Campo de la técnica

La presente invención se refiere a un sistema para la administración de principios activos que comprende nanocápsulas a base de protamina de tamaño nanométrico, así como a las composiciones farmacéuticas que comprenden los mismos y procedimientos para su elaboración.

Antecedentes de la invención

La incorporación de ingredientes activos en sistemas de tamaño nanométrico ha ayudado a solventar las limitaciones de formulación que presentan estas moléculas, incrementando adicionalmente su potencial en terapéutica. Mejoras en la solubilidad, protección frente a la degradación o mayor penetración de los ingredientes activos son algunas de las ventajas que ofrecen la nanoencapsulacion de moléculas activas o la adsorción de estas mismas en la cubierta polimérica. Asimismo, es también conocido que la capacidad de estos sistemas para atravesar las barreras externas y acceder al interior del organismo depende tanto de su tamaño como de su composición. Partículas de pequeño tamaño aumentarán el grado de transporte respecto a las de un mayor tamaño: los nanosistemas, de diámetro inferior a 1 pm, responden a este criterio.

Además, es posible recubrir estas nanocápsulas con materiales poliméricos. Así un posible material polimérico es la protamina, la cual pertenece a una familia de polipéptidos naturales, ricos en arginina que se sintetizan en la última etapa de espermátida de muchos animales y plantas, en el proceso de la espermatogénesis. Si bien su estudio comienza en los año 1868 por Friedrich Miescher, muchos son los trabajos que se han realizados para caracterizar a este conjunto de péptidos alifáticos, fuertemente básicos, de peso molecular aproximado entre los 4000 - 10000 Da.

La Protamina ha sido aprobada como excipiente farmacéutico y su principal aplicación hoy en día, se encuentra en la formulación de liberación sostenida de insulina: NPH (del ingles: Neutral Protamine Hagedorn), aparte de tener registro sanitario como principio activo por ser el antídoto para intoxicaciones por heparina. Muchos y diversos son los estudios en los que se han utilizado este excipiente principalmente en combinación con liposomas para la liberación de DNA al interior de las células (Gene Ther. 1997. 4, 961-968), conjugadas con algún oligonucleótido; nanopartículas llamadas proticles (Nucleic Acids Res. 2000. 15;28(10):E45.), para la liberación de péptido intestinal vasoactivo (J Control Reléase. 2008. 10; 130(2): 192-8), aprovechando su supuesta actividad antimicrobiana (J Antimicrob Chemother. 2008 Mar;61 (3):651 -7), entre otras.

En los estudios mencionados anteriormente, por su actividad intrínseca, la protamina ha sido ampliamente utilizada e investigada para formar complejos con material genético mediante interacciones electrostáticas entre su elevada carga positiva, dada por los grupos argininas que interaccionan con los grupos aniónicos de los ácidos nucleicos; por ende es capar de unir y precipitar el DNA dentro de las estructuras que sirven como vehículos en su administración.

También se ha demostrado la actividad adyuvante de este polipéptido, incrementando la secreción de interleukina 2 e interferón gama, así como la proliferación de células T (J Control Reléase. 2008; 10; 130(2): 161 -7).

No obstante se hace imposible su utilización en la formulación de nanocápsulas de protamina conteniendo un núcleo oleoso, ya que este polipéptido desestabiliza las emulsiones aceite/agua. Teniendo esto en consideración se hace necesario diseñar nuevos sistemas nanocapsulares que no sean desestabilizados por la protamina y se beneficien de sus propiedades.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Los autores de la presente invención han desarrollado un sistema nanocapsular que incorpora protamina y no se desestabiliza por su presencia. Este sistema nanocapsular es estable, fácil de obtener y además permite asociar eficazmente ingredientes activos de diferente naturaleza, tanto hidrofílicos como lipofílicos. El tamaño reducido de dichas nanocápsulas (diámetro inferior a 1 pm) y la carga superficial positiva de protamina, permite la interacción con superficies biológicas del organismo cargadas negativamente, como lo son las mucosas, y posibilita su paso a través de estas y que sean internalizadas por las células. Asimismo, la presencia de una cubierta polimérica le confiere mayor estabilidad a las nanocápsulas y le proporciona características beneficiosas propias de la protamina.

Por lo tanto, un primer aspecto de la presente invención se refiere a un sistema nanocapsular (de aquí en adelante "sistema nanocapsular de la invención") adecuado para la administración de principios activos, donde las nanocápsulas del sistema comprenden:

a. Una capa superficial constituida por el polipéptido protamina ó que comprende el polipéptido protamina;

b. Un núcleo oleoso;

c. Un tensoactivo caracterizado por tener una relación hidrofílica-lipofílica (balance hidrófilico-lipofílico (HLB)) superior a 8; y

d. opcionalmente al menos un principio activo,

con la condición de que el tensoactivo no es un fosfolípido.

Ejemplos de tensoactivos adecuados para poner en práctica la presente invención son: monooleato de sorbitán poli oxietilénico (Tween 80®), monoláurato de sorbitan poli oxietilénico (Tween 20®), monoestearato de polioxietilensorbitano (Tween 61®), monooleato de polioxietilensorbitano (Tween 81®), triestearato de polioxietilensorbitano (Tween 65®), trioleato de polioxietilensorbitano (Tween 85®), monolaurato de polioxietilensorbitano (Tween 21®), monoestearato de polietilenglicol, estearato de polietilenglicol, dilaurato de polietilenglicol, monopalmitato de polietilenglicol, polietilenglicol estearato, Poloxamer 124, Poloxamer 188, Poloxamer 237, Poloxamer 338, Poloxamer 407, Solutol HS15 ®, TPGS, oleato de trietanolamonio, oleato sódico, colato de sodio, deoxicolato de sodio, lauril sulfato sódico, oleato de irietanolamina, goma tragacanto y dodecilsulfato sódico ó cualquier combinación de los tensoactivos citados. Preferentemente el tensoactivo se selecciona de la lista que consiste en colato de sodio, polietilenglicol estearato, Solutol HS15 ®, TPGS, monooleato de sorbitán poli oxietilénico (Tween 80®) y monoláurato de sorbitan poli oxietilénico (Tween 20®) ó cualquier combinación de estos tensoactivos.

Ejemplos de componentes del núcleo oleoso adecuados para poner en práctica la presente invención son: aceite de cacahuete, algodón, oliva, ricino, soja, cártamo, palma, α tocoferol (vitamina E), miristato de isopropilo, escualeno, Miglyol®, Labrafil®, Labrafac®, Peceol® y Maisine® o cualquier combinación de estos aceites. Preferentemente el núcleo lipófilo oleoso se selecciona de la lista que consiste en Miglyol® (como por ejemplo Miglyol 812), escualeno ó α tocoferol ó cualquiera de sus combinaciones.

En una realización particular del primer aspecto de la invención, el sistema nanocapsular de la invención comprende:

a. Una capa superficial constituida por el polipéptido protamina ó que comprende el polipéptido protamina;

b. Un núcleo oleoso seleccionado de la lista que consiste en Miglyol®, escualeno ó α tocoferol o cualquiera de sus combinaciones;

c. Un tensoactivo caracterizado por tener una relación hidrofílica-lipofílica (balance hidrófilico-lipofílico (HLB)) superior a 8, seleccionado de la lista que consiste en colato de sodio, polietilenglicol estearato, Solutol HS15 ®, TPGS, monooleato de sorbitán poli oxietilénico (Tween 80®) y monoláurato de sorbitan poli oxietilénico (Tween 20®) ó cualquiera de sus combinaciones; y

d. opcionalmente al menos un principio activo.

En otra realización del primer aspecto de presente invención el sistema nanocapsular de la invención se caracteriza por estar liofilizado.

Un segundo aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para obtener el sistema nanocapsular de la invención (de aquí en adelante "procedimiento de obtención de la invención"). Así, para lograr la formación de nanocápsulas en un rango de tamaños deseado, se procede a la formación de los núcleos oleosos que comprenden un aceite y uno o más tensoactivos, en cuya superficie se une el polímero de recubrimiento a través de diferentes tipos de interacción. Se trata, por tanto, de un proceso de difusión de solventes, que ocurre de manera controlada y proporciona estabilidad al sistema, sin que exista la necesidad de crear enlaces covalentes entre los componentes.

Por tanto, en una realización preferida del segundo aspecto de la invención, el procedimiento de obtención de la invención es un procedimiento de difusión de disolvente en una etapa que comprende los siguientes pasos:

a. preparar una disolución acuosa que comprende protamina; b. preparar una disolución orgánica que comprende los componentes del núcleo oleoso y uno o más tensoactivos caracterizados por tener una relación hidrofílica-lipofílica superior a 8;

c. mezclar bajo agitación las disoluciones preparadas en las etapas a) y b) para obtener las nanocápsulas; y

d. opcionalmente, evaporar total o parcialmente los disolventes orgánicos de la mezcla obtenida en la etapa anterior hasta volumen constante,

con la condición de que el tensoactivo no es un fosfolípido.

En otra realización preferida del segundo aspecto de la invención, el procedimiento de obtención de la invención es un procedimiento de difusión de disolvente en dos etapas que comprende los siguientes pasos:

a. preparar una disolución orgánica que comprende los componentes del núcleo oleoso y uno o más tensoactivos caracterizados por tener una relación hidrofílica-lipofílica superior a 8;

b. añadir la disolución obtenida en la etapa a) sobre una fase acuosa que opcionalmente contiene un tensoactivo soluble en agua y que está bajo agitación para formar una nanoemulsión;

c. opcionalmente, evaporar total o parcialmente los disolventes orgánicos hasta volumen constante; y

d. recubrir la nanoemulsión obtenida en la etapa anterior mediante un proceso de incubación con una disolución acuosa que comprenda protamina, con la condición de que el tensoactivo no es un fosfolípido.

En el supuesto que el sistema nanocapsular de la invención comprendiese un principio activo el procedimiento de la invención incluiría la adición de éste a la disolución orgánica si éste tiene carácter lipófílo ó a la disolución acuosa si éste tiene carácter hidrófilo. Los principios activos se seleccionan preferentemente de la lista que consiste en docetaxel, antígenos recombinante de la hepatitis B (rHBsAg), antígenos de la influenza H1 N1 , ácidos nucleicos, compuestos sacarídicos, péptidos, proteínas o cualquier combinación de los mismos.

Un tercer aspecto de la presente invención, se refiere al sistema nanocapsular de la invención para su uso en terapia. En una realización preferida del tercer aspecto de la invención, el sistema nanocapsular de la invención comprende como principio activo docetaxel y se usa para el tratamiento del cáncer, preferentemente del cáncer de pulmón o páncreas. En otra realización preferida del tercer aspecto de la invención, el sistema nanocapsular de la invención comprende como principio activo el antígeno recombinante de la hepatitis B (rHBsAg) y se usa para el tratamiento o prevención de la hepatitis B. En aún otra realización preferida del tercer aspecto de la invención, el sistema nanocapsular de la invención comprende como principio activo el antígeno recombinante de la influenza H1 N1 (Hl) y se usa para el tratamiento o prevención de la influenza del tipo H1 N1 . Un cuarto aspecto de la invención, se refiere a una composición farmacéutica que comprende el sistema nanocapsular de la invención y opcionalmente uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1 : Viabilidad de la línea celular de cáncer A549 tras 24 y 48 horas de contacto con nanocápsulas de protamina cargadas con DCX, nanocápsulas blancas de protamina, disolución de DCX en etanol y etanol.

Figura 2: Viabilidad de la línea celular de cáncer H460 tras 24 y 48 horas de contacto con nanocápsulas de protamina cargadas con DCX, nanocápsulas blancas de protamina, disolución de DCX en etanol y etanol.

Figura 3: Viabilidad de la línea celular de cáncer MiaPaCa 2 tras 24 y 48 horas de contacto con nanocápsulas de protamina cargadas con DCX, nanocápsulas blancas de protamina, disolución de DCX en etanol y etanol.

Figura 4: Viabilidad de la línea celular de cáncer BxPC3 tras 24 y 48 horas de contacto con nanocápsulas de protamina cargadas con DCX, nanocápsulas blancas de protamina, disolución de DCX en etanol y etanol.

Figura 5: Niveles de anticuerpo IgG en sangre de ratón tras la administración de nanocápsulas de protamina con aceite escualeno (SQL) y α tocoferol (TCPH) cargadas con el antígeno de la hepatitis B (10 g) por vía nasal (in) (3 dosis), intramuscular (im) (2 dosis), y un calendario combinado (im, in) (1 dosis intramuscular y 2 nasal); comparados con el antígeno adsorbido en hidróxido de aluminio administrado por vía intramuscular (2 dosis). Figura 6: Niveles de absorbancia producido por los anticuerpos IgG en sangre de ratón tras la administración de nanocápsulas de protamina con núcleo de α tocoferol (TCPH) cargadas con el antígeno de la influenzaen dosis de 2 y 7,5 g, por vía subcutánea.

Figura 7: Wesern blot del antígeno recombinante de la hepatitis B adsorbido en las nanocápsulas de protamina tras el proceso de liofilización. Figura 8: Viabilidad de la línea celular de macrófagos RAW 264,7 tras 24 y 48 horas de contacto con nanocápsulas de protamina y núcleo de escualeno (SQL) o α tocoferol (TCPH).

Figura 9: Imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM) de nanocápsulas de protamina preparadas con la combinación de tensoactivos PEG estearato/colato de sodio y aceite Miglyol®.

Figura 10: Imágenes de microscopía confocal de nanocápsulas de protamina preparadas con el tensoactivo PEG estearato/colato de sodio y aceite α tocoferol. Como molécula activa están cargadas con el antígeno de la influenza (H1 N1 ).

Figura 11 : Activación del complemento inducido por las nanocápsulas de protamina, analizado a través de Western blot. Diferentes concentraciones de nanocápsulas de protamina con α tocoferol (izquierda) o escualeno (derecha) fueron estudiadas. El control negativo fue PBS (C-) y el control positivo fue veneno de cobra (C+).

Figura 12: Efecto de las nanocápsulas de protamina con un núcleo oleoso de α tocoferol en la viabilidad de RAW 264.7, determinado por xCELLingence. Diferentes concentraciones de nanocápsulas de protamina (25 en gris, 50 en línea discontinua y 100 en negro, pg/ml) fueron incubadas. Los valores representan el índice de células normalizadas respecto al control (células incubadas sólo con medio).

Figura 13: Caracterización fisicoquímica de nanocápsulas de protamina cargadas con rHBsAg liofilizadas y resuspendidas; conservadas a temperatura ambiente. Figura 14: Análisis de Western blot del antígeno (rHBsAg) asociado a las nanocápsulas liofilizadas y conservadas a temperatura ambiente por un año. Figura 15: Análisis de la asociación de pDNA a las nanocápsulas de protamina mediante electroforesis en gel de agarosa. Carriles: 1 : marcador de peso molecular; 2: pDNA control; 3: nanocápsulas de protamina + pDNA; 4: heparina + pDNA control; 5: nanocápsulas de protamina + pDNA. Las muestras fueron incubadas con un exceso de heparina para permitir el desplazamiento del pDNA desde la formulación (2h, 37°C). 1 g de pDNA por carril. Resultados similares se obtuvieron para el siRNA.

Figura 16: Imagen de microscopía de fluorescencia las 48 horas post-transfección del pEGFPF asociado a las nanocápsulas de protamina. 1 g pEGFPF por pocilio (placas de 24 pocilios), 4h de incubación. Imágenes obtenidas 48 horas post-transfección.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención se dirige al diseño y desarrollo de sistemas de nanocápsulas para la administración de principios activos, en donde las nanocápsulas del sistema tienen un diámetro medio inferior a 1 μι y se caracterizan por comprender (a) una cubierta de protamina (b) un núcleo oleoso y uno o más tensoactivos caracterizados por tener una relación hidrofílica-lipofílica superior a 8, con la condición de que dicho tensoactivo no es un fosfolípido.

Resulta conocido que la protamina desestabiliza las emulsiones aceite/agua. De hecho, ni siquiera la utilización de tensoactivos tales como lipoproteínas u otros que posean estructura fosfolipídica, como lecitina, fosfatidilglicerol, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, difosfatidilglicerol, ácido fosfatídico, fosfatidilcolina y fosfatidiletanolamina son capaces de lograr estabilizar dichas emulsiones aceite/agua en las que la protamina está presente. Este hecho se confirma en el ejemplo 1 de la presente invención donde los autores han intentado la formación de sistemas de nanocápsulas con un diámetro medio inferior a 1 pm caracterizadas por comprender (a) una cubierta de protamina y (b) un núcleo oleoso utilizando como tensoactivos fosfolípidos como la lecitina, lecitinas modificadas o la lisofosfatidilcolina sin éxito. Por lo tanto se hace imposible la utilización de la protamina en este tipo de formulaciones. Por ello y con el objeto de solventar este problema los autores de la presente invención han diseñado nuevos sistemas nanocapsulares que no sean desestabilizados por la protamina y se beneficien de sus propiedades. En este sentido, los autores de la presente invención han descubierto como a través de la utilización de ciertos tipos de tensoactivos caracterizados por tener una relación hidrofílica-lipofílica (balance hidrófilico-lipofílico (HLB)) superior a 8, preferentemente superior a 12, se puede observar la obtención de sistemas nanocápsulares de protamina caracterizadas por comprender (a) una cubierta de protamina y (b) un núcleo oleoso. Así, en los ejemplos 2.1 a 2.18 se ¡lustra como con diferentes surfactantes, núcleos oleosos y métodos de preparación se pueden obtener este tipo de sistemas, siempre y cuando los tensoactivos utilizados estén caracterizados por tener un HLB > 8 y no sean fosfolípidos. Asimismo, estos ejemplos demuestran la versatilidad del sistema respecto a sus características fisicoquímicas.

Por lo tanto, un primer aspecto de la presente invención se refiere a un sistema nanocapsular ("sistema nanocápsular de la invención) adecuado para la administración de principios activos, que comprende:

a. Una capa superficial constituida por el polipéptido protamina ó que comprende el polipéptido protamina;

b. Un núcleo oleoso;

c. Un tensoactivo caracterizado por tener una relación hidrofílica-lipofílica (balance hidrófilico-lipofílico (HLB)) superior a 8; y

d. opcionalmente al menos un principio activo, con la condición de que el tensoactivo no es un fosfolípido.

La ventaja de este sistema concreto de nanocápsulas con respecto a otros sistemas conocidos ya sean nanocápsulares o de nanoemulsiones es la presencia del polipéptido protamina en la cubierta. Este polipéptido brinda, entre otras propiedades, estabilidad a la nanocápsula así como protección, capacidad de penetración y especificidad en su interacción con determinadas células diana. La presencia de protamina en la superficie de las nanocápsulas además brinda una mayor respuesta por parte de las células inmunes por tener una comprobada actividad adyuvante. La protamina es un compuesto natural, lo que presenta ventajas frente a otros polímeros con alto contenido de argininas como por ejemplo la poliarginina que es una molécula sintética. De este modo, la presencia de protamina permite que las nanocápsulas de la invención sean un vehículo seguro capaz de metabolizarse y excretarse rápidamente evitando así llegar a concentraciones tóxicas y acumulación en el organismo. Además, para las nanocápsulas de la invención con cubierta de protamina no es necesario un crioprotector para la liofilización ni elevadas diluciones para evitar agregaciones indeseadas.

Adicionalmente, se hace notar que en el contexto de la presente invención el término protamina incluye las sales solubles en agua de protamina así como derivados hidrosolubles de protamina.

Además, en comparación con otros sistemas como los liposomas o las nanopartículas, que generalmente se ven condicionadas a una limitada carga de fármaco, las nanocápsulas de la presente invención poseen una mayor posibilidad de carga, en particular de fármacos lipofílicos, debido a la presencia del núcleo oleoso. Otra de las grandes ventajas de las nanocápsulas de la presente invención es la capacidad de combinar fármacos de diferente naturaleza, pudiendo estar un fármaco lipofílico encapsulado en el núcleo y un fármaco hidrofílico asociado a la cubierta; asimismo, la cubierta les brinda estabilidad, protección y especificidad.

Estos sistemas presentan además ventajas respecto a otros de mayor tamaño (micropartículas, pellets, films, esponjas... ) en cuanto a sus aplicaciones biológicas. De hecho, se sabe que la interacción de un sistema de liberación de fármacos con una superficie biológica está altamente condicionada por su tamaño. Así, las nanocápsulas son capaces de atravesar mucosas y de ser internalizadas por las células actuando como sistemas de transporte de fármacos, mientras que las micropartículas no tienen esa capacidad. Igualmente, la biodistribución de estos sistemas está altamente condicionada por el tamaño. El conocimiento generado en los últimos años en el mundo de la nanomedicina y los nanosistemas de liberación de fármacos ha permitido fijar una frontera claramente definida entre los sistemas nanométricos (que poseen un tamaño inferior a una miera ej. nanopartículas y nanocápsulas) y los sistemas micrométricos (micropartículas y microcápsulas). Además de las diferencias de comportamiento en cuanto a su capacidad para ser internalizados por las células y superar complejas barreras biológicas, en el caso de las formulaciones destinadas a la administración intravenosa de fármacos antitumorales es imprescindible el tamaño nanométrico de los sistemas de liberación a fin de prevenir la obstrucción de los capilares sanguíneos. Asimismo, se sabe que las posibilidades de los nanosistemas para alcanzar el tejido tumoral están estrictamente relacionadas con su tamaño y también por el carácter hidrofílico de su superficie. Asimismo, es importante destacar la diferencia entre los sistemas de nanocápsulas y los "complejos". Se entiende por "complejos" la nanoestructura formada por la interacción de polielectrolitos o bien por polielectrolitos y tensoactivos de carga opuesta. Los sistemas de nanocápsulas de la presente invención se diferencian de los complejos por tratarse de un sistema transportador nanocapsular, tipo reservorio, en cuyo núcleo se pueden alojar un importante número de moléculas que tengan una mayor o menor afinidad por el núcleo oleoso (encapsulación) y en cuya cubierta pueden incorporarse moléculas hidrofílicas que tengan una cierta afinidad por la misma (adsorción). Estas características permiten mantener la integridad y funcionalidad de la nanoestructura, así como aportar mayor estabilidad en presencia de fluidos biológicos.

Así, el sistema nanocapsular de la invención presenta ventajas en comparación con otros sistemas de administración y/o liberación de fármacos, debido a su comportamiento singular en cuanto a: - la encapsulación/asociación de principios activos: el sistema puede incluir uno o más principios activos o sustancias adyuvantes, hidrofílicos o lipofílicos, en proporciones superiores a la de las nanopartículas, micelas, complejos, nanogeles. la liberación del principio activo: la cubierta ejerce una función en la velocidad de liberación del mismo, permitiendo liberar de forma controlada el principio activo según aplicación y necesidades. la estabilidad en fluidos biológicos: la cubierta polimérica confiere a los núcleos oleosos una gran estabilidad, lo que representa una ventaja frente a otros sistemas de micro y nanoemulsiones. la interacción específica con determinados superficies biológicas: la cubierta polimérica confiere a los núcleos oleosos la posibilidad de interaccionar con superficies mucosas así como con epitelios y células específicas. la rápida metabolización y excreción de la protamina, confiere a este sistema un perfil de segundad farmacocinético, no pudiéndose demostrar el mismo perfil para otros sistemas nanocapsulares con otra tipo de cubierta, como el de poliarginina. - la estabilidad durante la liofilización, no es necesario en las nanocápsulas de la invención crioprotectores para ese proceso, ni elevadas diluciones para evitar agregaciones indeseadas. Las nanocápsulas del sistema de la presente invención presentan un diámetro medio inferior a 1 pm, respondiendo por tanto a la definición de nanosistema, sistema coloidal constituido a base de polímeros con un tamaño inferior a 1 pm, es decir, tienen un tamaño de entre 1 y 999 nm, preferiblemente de entre 30 y 500 nm. Se entiende por diámetro medio aquel medido mediante la técnica Dynamic Light Scattering (DLS) que está definido por el diámetro hidrodinámico de una esfera que difunde a la misma velocidad que las partículas que se están midiendo. El tamaño de las nanocápsulas está influido principalmente por la composición y las condiciones de formación y puede medirse utilizando procedimientos estándar conocidos por el experto en la técnica y que se describen en el apartado de ejemplos. En este sentido, tal y como se puede comprobar el tamaño de las mismas no varía notoriamente al modificar la relación de compuesto de cubierta en la formulación, obteniéndose en todos los casos sistemas de tamaño nanométrico.

Los sistemas de nanocápsulas aquí descritos presentan una estabilidad adecuada tanto en suspensión como bajo forma de liofilizado. Por otra parte, los estudios de estabilidad parecen indicar que tras su administración a organismos, humano o animal, no sufren un proceso rápido de agregación o destrucción, sino que previsiblemente permanecen bajo forma nanocapsular hasta alcanzar el tejido o célula diana.

Por otro lado, como ya se ha comentado, el sistema nanocapsular de la presente invención comprende al menos un tensoactivo. En la presente invención, el término "tensoactivo" alude a un componente que posee estructuras y/o grupos funcionales que les permiten interaccionar simultáneamente con la parte lipófila e hidrófila de la formulación. Para preparar el sistema nanocapsular de la invención resulta necesario tener en consideración el HLB del tensoactivo a utilizar. El concepto HLB se basa en un método experimental que consiste en atribuir un cierto número HLB a los agentes emulsionantes a partir de datos relativos a la estabilidad de una emulsión. Este número HLB representa implícitamente varios parámetros y da cuenta del balance hidrofílico- lipofílico del sistema. El método para calcular el HLB como se define en la presente invención se basa en los grupos funcionales de la molécula estudiada, teniendo en cuenta la fuerza de los grupos hidrofílicos, se calcula de la siguiente manera: H.L3 = 7 + m * Hh - n * Hl

Donde m es el número de grupos hidrofilicos, H/7 el valor de los grupos hidrofilicos, n el número de grupos lipofilicos y H/ su valor (Davies, J. T. (1957) "A quantitative kinetic theory of emulsión type. I. Physical chemistry of the emulsifying agent. Gas/Liquid and Liquid/Liquid Interfaces". Proceedings of 2nd International Congress Surface Activity, Butterworths, London, pp. 426-38).

Ejemplos de tensoactivos adecuados para llevar a cabo la presente invención se seleccionan de entre ésteres de sorbitan etoxilados y ésteres de ácidos grasos. En una realización particular, los ésteres de sorbitán se seleccionan de entre monooleato de sorbitán poli oxietilénico (Tween 80®), monoláurato de sorbitan poli oxietilénico (Tween 20®), monoestearato de polioxietilensorbitano (Tween 61 ®), monooleato de polioxietilensorbitano (Tween 81 ®), triestearato de polioxietilensorbitano (Tween 65®), trioleato de polioxietilensorbitano (Tween 85®) y monolaurato de polioxietilensorbitano (Tween 21 ®). En otra realización particular, los ésteres de ácidos grasos se seleccionan de entre monoestearato de polietilenglicol, estearato de polietilenglicol, dilaurato de polietilenglicol, monopalmitato de polietilenglicol, polietilenglicol estearato, Poloxamer 124, Poloxamer 188, Poloxamer 237, Poloxamer 338, Poloxamer 407, Solutol HS15 ® (polietilenglicol-15-hidroxiesterato, cuya denominación en inglés sería "polyethylene glycol-15-hydroxystearate"), TPGS (succinato de D-alfa-tocoferol polietilenglicol 1000, cuya denominación en inglés sería "D-a-tocopherol polyethylene glycol 1000 succinate"). En otra realización particular, el tensoactivo se selecciona de entre el grupo constituido por oleato de trietanolamonio, oleato sódico, colato de sodio, deoxicolato de sodio, lauril sulfato sódico, oleato de irietanolamina, goma tragacanto y dodecilsulfato sódico. En aún otra realización particular el tensoactivo es colato de sodio, estearato de polietilenglicol, TPGS, Solutol HS15 ®, Tween 20, Tween 80 o combinaciones de los mismos. Los Poloxameros ("Poloxamer" en inglés) se pueden definir como copolímeros de bloque sintético de óxido de etileno y óxido de propileno (polioxietileno- polioxipropileno), representado por la siguiente fórmula general: Tipo de Unidades Unidades Contenido Masa

poloxamero de óxido de óxido en molecular

de de oxietileno media

etileno propileno (porcentaje)

(a) (b)

124 19 - 15 1S - 23 44.8 - 48.6 2090■ 2360

188 75 - 85 25 - 30 7§,9 - 83.7 7680 - 9510

237 60 - 6 35 - 40 70.5 - 74,3 6840 - 8830

338 137 - 146 42 - 47 81.4 - 84.9 22 700 - 17 400

407 95 - IOS 54 - 60 71.5 - 74.9 §840 - 14 600

Opcionalmente, se puede añadir un antioxidante apropiado.

{European Pharmacopoeia 5.0, páginas 2264-2265). Otros ejemplos de tensoactivos adecuados para llevar a cabo la presente invención se seleccionan de entre los tensoactivos de tipo no iónico de grado farmacéutico. Preferiblemente, los tensoactivos de tipo no iónico de grado farmacéutico adecuados para llevar a cabo la presente invención se seleccionan de entre el grupo que consiste en derivados hidroxílicos de cadena larga de 8 a 18 átomos de carbono (alcoholes grasos), ácidos carboxílicos etoxilados, amidas etoxiladas, glicéridos etoxilados, ésteres de glicol y derivados, monoglicéridos, poligliceril ésteres, ésteres y éteres de polialcoholes, ésteres de sorbitán/sorbitol, triésteres del ácido fosfórico, derivados etoxilados de los alcoholes grasos y éteres de polietilenglicol. Adicionalmente, el sistema nanocapsular de la presente invención se caracteriza por tener un núcleo oleoso constituido, entre otros componentes, a base de aceites volátiles o no volátiles. En el contexto de la presente invención se entiende por núcleo oleoso el que constituye la estructura interna de las nanocápsulas de la invención y está compuesto por al menos un aceite y al menos un tensoactivo como se ha descrito anteriormente. Estos aceites se pueden seleccionar entre aceites naturales, semisintéticos y sintéticos de uso farmacéutico tales como aceites de origen animal, vegetal, aceites hidrocarbonados o aceites de silicona. Aceites adecuados para llevar a cabo la presente invención incluyen, pero no se limitan a, aceite mineral, aceite de escualeno, aceites de sabor, aceite de silicona, aceites esenciales, vitaminas insolubles en agua, isopropil estearato, butil estearato, octil palmitato, cetil palmitato, tridecil behenato, diisopropil adipato, dioctil sebacato, mentil antranilato, cetil octanoato, octil salicilato, isopropil miristato, cetoles de dicarpato de neopentilglicol, Cerafilos®, decil oleato, C12-C 15 alquil lactatos, cetil lactato, lauril lactato, isostearil neopentanoato, miristil lactato, isocetil estearoil estearato, octildodecil estearoil estearato, aceites de hidrocarburos, isoparafina, parafinas fluidas, isododecano, vaselina, aceite de argán, aceite de colza, aceite de chile, aceite de coco, aceite de maíz, aceite de algodón, aceite de lino, aceite de semilla de uva, aceite de mostaza, aceite de oliva, aceite de palma, aceite de palma fraccionado, aceite de cacahuete, aceite de ricino, aceite de semilla de pino, aceite de semilla de amapola, aceite de semilla de calabaza, aceite de salvado de arroz, cártamo, aceite de té, aceite de trufa, aceite vegetal, aceite de albaricoque, aceite de jojoba, aceite de macadamia, aceite de germen de trigo, aceite de almendra, aceite de soja, aceite de sésamo, aceite de avellana, aceite de girasol, aceite de cáñamo, aceite de bois, aceite de nuez de Kukui, aceite de aguacate, aceite de nuez, aceite de pescado, aceite de baya, aceite de pimienta de Jamaica, aceite de enebro, aceite de semilla, aceite de semilla de almendra, aceite de semilla de anís, aceite de semilla de apio, aceite de semilla de comino, aceite de semilla de nuez moscada, aceite de hoja de albahaca, aceite de hoja de laurel, aceite de hoja de canela, aceite de hoja de salvia común, aceite de hoja de eucalipto, aceite de hoja de limón, aceite de hoja de melaleuca, aceite de orégano, aceite de hoja de pachuli, aceite de hoja de menta, aceite de aguja de pino, aceite de hoja de romero, aceite de menta verde, aceite de hoja del árbol de té, aceite de hoja de tomillo, aceite de hoja de té de Canadá, aceite de flor, aceite de camomila, aceite de salvia romana, aceite de clavo, aceite de flor de geranio, aceite de flor de hisopo, aceite de flor de jazmín, aceite de flor de lavanda, aceite de flor de mauka, aceite de flor de mejorana, aceite de flor de naranja, aceite de flor de rosa, aceite de flor de ylang-ylang, aceite de corteza, aceite de corteza de casia, aceite de corteza de canela, aceite de corteza de sasafrás, aceite de madera, aceite de madera de alcanfor, aceite de madera de cedro, aceite de palo de rosa, aceite de sándalo, aceite de madera de jengibre, aceite de resina, aceite de reciño, aceite de mirra, aceite de piel, aceite de piel de Bérgamo, aceite de piel de pomelo, aceite de piel de limón, aceite de piel de lima, aceite de piel de naranja, aceite de piel de mandarina, aceite de raíz, aceite de valeriana, ácido oleico, ácido linoleico, oleil alcohol, alcohol de isostearilo, oleato de etilo, Miglyol® (mezcla de decanoil- y octanoilglicérido, cuya denominación en inglés sería "mixture of decanoyl- and octanoylglyceride"), Labrafil® (glicéridos de oleoil polioxil-6, cuya denominación en inglés sería "oleoyl polyoxyl-6 glycerides"), Labrafac® (propilenglicol dicaprilocaprate, cuya denominación en inglés sería "propylene glycol dicaprylocaprate"), Rylo® (mezcla de ácidos grasos), Peceol® (monooleato de glicerol) y Maisine® (monoolinoleato de glicerol), derivados sintéticos o semisintéticos de los mimos y combinaciones de los mismos. Preferentemente el aceite se selecciona de la lista que consiste en aceite de cacahuete, algodón, oliva, ricino, soja, cártamo, palma, α tocoferol (vitamina E), miristato de isopropilo, escualeno, Miglyol®, Labrafil®, Labrafac®, Peceol® y Maisine® o mezclas de los mismos. De forma más preferida los aceites son Miglyol® (como por ejemplo Miglyol 812 (triglicérido cáprico/caprílico, cuya denominación en inglés sería "caprylic / capric triglyceride")), escualeno o α tocoferol.

Otros aceites adecuados para llevar a cabo la presente invención se seleccionan de entre el grupo que comprende aceites de la familia de los terpenos formado por unidades de isopreno (2-metilbuta-l,3-dieno) y subdivididas según sus átomos de carbono: hemiterpenos (C5), monoterpenos (C10), sesquiterpenos (C15), diterpenos (C20), sesterterpenos(C25), triterpenos(C30), tetraterpenos (C40, carotenoides) y politerpenos. Vitamina A y escualano.

Tal como se ha definido anteriormente, las nanocápsulas de la invención también comprenden de manera opcional al menos un principio activo. El término "principio activo" se refiere a cualquier sustancia que se utiliza en el tratamiento, cura, prevención o diagnóstico de una enfermedad o que se utiliza para mejorar el bienestar físico y mental de seres humanos y animales. El principio activo podrá ser por ejemplo un fármaco, un antígeno, una vitamina, etc. Los sistemas de nanocápsulas objeto de la presente invención son adecuados para incorporar principios activos de naturaleza lipófila o hidrófila.

En una realización preferida, los ingredientes activos son antígenos de superficie recombinante de hepatitis B, antígeno de la influenza (H1 N1 ) y docetaxel.

La proporción de principio activo incorporado dependerá en cada caso del ingrediente activo que va a incorporarse, la indicación para la que se utiliza y la eficiencia de administración. Por otro lado, los procedimientos de obtención de los sistemas de nanocápsulas de la invención son métodos sencillos que evitan condiciones drásticas como altas temperaturas. Además, tampoco es necesario llevar a cabo ningún tipo de reacción química para la obtención de los mismos, ya que según se ha indicado anteriormente la obtención del sistema implica interacciones no covalentes. Por tanto, se preserva así la integridad de las moléculas incorporadas al sistema, susceptibles de ser degradadas. Para lograr la formación de nanocápsulas en un rango de tamaños deseado, se procede a la formación de los núcleos oleosos que comprenden un aceite y uno o más tensoactivos, en cuya superficie se une el polímero de recubrimiento a través de diferentes tipos de interacción. Se trata, por tanto, de un proceso de difusión de solventes, que ocurre de manera controlada y proporciona estabilidad al sistema, sin que exista la necesidad de crear enlaces covalentes entre los componentes.

Un procedimiento particular para la obtención de los sistemas de la invención (denominado en los ejemplos procedimiento de difusión de disolvente en una etapa), comprende: a) preparar una disolución acuosa que comprende protamina, y opcionalmente un tensoactivo soluble en agua; b) preparar una disolución orgánica que comprende un aceite y uno o más tensoactivos, caracterizados por tener una relación hidrofílica-lipofílica superior a 8, con la condición de que el tensoactivo no es un fosfolípido; c) mezclar bajo agitación las disoluciones preparadas en las etapas a) y b), obteniéndose espontáneamente las nanocápsulas; y d) opcionalmente, evaporar total o parcialmente los disolventes orgánicos de la mezcla obtenida en la etapa anterior hasta volumen constante.

Los sistemas de la presente invención se pueden preparar mediante un procedimiento alternativo (denominado en los ejemplos procedimiento de difusión de disolvente en dos etapas) que comprende recubrir una nanoemulsion con protamina mediante un proceso de incubación con una disolución acuosa del polímero. Asimismo, la formación de la nanoemulsion puede favorecerse mediante ultrasonidos (denominado en los ejemplos procedimiento de sonicación) u homogeneización (denominado en los ejemplos procedimiento de homogeneización). En una realización particular, el proceso de incubación comprende mezclar la nanoemulsion con una disolución acuosa del polímero de recubrimiento. Dicha nanoemulsion está constituida al menos por un aceite, uno o más tensoactivos, caracterizados por tener una relación hidrofílica-lipofílica superior a 8 y una fase acuosa. La fase acuosa puede contener otros agentes tensoactivos, sales, y otros agentes auxiliares.

Los procedimientos de preparación de dicha nanoemulsion son conocidos en el estado de la técnica, y pueden comprender un proceso de difusión, sonicación u homogeneización (Prego et al. J. Nanosci. Nanotechnol. (2006) 6: 1 ; Tadros et al. Adv. Colloid Interface Sci. (2004) 109:303).

Un procedimiento particular para la obtención de la nanoemulsion (denominado en los ejemplos procedimiento de difusión de disolvente) comprende: i) preparar una disolución orgánica que comprende un aceite, uno o más tensoactivos, caracterizados por tener una relación hidrofílica-lipofílica superior a 8, con la condición de que el tensoactivo no es un fosfolípido;

¡i) añadir la disolución obtenida en la etapa i) sobre una fase acuosa que opcionalmente contiene un tensoactivo soluble en agua y que está bajo agitación para formar una nanoemulsion; i¡¡) opcionalmente, evaporar total o parcialmente los disolventes orgánicos hasta volumen constante.

Otro procedimiento particular para la obtención de la nanoemulsion (denominado en los ejemplos procedimiento de sonicación) comprende: i) preparar una disolución orgánica que comprende un aceite, uno o más tensoactivos caracterizados por tener una relación hidrofílica-lipofílica superior a 8, con la condición de que el tensoactivo no es un fosfolípido; ¡i) añadir la disolución obtenida en la etapa i) sobre una fase acuosa que opcionalmente contiene un tensoactivo soluble en agua y sonicar; i¡¡) diluir con agua la emulsión obtenida en la fase ¡i); opcionalmente, evaporar total o parcialmente los disolventes orgán ^' hasta volumen constante.

Aún otro procedimiento particular para la obtención de la nanoemulsion (denominado en los ejemplos procedimiento de homogeneización) comprende: i) preparar una disolución orgánica que comprende un aceite, uno o más tensoactivos, caracterizados por tener una relación hidrofílica-lipofílica superior a 8, con la condición de que el tensoactivo no es un fosfolípido;

¡i) añadir la disolución obtenida en la etapa i) sobre una fase acuosa que opcionalmente contiene un tensoactivo soluble en agua y homogeneizar;

¡ii) diluir con agua la emulsión obtenida en la fase ¡i) y homogeneizar; iv) opcionalmente, evaporar total o parcialmente los disolventes orgánicos hasta volumen constante.

Según realizaciones particulares de los procedimientos anteriores, si el principio activo es lipofílico o anfifílico, dicho ingrediente activo se añade a la disolución orgánica de la etapa b) o de la etapa i). Según otras realizaciones particulares, si el ingrediente activo es hidrofílico, dicho ingrediente activo se añade a la disolución de la etapa a) o de la etapa ¡i). De manera preferida, dicho ingrediente activo hidrófilo se añade disuelto en una disolución acuosa. También es posible incorporar el ingrediente activo hidrófilo mediante adsorción a la suspensión de nanocápsulas obtenidas en la etapa d) o tras el proceso de incubación una vez formadas las nanocápsulas.

Otro procedimiento particular para la obtención de la nanoemulsion (denominado en los ejemplos variación del procedimiento de difusión de disolvente (por goteo)) comprende: i) preparar una disolución acuosa que comprende protamina, y opcionalmente un tensoactivo soluble en agua;

¡i) preparar una fase oleosa que comprende un aceite y uno o más tensoactivos, caracterizados por tener una relación hidrofílica-lipofílica superior a 8, con la condición de que el tensoactivo no es un fosfolípido;

¡ii) añadir la disolución obtenida en la etapa ¡i) o la disolución acuosa obtenida en la etapa i), en alícuotas a intervalos de tiempo determinados sobre la disolución acuosa obtenida en la etapa i), o sobre la disolución obtenida en la etapa ¡i) respectivamente; iv) opcionalmente, evaporar total o parcialmente los disolventes orgánicos hasta volumen constante. Según realizaciones particulares del procedimiento anterior, si el principio activo es lipofílico o anfifílico, dicho ingrediente activo se añade a la disolución orgánica de la etapa ¡i). Según otras realizaciones particulares, si el ingrediente activo es hidrofílico, dicho ingrediente activo se añade a la disolución de la etapa i). De manera preferida, dicho ingrediente activo hidrófilo se añade disuelto en una disolución acuosa. También es posible incorporar el ingrediente activo hidrófilo mediante adsorción a la suspensión de nanocápsulas o tras el proceso de incubación una vez formadas las nanocápsulas.

En el contexto de la presente invención se entiende por lipofílico a las moléculas, sustancias, principios activos, estructuras o parte de ellas que no son capaces de interaccionar por si sola con moléculas de agua y son principalmente disueltas en solventes apolares.

En el contexto de la presente invención se entiende por anfifílico a las moléculas, sustancias, principios activos, estructuras o parte de ellas que poseen tanto propiedades hidrofóbicas como hidrofílicas.

En el contexto de la presente invención se entiende por hidrofílico a las moléculas, sustancias, principios activos, estructuras o parte de ellas que son atraídas por el agua y son capaces de disolverse en ella o en solventes polares

La formación de las nanocápsulas se produce al mezclar volúmenes de las soluciones mencionadas que contienen la nanoemulsión con disoluciones acuosas del polímero de recubrimiento en diferentes proporciones, variando la relación de polímero de recubrimiento.

El disolvente de la disolución orgánica es preferentemente una mezcla de disolventes polares tales como etanol, isopropanol y acetona pudiendo incluir además disolventes no polares como por ejemplo el diclorometano. En esta fase orgánica se incorpora el aceite y el o los tensoactivos, caracterizados por tener una relación hidrofílica-lipofílica superior a 8. En una composición particular se incorpora igualmente el ingrediente activo.

Un ejemplo particular para la obtención de los sistemas de nanocápsulas de la invención que comprenden protamina siguiendo el primer procedimiento descrito anteriormente comprende: a) preparar una disolución acuosa de 20 mi al 0,05 % p/v de Protamina; b) preparar una fase oleosa compuesta por una disolución etanol/acetona un o ambos tensoactivos (Colato de Sodio y/o PEG estearato), a la que se le adiciona Miglyol® 812. c) mezclar bajo agitación las disoluciones resultantes de las etapas a) y b), obteniéndose espontáneamente las nanocápsulas; d) opcionalmente, evaporar los disolventes orgánicos de la mezcla obtenida en la etapa anterior hasta volumen constante.

El procedimiento de elaboración de los sistemas de nanocápsulas puede incluir una etapa adicional de liofilización, con el fin de preservarlos durante su almacenamiento para que conserven sus características iniciales. Debido a la naturaleza de la cubierta de las nanocápsulas de la presente invención, así como de las características de las mismas, no es necesario emplear crioprotectores durante la liofilización. Otra ventaja adicional, es que no es necesano diluir el sistema coloidal antes de la liofilización, ya que los sistemas nanocapsulares de la invención no forman agregados durante la reconstitución del liofilizado.

Alternativamente, es posible añadir uno o más azúcares que ejerzan efecto choprotector como por ejemplo trehalosa, glucosa, sucrosa, manitol, maltosa, polivinil pirrolidona (PVP). En forma liofilizada, las nanocápsulas pueden ser almacenadas durante largos períodos de tiempo, y ser fácilmente regeneradas, en caso necesano, simplemente añadiendo un volumen de agua óptimo. De acuerdo con esta etapa adicional, la presente invención se refiere también a los sistemas de nanocápsulas que comprenden una cubierta de protamina bajo forma de liofilizado.

Adicionalmente, la invención en una realización particular se refiere al sistema nanocápsular de la invención para su uso en terapia. Más concretamente, a una composición farmacéutica, que comprende los sistemas de nanocápsulas de la invención, y opcionalmente uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. En particular, la incorporación de principios activos en las nanocápsulas de la invención origina sistemas, cuyas características en cuanto a su composición, propiedades y morfología, les convierte en excelentes candidatos para el área de la terapéutica. El principio activo a incorporar en los sistemas de la invención será aquél con propiedades farmacoterapéuticas adecuadas de acuerdo con la aplicación terapéutica a la cual sea destinada la formulación. En una realización particular, el principio activo se selecciona entre péptidos, proteínas, compuestos lipidíeos o lipofílicos, compuestos sacarídicos, compuestos de ácidos nucleicos o nucleótidos como oligonucleótidos, polinucleótidos o bien combinaciones de las moléculas citadas.

En una realización preferida, el principio activo lipofílico es docetaxel.

En otra realización preferida, el principio activo es de naturaleza hidrofóbica, anfifílica o hidrofílica. Los principios activos de naturaleza hidrofóbica o anfifílica preferentemente son añadidos en la etapa b) del procedimiento de preparación de nanocápsulas de la invención. Los principios activos de naturaleza hidrofílica preferentemente son añadidos en la etapa a) del procedimiento o en una etapa posterior a la d) mediante un proceso de incubación. Sin embargo, la invención también contempla otras realizaciones como por ejemplo añadir en la etapa b) un principio activo hidrófilo disuelto en un pequeño volumen de fase acuosa. A diferencia de los principios activos hidrofóbicos, que son encapsulados dentro de las nanocápsulas, los principios activos de naturaleza hidrofílica se pueden asociar a la superficie de las mismas mediante adsorción. En una realización preferida, los principios activos hidrofílicos son el antígeno de superficie recombinante de hepatitis B y el antígeno de la influenza (H1 N1 ).

Dichas composiciones farmacéuticas pueden ser administradas por diferentes vías, tales como a través de mucosas, tópica o parenteral.

La proporción de principio activo incorporado en los sistemas puede llegar a ser de hasta aproximadamente el 50% en peso con respecto al peso total, base seca, de los componentes del sistema de nanocápsulas. Sin embargo, la proporción adecuada dependerá en cada caso del ingrediente activo que va a incorporarse, la indicación para la que se utiliza y la eficiencia de administración. En una realización particular, la proporción de principio activo lipofílico puede llegar a ser de hasta aproximadamente el 10% en peso, preferentemente hasta aproximadamente el 5%.

Tal como se ha descrito anteriormente, cabe la posibilidad de que los sistemas de nanocápsulas descritos en la presente invención incorporen más de un principio activo, que podrán estar disueltos en la misma disolución o por separado, dependiendo esto de la naturaleza de las moléculas a incorporar, evitando que exista ningún tipo de interacción, bien sea química o física, entre ellos. Tal como se ha definido anteriormente, la invención se refiere al uso de dicho sistema en la preparación de un medicamento. En una realización particular, dicho uso está relacionado con el uso de vacunas o el tratamiento del cáncer. En este sentido, en una realización preferida de la invención, el sistema nanocapsular de la invención comprende como principio activo docetaxel y se usa para el tratamiento del cáncer, preferentemente del cáncer de pulmón o páncreas. Alternativamente, la presente invención también se refiere al uso del sistema nanocapsular de la invención comprendiendo como principio activo docetaxel para la elaboración de un medicamento para el tratamiento del cáncer, preferentemente del cáncer de pulmón o páncreas.

En otra realización preferida de la invención, el sistema nanocapsular de la invención comprende como principio activo el antígeno recombinante de la hepatitis B (rHBsAg) y se usa para el tratamiento o prevención de la hepatitis B. Alternativamente, la presente invención también se refiere al uso del sistema nanocapsular de la invención comprendiendo como principio activo el antígeno recombinante de la hepatitis B (rHBsAg) para la elaboración de un medicamento para el tratamiento o prevención de la hepatitis B.

En aún otra realización preferida de la invención, el sistema nanocapsular de la invención comprende como principio activo el antígeno recombinante de la influenza H1 N1 (Hl) y se usa para el tratamiento o prevención de la influenza del tipo H1 N1 . Alternativamente, la presente invención también se refiere al uso del sistema nanocapsular de la invención comprendiendo como principio activo el antígeno recombinante de la influenza H1 N1 (Hl) para la elaboración de un medicamento para el tratamiento o prevención de la la influenza H1 N1 .

A continuación, para una mayor comprensión de las características y ventajas de la presente invención, se hará referencia a una serie de ejemplos que de forma explicativa completan la descripción antenor, sin suponer en modo alguno que ésta se vea limitada a los mismos.

Ejemplos

A continuación se indica el significado de las abreviaturas utilizadas a lo largo de los ejemplos.

1 . Pr: Protamina; la sal utilizada en los siguientes ejemplos fue sulfato de protamina (Yuki Gosei Kogyo Co, Ltd.). Se utilizo otra sal de protamina (SIGMA) sin encontrarse diferencias significativas para ninguno de los ejemplos.

2. PEG: estearato de polietilenglicol. Simulsol® M52 PEG-2000 (Seppic).

3. Nanoemulsión (NE): Este término se utiliza por simplicidad en los ejemplos para referirse a los nanosistemas comprendidos por un aceite y uno o más tensoactivos que posean un HLB superior a 8; de forma preferida el o los tensoactivos utilizados fueron: Colato de Sodio, PEG estearato, Solutol HS15 ®, TPGS, Tween 20® y Tween 80® o combinación de los mismos. La única diferencia con las nanocápsulas es la ausencia de protamina en el recubrimiento de la superficie de los sistemas.

4. Nanocápsulas (NCs) de Pr = Este término se utiliza por simplicidad en los ejemplos y las figuras para referirse a los nanosistemas cuyas nanocápsulas comprenden un aceite, uno o más tensoactivos que posean un HLB superior a 8; de forma preferida el o los tensoactivos utilizados fueron: Colato de Sodio, PEG estearato, Solutol HS15®, TPGS, Tween 20, Tween 80 o combinación de los mismos. Por último el recubrimiento de Pr.

5. DCX: Docetaxel.

6. rHBsAg: Antígeno recombinante de la hepatitis B.

7. Hl: Antígeno de la influenza H1 N1

8. Miglyol®: Miglyol 812

Ejemplo 1 :

Ejemplo 1 .1 . Se prepararon nanocápsulas de protamina constituidas por un núcleo oleoso de Miglyol® según el procedimiento de difusión de disolvente en una etapa: i) se preparó una disolución acuosa (10 mi) en la que se disuelve protamina a una concentración de 0,05 p/v.

¡i) se preparó una fase oleosa compuesta por una disolución etanol/acetona

(0,25:4,5 mi), 62,5 μΙ de Miglyol® y 15 mg de fosfolípidos (lecitina, lisofosfatidilcolina, lecitina hidroxilada Yelkin®, lecitina libre de aceites

Ultralec®).

i¡¡) se mezclaron bajo agitación magnética durante 10 minutos las disoluciones resultantes de las etapas i) y ¡i), obteniéndose espontáneamente las nanocápsulas.

iv) se evaporaron los disolventes orgánicos hasta volumen constante.

Una vez preparadas, se midió su diámetro medio, índice de polidispersión (Pl) así como su carga eléctrica superficial (potencial zeta). La tabla 1 muestra los valores obtenidos de los parámetros citados:

Tabla 1

Tamaño Potencial z

Formulación Fosfolípido Pl

(nm) (nm) NC Pr Lecitina Agregados

NC Pr Lisofosfatidilcolina Agregados

NC Pr Lecitina hidroxilada Agregados

Lecitina libre de Agregados

NC Pr

aceites

Ejemplo 1 .2. Se prepararon nanocápsulas de protamina constituidas por un núcleo oleoso de Miglyol® según el procedimiento de difusión de disolvente en dos etapas:

i) se preparó una fase oleosa compuesta por una disolución etanol/acetona (0,25:4,5 mi), 62,5 μΙ de Miglyol® y diferentes cantidades de fosfolípidos (lecitina o lisofosfatidilcolina).

¡i) se añade la disolución obtenida en la etapa i) sobre 10 mi de una solución acuosa bajo agitación magnética manteniéndose durante 10 minutos, de este modo se obtiene espontáneamente la nanoemulsión.

i¡¡) se evaporaron los disolventes orgánicos hasta volumen constante.

iv) se recubrió la nanoemulsión obtenida en la etapa i¡¡) mediante un proceso de incubación con una disolución acuosa (1 mi) compuesta por Pr a una concentración de 1 o 2 mg/ml, en una proporción 1 :1 y 1 :2 (mi nanoemulsión:mg de Pr), produciéndose de forma inmediata el recubrimiento, independientemente de la temperatura.

Una vez preparadas, se midió su diámetro medio, índice de polidispersión (Pl) así como su carga eléctrica superficial (potencial zeta). La tabla 2 muestra los valores obtenidos de los parámetros citados en función de la cantidad de fosfolípidos y distintas relaciones de protamina en la etapa iv).

Tabla 2

Cantidad Pr

de etapa Tamaño Potencial

Formulación Fosfolípido Pl

fosfolípido iv (nm) z (nm) (mg) (mg)

NC Pr 1 Agregados

lecitina 15

NC Pr 2 Agregados NC Pr 1 Agregados

30

NC Pr 2 Agregados

NC Pr 1 Agregados

lisofosfatidilcolina 15

NC Pr 2 Agregados

Ejemplo 1 .3. Se prepararon nanocápsulas de protamina constituidas por un núcleo oleoso de Miglyol® según el procedimiento de difusión de disolvente en una etapa: v) se preparó una disolución acuosa (10 mi) en la que se disuelve protamina a una concentración de 0,05 p/v.

vi) se preparó una fase oleosa compuesta por una disolución diclorometano/acetona (en relaciones del 0, 1 :4,5 mi al 0,25:4,5ml), 62,5 μΙ de Miglyol® y una cantidad de lecitina hidroxilada (Yelkin®) o libre de aceite (Ultralec®).

vii) se mezclaron bajo agitación magnética durante 10 minutos las disoluciones resultantes de las etapas i) y ¡i), obteniéndose espontáneamente las nanocápsulas.

viii) se evaporaron los disolventes orgánicos hasta volumen constante.

Una vez preparadas, se midió su diámetro medio, índice de polidispersión (Pl) así como su carga eléctrica superficial (potencial zeta). La tabla 1 muestra los valores obtenidos de los parámetros citados:

Tabla 1

Ejemplo 1 .4. Se prepararon nanocápsulas de protamina constituidas por un núcleo oleoso de Miglyol® según el procedimiento de difusión de disolvente en dos etapas: v) se preparó una fase oleosa compuesta por una disolución diclorometano/acetona (en relaciones del 0, 1 :4,5 mi al 0,25:4,5 mi), 62,5 μΙ de Miglyol® y diferentes cantidades de fosfolípidos (lecitina hidroxilada o lecitina libre de aceites).

vi) se añade la disolución obtenida en la etapa i) sobre 10 mi de una solución acuosa bajo agitación magnética manteniéndose durante 10 minutos, de este modo se obtiene espontáneamente la nanoemulsión.

vii) se evaporaron los disolventes orgánicos hasta volumen constante.

viii) se recubrió la nanoemulsión obtenida en la etapa i¡¡) mediante un proceso de incubación con una disolución acuosa (1 mi) compuesta por Pr a una concentración de 1 o 2 mg/ml, en una proporción 1 :1 y 1 :2 (mi nanoemulsión:mg de Pr), produciéndose de forma inmediata el recubrimiento, independientemente de la temperatura.

Una vez preparadas, se midió su diámetro medio, índice de polidispersión (Pl) así como su carga eléctrica superficial (potencial zeta). La tabla 2 muestra los valores obtenidos de los parámetros citados en función de la cantidad de fosfolípidos y distintas relaciones de protamina en la etapa iv).

Tabla 2

Ejemplo 2: Ejemplo 2.1 . Se prepararon nanocápsulas de protamina constituidas por un núcleo oleoso de Miglyol® según el procedimiento de difusión de disolvente en una etapa:

i) se preparó una disolución acuosa (10 mi) en la que se disuelve Pr a una concentración de 0,05 p/v. Adicionalmente esta disolución puede estar al

0,25 % p/v de poloxámero 188.

¡i) se preparó una fase oleosa compuesta por una disolución etanol/acetona

(0,25:4,5 mi), 62,5 μΙ de Miglyol® 40 mg de colato de sodio y 48 mg de

PEG estearato.

i¡¡) se mezclaron bajo agitación magnética durante 10 minutos las disoluciones resultantes de las etapas i) y ¡i), obteniéndose espontáneamente las nanocápsulas.

iv) se evaporaron los disolventes orgánicos hasta volumen constante.

Una vez preparadas, se midió su diámetro medio, índice de polidispersión (Pl) así como su carga eléctrica superficial (potencial zeta). La tabla 3 muestra los valores obtenidos de los parámetros citados:

Tabla 3

Ejemplo 2.2 Se prepararon nanocápsulas de protamina constituidas por un núcleo oleoso de Miglyol® según el procedimiento de difusión de disolvente en dos etapas: i) Se preparó una fase oleosa compuesta por una disolución etanol/acetona

(0,25:4,5 mi), 62,5 μΙ de Miglyol® 40 mg de colato de sodio y 48 mg de

PEG estearato.

¡i) se añade la disolución obtenida en la etapa i) sobre 10 mi de una solución acuosa bajo agitación magnética manteniéndose durante 10 minutos, de este modo se obtiene espontáneamente la nanoemulsión:

i¡¡) se evaporaron los disolventes orgánicos hasta volumen constante. iv) se recubrió la nanoemulsión obtenida en la etapa iii) mediante un proceso de incubación con una disolución acuosa (1 mi) compuesta por Pr a una concentración de 1 o 2 mg/ml de, en una proporción 1 : 1 y 1 :2 (mL nanoemulsión:mg de protamina), produciéndose de forma inmediata el recubrimiento, independientemente de la temperatura.

Una vez preparadas, se midió su diámetro medio, índice de polidispersión (Pl) así como su carga eléctrica superficial (potencial zeta). La tabla 4 muestra los valores obtenidos de los parámetros citados en función de la cantidad de Pr en la etapa iv).

Tabla 4

Ejemplo 2.3. Se prepararon nanocápsulas de protamina constituidas por un núcleo oleoso de α tocoferol y diferentes cantidades de PEG-estearato según el procedimiento de difusión de disolvente en una etapa:

i) se preparó una disolución acuosa (10 mi) en la que se disuelve protamina a una concentración de 0,05 mg/ml.

¡i) se preparó una fase oleosa compuesta por una disolución etanol/acetona (0,25:4,5 mi), 60 mg de α tocoferol y diferentes cantidades de PEG- estearato.

i¡¡) se mezclaron bajo agitación magnética durante 10 minutos las disoluciones resultantes de las etapas i) y ¡i), obteniéndose espontáneamente las nanocápsulas.

iv) se evaporaron los disolventes orgánicos hasta volumen constante.

Una vez preparadas, se midió su diámetro medio, índice de polidispersión (Pl) así como su carga eléctrica superficial (potencial zeta). La tabla 5 muestra los valores obtenidos de los parámetros citados en función de la cantidad de PEG- estearato. Tabla 5

Ejemplo 2.4. Se prepararon nanocápsulas de protamina constituidas por un núcleo oleoso de α tocoferol según el procedimiento de difusión de disolvente en dos etapas:

i) Se preparó una fase oleosa compuesta por una disolución etanol/acetona (0,25:4,5 mi), 60 mg de α tocoferol y diferentes cantidades de PEG- estearato.

¡i) se añade la disolución obtenida en la etapa i) sobre 10 mi de una solución acuosa bajo agitación magnética manteniéndose durante 10 minutos, de este modo se obtiene espontáneamente la nanoemulsión:

i¡¡) se evaporaron los disolventes orgánicos hasta volumen constante.

iv) se recubrió la nanoemulsión obtenida en la etapa i¡¡) mediante un proceso de incubación con una disolución acuosa (1 mi) compuesta por Pr a una concentración de 1 o 2 mg/ml, en una proporción 1 :1 y 1 :2 (mi nanoemulsión:mg de protamina), produciéndose de forma inmediata el recubrimiento, independientemente de la temperatura.

Una vez preparadas, se midió su diámetro medio, índice de polidispersión (Pl) así como su carga eléctrica superficial (potencial zeta). La tabla 6 muestra los valores obtenidos de los parámetros citados en función de la cantidad de PEG- estearato y distintas relaciones de protamina en la etapa iv).

Tabla 6

PEG etapa

Pr etapa iv Tamaño Potencial z

Formulación i Pl

(mg) (nm) (nm)

(mg) NC Pr 1 205 ± 10 0, 1 +4 ± 3

48

NC Pr 2 210 ± 15 0,2 +6 ± 9

NC Pr 1 205 ± 9 0, 1 +17 ± 5

24

NC Pr 2 216 ± 17 0,2 +4 ± 2

NC Pr 1 226 ± 7 0,2 +16 ± 9

12

NC Pr 2 238 ± 18 0,2 +9 ± 6

Ejemplo 2.5. Se prepararon nanocápsulas de protamina constituidas por un núcleo oleoso de escualeno y diferentes cantidades de tensoactivos según el

procedimiento de difusión de disolvente en una etapa: i) se preparó una disolución acuosa (10 mi) en la que se disuelve protamina a una concentración de 0,05 p/v.

¡i) se preparó una fase oleosa compuesta por una disolución de acetona

(4,75 mi), 62,5 μΙ de escualeno y diferentes cantidades de PEG-estearato. i¡¡) se mezclaron bajo agitación magnética durante 10 minutos las disoluciones resultantes de las etapas i) y ¡i), obteniéndose espontáneamente las nanocápsulas.

iv) se evaporaron los disolventes orgánicos hasta volumen constante.

Una vez preparadas, se midió su diámetro medio, índice de polidispersión (Pl) así como su carga eléctrica superficial (potencial zeta). La tabla 7 muestra los valores obtenidos de los parámetros citados en función de la cantidad de PEG- estearato:

Tabla 7

Ejemplo 2.6. Se prepararon nanocápsulas de protamina constituidas por un núcleo oleoso de escualeno según el procedimiento de difusión de disolvente en dos etapas: i) Se preparó una fase oleosa compuesta por una disolución acetona (4,5 mi), 62,5 μΙ de escualeno y diferentes cantidades de PEG-estearato.

¡i) se añade la disolución obtenida en la etapa i) sobre 10 mi de una solución acuosa bajo agitación magnética manteniéndose durante 10 minutos, de este modo se obtiene espontáneamente la nanoemulsión:

i¡¡) se evaporaron los disolventes orgánicos hasta volumen constante.

iv) se recubrió la nanoemulsión obtenida en la etapa i¡¡) mediante un proceso de incubación con una disolución acuosa (1 mi) compuesta por Pr a una concentración de 1 o 2 mg/ml, en una proporción 1 :1 y 1 :2 (mi nanoemulsión:mg de protamina), produciéndose de forma inmediata el recubrimiento, independientemente de la temperatura.

Una vez preparadas, se midió su diámetro medio, índice de polidispersión (Pl) así como su carga eléctrica superficial (potencial zeta). La tabla 8 muestra los valores obtenidos de los parámetros citados en función de la cantidad de PEG- estearato y distintas relaciones de protamina en la etapa iv).

Tabla 8

Ejemplo 2.7. Se prepararon nanocápsulas de protamina constituidas por un núcleo oleoso de α tocoferol y diferentes tensoactivos según el procedimiento de difusión de disolvente en una etapa: i) se preparó una disolución acuosa (10 mi) en la que se disuelve protamina a una concentración de 0,05 p/v.

¡i) se preparó una fase oleosa compuesta por una disolución etanol/acetona (0,25:4,5 mi), y 3 relaciones diferentes de α tocoferol y como tensoactivo se empleó PEG-estearato (PEG-st) o Solutol HS15. Las relaciones en masa fueron de 12:12, 60:12 y 60:60 α tocoferol:surfactante, respectivamente.

iii) se mezclaron bajo agitación magnética durante 10 minutos las disoluciones resultantes de las etapas i) y ¡i), obteniéndose espontáneamente las nanocápsulas.

iv) se evaporaron los disolventes orgánicos hasta volumen constante.

Una vez preparadas, se midió su diámetro medio, índice de polidispersión (Pl) así como su carga eléctrica superficial (potencial zeta). La tabla 9 muestra los valores obtenidos de los parámetros citados.

Tabla 9

Ejemplo 2.8. Se prepararon nanocápsulas de protamina constituidas por un núcleo oleoso de α tocoferol y diferentes tensoactivos según el procedimiento de difusión de disolvente en una etapa:

se preparó una disolución acuosa (10 mi) en la que se disuelve protamina a una concentración de 0,05 p/v.

se preparó una fase oleosa compuesta por una disolución etanol/acetona (0,25:4,5 mi), y 3 relaciones diferentes de α tocoferol y como tensoactivo se empleó Tween 20 o Tween 80. Las relaciones en masa fueron de 12: 12, y 60: 12 de α tocoferol:tensoactivo, respectivamente iii) se mezclaron bajo agitación magnética durante 10 minutos las disoluciones resultantes de las etapas i) y ¡i), obteniéndose espontáneamente las nanocápsulas.

iv) se evaporaron los disolventes orgánicos hasta volumen constante.

Una vez preparadas, se midió su diámetro medio, índice de polidispersión (Pl) así como su carga eléctrica superficial (potencial zeta). La tabla 10 muestra los valores obtenidos de los parámetros citados:

Tabla 10

Ejemplo 2.9. Se prepararon nanocápsulas de protamina constituidas por un núcleo oleoso de α tocoferol y TPGS según el procedimiento de difusión de disolvente en una etapa:

i) se preparó una disolución acuosa (10 mi) en la que se disuelve protamina a una concentración de 0,05 mg/ml.

¡i) se preparó una fase oleosa compuesta por una disolución etanol/acetona

(0,25:4,5 mi), 60 mg de α tocoferol y 24 mg de TPGS.

i¡¡) se mezclaron bajo agitación magnética durante 10 minutos las disoluciones resultantes de las etapas i) y ¡i), obteniéndose espontáneamente las nanocápsulas.

iv) se evaporaron los disolventes orgánicos hasta volumen constante.

Una vez preparadas, se midió su diámetro medio, índice de polidispersión (Pl) así como su carga eléctrica superficial (potencial zeta). La tabla 1 1 muestra los valores obtenidos. Tabla 11

Ejemplo 2.10. Se prepararon nanocápsulas de protamina constituidas por un núcleo oleoso de Miglyol® según el procedimiento de difusión de disolvente en una etapa: v) se preparó una disolución acuosa (10 mi) en la que se disuelve Pr a una concentración de 0,05 p/v.

vi) se preparó una fase oleosa compuesta por una disolución etanol/acetona (0,25:4,5 mi), 62,5 μΙ de Miglyol® y 40 mg de colato de sodio. vii) se mezclaron bajo agitación magnética durante 10 minutos las disoluciones resultantes de las etapas i) y ¡i), obteniéndose espontáneamente las nanocápsulas.

viii) se evaporaron los disolventes orgánicos hasta volumen constante. Una vez preparadas, se midió su diámetro medio, índice de polidispersión (Pl) así como su carga eléctrica superficial (potencial zeta). La tabla 12 muestra los valores obtenidos de los parámetros citados.

Tabla 12

Ejemplo 2.1 1 Se prepararon nanocápsulas de protamina constituidas por un núcleo oleoso de Miglyol® según el procedimiento de difusión de disolvente en dos etapas:

v) Se preparó una fase oleosa compuesta por una disolución etanol/acetona (0,25:4,5 mi), 62,5 μΙ de Miglyol® y 40 mg de colato de sodio. vi) se añade la disolución obtenida en la etapa i) sobre 10 mi de una solución acuosa bajo agitación magnética manteniéndose durante 10 minutos, de este modo se obtiene espontáneamente la nanoemulsión:

vii) se evaporaron los disolventes orgánicos hasta volumen constante. viii) se recubrió la nanoemulsión obtenida en la etapa iii) mediante un proceso de incubación con una disolución acuosa (1 mi) compuesta por Pr a una concentración de 1 o 2 mg/ml de, en una proporción 1 : 1 y 1 :2 (ml_ nanoemulsión:mg de protamina), produciéndose de forma inmediata el recubrimiento, independientemente de la temperatura.

Una vez preparadas, se midió su diámetro medio, índice de polidispersión (Pl) así como su carga eléctrica superficial (potencial zeta). La tabla 13 muestra los valores obtenidos de los parámetros citados en función de la cantidad de Pr en la etapa iv).

Tabla 13

Ejemplo 2.12. Se prepararon nanocápsulas de protamina constituidas por un núcleo oleoso de α tocoferol según el procedimiento de sonicación, en una etapa:

i) Se preparó una fase oleosa compuesta por una disolución 24 mg de PEG- estearato, 120 mg de α tocoferol en diclorometano (1 mi),

¡i) se preparó una disolución acuosa en la que se disuelve protamina a una concentración de 0,05 p/v.

i¡¡) se añadió la disolución obtenida en la etapa i) sobre 2 mi de agua y se sónico durante 30 segundos.

iv) se diluyó la emulsión obtenida con la disolución obtenida en ¡i (dilución 1 : 10); para formar las NC.

v) se evaporaron los disolventes orgánicos hasta volumen constante.

Una vez preparadas, se midió su diámetro medio, índice de polidispersión así como su carga eléctrica superficial (potencial zeta). En la tabla 14 se muestran los valores obtenidos. Tabla 14

Ejemplo 2.13. Se prepararon nanocápsulas de protamina constituidas por un núcleo oleoso de α tocoferol según el procedimiento de homogeneización, en una etapa:

i) Se preparó una fase oleosa compuesta por una disolución 24 mg de PEG- estearato, 120 mg de α tocoferol en diclorometano (1 mi),

¡i) se preparó una disolución acuosa en la que se disuelve protamina a una concentración de 0,05 p/v.

i¡¡) se añadió la disolución obtenida en la etapa i) sobre 2 mi de agua y se homogeneizó a 16.000 rpm durante 5 minutos y posteriormente a 19.000 rpm durante otros 5 minutos.

iv) se diluyó la emulsión obtenida con la disolución preparada en ¡i (dilución 1 : 10) y se homogeneizó durante 3 minutos a 22.000 rpm; para formar las NC.

v) se evaporaron los disolventes orgánicos hasta volumen constante.

Una vez preparadas, se midió su diámetro medio, índice de polidispersión así como su carga eléctrica superficial (potencial zeta). En la tabla 15 se muestran los valores obtenidos de los parámetros citados.

Tabla 15:

Ejemplo 2.14 Se prepararon nanocápsulas de protamina constituidas por un núcleo oleoso de α tocoferol según el procedimiento de sonicacion, en dos etapas: i) Se preparó una fase oleosa compuesta por una disolución 24 mg de PEG- estearato, 120 mg de α tocoferol en diclorometano (1 mi). se añadió la disolución obtenida en la etapa i) sobre 2 mi de agua y se sónico durante 30 segundos.

se diluyó la emulsión obtenida con agua (dilución 1 : 10).

se evaporaron los disolventes orgánicos hasta volumen constante para formar una nanoemulsión catiónica.

se recubrió la nanoemulsión obtenida en la etapa iv) mediante un proceso de incubación con una disolución acuosa (1 mi) compuesta por Pr a una concentración de 1 o 2 mg/ml, en una proporción 1 : 1 y 1 :2 (ml_ nanoemulsión:mg de protamina), produciéndose de forma inmediata el recubrimiento, independientemente de la temperatura.

Una vez preparadas, se midió su diámetro medio, índice de polidispersión así como su carga eléctrica superficial (potencial zeta). En la tabla 16 se muestran los valores obtenidos.

Tabla 16

Ejemplo 2.15. Se prepararon nanocápsulas de protamina constituidas por un núcleo oleoso de α tocoferol según el procedimiento de homogeneización, en dos etapas:

i) Se preparó una fase oleosa compuesta por una disolución 24 mg de PEG- estearato, 120 mg de α tocoferol en diclorometano (1 mi),

¡i) se añadió la disolución obtenida en la etapa i) sobre 2 mi de agua y se homogeneizó a 16.000 rpm durante 5 minutos y posteriormente a 19.000 rpm durante otros 5 minutos.

i¡¡) se diluyó la emulsión obtenida con agua (dilución 1 : 10) y se homogeneizó durante 3 minutos a 22.000 rpm.

iv) se evaporaron los disolventes orgánicos hasta volumen constante para formar una nanoemulsión.

v) se recubrió la nanoemulsión obtenida en la etapa iv) mediante un proceso de incubación con una disolución acuosa (1 mi) compuesta por protamina a una concentración de 1 o 2 mg/ml, en una proporción 1 : 1 y 1 :2 (ml_ nanoemulsión:mg de protamina), produciéndose de forma inmediata el recubrimiento, independientemente de la temperatura.

Una vez preparadas, se midió su diámetro medio, índice de polidispersión así como su carga eléctrica superficial (potencial zeta). En la tabla 17 se muestran los valores obtenidos de los parámetros citados.

Tabla 17

Ejemplo 3. Evaluación de las características físico-químicas de las nanocápsulas de Protamina con núcleo oleoso de α tocoferol en función de la cantidad de Protamina.

Ejemplo 3.1 . Se prepararon nanocápsulas de protamina constituidas por un núcleo oleoso de α tocoferol según el procedimiento de difusión de disolvente en una etapa:

i) Se preparó una disolución acuosa de protamina (10ml) en la que se disuelven de 100 a 1 mg de protamina.

¡i) se preparó una fase oleosa compuesta por una disolución etanol/acetona

(0,25:4,5 mi), 60 mg de α tocoferol, 5 mg de colato de sodio y 12 mg de

PEG-estearato.

i¡¡) se añade la disolución obtenida en la etapa ¡i) sobre los 10 mi de la solución acuosa de protamina preparada en i) bajo agitación magnética manteniéndose durante 10 minutos, de este modo se obtiene espontáneamente las nanocápsulas.

iv) se evaporaron los disolventes orgánicos hasta volumen constante. Una vez preparadas, se midió su diámetro medio, índice de polidispersión (Pl) así como su carga eléctrica superficial (potencial zeta). La tabla 18 muestra los valores obtenidos de los parámetros citados en función de la cantidad de de protamina en la disolución acuosa de la etapa i). Se puede observar la posibilidad de obtención del sistema a pesar de la variación de Pr.

Tabla 18

Ejemplo 4. Evaluación de la capacidad de encapsulacion del fármaco lipofílico docetaxel en nanocápsulas de protamina

Se prepararon nanocápsulas de protamina, un núcleo oleoso compuesto por PEG estearato y α tocoferol o Miglyol®. Se procedió a la incorporación de un fármaco lipofílico, tomando para ello el docetaxel, un agente antitumoral prácticamente insoluble en agua. El procedimiento de elaboración corresponde al procedimiento previamente descrito en el ejemplo 2.1 , con una modificación, ya que una pequeña alícuota de una solución stock del ingrediente activo en etanol (1 -100 mg/ml) es incorporada a la fase oleosa. Posteriormente se eliminaron los solventes orgánicos por medio del rotavapor hasta obtener un volumen constante formándose las nanocápsulas de protamina encapsulando docetaxel.

Una vez preparadas las nanocápsulas según el procedimiento de la invención se determinó la eficacia de encapsulacion (evaluando el fármaco libre mediante cromatografía líquida de alta resolución, con A=227nm), obteniéndose una eficacia de encapsulacion de 35 % También se midieron los parámetros diámetro medio de partícula, índice de polidispersión y potencial zeta (Tabla 19 ). Se puede apreciar la posibilidad de incorporar principios activos de naturaleza hidrofóbica de manera eficaz, sin haber diferencias significativas en la inclusión de Pr en la NE.

Tabla 19

Ejemplo 5. Estudio de la capacidad de inhibición de la proliferación celular de las nanocápsulas de protamina

Con el fin de evaluar el potencial de las nanocápsulas de protamina que encapsulan docetaxel para inhibir la proliferación celular de las líneas celular de cáncer de pulmón NCI-H460 y A549 y en línea celular de cáncer de páncreas MiaPaCa2 y BxPC3, se prepararon las nanocápsulas de protamina según el procedimiento descrito en el ejemplo 4. Para este estudio se analizan cuatro tratamientos; (i) etanol (¡i) disolución de DCX en etanol, (i¡¡) nanocápsulas blancas como controles y (iv) nanocápsulas cargadas con DCX, diluidas en medio de cultivo (DMEM). Transcurrido el tiempo de incubación (24 y 48h), se trataron las muestras con Cristal violeta y las células solubilizadas se cuantificaron por determinación espectrofotométrica (λ = 590 nm). Las siguientes figuras (1 -4) muestran los resultados de este estudio: Como se puede observar en los diferentes gráficos, la actividad del docetaxel en etanol es comparable con la del mismo fármaco encapsulado en las Ncs de Pr, para los diferentes tiempos y para las diferentes líneas celulares. Esto permitiría concluir la posibilidad de administración de estos sistemas in vivo sin la necesidad de otros excipientes, como el cremophor o altas concentraciones de tween 80, causante de la biodistribución irracional de estos sistemas y de las principales reacciones adversas que presentan.

Ejemplo 6. Evaluación de la capacidad de encapsulación de otras moléculas lipofílicas en las nanocápsulas de protamina

Ejemplo 6.1 . Encapsulación de rodamina 6G en las nanocápsulas de protamina Se prepararon nanocápsulas de protamina, un núcleo oleoso compuesto por α tocoferol. Se procedió a la incorporación de una molécula lipofílica, tomando para ello rodamina 6G, un compuesto orgánico heterocíclico, además de ser un medio de contraste fluorescente y perteneciente a la familia de las rodaminas. El procedimiento de elaboración corresponde al procedimiento previamente descrito en el ejemplo 2.1 , con una modificación, ya que una pequeña alícuota de una solución stock del ingrediente activo en etanol (1 mg/ml) es incorporada a la fase oleosa. Posteriormente se eliminan los solventes orgánicos del sistema hasta obtener un volumen constante formándose las nanocápsulas de protamina encapsulando rodamina 6G.

Una vez preparadas las nanocápsulas según el procedimiento de la invención se determinó la eficacia de encapsulación (evaluando la cantidad de rodamina libre mediante espectroscopia visible, λ=530 nm.). Los parámetros diámetro medio de partícula, índice de polidispersión y potencial zeta se presentan en la tabla 20. Como se puede concluir, es posible incluir diferentes moléculas de características hidrofóbicas al núcleo de las NC de Pr.

Tabla 20

Potencial Encapsulación

Tamaño

Formulación Pl z %

(nm)

(mv)

NC Protamina rodamina 230 ± 4 0.2 +24 ± 2 58 ± 1

Ejemplo 6.2. Encapsulación de curcumina en las nanocápsulas de protamina

Se prepararon nanocápsulas de protamina, un núcleo oleoso compuesto por α tocoferol. Se procedió a la incorporación de una molécula lipofílica, tomando para ello curcumina, un fenol natural con cierta actividad antitumoral, analgésica y antimicrobiana, entre otras. El procedimiento de elaboración corresponde al procedimiento previamente descrito en el ejemplo 2.8, utilizando tween 80 como surfactante, en una relación en masa 60: 12 α tocoferol:tween 80; y con una modificación, ya que una pequeña alícuota de una solución stock del ingrediente activo en etanol (1 mg/ml) es incorporada a la fase oleosa. Posteriormente se eliminan los solventes orgánicos del sistema hasta obtener un volumen constante formándose las nanocápsulas de protamina encapsulando curcumina.

Una vez preparadas las nanocápsulas según el procedimiento de la invención se determinó la eficacia de encapsulación (evaluando la cantidad de curcumina libre mediante fluorescencia.)

Los parámetros diámetro medio de partícula, índice de polidispersión y potencial zeta se presentan en la tabla 21 . Como se puede concluir, es posible incluir diferentes moléculas de características hidrofóbicas al núcleo de las NC de Pr, sin importar el tensoactivo que se utilice.

Tabla 21

Ejemplo 7

Evaluación de la capacidad de adsorción del antígeno recombinante de hepatitis B en nanocápsulas de protamina

Se prepararon nanocápsulas de protamina, un núcleo oleoso compuesto por PEG estearato y como aceite α tocoferol, escualeno o Miglyol® 812. Se procedió a la asociación de un antígeno hidrofílico, tomando para ello el antígeno recombinante de la hepatits B (rHBsAg). El procedimiento de elaboración corresponde al procedimiento previamente descrito en el ejemplo 2.1 , Posteriormente se incuba una alícuota del antígeno con las nanocápsulas de protamina ya formadas, teniendo para ello, diferentes relaciones de masa (protamina: antígeno).

Una vez preparadas las nanocápsulas con el antígeno adsorbido se determinó la eficacia de asociación de alguna de estas formulaciones a través de ELISA y se cuantificaron los parámetros diámetro medio de partícula, índice de polidispersión y potencial zeta (Tabla 22). Como se puede observar en la tabla, lasd NC de Pr asocian eficazmente gran cantidad de rHBsAg a su superficie.

Tabla 22

Ejemplo 8

Estudio de inmunización con las nanocápsulas de protamina cargadas con el antígeno recombinante de hepatitis B

Se prepararon nanocápsulas de protamina, un núcleo oleoso de α tocoferol (TCPH) y escualeno (SQL). Se procedió a la asociación antígeno recombinante de la hepatitis B (rHBsAg) en una relación 4: 1 NC: HBsAg. El procedimiento de elaboración corresponde al procedimiento previamente descrito en el ejemplo 7. La habilidad de las NC para inducir respuesta inmune fue medida en ratones hembras BALB/c, la respuesta fue cuantificada a través de ELISA los días 42, 126 y 183. Los animales tuvieron ciclos de 12 horas de luz y 12 horas de oscundad con temperatura constante a 22°C, con agua y alimentos ad libitum. Los animales estuvieron consientes durante la inmunización y la toma de muestras. Los ratones fueron utilizados de acuerdo a las directrices de la normativa española (decreto real 1201/2005). Grupos de 7 ratones fueron elegidos al azar y fueron inmunizados con una dosis de 10 g de antígeno adsorbido en las NC Pr los días 0 y 28 para administración intramuscular (im) y días 0,28 y 1 12 por vía intranasal (in). Para NC Pr-TOCOPH se probó una administración combinada, siendo el día 0 intramuscular y el día 28 y 1 12 intranasal (im, in). El siguiente gráfico, señala los resultados obtenidos para el estudio realizado.

Teniendo en cuenta de que el valor de 100 (mUI/ml) IgG, se considera valores protectores, se puede apreciar en la figura 5, que las NC Pr alcanzan dicha protección por vía intramuscular y el tratamiento combinado (im, in) sin importar el aceite utilizado. Por vía nasal, aunque no se logra este nivel, se conoce que una administración transmucosa como esta de preferencia estimula una respuesta inmune de tipo celular; por lo que no se descarta la protección de esta enfermedad. Ejemplo 9

Evaluación de la capacidad de adsorción del antígeno de influenza a las nanocápsulas de protamina con núcleo de α tocoferol

Se prepararon nanocápsulas de protamina, un núcleo oleoso compuesto por PEG estearato y como aceite α tocoferol. Se procedió a la asociación de un antígeno de naturaleza proteica e hidrofílico, tomando para ello el antígeno de la influenza H1 N1 (Hl). El procedimiento de elaboración corresponde al procedimiento previamente descrito en el ejemplo 2.1 , Posteriormente se incuba una alícuota del antígeno con las nanocápsulas de protamina ya formadas, teniendo para ello, diferentes relaciones de masa (protamina: antígeno).

Una vez preparadas las nanocápsulas con el antígeno adsorbido se determinó la eficacia de asociación de la formulación 4: 1 NC: antígeno a través de western blot y se evaluaron los parámetros diámetro medio de partícula, índice de polidispersión y potencial zeta (Tabla 20). Como se puede apreciar en la tabla 23, las características fisicoquímicas del sistema no se ven afectadas tras la adsorción del Hl. Las NC Pr asocian eficientemente el antígeno de naturaleza proteica.

Tabla 23

Ejemplo 10

Estudio de inmunización con las nanocápsulas de protamina cargadas con el antígeno de influenza H1 N1

Se prepararon nanocápsulas de protamina, un núcleo oleoso de α tocoferol. Se procedió a la asociación antígeno de Hl en una relación 4: 1 NC: HI. El procedimiento de elaboración corresponde al procedimiento previamente descrito en el ejemplo 9.

La habilidad de las NC para inducir respuesta inmune fue medida en ratones hembras BALB/c, la respuesta fue cuantificada a través de ELISA los días 21 , 35, 49 y 196. Los animales tuvieron ciclos de 12 horas de luz y 12 horas de oscundad con temperatura constante a 22°C, con agua y alimentos ad libitum. Los animales estuvieron consientes durante la inmunización y la toma de muestras. Los ratones fueron utilizados de acuerdo a las directrices de la normativa española (decreto real 1201 /2005). Grupos de 5 ratones fueron elegidos al azar y fueron inmunizados con una dosis de 7,5 ó 2 g de antígeno adsorbido en las nanocápsulas de Pr, los días 0, 21 , 35 por vía subcutánea y se evaluó la presencia de anticuerpos IgG específicos frente al antígeno mediante técnicas de ELISA. La figura 6, señala los resultados obtenidos para el estudio realizado. Como se puede observar en la imagen, las NC Pr inducen títulos de inhibición de hemaglutinación mayores de una dilución de 1 :64, que es considerado suficiente para la protección contra la infección de influenza. Ejemplo 11

Evaluación de la capacidad de adsorción de material genético a las nanocápsulas de protamina con núcleo de α tocoferol

Se prepararon nanocápsulas de protamina, un núcleo oleoso compuesto por α tocoferol y como tensoactivo PEG estearato o PEG estearato y colato de sodio. Se procedió a la asociación de material genético EGFP-C1 . El procedimiento de elaboración corresponde al procedimiento previamente descrito en el ejemplo 2.1 , Posteriormente se incuba una alícuota del plásmido con las nanocápsulas de protamina ya formadas, teniendo para ello, diferentes relaciones de carga, al 5, 10 y 20 % respecto a la masa de Pr. Una vez incubadas las nanocápsulas con el pDNA adsorbido se evaluaron los parámetros diámetro medio de partícula, índice de polidispersión y potencial zeta (Tabla 24).

Como muestra la tabla 21 , existe un descenso notable de la carga superficial de los sistemas, observándose incluso una inversión del potencial, ejemplo de que el material genético se encuentra adsorbido a la superficie de las NC Pr.

Tabla 24

Formulación Tensoactivos Size Pdl Zeta

245 ±

NC Pr α tocoferol 0,2 -8 ± 7

1 1

NC Pr α tocoferol (5% pDNA 262 ± -14 ±

0,2

loading) PEG 16 6

NC Pr α tocoferol (10% pDNA estearato -20 ±

244 ± 3 0,2

loading) 5

NC Pr α tocoferol (20% pDNA -15 ±

248 ± 4 0,2

loading) 1

PEG +33 ±

NC NC Pr α tocoferol 246 ± 2 0, 1

estearato y 1

NC Pr α tocoferol (5% pDNA colato de 238 ±4 0, 1 -25 ± loading) sodio 3

NC Pr α tocoferol (10% pDNA -24 ±

240 ± 8 0,2

loading) 2

NC Pr α tocoferol (20% pDNA -26 ±

276 ± 2 0,3

loading) 1

Ejemplo 12

Ejemplo 12.1 Evaluación del efecto la trehalosa y la glucosa sobre el tamaño de partícula de las nanocápsulas de protamina tras el proceso de liofilización

Se prepararon nanocápsulas de protamina, un núcleo oleoso compuesto por PEG estearato y escualeno, según el procedimiento previamente descrito. Se evaluó el efecto que tiene los agentes crioprotectores glucosa y trehalosa durante el proceso de liofilización de las nanocápsulas de Pr y en la posterior recuperación del tamaño de partícula tras la resuspensión ensayando dos concentraciones de crioprotector, 5 y 10% p/v. Asimismo, se evaluó la influencia de la concentración de nanocápsulas (0,025; 0,05; 0,08; 0, 1 ; 0,25; 0,5; 0,75; y 1 % p/v) en la suspensión a liofilizar. Como control se liofilizo una suspensión de NC de Pr a una concentración de 1 ,54 % sin crioprotector. Los resultados de la Tabla muestran el tamaño de partícula de las nanocápsulas de Pr liofilizadas tras la resuspensión (Tabla 25).

Como se observa en la tabla 22, es posible obtener una formulación en seco de las NC Pr, la cual no pierde sus propiedades fisicoquímicas, inclusive sin el uso de crioprotector. Se sabe que las formulaciones en polvo seco poseen una mayor estabilidad que en suspensión acuosa, por ende se espera que dicha formulación pueda ser estable a T° ambiente.

Tabla 25

Trehalosa 10

Glucosa 5 % Glucosa 10 % Trehalosa 5%

%

Conc. Tamaño Tamaño Tamaño Tamaño

Pl Pl Pl Pl

NC (nm) (nm) (nm) (nm)

1 ,54 % 219 ± 83 0,3 Formu ación sin crioprotector 1 % 317 ± 66 0,4 273 ± 51 0,4 330 ± 74 0,5 256 ± 39 0,4

0,75% 300 ± 67 0,4 628 ± 501 0,6 320 ± 84 0,5 258 ± 45 0,3

0,50% 310 ± 52 0,4 415 ± 373 0,4 320 ± 27 0,5 237 ± 31 0,3

0,25% 305 ± 44 0,4 259 ± 40 0,4 303 ± 37 0,4 210 ± 46 0,3

0, 10% 244 ± 30 0,3 254 ± 22 0,3 285 ± 47 0,4 212 ± 27 0,3

0,08% 251 ± 56 0,4 226 ± 1 1 0,3 229 ± 6 0,3 198 ± 39

0,05% 268 ± 41 0,4 279 ± 57 0,3 204 ± 10 0,3 204 ± 33 0,2

0,025% 243 ± 37 0,3 217 ± 14 0,3 184 ± 20 0,3 252 ± 68 0,3

Ejemplo 12.2 Evaluación del efecto la sobre el tamaño de partícula de las nanocápsulas de protamina y la integridad del rHBsAg tras el proceso de liofilización Se prepararon nanocápsulas de protamina, un núcleo oleoso compuesto por

PEG estearato, colato de sodio y α tocoferol, según el procedimiento previamente descrito. Se evaluó el efecto del tamaño de partícula de Las NC Pr a una concentración de 1 % y utilizando los agentes crioprotectores glucosa y trehalosa, a una concentración del 5%. Los resultados de la Tabla muestran el tamaño de partícula de las nanocápsulas de Pr liofilizadas tras la resuspensión (Tabla 23) La integridad del antígeno adsorbido se analizo a través de Western blot.

Como se observa en la tabla 26, es posible obtener una formulación en seco de las NC Pr con el antígenos rHBsAg adsorbido a su cubierta, la cual no pierde sus propiedades fisicoquímicas. La imagen muestra la integridad del antígeno rHBsAg asociado a las NC-Pr luego del proceso de liofilización.

Las imagen de Western blot muestra que no existe degradación tras el proceso de liofilización.

Tabla 26

Formulación Concentración Crioprotector Tamaño PDI

NC (% p/p)

NC Pr sin 1 .64 268 ± 35 0,2

liofilizar

NC Pr 0,5 Trehalosa 228 ± 43 0,3 Liofilizadas

NC Pr 1 Trehalosa 188 ± 7 0,3

Liofilizadas

NC Pr 1 Glucosa 254 ± 0,3

Liofilizadas 109

Ejemplo 13

Evaluación de la variación del tamaño de partícula de la formulación de nanocápsulas de protamina durante su almacenamiento

Se prepararon nanocápsulas de protamina, un núcleo oleoso compuesto por α tocoferol y PEG-st, según el procedimiento previamente descrito en el ejemplo 2.3, con 12 mg de PEG-st. Se realizaron medidas de tamaño de partícula durante un largo periodo de tiempo, con el fin de obtener información acerca de la evolución del tamaño del sistema con el tiempo. Asimismo se evaluó el efecto de la temperatura de almacenamiento (4-8 °C) sobre la estabilidad de las nanocápsulas. Los resultados presentados en la tabla 27 muestran la escasa variabilidad del tamaño de las nanocápsulas de Pr, durante el almacenamiento.

Tabla 27

Tiempo Tamaño

Día 0 261 ±

13

Día 7 261 ± 7

Día 14 263 ±

10

Día 21 258 ± 8

Día 28 265 ± 7

2 meses 270 ±

12

3 meses 300 ±

15

4 meses 289 ±

18 Ejemplo 14

Evaluación de la viabilidad celular de las nanocápsulas de protamina

Con el fin de evaluar la viabilidad de las nanocápsulas de protamina en células inmunes RAW 264,7. Para ello se prepararon las nanocápsulas de protamina según el procedimiento descrito en el ejemplo 2.1 con aceite α tocoferol (TCPH) y escualeno (SQL). Para este estudio se incubaron diferentes concentraciones de nanocápsulas en la línea celular mencionada y luego de 24 ó 48 horas se cuantifico su viabilidad a través del método de QCCS (del ingles Quick Cell Countig Solution). Como muestra en la figura 5 a diferentes concentraciones de nanocápsulas de protamina, la viabilidad se encuentra sobre el 75% incluso tras 48 horas de incubación, lo que nos entrega los valores de toxicidad de la invención

Ejemplo 15:

Evaluación de la capacidad de las nanocápsulas de protamina para inducir la secreción de citocinas en células mononucleares de sangre periférica.

Se prepararon nanocápsulas de protamina con un núcleo oleoso de α tocoferol o escualeno, según el procedimiento descrito en el ejemplo 2.3 y 2.5 respectivamente. Una vez preparadas las nanocápsulas, se determinaron las diferentes citocinas secretadas por células mononucleares de sangre periférica. Para ello, sangre de tres individuos sanos fue heparinizada, diluida en PBS y separada por centrifugación en gradiente a través de Ficoll-Hypaque para poder separar las células mononucleares. Para la cuantificación de la producción de citocinas, 2x10 ⁵ de estas células fueron incubadas durante 24 horas en presencia de nanocápsulas de protamina con un núcleo oleoso de α tocoferol o escualeno a dos concentraciones 10 y 100 pg/ml, utilizando como control positivo LPS (10 pg/ml). Los niveles de secreción fueron determinados utilizando Th1/Th2 FlowCytomix TM, siguiendo las indicaciones del fabricante. Como se muestra en la Tabla 28, las nanocápsulas son capaces de inducir la secreción de citocinas. Esta respuesta es modulable en función de la concentración y/o el componente del núcleo oleoso. (n/3)= número de sujetos respondedores. Tabla 28

Ejemplo 16:

Evaluación de la activación de la cascada del complemento por las nanocápsulas de protamina:

Se prepararon nanocápsulas de protamina con un núcleo oleoso de α tocoferol o escualeno, según el procedimiento descrito en el ejemplo 2.3 y 2.5 respectivamente. Una vez preparadas las nanocápsulas se determinó la activación del complemento, para ello se analizó a través de Western blot el producto C3. Diferentes concentraciones de nanocápsulas de protamina se incubaron con plasma humano, y se utilizó veneno de cobra como control positivo y PBS como negativo. Como se muestra en la Figura 1 1 , se puede observar que las nanocápsulas de protamina activan la cascada del complemento, dependiendo de su composición en el núcleo oleoso y concentración, siendo esta una característica que se puede aprovechar para el desarrollo de nuevos adyuvantes de inmunización profiláctica o terapéutica.

Ejemplo 17

Evaluación de la viabilidad celular en células Raw 267.4 tras incubación con las nanocápsulas de protamina:

Se prepararon nanocápsulas de protamina con un núcleo oleoso de α tocoferol según el procedimiento descrito en el ejemplo 2.3.

Una vez preparadas las nanocápsulas, se determinó la influencia de las nanocápsulas de protamina sobre la viabilidad celular con un método diferente al expuesto en el ejemplo 14.

Para ello la viabilidad celular se midió a través de xCELLigence®, en macrófagos RAW 264.7, siguiendo las instrucciones del fabricante. Tres concentraciones de nanocápsulas fueron testadas y como control positivo se utilizaron las células sin nanocápsulas (línea roja). La viabilidad celular está correlacionada con la impedancia eléctrica de los electrodos de oro que cuantifican número de células y morfología cada 15 minutos durante 48 horas.

Como se observa en la figura 12, a las 24 horas de contacto continuo con las células, las nanocápsulas no alteran el crecimiento celular hasta 50 Dg/ml concentración (i.e perfil idéntico al control).

Ejemplo 18

Evaluación de la estabilidad de las nanocápsulas de protamina liofilizadas asociando el antígeno de la hepatitis B:

Se prepararon nanocápsulas de protamina con un núcleo oleoso de α tocoferol según el procedimiento descrito en el ejemplo 2.3.

Una vez preparadas las nanocápsulas, se les asoció el antígeno recombinante de hepatitis B (rHBsAg) como se especifica en el ejemplo 7 en una relación 4: 1 NC:rHBsAg. Posteriormente, esta formulación fue liofilizada con trehalosa al 5%, como se especifica en el ejemplo 12 a una concentración de nanocápsulas de 1 %. El producto liofilizado fue almacenado a temperatura ambiente (25°C) y fue resuspendido a diferentes tiempos con el fin de evaluar sus propiedades fisicoquímicas. La integridad del antígeno fue analizada a través de Western blot para cada punto de tiempo.

Como se puede observar en la caracterización fisicoquímica de la Figura 13; el producto liofilizado permanece estable, con tamaño nanométrico y potencial zeta positivo al menos durante 12 meses. La imagen de Western blot (Figura 14) indica que el antígeno adsorbido en las nanocápsulas de protamina (carril 2, 3 y 4), no pierde su estructura o antigenicidad ni en el proceso de liofilización ni a lo largo del tiempo de conservación a temperatura ambiente y es comparable con el antígeno que ha sido conservado a 4°C (carril 6). El carril 5 muestra el rHBsAg libre liofilizado y conservado a temperatura ambiente, donde es posible observar la relativa pérdida de antígeno en comparación con el asociado a las nanocápsulas de protamina.

Con este ejemplo, se demuestra la termoestabilidad de las nanocápsulas de la invención, al menos de un año y la protección que ejerce este vehículo sobre el antígeno o molécula asociada.

Ejemplo 19

Se prepararon nanocápsulas de protamina constituidas por un núcleo oleoso de α tocoferol, procedimiento descrito según el ejemplo 2.8, con la variación del procedimiento de difusión de disolvente (por goteo), con el fin de reducir el tamaño de la formulación resultante.

i) se preparó una disolución acuosa (10 mi) en la que se disolvió protamina a una concentración de 0,25 y 0, 125 mg/ml.

¡i) se preparó una fase oleosa compuesta por una disolución etanol/acetona

(0,750:4,25 mi), 15 mg de α tocoferol y 6 mg de Tween® 80. i¡¡) la disolución etanólica resultante de ¡i) fue añadida en alícuotas de 0,250 mi cada 20 segundos sobre i), obteniéndose espontáneamente las nanocápsulas.

iv) se evaporaron los disolventes orgánicos hasta volumen constante (5 mi).

Una vez preparadas, se midió su diámetro medio e índice de polidispersión (Pl), así como su carga eléctrica superficial (potencial zeta). La tabla 29 muestra los valores obtenidos. Tabla 29

Ejemplo 20

Se prepararon nanocápsulas de protamina constituidas por un núcleo oleoso de Miglyol® con la variación del procedimiento de difusión de disolvente (por goteo), con el fin de reducir el tamaño de la formulación resultante.

i) se preparó una disolución acuosa (10 mi), en la que se disolvió protamina a una concentración de 0,25 y 0, 125 mg/ml.

¡i) se preparó una fase oleosa compuesta por una disolución etanol/acetona

(0,750:4,25 mi), 15 mg de Miglyol® y 6 mg de Tween® 80.

i¡¡) la disolución etanólica resultante de ¡i) fue añadida en alícuotas de 0,250 mi cada 20 segundos sobre i), obteniéndose espontáneamente las nanocápsulas.

iv) se evaporaron los disolventes orgánicos hasta volumen constante (5 mi).

Una vez preparadas, se midió su diámetro medio e índice de polidispersión (Pl), así como su carga eléctrica superficial (potencial zeta). La Tabla 30 muestra los valores obtenidos.

Tabla 30

Tamaño Potencial zeta

Formulación Pl

(nm) (mV)

NC Pr (0,25 mg/ml) 133 ± 3 0,2 +1 ± 1

NC Pr (0, 125 mg/ml) 141 ± 9 0,2 +12 ±14 Ejemplo 21

Evaluación de la capacidad de adsorción de material genético a las nanocápsulas de protamina con núcleo de α tocoferol.

Se prepararon nanocápsulas de protamina, un núcleo oleoso compuesto por α tocoferol y teniendo como tensoactivo Tween® 80. Se procedió a la asociación de material genético i) pDNA EGFP-C1 y ¡i) si-RNA GL3. El procedimiento de elaboración corresponde al procedimiento previamente descrito en el ejemplo 2.1 . Posteriormente, se incubó una alícuota de plásmido y/o siRNA (0,050 mi) con las nanocápsulas de protamina ya formadas, teniendo para ello, una carga de 15,4% de material genético respecto a la masa de protamina. Una vez incubadas las nanocápsulas con el material genético se evaluaron los siguientes parámetros: diámetro medio de partícula, índice de polidispersión y potencial zeta (Tabla 31 ).

Como se muestra en la Tabla 31 , existe un descenso notable de la carga superficial de los sistemas, observándose incluso una inversión del potencial, hecho indicativo de que el material genético se encuentra adsorbido en la superficie de las NC Pr.

Tabla 31

Por otro lado, se confirmó la asociación del material genético mediante electroforesis en gel de agarosa (Figura 15).

Ejemplo 22

Evaluación de la capacidad de las nanocápsulas de protamina con núcleo de α tocoferol y asociando plásmido DNA EGFP-C1 para ser internalizadas y transfectar células cancerosas, como la línea de glioblastoma U87MG. Se prepararon nanocápsulas de protamina con un núcleo oleoso compuesto por α tocoferol y utilizando como tensoactivo Tween ^® 80. Se procedió a la asociación de matenal genético pDNA EGFP-C1 . El procedimiento de elaboración corresponde al procedimiento previamente descrito en el ejemplo 2.1 . Posteriormente, se incubó una alícuota de plásmido (0,050 mi) con las nanocápsulas de protamina ya formadas (0,250 mi), teniendo para ello, una carga del 15,4% de matenal genético respecto a la masa de protamina. Una vez incubadas las nanocápsulas con el material genético adsorbido se evaluaron los parámetros diámetro medio de partícula, índice de polidispersión y potencial zeta (Tabla 31 ). Asimismo, se evaluó su eficacia para transfectar células cancerosas (U87MG). Para ello, los sistemas fueron incubados con las células durante 4 horas, y la expresión de la proteína verde fluorescente (GFP) codificada por el plásmido asociado fue evaluada mediante microscopía de fluorescencia a las 48 horas post-transfección como se ve en la Figura 16.