本发明涉及材料化学和生物学技术领域， 具体地， 本发明涉及一种近红外硫 化银量子点、 其制备方法及其生物应用。 背景技术

作为生物医学研究的基本手段， 荧光标记和检测技术将在亚细胞水平、细胞 水平和活体水平这三个层面的研究中发挥重要 作用，近红外量子点荧光成像技术 在活体水平成像有很多独特的优势， 比如对组织穿透深度较大， 能够克服可见光 量子点在进行深层组织成像时易受背景荧光干 扰的缺陷等。 因此在医学诊断学、 分子生物学、细胞生物学等方面引起了人们广 泛的关注。 目前常见的近红外量子 点都含有 Cd、 Hg、 Pb等具有毒性的元素。 低毒甚至无毒的具有近红外荧光的硫 化银 ( Ag ₂ S )量子点已经被报道 ( Near-infrared photo luminescent Ag ₂ S quantum dots from a single source precursor. J. Am. Chem. Soc, 2010, 132, 1470),但是颗粒偏大， 近红外荧光强度还不够强。对于其他文献报道 的 Ag ₂ S， 还没有荧光的报导， 而且 制备方法较复杂、均一性和分散性不好。再者 ， 现在报道中关于对量子点进行表 面功能化， 也就是由疏水性转为亲水性， 使之应用于生物医学研究的文章较多， 但是基本上都不适用于 Ag ₂ S量子点， 因为 Ag ₂ S量子点均为超晶格状态， 常规方 法难以打开超晶格， 而且 Ag ₂ S转水相过程中不适用氧化性强的试剂。 因此， 发展 出一种工艺简易、 产物尺寸均匀、 粒子分散性好、 荧光强度高、 重复性好的高质 量 Ag ₂ S量子点的制备方法和表面功能化方法使� �具有生物相容性能，从而可在生 物领域得到应用具有重要的意义。 发明内容

本发明的目的在于， 为了克服上述问题提供了一种近红外硫化银量 子点，该 近红外 Ag ₂ S量子点具有高荧光产率、 荧光稳定性、 尺度均一、 制备工艺简单等 优点， 且通过表面功能化处理还可具有良好生物相容 性， 能应用于生物成像。

根据本发明的近红外硫化银量子点，所述硫化 银量子点表面连接有来源于含 巯基亲水性试剂的亲水性基团， 所述亲水性试剂为巯基乙酸、巯基丙酸、半胱 氨 酸、 半胱胺、 辛硫酸和巯基乙酸铵的任意一种或两种以上的 组合。 本发明的再一目的在于为了克服上述问题，提 供了一种制备近红外硫化银量 子点的方法， 所述方法包括以下步骤：

1 ) 疏水性硫化银量子点的制备；

2)将步骤 1 )中的疏水性硫化银量子点与等量或过量的含� �基的亲水性试剂 在含有极性有机溶剂中反应，使其表面连接有 亲水性基团， 得到近红外硫化银量 子点； 在本发明中， 只要含巯基的亲水性试剂的摩尔数大于或等于 疏水性硫化银 量子点时，制备得到的亲水性的硫化银量子点 都具有良好的效果， 在制备过程中 可以根据实际需要对该比例进行调节， 但都可以实现本发明所述目的。

所述亲水性试剂为巯基乙酸、 巯基丙酸、 半胱氨酸、 半胱胺、 辛硫酸和巯基 乙酸铵的任意一种或两种以上的组合。

根据本发明的制备近红外硫化银量子点的方法 ， 所述步骤 2) 中所述极性有 机溶剂包括乙醇、 甲醇、 丙酮和 1-甲基 -2-吡咯烷酮中的任意一种或多种， 但不局 限于所述有机溶剂， 调节所述步骤 2) 中疏水性硫化银量子点与含巯基的亲水性 试剂混合体系的 pH为 7-14， 在含有极性有机溶剂中 2-80°C下反应 3小时以上， 在 本发明中， 只要反应时间大于或等于 3小时， 制备得到的亲水性的硫化银量子点 都具有良好的效果，在制备过程中可以根据实 际需要对该比例进行调节， 但都可 以实现本发明所述目的。

优选的， 所述步骤 1 ) 中疏水性硫化银量子点的制备方法包括以下步 骤：

1-1 )将包含银源和长链硫醇的混合反应体系于密� �环境中加热至 80-350°C, 并充分反应；

1-2) 将混合反应体系自然冷却至室温后加入极性溶 剂， 经离心、 洗涤得到 疏水性近红外硫化银量子点；

其中， 所述银源包括硝酸银、二乙基二硫代氨基甲酸 银、 二烃基二硫代磷酸 银、 磺基丁二酸银二辛酯、 硫代苯甲酸银、 乙酸银、 十二酸银、 十四酸银和十八 酸银中的一种或多种；

所述长链硫醇包括辛硫醇、 ^一硫醇、 十二硫醇、 十三硫醇、 十四硫醇、十 五硫醇、 十六硫醇、 十八硫醇、 二十硫醇、 己硫醇、 1，6 己二硫醇和 1，8 辛二硫 醇中的一种或多种。

根据本发明的制备近红外硫化银量子点的方法 ， 作为优选， 所述步骤 1-2) 的混合反应体系中还包括具有配位特性的表面 活性剂，所述表面活性剂为长链烷 基酸、 烷基胺、 长链醇、 长链硫醇和醚中的任意一种或两种以上的组合 ； 所述混 合反应体系置于密闭环境中反应。 作为更进一步的优选， 所述步骤 2) 中疏水性 硫化银量子点与含巯基的亲水性试剂是在持续 搅拌和 /或震荡和 /或超声的条件下 在 2-80 V含有极性有机溶剂中反应 3小时以上。

根据本发明的制备近红外硫化银量子点的方法 ，通过本发明所述方法制备得 到的近红外硫化银量子点具有单斜相结构， 其粒径在 8 nm以下。

本发明所述的近红外硫化银量子点在生物组织 成像中的应用。

本发明采用银源和长链硫醇作为反应物，在存 在具不同配位特性的表面活性 剂的反应体系中进行成核与生长，得到疏水性 硫化银量子点， 其中长链硫醇提供 硫源并可以做溶剂和表面活性剂；然后将制备 得到的疏水性量子点用含巯基的亲 水性试剂进行表面功能化， 因为巯基和银具有很好的结合能力， 它可以替代硫化 银量子点表面的其它基团，得到一种低毒生物 相容性好的高荧光产率近红外硫化 银量子点。与现有技术中将疏水性物质改性为 亲水性物质不同的是本发明中首先 制备得到的 Ag ₂ S量子点为超晶格状态， 由于该结构的特殊性，若采用现有技术中 的改性实验条件， 根本不可能将疏水性的 Ag ₂ S量子点改性为亲水性的 Ag ₂ S量子 点， 通过大量的实验、总结以及结合发明人的经验 ， 发现在对该特殊结构的 Ag ₂ S 量子点进行改性时，其改性时间对改性效果具 有重要的影响，为关键的实验条件, 并且发现当改性时间在 3小时或 3小时以上时能达到较好的改性效果， 时间越长， 其改性效果越好， 因此， 在制备过程中可以根据实际需要对时间进行调 节， 但只 要 3小时以上都可以实现本发明所述目的， 而且改性后的亲水性 Ag ₂ S量子点为单 分散， 不会发生团聚， 具有良好的亲水性和稳定性， 并可以进行细胞成像， 尤其 可以应用于活体进行成像。

具体来看，本发明的工艺为：采用银源、长链 硫醇和合适的表面活性剂混合, 放置在一密闭装置中， 加热到合适的温度保持一定的时间， 使其成核生长； 然后 让其自然冷却， 加入过量的乙醇离心、洗涤得到疏水性硫化银 量子点。然后将制 备得到的疏水性量子点、一定量的含巯基的亲 水性试剂和乙醇混合， 搅拌、震荡 或超声使其充分反应，再用水离心洗涤得到一 种低毒生物相容性好的高荧光产率 近红外硫化银量子点， 最后进行细胞成像。

此外， 上述技术方案的优化方案还可以包括：

1. 该反应使用不同的银源、 不同的长链硫醇、 不同的表面活性剂、 不同的 反应温度、 不同的反应时间均可以来调控硫化银纳米颗粒 的大小， 如升高温度， 延长反应时间可以使颗粒变大。 2.该反应根据不同含巯基的亲水性试剂修饰的� ��同，可以通过调节 pH值 (在 碱性 7-14时分散性较好)来改变功能化后的 Ag ₂ S量子点在水溶液中的分散性。

实施本发明的技术方案，较之于现有技术其显 著的优点在于： 本发明的方法 反应条件温和、 操作简单、 制备周期短、 重复性好、 易控制， 制备出来的 Ag ₂ S 量子点荧光产率高、 荧光稳定性好、 生物相容性佳、 尺寸均一性好， 可以进行包 括细胞在内的生物组织以及活体内的成像。 附图说明

图 1是实施例 1中疏水 Ag ₂ S量子点的透射电子显微镜照片；

图 2是实施例 1中疏水性 Ag ₂ S量子点的近红外荧光光谱图；

图 3是实施例 1中亲水性 Ag ₂ S量子点的近红外荧光光谱图；

图 4是硫化银近红外量子点对细胞的特异性标记� �光照片；

图 5是硫化银近红外量子点对小鼠活体肿瘤的特� �性标记荧光照片。 具体实施方式

以下通过两个具体实施例， 详细介绍本发明的制备工艺过程：

实施例 1

将 0.1 mmol的二乙基二硫代氨基甲酸银、 10 g 十二硫醇混合置于烧瓶中，在 N ₂ 气氛中升温至 200 °C保持 1 h， 最后待溶液自然冷却至室温后， 加入 50 mL无 水乙醇， 经离心、 洗涤， 分散在环己烷中， 所得的样品用透射电子显微镜经 X射 线衍射鉴定为单斜相的 Ag ₂ S 量子点 （其粒径在 5 nm左右， 如图 1所示）， 得到了 具有很好的如图 2所示近红外荧光发射光谱； 将 0.15 g硫辛酸加入上述环己烷中， 再加入同等体积的无水乙醇， 在超声清洗器中超声 4 h， 然后离心， 用去离子水 洗涤，得到粒径在 5 nm左右的水溶性 Ag ₂ S 量子点，荧光发射依然很强（如图 3 所 示）； 将 0.25 mg 上述 Ag ₂ S量子点分散在 lOO L 二甲基亚砜 （DMSO ) 里， 再将 含 O.Ol mmol NHS 的 50 DMSO 溶液与上述溶液混合； 再将含 O.Olmmol EDC 的 50 DMSO 溶液加入到上述混合溶液中， 用铝箔包裹， 搅拌 l h， 离心， 再 分散在 100 μL DMSO 里；将 15 μL 2 mg/mL 艾比特思（Erbitux)与 185 μL lx PBS 的混合溶液加到 100 uL Ag ₂ S/DMSO 混合溶液里，在 4°C避光反应 12 h，然后 400 g 离心 4 min， 取上清液； 将 MDA-MB-468 细胞加到上述 100 上清液和 100 lx PBS 的混合溶液中在 4°C着色 2 h， 再用 lx PBS 溶液洗涤 3次； 用 658 nm 的激光 器激发， 1100 nm 的滤光片， 用 2D 的 InGaAs 照相机拍照， 可以很清楚得看出 Ag ₂ S 量子点在细胞里发光 （参阅图 4)。

实施例 2

将 0.1 mmol 的硝酸银、 8g 十二硫醇和 5.4 g 油胺混合置于三口烧瓶中， 在 空气中升温至 180 °C保持 lh，最后待溶液自然冷却至室温后，加入 50mL无水乙 醇， 经离心、 洗涤， 分散在环己烷中， 所得的样品用透射电子显微镜经 X射线 衍射鉴定为单斜相的 Ag ₂ S 量子点， 其粒径在 8nm 以下， 并亦具有良好近红外 荧光发射光谱； 将 0.2 gL-半胱氨酸加入上述环己烷中， 再加入同等体积的无水 乙醇， 搅拌 24h， 然后离心， 用去离子水洗涤， 得到粒径在 8 nm左右的水溶性 Ag ₂ S 量子点， 其荧光发射依然很强； 将 0.25mg 上述 Ag ₂ S 量子点分散在 ΙΟΟμΙ^ 二甲基亚砜（DMSO)里， 再将含 0.01 mmol NHS 的 50 DMSO 溶液与上述溶 液混合； 再将含 0.01 mmol EDC 的 50 DMSO 溶液加入到上述混合溶液中，用 铝箔包裹， 搅拌 l h， 离心， 再分散在 100 DMSO 里； 将 15 2 mg/mL艾比特 思 （Erbitux) 与 185 LlxPBS 的混合溶液加至 IjlOOuL Ag ₂ S/DMSO 混合溶液里， 在 4°C避光反应 12h， 然后 400 g 离心 4min， 取上清液； 将 MDA-MB-468细胞加 到上述 100 上清液和 ΙΟΟμΙ^ lxPBS 的混合溶液中在 4°C着色 2 h， 再用 lxPBS 溶液洗涤 3 次；用 658nm 的激光器激发， 1100 nm 的滤光片，用 2D 的 InGaAs 照 相机拍照， 可以很清楚得看出 Ag ₂ S 量子点在细胞里发光的照片。

实施例 3

将 0.1 mmol 的硫代苯甲酸银、 8 g 十六硫醇和 2 g三辛基氧化磷混合置于三 口烧瓶中， 在空气中升温至 160 °C保持 4h， 最后待溶液自然冷却至室温后， 加入 50mL无水乙醇， 经离心、 洗涤， 分散在环己烷中； 将 0.1 g巯基丙酸加入上述 环己烷中， 再加入同等体积的无水乙醇， 在振荡器上振荡 8 h， 然后离心， 用去离 子水洗涤， 得到粒径在 6 nm左右的水溶性 Ag ₂ S 量子点， 荧光发射依然很强； 将 0.25mg 上述 Ag ₂ S 量子点分散在 100 二甲基亚砜（DMSO)里，再将含 0.01 mmolNHS 的 50 μL DMSO 溶液与上述溶液混合；再将含 0.01 mmol EDC的 50 μL DMSO 溶液加入到上述混合溶液中， 用铝箔包裹， 搅拌 lh， 离心， 再分散在 100 LDMSO 里； 将 15 L2mg/mL艾比特思 （Erbitux) 与 185 lx PBS的混合溶 液加到 100uLAg ₂ S/DMSO 混合溶液里， 在 4°C避光反应 12h， 然后 400g 离心 4 min, 取上清液； 将 MDA-MB-468 细胞加到上述 100 μΐ^ 上清液禾 Β ΙΟΟμ χ PBS 的混合溶液中在 4°C着色 2h， 再用 lxPBS 溶液洗涤 3 次； 用 658nm 的激光器激 发， llOOnm 的滤光片，用 2D 的 InGaAs 照相机拍照，可以很清楚得看出 Ag ₂ S 量 子点在细胞里发光的照片。

实施例 4

将 0.1 mmol 的十六酸银、 5g 十六硫醇和 4 g 十八胺混合置于三口烧瓶中， 在 Ar气氛中升温至 200 °C保持 1 h， 最后待溶液自然冷却至室温后， 加入 50mL 无水乙醇， 经离心、 洗涤， 分散在环己烷中； 将 0.12 g巯基乙酸加入上述环己烷 中， 再加入同等体积的无水乙醇， 搅拌 24h， 然后离心， 用去离子水洗涤， 得到 粒径在 6nm 左右的水溶性 Ag ₂ S 量子点， 荧光发射依然很强； 将 0.25 mg 上述 Ag ₂ S 量子点分散在 100 二甲基亚砜（DMSO)里， 再将含 0.01 mmol NHS 的 50 μΐ DMSO 溶液与上述溶液混合；再将含 0.01 mmol EDC 的 50 μ DMSO 溶液 加入到上述混合溶液中， 用铝箔包裹， 搅拌 l h， 离心， 再分散在 100 DMSO 里； 将 15 L2mg/mL 艾比特思 （Erbitux) 与 185 L lxPBS 的混合溶液加到 100uLAg ₂ S/DMSO 混合溶液里， 在 4°C避光反应 12h， 然后 400 g 离心 4 min， 取 上清液； 将 MDA-MB-468 细胞加到上述 100 上清液和 ΙΟΟμΙ^ lx PBS 的混合 溶液中在 4°C着色 2h， 再用 lxPBS 溶液洗涤 3 次；用 658nm 的激光器激发， 1100 nm的滤光片， 用 2D 的 InGaAs 照相机拍照， 可以很清楚得看出 Ag ₂ S 量子点在 细胞里发光的照片。

实施例 5

将 0.1 mmol 的二烃基二硫代磷酸银、 10g 二十硫醇和 4 g 十六胺混合置于三 口烧瓶中， 在 Ar气氛中升温至 230 °C保持 0.5 h， 最后待溶液自然冷却至室温后， 加入 50mL无水乙醇， 经离心、 洗涤， 分散在环己烷中； 将 O.l g 半胱胺加入上 述环己烷中， 再加入同等体积的无水乙醇， 搅拌 24h， 然后离心， 用去离子水洗 涤，得到粒径在 5 nm左右的水溶性 Ag ₂ S 量子点，荧光发射依然很强；将 0.25 mg 上述 Ag ₂ S 量子点分散在 100 二甲基亚砜（DMSO)里，再将含 0.01 mmol NHS 的 50 μΐ DMSO 溶液与上述溶液混合； 再将含 0.01 mmol EDC的 50 μ DMSO 溶 液加入到上述混合溶液中， 用铝箔包裹， 搅拌 lh， 离心， 再分散在 100 DMSO 里；将 15 μL 2 mg/mL 艾比特思（Erbitux)与 185 μL lx PBS的混合溶液加到 lOOuL Ag ₂ S/DMSO 混合溶液里，在 4°C避光反应 12h， 然后 400g 离心 4 min，取上清液； 将 MDA-MB-468 细胞加到上述 100 上清液和 ΙΟΟμ χ PBS 的混合溶液中在 4°C着色 2h， 再用 lxPBS 溶液洗涤 3 次； 用 658nm 的激光器激发， 1100 nm 的 滤光片， 用 2D 的 InGaAs 照相机拍照， 可以很清楚得看出 Ag ₂ S 量子点在细胞里 发光的照片。 实施例 6

将 0.1 mmol 的十二酸银、 8 g 辛硫醇和 4 g 十二胺胺混合置于三口烧瓶中， 在 Ar气氛中升温至 200 °C保持 0.5 h， 最后待溶液自然冷却至室温后， 加入 50 mL 无水乙醇， 经离心、 洗涤， 分散在环己烷中； 将 0.12 g巯基乙酸加入上述环己烷 中， 再加入同等体积的无水乙醇， 搅拌 24 h， 然后离心， 用去离子水洗涤， 得到 粒径在 5 nm 左右的水溶性 Ag ₂ S 量子点， 荧光发射依然很强； 将 0.25 mg 上述 Ag ₂ S 量子点分散在 100 二甲基亚砜（DMSO )里， 再将含 0.01 mmol NHS 的 50 μΐ DMSO 溶液与上述溶液混合；再将含 0.01 mmol EDC 的 50 μ DMSO 溶液 加入到上述混合溶液中， 用铝箔包裹， 搅拌 l h， 离心， 再分散在 100 DMSO 里； 将 15 L 2 mg/mL 艾比特思 （Erbitux ) 与 185 L lx PBS 的混合溶液加到 100uLAg ₂ S/DMSO 混合溶液里， 在 4°C避光反应 12 h， 然后 400 g 离心 4 min， 取 上清液； 将 MDA-MB-468 细胞加到上述 100 上清液和 ΙΟΟμΙ^ lx PBS 的混合 溶液中在 4°C着色 2 h， 再用 lx PBS 溶液洗涤 3 次；用 658 nm 的激光器激发， 1100 nm的滤光片， 用 2D 的 InGaAs 照相机拍照， 可以很清楚得看出 Ag ₂ S 量子点在 细胞里发光的照片。

综上所述，本发明的方法反应条件温和、操作 简单、制备周期短、重复性好、 易控制； 制备出来的 Ag ₂ S 量子点荧光产率高、 荧光稳定性好、 生物相容性佳、 尺寸均一性好， 并且可以很好地进行细胞和动物成像； 而且很容易放大反应，适 于大规模工业化生产。

以上仅是本发明众多具体应用范例中的颇具代 表性的实施例，对本发明的保 护范围不构成任何限制。凡采用等同变换或是 等效替换而形成的技术方案， 均落 在本发明权利保护范围之内。