纳米级环磷酰胺及其制备方法 技术领域

本发明涉及抗肿瘤药物环磷酰胺， 具体涉及一种纳米级环磷酰胺及其制备 方法。

背景技术

环磷酰胺是最常用的烷化剂类抗肿瘤药， 其在体外无抗肿瘤活性， 进入体 内后先在肝脏中经 粒体功能氧化酶转化成 磷酰胺， 而醛酰胺不稳定， 在肿 瘤细胞内分解成酰胺氮芥及丙烯醛， 酰胺氮芥对肿瘤细胞有细胞毒作用。 环磷 酰胺是双功能烷化剂及细胞周期非特异性药物 ， 可干扰 DNA及 RNA功能， 尤 以对前者的影响更大， 它与 DNA发生交叉联结， 抑制 DNA合成， 对 S期作用 最明显。 临床用于恶性淋巴瘤、 多发性骨髓瘤、 白血病、 乳腺癌、 卵巢癌、 宫 颈癌、 前列腺癌、 结肠癌、 支气管癌、 肺癌等。 此外， 环磷酰胺还具有显著免 疫作用， 可用于类风湿关节炎、 儿童肾病综合征以及自身免疫疾病的治疗。

环磷酰胺溶于水， 但溶解度不大， 其水溶液不稳定， 故应在溶解后短期内 使用。 环磷酰胺的毒副作用较大， 骨髓抑制为最常见的毒性， 主要表现为白细 胞减少； 环磷酰胺的代谢产物可产生严重的出血性膀胱 炎， 如尿频、 尿急、 膀 胱尿感强烈、 血尿， 甚至排尿困难； 环磷酰胺还可引起生殖系统毒性， 如停经 或精子缺乏， 妊娠初期时给予可致畸胎； 另外还会对消化系统、 皮肤和肝脏产 生危害。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种新型的纳米级 环磷酰胺颗粒， 以改善环磷 酰胺难溶于水、 口服吸收差且生物利用度低的问题， 并且降低其毒副作用、 提 高治疗效果。

为实现上述目的， 本发明提供了一种纳米级环磷酰胺颗粒， 其特征在于： 以二氧化硅气凝胶作为环磷酰胺的载体， 所述二氧化硅气凝胶的孔隙率为 95 ~ 99%、 孔径为 10 ~ 50nm、 比表面积为 200 ~ 1000m ² /g、 密度为 3 ~ 300kg/m ³ 、 组 成网络的胶体颗粒直径为 l ~ 50nm, 所述环磷酰胺以吸附在所述二氧化硅气凝 胶的孔洞中的形式形成直径小于 lOOnm的环磷酰胺颗粒。 进一步地， 所述环磷酰胺与所述二氧化硅气凝胶的质量比 为 1 : 0.5 ~ 20。 由上述纳米级环磷酰胺颗粒可制成药学上可接 受的口服制剂。

进一步地， 所述口服制剂为片剂、 丸剂、 散剂、 胶嚢剂、 颗粒剂或混悬剂。 由上述纳米级环磷酰胺颗粒可制成药学上可接 受的注射剂或栓剂。

本发明的另一个目的是提供上述纳米级环磷酰 胺颗粒的制备方法， 其特征 在于， 所述方法包括以下步骤：

( 1 )将环磷酰胺溶解于无水乙醇中；

( 2 ) 向上述乙醇溶液中加入二氧化硅气凝胶；

( 3 )待环磷酰胺与二氧化硅气凝胶吸附完全后， 干燥；

( 4 ) 向上述干燥后的产物中加入纯净水， 并送入乳化机中乳化；

( 5 )将步骤（4 )所得乳化液送入高压均质机中均质；

( 6 ) 步骤（5 )所得均质液干燥后即得纳米级环磷酰胺颗粒� �

当步骤（2 ) 中所述的二氧化硅气凝胶具有疏水性时， 在加入乙醇溶液之前 需先经 300 ~ 1000 °C热处理使其表面的烷基消失而具有亲水性。

进一步地， 所述环磷酰胺的质量与所述无水乙醇的体积之 比为 1 : 5 ~ 200。 进一步地， 步骤（3 ) 中的干燥为自然干燥、 烘箱干燥或冷冻干燥。

进一步地， 步骤（ 4 ) 中纯净水的加入量为 20 ~ 200ml/g环磷酰胺。

进一步地， 步骤（6 ) 中的干燥为喷雾干燥。

有益效果：

1、 本发明首次以二氧化硅气凝胶为载体成功制备 了纳米级环磷酰胺， 与现 有的纳米级环磷酰胺不同， 该纳米级环磷酰胺的直径在 lOOnm以下， 达到了材 料学范畴的纳米级别， 是真正意义上的纳米级环磷酰胺。 尽管直径小于 Ιμιη的 粒子都被称为纳米粒， 然而人们倾向于研制粒径小于 lOOnm的粒子， 因为这些 粒子会表现出一些独特的物理性质， 并因此显示出潜在不同的和有用的生物学 特性。 如， 受机体毛细血管的微循环以及细胞屏障所限， 能够进入血液循环进 而被机体吸收的药物粒子的最佳粒径为 10-100nm。 因此， 本发明的纳米级环磷 酰胺在生物利用度方面有了质的飞跃。

2、 本发明的纳米级环磷酰胺颗粒的载药量可以达 到 90%以上， 是现有的脂 质体纳米粒、 聚合物纳米粒等所望尘莫及的， 其载药量可与纳米晶型药物混悬 剂相媲美， 但制作方法更筒单， 成本更低廉。

3、 本发明以二氧化硅气凝胶为载体成功制备了纳 米级环磷酰胺， 二氧化硅 气凝胶并非当今流行的纳米颗粒材料或纳米粉 末， 而是真正实现了纳米级的载 药空穴新结构。 二氧化硅气凝胶结合已经具有靶向治疗功能的 环磷酰胺原料药， 可以实现"双靶向 "及"多靶向 "抗肿瘤应用， 是真正意义上的"纳米靶向载药系 统"， 实现了纳米药物领域研究者们半个多世纪（纳 米概念 40年代提出） 的梦 相

4、 本发明的纳米级环磷酰胺颗粒中， 环磷酰胺被装载在二氧化硅气凝胶无 数的纳米级空穴中， 形成不会团聚的独立 "纳米分散体"， 结构极其稳定， 直接破 解了微纳米药物研究中因团聚不能成药、 难溶药物很难提高生物利用度等制剂 学国际难题。 该纳米级环磷酰胺是一种高效、 低毒、 经济、 具有"靶向功能"的抗 肿瘤药物，其以"纳米分散"的物理新机制解决� ��环磷酰胺的溶解与吸收难题，使 其药效充分发挥、 口服生物利用度空前提高， 实现了环磷酰胺抗肿瘤药物治疗 中由全身毒性到向肿瘤部位的靶向聚集。

5、 口服抗肿瘤药物一直被视为制药领域的最高端 技术， 数十年久攻不克。 本发明提供的纳米级环磷酰胺， 实现了以纳米摄取为主要吸收方式的全新口服 机理， 又以"纳米固体分散体"的全新结构使得环磷酰� ��的溶解度大大增加，得到 了较好的口服吸收效果， 提高了生物利用度。

6、 本发明的纳米级环磷酰胺中作为载体所使用的 二氧化硅气凝胶的前体为 廉价、 易得、 且已经在药物及食品中广泛应用、 具有国家及国际标准的使用多 年的硅基药食用辅料， 其也是《药用辅料手册》 中记载的辅料之一， 故本发明 的纳米级环磷酰胺的安全性是可靠的。

下面通过抗肿瘤棵鼠实验来说明本发明的纳米 级环磷酰胺的抗肿瘤效果， 实验中所使用的二氧化硅气凝胶均选自具有以 下特性的二氧化硅气凝胶： 孔隙 率为 95 ~ 99%、 孔径为 10 ~ 50nm、 比表面积为 200 ~ 1000m ² /g、 密度为 3 ~ 300kg/m ³ 、 组成网络的胶体颗粒直径为 l ~ 50nm。

1.材料： Balb/c棵鼠， 雌性， 体重为 （18±2 ) g, 购自北京维通利华实验 动物技术有限公司； 实验用环磷酰胺注射液，购自江苏恒瑞药业有 限公司（国 药准字： H32020857 ); 实验用纳米环磷酰胺为本发明实施例 1得到的干粉。 2. 动物模型的建立 收集足量的肿瘤细胞， 用 PBS重悬在离心管中， 以 2xl0 ⁶ cells/O.lml每点皮下接种于棵鼠背部。

3. 实验分组和给药方案 肿瘤模型建立后， 待棵鼠的肿瘤直径为 4 ~ 6mm, 按 5只 /组， 分组。 参考商品药说明书用法用量、 最新《临床肿瘤内科 手册》相关文献与前期实验结果， 口服生物利用度按照 20% ~ 30%, 确定给 药方案； 空白组（仅设一个， 为各组参考）， 注射环磷酰胺组， 25mg/kg, 每 天给药一次， 腹腔注射； 环磷酰胺原料药组， 50mg/kg, 口服灌胃给药， 每天 1次； 纳米环磷酰胺组， 50mg/kg, 口服灌胃给药， 每天 1次。

4.检测方法 给药后动物正常饲养， 每天观察动物一般状态， 记录动物 的体重。 每周 2次测量肿瘤直径（游标卡尺）， 计算肿瘤体积（V ): v= ( ab ² ) /2(式中， a为肿瘤长径， b为肿瘤短径）。比较各组相对肿瘤（ RTV ): RTV=v _t /v ₀ , 式中， V。为分笼给药当天（DayO )测量所得肿瘤体积， v _t 为每一次测量时的 肿瘤体积；

用相对肿瘤体积计算药物对肿瘤体积的抑制率 （ VIR ):

RTV治疗组

VIR= ( 1- )χ100%

RTV阴性对照组

5.实验结果

5.1环磷酰胺治疗人转移棵鼠乳腺癌 MCF-7实验结果见表 1和图 4

表 1

相对肿瘤抑制率％

剂量 时间 4d 7d lid 14d

注射环碑酰胺 25mg/kg A 40.93 45.98 76.17 77.95 口服纳米环磷酰胺 50mg/kg B 59.93 63.25 70.29 69.46 口服环磷酰胺原料药 50mg/kg C 43.65 50.01 55.71 69.92

注： 注射环磷酰胺组， 25mg/kg, 3天 /次腹腔注射给药， 共给药 4次， 5只 /组;

口服纳米环磷酰胺 50mg/kg, 连续给药 4天， 死亡 1只， 5只 /组；

口服环磷酰胺原料药 50mg/kg, 连续给药 4天， 死亡 2只， 5只 /组。

5.2环磷酰胺治疗人转移棵鼠结直肠癌 LOVO实验结果见表 2和图 5

表 2 相对肿瘤抑制率％

剂量 时间 4d 7d l id 14d

注射环磷酰胺 25mg/kg A 22.13 33.63 34.24 35.19 口服纳米环磷酰胺 25mg/kg B 24.78 53.65 46.51 50.88 口服纳米环磷酰胺 50mg/kg C 20.64 32.81 30.58 55.16 注： 注射环磷酰胺组 25mg/kg, 连续给药 14天， 腹腔注射给药， 无死亡， 5只 /组;

口服纳米环磷酰胺 25mg/kg, 连续给药 14天， 死亡 1只， 5只 /组；

口服纳米环磷酰胺 50mg/kg, 连续给药 14天， 死亡 1只， 5只 /组。

5.3结果讨论

1、 实验中根据抗肿瘤药物尽量大剂量使用， 以求快速杀灭癌细胞特点， 用 药量按照最大耐受度 (MTD)设计， 使阳性对照商品药物抗癌效果达到最好水平， 在比较商品药物与本发明口服纳米药物抗癌效 果的同时， 考察比较两者的安全 性；

2、 实验结果表明： 本发明口服纳米制剂的相对肿瘤抑制率优于商 品注射药 物的水平， 毒副作用也明显降低， 提示了本发明口服纳米药物有提高患者生活 质量和延长生存期的良好效果。

附图说明

图 1是本发明用二氧化硅气凝胶的电镜图片；

图 2是环磷酰胺原料药的电镜图片；

图 3是本发明的纳米级环磷酰胺的电镜图片；

图 4是抗肿瘤棵鼠实验研究结果中人转移棵鼠乳� �癌 MCF-7的相对肿瘤抑 制率曲线图；

图 5是抗肿瘤棵鼠实验研究结果中人转移棵鼠结� �肠癌 LOVO的相对肿瘤 抑制率曲线图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明， 以下实施例是对本发明的解 释， 本发明并不局限于以下实施例。

以下实施例中所使用的二氧化硅气凝胶均选自 具有以下特性的二氧化硅气 凝胶： 孔隙率为 95 ~ 99%、 孔径为 10 ~ 50nm、 比表面积为 200 ~ 1000m ² /g、 密 度为 3 ~ 300kg/m ³ 、 组成网络的胶体颗粒直径为 1 ~ 50nm。

实施例 1 本实施例的纳米级环磷酰胺按以下方法制备：

1、 环磷酰胺原料药 （湖北海泊元化工有限公司） lg, 加入无水乙醇 20ml 溶解；

2、 加入 500 °C热处理后的二氧化硅气凝胶 2g进行吸附；

3、 待吸附完全后， 于 60°C烘箱干燥；

4、 干燥后， 加入 100ml纯净水， 25000rpm/min普通乳化机乳化， 5min;

5、 高压均质机（上海东华 GYB 30-6S ), 400bar, 循环 6次， lOmin;

6、 将均质液于实验型喷雾干燥机（上海顺仪科技 SP-1500 )喷雾干燥， 参 数： 温度 130°C , 流速 500ml/h, 喷头： 0.75mm, 干燥后得到纳米级环磷酰胺颗 粒。

实施例 2

本实施例的纳米级环磷酰胺按以下方法制备：

1、 环磷酰胺原料药 （湖北海泊元化工有限公司） lg, 加入无水乙醇 5ml溶 解；

2、 加入 1000 °C热处理后的二氧化硅气凝胶 0.5g进行吸附；

3、 待吸附完全后， 自然干燥；

4、 干燥后， 加入 20ml纯净水， 25000rpm/min普通乳化机乳化， 5min;

5、 高压均质机（上海东华 GYB 30-6S ), 400bar, 循环 8次， lOmin;

6、 将均质液于实验型喷雾干燥机（上海顺仪科技 SP-1500 )喷雾干燥， 参 数： 温度 130°C , 流速 500ml/h, 喷头： 0.75mm, 干燥后得到纳米级环磷酰胺颗 粒。

实施例 3

本实施例的纳米级环磷酰胺按以下方法制备：

1、 环磷酰胺原料药 （湖北海泊元化工有限公司） lg, 加入无水乙醇 150ml 溶解；

2、 加入亲水性二氧化硅气凝胶 15g进行吸附；

3、 待吸附完全后， 冷冻干燥；

4、 干燥后， 加入 150ml纯净水， 25000rpm/min普通乳化机乳化， 5min;

5、 高压均质机（上海东华 GYB 30-6S ), 400bar, 循环 7次， lOmin; 6、 将均质液于实验型喷雾干燥机（上海顺仪科技 SP-1500 )喷雾干燥， 参 数： 温度 130°C , 流速 500ml/h, 喷头： 0.75mm, 干燥后得到纳米级环磷酰胺颗 粒。

实施例 4

本实施例的纳米级环磷酰胺按以下方法制备：

1、 环磷酰胺原料药 （湖北海泊元化工有限公司） lg, 加入无水乙醇 200ml 溶解；

2、 加入 300 °C热处理后的二氧化硅气凝胶 20g进行吸附；

3、 待吸附完全后， 于 60°C烘箱干燥；

4、 干燥后， 加入 200ml纯净水， 25000rpm/min普通乳化机乳化， 5min;

5、 高压均质机（上海东华 GYB 30-6S ), 400bar, 循环 6次， lOmin;

6、 将均质液于实验型喷雾干燥机（上海顺仪科技 SP-1500 )喷雾干燥， 参 数： 温度 130°C , 流速 500ml/h, 喷头： 0.75mm, 干燥后得到纳米级环磷酰胺颗 粒。

实施例 5

本实施例的纳米级环磷酰胺按以下方法制备：

1、 环磷酰胺原料药 （湖北海泊元化工有限公司） lg, 加入无水乙醇 70ml 溶解；

2、 加入 700 °C热处理后的二氧化硅气凝胶 7g进行吸附；

3、 待吸附完全后， 冷冻干燥；

4、 另取 6g的 PEG-4000加入 400ml的无水乙醇中溶解；

5、 将步骤 3冻干后的固体加入上述 PEG-4000的乙醇溶液中， 超声乳化机 乳化 3min;

6、 将步骤 5的乳化液于 60°C电热恒温干燥箱中干燥 12h;

7、 研磨步骤 6干燥后的固体， 并过 200目筛， 得到纳米级环磷酰胺颗粒。 实施例 6

实施例 1至 5得到的纳米级环磷酰胺颗粒与适量的微晶纤� �素、 淀粉和硬 脂酸镁混合均匀后， 用压片机压片， 得到本发明的纳米级环磷酰胺片剂。 将实施例 1至 5得到的纳米级环磷酰胺颗粒直接装填入硬胶� �壳中， 得到 本发明的纳米级环磷酰胺胶嚢剂。

实施例 8

实施例 1至 5得到的纳米级环磷酰胺颗粒加入水溶液中， 搅拌均勾， 得到 本发明的纳米级环磷酰胺混悬液。 该混悬液可以直接口服， 也可以按照注射剂 的制备标准制成注射剂。

实施例 9

实施例 1至 5得到的纳米级环磷酰胺颗粒与适量的 Witepsol,采用热熔法制 备得到本发明的纳米级环磷酰胺栓剂。