf der definierten Zeit wird die die kultivierten Zellen oder Gewebe enthaltende Matrix mit einer Färbelösung inkubiert. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Herstellungsverfahren für ein solches Präparat sowie Verwendungen desselben. Die Erfindung betrifft schließlich eine Fixier-und Färbelösung zur Verwendung in einem solchen Verfahren.

Ein morphometrisches Gewebe-oder Zellpräparat ist in einer Weise behandelt, die eine Erkennung der Formbildung (Morphogenese) zellulärer Strukturen bzw. von Gewebestrukturen erlaubt. Hierbei ist es wesentlich, daß Formen, beispielsweise Formen von Zellen und/oder Zellbestandteilen und/oder Geweben, mittels kontrastbildender Methoden erkennbar gemacht werden. Eine Erkennung kann dabei durch Betrachtung unter Verwendung diverser optischer Methoden, im einfachsten Falle mittels normaler Lichtmikroskopie, erfolgen. Oft erfolgt im Rahmen der Erkennung eine Zählung von bestimmten Formmerkmalen, welche meist mit bestimmten zellulären Prozessen korreliert sind. Die Erkennung kann visuell durch das menschliche Auge erfolgen, wobei dann eine betrachtende Person beispielsweise die Identifizierung gesuchter Strukturen und ggf. deren Zählung anhand der Betrachtung des Präparats, ggf. durch ein Mikroskop, oder durch Betrachtung einer entsprechenden Aufnahme durchführt. Einfacher und sicherer ist es jedoch, die

Erkennung zu automatisieren, beispielsweise durch Aufnahme des (Mikroskop-) Bildes und Auswertung mittels eines computergesteuerten Mustererkennungssystems, welches dann auch automatisch eine Zählung durchführen kann. Eine Aufnahme kann photographisch oder elektronisch, beispielsweise mittels CCD Elementen, durchgeführt werden. Die Methodik dient dazu festzustellen, welchen Einfluß die definierten Kultivierungsbedingungen auf die Morphogenese haben. Der Ausdruck der definierten Kultivierungsbedingungen umfaßt daher insbesondere auch nicht-natürliche bzw. nicht-Standard-Bedingungen, welche beispielsweise durch Zugabe eines oder mehrerer prospektiver Wirkstoffe zu einem Standardmedium charakterisiert sind. Es versteht sich, daß die Bedingungen in jedem Fall so zu wählen sind, daß nicht praktisch sofortige Apoptose aller Zellen des Präparats insgesamt induziert wird. Die Färbelösung dient dazu, die Formgebungsmerkmale von Interesse im Kontrast hervorzuheben. Den Farbstoff kann der Durchschnittsfachmann unschwer nach Maßgabe der interessierenden Formen auswählen (beispielsweise basische Farbstoffe binden an saure Zellstrukturen, wie DNA im Kern oder RNA in den Ribosomen ; saure Farbstoffe binden bevorzugt an basische Plasmaproteine). Wesentlich bei der Färbung ist, daß der Farbstoff an (bestimmte) zelluläre Strukturen so fest gebunden wird, daß eventuelle subsequente Waschverfahrenstufen den Farbstoff nicht mehr abzulösen vermögen. Die Bindungsstellen des Farbstoffes bilden dann die gefärbten Bereiche, während Bereiche, in welchen keine oder weniger Bindungsstellen für den Farbstoff vorliegen, nicht oder nur schwach gefärbte Bereiche darstellen. Dies ist letztendlich der Mechanismus der Kontrastbildung.

Ein Verfahren der eingangs genannten Art ist beispielsweise aus der Literaturstelle Leclere, P.,

Neuroscience : 82,545-548,1998, bekannt. Bei dem insofern bekannten Verfahren wurden Ganglienzellenexplantate mit Nervenwachstumsfaktor behandelt bzw. in dessen Gegenwart kultiviert und anschließend wurde das dadurch induzierte Neuritenwachstum morphometrisch analysiert. Dabei wurde eine Färbung unter Einsatz von farbstoffmarkierbaren bzw. farbstoffmarkierten Antikörpern durchgeführt. Es handelt sich folglich um eine Antigen-abhängige Färbemethode. Spezifische Färbungen dieser Art sind jedoch nur für recht dünne Matrices geeignet. Oft ist es jedoch wünschenswert, ausgeprägt dreidimensionale Matrices bzw. Kulturen zu verwenden, wobei dann eine ausreichend homogene Antigen-abhängige Färbung nur schwer oder gar nicht gelingt. Zudem sind Antigen-abhängige Färbemethoden zeitaufwendig und kostspielig.

Aus den Literaturstellen Hayakawa, K., et al., Neurosci Lett. : 274,103-106,1999, und Carreau, A., Neuropharmacology : 36,1755-1762,1997, ist es bekannt, morphometrische Analysen mittels der Phasenkontrastmikroskopie in-situ, i. e. in unfixiertem Zustand, durchzuführen. Die Aufnahmen sind jedoch sehr kontrastarm, was insbesondere eine automatische Mustererkennung erschwert, wenn nicht unmöglich macht.

Zudem können die Kulturen dabei sehr schnell degenerieren. Im Falle der erstgenannten Literaturstelle ist das Auswandern von Zellen aus komplexen Geweben, wie z. B. bei der Metastasierung von Tumoren untersucht. Die zweitgenannte Literaturstelle beschreibt den Einfluß von Nervenwachstumsfaktoren auf das Neuritenwachstum.

Demgegenüber liegt der Erfindung das technische Problem zugrunde, ein morphometrisches Gewebe-oder Zellpräparat anzugeben, welches eine stabile und dauerhafte morphogenetische Momentaufnahme darstellt

und gleichzeitig einfach herstellbar ist bei sehr guter Kontrastbildung.

Zur Lösung dieses technischen Problems lehrt die Erfindung ein morphometrisches Gewebe-oder Zellpräparat, welches erhältlich ist, indem die folgenden Verfahrenstufen ausgeführt werden : a) Zellen oder Gewebe werden über eine definierte Zeit unter definierten Bedingungen in einer dreidimensionalen Matrix kultiviert, b) nach Ablauf der definierten Zeit wird die die kultivierten Zellen oder Gewebe enthaltende Matrix mit einer Fixier-und Färbelösung enthaltend ein Aldehyd und, optional einen Alkohol, sowie ein antigenunspezifisches Färbemittel inkubiert.

Hieran kann sich eine Waschverfahrensstufe, beispielsweise mit Wasser, anschließen. Ein antigenun- spezifisches Färbemittel ist ein Farbstoff, welcher allein aufgrund seiner sauren oder basischen Gruppen, aber auch durch Redox-Prozesse, unspezifisch an Moleküle bzw. Molekülklassen einer Zelle oder eines Gewebes binden kann. Es kann auch eine Bindung an praktisch alle Strukturen von Zellen oder eines Gewebes stattfinden. Ein Einsatz von Antikörpern findet nicht statt. Das Aldehyd und ggf. der Alkohol bewirken eine zuverlässige Fixierung von Strukturen der Zellen oder des Gewebes durch eine Vielfalt von immobilisierenden Reaktionen mit an sich mobilen Molekülen der Zellen oder des Gewebes, beispielsweise im Wege von Mannich Reaktionen. In einer dreidimensionalen Matrix erfolgt Zellwachstum bzw.

Wachstum von Zellteilen in allen drei Raumrichtungen.

Insbesondere sind hierunter Präparate zu verstehen, deren räumliche Ausdehnung in allen drei Raumrichtungen ein Mehrfaches der räumlichen Ausdehnung der kultivierten Zellen ist, beispielsweise gleich oder mehr als das 2-fache, vorzugsweise mehr als das 10-fache, bis zu mehr als das 100-fache.

Mit der Erfindung wird erreicht, daß das ausgeprägt

dreidimensionale Zell-oder Gewebepräparate stabil und dauerhaft fixiert sind und zugleich mittels einfachster Methoden, beispielsweise einfacher Lichtmikroskopie, sehr kontrastreiche Aufnahmen erhalten werden. Dabei ist nur eine einzige Behandlung mit der Fixier-und Färbelösung notwendig, i. e. es handelt sich um eine"one-step"-Methode. Zudem lassen sich ausgeprägt dreidimensionale Präparate gut fixieren und färben, während eine spezifische Färbung solcher Präparate mit Antikörper-basierenden Methoden kaum, wenn überhaupt, gelingt. Ausgeprägt dreidimensionale Präparate sind solche, die nicht ledigliche eine minimale Dicke aufweisen (Schnitte), sondern Dicken von durchaus 0,2 ßm bis hin zu 20 mm, insbesondere 0,2 mm bis 20 mm, aufweisen können.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, welche von selbstständiger Bedeutung ist, enthält die Fixier-und Färbelösung Wasser, optional ein mit Wasser mischbares organisches Lösemittel, und Kochsalz. Die wäßrige Kochsalzlösung, insbesondere im Falle einer physiologischen Kochsalzlösung, verhindert zuverlässig Formänderungen von Zellen oder Gewebe, beispielsweise osmosebedingt, im Zuge der Fixierung und Färbung.

Im Einzelnen kann die Fixier-und Färbelösung die folgenden Komponenten enthalten : A) 0,5-35 Gew.-%, vorzugsweise 1-2 Gew.-%, Aldehyd, B) 0,01 bis 10 Gew.-%, vorzugsweise 0,3-0,6 Gew.-%, Färbemittel, C) 0-90 Gew.-%, vorzugsweise 30-50 Gew.-%, eines oder mehrerer mit Wasser mischbaren organischen Lösemittel, D) 0-90 Gew.-%, vorzugsweise 50-70 Gew.-%, Wasser, E) 0-5 Gew.-%, vorzugsweise 0,1-1 Gew.-%, Kochsalz, wobei die Summe der Anteile der Komponenten A) bis E) stets 100 Gew.-% ergibt, und wobei das Verhältnis der Gewichtsanteile der Komponenten E : D in dem Bereich von 1 : 1000 bis 1 : 100 liegt,

vorzugsweise dem Verhältnis der Gewichtsanteile einer physiologischen Kochsalzlösung entspricht. Die Erfindung betrifft auch selbstständig eine solche Fixier-und Färbelösung.

Die Dauer der Inkubation in Stufe b) kann im Bereich von 0,5 bis 24 h, vorzugsweise im Bereich von 1 bis 10 min., betragen. Die Inkubation in Stufe b) kann bei einer Temperatur von 0 °C bis 60 °C, vorzugsweise von 0 °C bis 40 °C, durchgeführt werden.

Das mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus"C1-10 Alkanole mit 1-3 OH-Gruppen, C1-10 alizyklische Alkohole mit 1-3 OH-Gruppen, Cl bis C10 aromatische Alkohole, und Mischungen solcher Stoffe". Bevorzugt ist Ethanol. Das Färbemittel kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus"Kristallviolett, Amidoschwarz, Kresylviolett, und Mischungen solcher Stoffe". Die Matrix kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus"extrahierten natürlichen extrscellulären Matrices verschiedenen Ursprungs, insbesondere aus Rattenschwänzen oder Schweinehaut, deren Hauptbestandteile, insbesondere Collagen, Laminin, Fibronektin, und Mischungen dieser Stoffe".

Das Aldehyd kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus"C1 bis C10 Alkanaldehyde, Cl bis C10 alizyklische Aldehyde, aromatische Cl bis C10 Aldehyde, und Mischungen solcher Aldehyde". Bevorzugt sind Formaldehyd und Paraformaldehyd.

Die einzelnen Zellen oder komplexen Gewebe des Präparats können beispielsweise aus Tumorzellen, Nervenzellen, Gliazellen, Muskelzellen, Blutzellen sein bzw. daraus bestehen. Im Bereich der Wirkstoffindung sind die Zellen optimalerweise (aber nicht zwingend) humane Zellen.

Die Erfindung lehrt weiterhin ein Verfahren zur Herstellung

eines morphometrischen Gewebe-oder Zellpräparat wobei die folgenden Verfahrenstufen ausgeführt werden : a) Zellen oder Gewebe werden über eine definierte Zeit unter definierten Bedingungen in einer ausgeprägt dreidimensionalen Matrix kultiviert, b) nach Ablauf der definierten Zeit wird die die kultivierten Zellen oder Gewebe enthaltende Matrix mit einer Fixier-und Färbelösung enthaltend ein Aldehyd sowie ein antigenunspezifisches Färbemittel inkubiert. Bezüglich des erfindungsgemäßen Verfahrens gelten die vorstehenden Anmerkungen zum Präparat analog.

Die Erfindung lehrt weiterhin die Verwendung eines erfindungsgemäßen morphometrischen Gewebe-oder Zellpräparats zur morphometrischen Analyse von kultivierungs-bedingungsbedingten zellulären Prozessen.

Mit anderen Worten ausgedrückt, in Stufe a) werden definierte Bedingungen eingestellt, von denen ein bestimmter morphogenetischer Effekt erwartet wird. Dieser wird dann ausgewertet und mit den definierten Bedingungen korreliert, ggf. halbquantitativ oder quantitativ.

Hierunter fällt auch die Verwendung eines erfindungs- gemäßen morphometrischen Gewebe-oder Zellpräparats in einem Verfahren zur Findung von Wirkstoffen, wobei der Wirkstoff in Stufe a) eingesetzt wird, wobei anschließend an Stufe b) eine Aufnahme der Zellen oder des Gewebes mittels beispielsweise eines Lichtmikroskops durchgeführt wird, wobei die erhaltene Aufnahme vorzugsweise mittels eines Bilderkennungssystems ausgewertet wird, wobei das Ergebnis der Auswertung dem Wirkstoff zugeordnet wird und wobei ggf. das Verfahren für verschiedene Wirkstoffe wiederholt wird und die erhaltenen Ergebnisse der Auswertung für verschiedene Wirkstoffe miteinander verglichen werden. Man erhält letztendlich eine quantitative, zumindest jedoch halbquantitative Aussage bezüglich des morphogenetischen Effekts, der von den untersuchten Wirkstoffen hervorgerufen wird. Die Zellen können beispielsweise Ganglienzellen, insbesondere dorsale

Hinterwurzelganglien, sein, wobei die Auswertung dann z. B. die Erfassung neugebildeter Neuriten umfaßt. Die Zellen können auch Tumorzellen sein, wobei die Auswertung dann z. B. die Erfassung ausgewanderter Zellen umfaßt.

Im folgenden wird die Erfindung anhand eines nicht limitierenden Beispiels näher erläutert.

Beispiel 1 Es wurde eine Explantatkultur aus dorsalen Hinterwurzelganglien der früh postnatalen Ratte angelegt in einem ausgeprägt dreidimensionalen Collagengel (Maße : Durchmesser 13 mm, Höhe 8 mm). Die Kultivierung erfolgte dann für mehrere Stunden in einem Kulturmedium enthaltend Nervenwachstumsfaktor. Die Kultivierung wurde durch Absaugung des Kulturmediums von dem Gel und durch den folgenden Färbe-und Fixierungsschritt beendet.

Beispiel 2 Das in Beispiel 1 erhaltene Gel wurde dann mit einer filtrierten Fixier-und Färbelösung behandelt. Diese ent- hielt : 2,42 g Kristallviolett, 162 ml Ethanol (100% ig), 323 ml destilliertes Wasser, 16 ml Formaldehyd (35% ig, Rest Wasser), und 0,8 g NaCl. Die Behandlung erfolgte für 5 min. bei 20 °C. Dann wurde mit Wasser gewaschen.

Das gewaschene Gel wurde dann auf einem Lichtmikroskop (Zeiss Axiovert, Hellfeld, Vergrößerung des Objektivs 10x) plaziert und eine Detailaufnahme, wie in Figur 1 gezeigt, angefertigt. In der Figur 1 unten ist der Rand des Explantatkerns erkennbar. Weiterhin erkennt man die daraus aufgrund der Kultivierung mit Nervenwachstumfaktor ausgewachsenen Neuriten. Es fällt auf, daß eine extrem kontrastreiche Abbildung erhalten wird, die einfach und sicher quantitativ auswertbar ist.