FUNGICIDA

ESTADO DE LA TÉCNICA

La quitina se encuentra ampliamente distribuida en Ia naturaleza, y de forma muy importante como polisacárido estructural en Ia pared celular de los hongos, llegando a alcanzar hasta un 16% del peso seco total en hongos filamentosos y basidiomicetos. Es un homopolímero insoluble en agua de carácter estructural formado por n repeticiones de N-acetil glucosamina unidas por enlaces β(1-4). También se encuentra en el exoesqueleto de artrópodos, cubierta de crustáceos, etc. Es uno de los polímeros más abundantes en Ia Naturaleza después de Ia celulosa.

La quitina es por tanto el compuesto más importante en el mantenimiento de Ia estructura de Ia pared fúngica, por Io que podría ser utilizado como blanco para Ia obtención de compuestos proteicos solubles de acción antifúngica.

La enzima conocida como quitinasa está presente en un amplio rango de organismos, particularmente microorganismos y frecuentemente de origen bacteriano, y su acción determina Ia hidrólisis del polímero de quitina impidiendo Ia viabilidad del hongo.

Entre los organismos que expresan quitinasa se encuentran virus, bacterias, hongos y plantas. La función de esta enzima en cada organismo es diversa, jugando importantes papeles fisiológicos y ecológicos: en invertebrados se requiere para Ia degradación parcial de sus antiguos exoesqueletos, en plantas como un mecanismo de defensa contra hongos patógenos, y en bacterias, para las funciones de nutrición y parasitismo, pudiéndose aplicar para el control de fitopatógenos en Ia agricultura. Hoy en día, Ia agricultura se ha hecho más vulnerable a las plagas de hongos debido, entre otras causas, a Ia escasa variación genética que presentan las plantas de cultivo a gran escala. Los hongos proliferan rápidamente, estimulados por el suelo rico en nutrientes y húmedo, ejerciendo un efecto devastador en los cultivos. No sólo afectan a Ia agricultura, el ser humano también puede ser un hospedador de estos patógenos oportunistas, particularmente cuando se encuentra en estados de inmunodepresión.

La quitinasa de Bacillus subtilis (EC 3.2.1.14) es una enzima de Ia familia 18 de Ia glicosil-hidrolasas que cataliza Ia degradación de Ia quitina. Bacillus subtilis es uno de los microorganismos con capacidad para secretar una gran variedad de enzimas extracelulares degradantes de polisacáridos, Io que hace que sea un microorganismo idóneo para Ia secreción de proteínas de interés comercial.

Las técnicas de ingeniería genética y biología molecular facilitan Ia sobreproducción de enzimas en microorganismos, Io que puede ser utilizado en los procesos de fermentación industrial para producir grandes cantidades de una enzima particular. Desde un punto de vista industrial, producir Ia mayor cantidad de una enzima determinada se hace necesario recurrir a las técnicas anteriormente citadas para sobreproducir Ia mayoría de las enzimas empleadas en esta industria.

DESCRIPCIÓN

La cepa de Bacillus subtilis 168 presenta dentro de su genoma Ia secuencia SEQ ID 7, que a pesar de estar secuenciada, no tenía hasta Ia fecha descrita, ni asociada por homología a secuencias similares en otros genomas, ninguna función concreta. En Ia presente invención se determina Ia función de este gen concreto como codificante para una nueva quitinasa, aspecto principal de Ia presente invención.

La presente invención se refiere a una nueva enzima quitinasa codificada por Bacillus subtilis 168, a un método para producir dicha quitinasa y su uso como fungicida.

Por otro lado, se describe más adelante mediante ejemplos el efecto fungicida, tanto in vivo como in vitro, de Ia quitinasa de Ia presente invención sobre diferentes especies de hongos, demostrando Ia efectividad de Ia misma.

Por todo ello, un primer aspecto de Ia invención se refiere a un polipéptido codificado por un polinucleótido que presenta al menos un 70% de homología con SEQ ID 1 , que presenta al menos un 80% de homología con SEQ ID 1 , que presenta al menos un 90% de homología con SEQ ID 1 o que consiste esencialmente en SEQ ID 1. A partir de ahora nos referiremos a ella como polipéptido de Ia invención.

Un segundo aspecto de Ia invención se refiere a Ia construcción génica que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica al polipéptido como se define en Ia reivindicación anterior y: a. una secuencia polinucleotídica que comprende SEQ ID NO 2, b. moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con Ia secuencia polinucleotídica de a), o c. moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a Ia degeneración del código genético

Un tercer aspecto de Ia invención plásmido recombinante que comprende:

Ia construcción génica según Ia reivindicación anterior

- el gen cat,

- el origen de replicación del plásmido pRMIcat de Escheríchia coli y del plásmido pPCT2 para Bacillus subtilis, - un gen repórter de promotores, y un gen de resistencia a kanamicina.

Otro aspecto de Ia invención se refiere al método de obtención del polipéptido de Ia invención que comprende introducir Ia construcción génica según Ia reivindicación 2 o el plásmido recombinante según Ia reivindicación 3, en una célula hospedante e incubar Ia célula hospedante según a) en un medio de cultivo adecuado.

Una realización preferida de dicho método además comprende purificar el polipéptido obtenido. En otra realización preferida Ia célula hospedadora se selecciona del grupo que comprende E. coli y B. subtilis.

Otro aspecto de Ia invención se refiere al uso del polipéptido de Ia invención como quitinasa. Finalmente otro aspecto de Ia invención es el uso del polipéptido de Ia invención como fungicida.

Adicionalmente, se describe en Ia presente invención un método que permite Ia sobreproducción de proteínas de interés biológico, preferiblemente de forma extracelular, en este caso, Ia sobreproducción de Ia enzima de interés, polipéptido de Ia invención. Para ello, se utiliza un promotor específico. Este método de promoción de Ia expresión también puede ser utilizado para Ia expresión de otros genes de interés, mediante su inclusión en el plásmido recombinante descrito en Ia presente invención.

Específicamente, se describe un vector de expresión para sobreproducir proteínas regulado por un promotor de B. subtilis o para inducir Ia secreción de las proteínas al medio exterior, las células transformadas con este vector y el uso de las mismas para Ia sobreproducción de Ia enzima hidrolítica extracelular quitinasa.

El uso del promotor utilizado para Ia sobrexpresión no está limitado al gen para Ia quitinasa de B. subtilis, sino que permite expresar otras proteínas homologas o heterólogas ya que Ia utilización de Ia secuencia del promotor csn (SEQ ID NO 2) para Ia regulación de Ia expresión de genes de interés produce incrementos de los mismos en comparación con el uso de los propios promotores de estos genes.

En Ia presente invención se describe en detalle el método de elaboración del plásmido recombinante pCSN73 mediante Ia amplificación de Ia SEQ ID NO 3, utilizando cebadores específicos, preferentemente los cebadores que comprenden Ia SEQ ID NO 4 y Ia SEQ ID NO 5 y el ligado del fragmento de DNA amplificado con el plásmido lanzadera pNR2.

Así mismo se describe un método de elaboración de un plásmido que comprende Ia amplificación mediante cebadores específicos de Ia secuencia nucleotídica de B. subtilis que a su vez comprende Ia secuencia codificante para Ia proteína madura del gen yvbx y el terminador de Ia transcripción independiente del factor de terminación rho; Ia posterior digestión mediante endonucleasas del fragmento amplificado y del plásmido pCSN73; Ia purificación de los fragmentos obtenidos en Ia digestión; Ia desfoforilación de los extremos 5 P del plásmido; y el ligado de los fragmentos purificados. Preferentemente el método de elaboración del plásmido de Ia invención utiliza los cebadores que comprenden Ia SEQ ID NO 6 y Ia SEQ ID NO 7.

Dichos plásmidos se pueden utilizar en Ia transformación de bacterias, por ejemplo pero sin limitarse, las bacterias transformadas se seleccionan del grupo que comprende E. coli y B. subtilis.

El término esencialmente, tal y como se utiliza en Ia presente invención, se refiere a las secuencias resultantes de Ia eliminación de aminoácidos de las regiones N-terminal y/o C-terminal de cualquiera de Ia secuencia SEQ ID NO: 1

A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Fig. 1. Ensayo in vivo de Ia actividad fungicida de quitinasa sobre Fusarium proliferatum. Se indican las diluciones del cultivo del hongo ensayadas.

Fig. 2. Ensayo in vivo de Ia actividad fungicida de quitinasa sobre Aspergillus ochraceus. Se indican las diluciones del cultivo del hongo ensayadas

EJEMPLOS DE REALIZACIÓN

Las cepas bacterianas empleadas han sido: Bacillus subtilis 168 proporcionada por F. Kunst y Escheríchia coli MC1061 y ésta última se ha empleado para Ia propagación del plásmido construido en esta invención. Los métodos empleados para el crecimiento y Ia manipulación de las cepas se han realizado según Sambrook y colaboradores [SambrooK, Firtsch y Maniatis, 1989. "Molecular cloning". A laboratory manual. CoId Spring Harbor Laboratory Press].

EJEMPLO 1 : Elaboración del plásmido recombinante pCSN73

El promotor de Ia presente invención, que posee una elevada actividad promotora, se identificó mediante Ia secuenciación de una librería genómica de Bacillus subtilis 168 [Anagnostopoulos C, Piggot, P. J. y Hoch, J. A. (1993). "The genetic map of Bacillus subtilis". In Bacillus subtilis and other Gram- positive Bacteria: Biochemistry, Physiology and Molecular Genetics, pp.425- 461. Edited by A. J. Sonenshein, J. A. Hoch & R. Losick. Washington, DC: American Society for Microbiology] en Ia posición 2748.10 kb del cromosoma.

Esta secuencia de DNA está situada en Ia región promotora del gen csn que codifica una proteína extracelular con actividad quitosanasa (n° de acceso: X92868) y descrita por Víctor Parro y colaboradores [Víctor Parro, Marta San Román, Inmaculada Galindo, Bénédicte Purnelle, Alexei Bolotin, Sorokin y Rafael P. Mellado. (1997). "A 2391 1 bp región of the Bacillus subtilis genome comprising genes located upstream and downstream of the lev operon". Microbiology 143: 1321 -1326].

La SEQ ID NO 3 muestra el fragmento de DNA de 445 nucleótidos obtenido a partir de Ia secuencia de DNA de Ia región cromosómica de Bacillus subtilis 168 comprendida entre las bases 2.748,1 17 y 2.748,562 de Ia secuencia publicada por Kunst et al. [Kunst, F. et al., (1997). "The complete genome sequence of the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis". Nature, vol

390: 249-256]. Esta secuencia de DNA incluye una secuencia de ADN promotora que contiene una región similar a Ia caja TATA localizada aproximadamente 10 pb delante del punto de iniciación de Ia transcripción y que induce Ia iniciación de Ia transcripción de Ia RNA polimerasa (nucleótidos

1-295). La secuencia promotora se presenta aislada en Ia SEQ ID NO 2.

A partir de dicha secuencia (SEQ ID NO 3) se diseñaron dos oligonucleótidos que permitieron amplificar por PCR un fragmento de DNA de 295 pb conteniendo Ia región promotora (oligonucleótidos prcsn1 -prcsn2). SEQ ID NO 4: prcsni : (directo) SEQ ID NO 5: prcns2: (inverso).

El fragmento de DNA de 295 pb se amplificó mediante Ia pareja de oligonucleótidos prcsni- prcsn2 a partir de DNA genómico de Bacillus subtilis 168. Las células de Bacillus subtilis 168 obtenidas mediante centrifugación a partir de 20 mi de un cultivo en medio LB, en fase exponencial, se usaron siguiendo el método de Cutting y Van der Horn [Simón M. Cutting y Peter B. Van der Horn. (1990). "Genetic Analysis". Molecular Biológica! Methods for Bacillus. Ed. CR. Harwood y S. M. Cutting]. En un tubo de PCR se añadieron 10 μl de tampón de enzima, dNTPs 1 mM de concentración final, Cl2Mg 1 ,5 mM de concentración final, 280 ng de cada uno de los oligonucleótidos, 500 ng de DNA cromosómico de Bacillus subtilis 168 y 1 U de DNA polimerasa (Ecogen), completando el volumen final a 100 μl. Cada ciclo de PCR constó de:1' a 94 ⁰ C; 5' a 55 ⁰ C y 2' a 72 ⁰ C durante 30 ciclos y se realizó en un termociclador modelo PTC-1000 de MJ. Research, Inc..

El fragmento de DNA obtenido mediante PCR se ligó al plásmido lanzadera pNR2, que contiene el gen de resistencia a kanamicina y el origen de replicación del plásmido pPCT2 para Bacillus subtilis, el gen cat, un gen "repórter" de promotores que codifica para Ia enzima cloranfenicol- acetiltransferasa y el origen de replicación del plásmido pRMIcat de E. coli construido por Parro V. y colaboradores [Víctor Parro y Rafael P. Mellado (1993) "Heterologous recognition in vivo of promotor sequences from the Streptomyces coelicolor dagA gene". FEMS Microbiol. Letters. 106: 347-356].

El plásmido pNR2 se propagó en un cultivo de células competentes de

E. coli MC1061. La cepa se inoculó en 10 mi de medio LB con 100 mg/ml de ampicilina y se incubó a 37 ⁰ C durante 12h. El cultivo se centrifugó y el pellet resultante se usó para extraer el plásmido con el kit Wizard plus SV minipreps de Promega.

El plásmido obtenido se digirió con Ia enzima de restricción Smal y se ligaron cada uno de los fragmentos obtenidos por PCR. Las ligaciones se transformaron en las células E. coli MC1061 y los transformantes obtenidos en

LB con ampicilina 100 μg/ml se seleccionaron por Ia técnica de hibridación en filtro. El DNA se desnaturalizó e inmovilizó en una membrana de nylon (Hybond-N+ de Amersham) y se híbrido en una solución de SSC 6X, SDS 0.1 %, 6 mg/ml de esperma de Salmón y solución de Denhardt's con el fragmento obtenido por PCR y marcado con el fragmento klenow de Ia DNA- polimerasa en sus extremos 5'OH con αdNTP(p32). Después de Ia hibridación, Ia adsorción no específica se lavó y se autorradiografió el filtro para identificar los clones positivos. Los transformantes se hibridaron a 65 ⁰ C durante toda Ia noche comprobando Ia presencia y Ia orientación del inserto por secuenciación con los oligonucleótidos prcsni o prcsn2. El plásmido resultante se denominó pCSN73 y contiene el promotor csn orientado en Ia dirección del gen cat.

EJEMPLO 2: Elaboración del plásmido recombinante de Ia invención y obtención de células transformadas con dicho plásmido.

Se diseñaron dos oligonucleótidos a partir de Ia secuencia de DNA del gen yvbX de Bacillus subtilis'\68 publicada por Kunst et al. [Kunst, F. et al., (1997). denominados:

Yvbx2: SEQ ID NO 6 Yvbxt1 h: SEQ ID NO 7

La secuencia de estos oligonucleótidos (Boehringer Ingelheim) comienza desde el extremo 5' y termina en el extremo 3'. Al primero de ellos se Ie incorporó un extremo 5' con una diana de restricción Bam\λ\, y al segundo un extremo 5' con una diana Hind\\\ para obtener extremos cohesivos.

El fragmento de DNA empleado para el clonaje de Ia secuencia de ADN de Ia proteína madura del gen yvbX se obtuvo mediante Ia técnica de PCR (modelo PTC-1000 de MJ. Research, Inc), empleando una temperatura de hibridación de 5O ⁰ C. En un tubo de PCR se añadieron 10 μl de tampón de enzima, 1 μl de desoxinucleótidos (dNTPs 10 mM), Cl2Mg 1 ,5 mM de concentración final, 280 ng de cada uno de los oligonucleótidos, 500 ng de DNA de Bacillus subtilis'\68 y 1 U de DNA polimerasa (Ecotaq de Ecogen), completando el volumen final a 100 μl. El producto de amplificación de PCR obtenido tiene un tamaño de 1965 pares de bases y comprende una secuencia de DNA que contiene Ia secuencia codificante para Ia proteína madura y un terminador de Ia transcripción independiente del factor de terminación rho. Un cultivo recombinante de E. coli que contenía el plásmido pCSN73 se cultivó en medio LB con ampicilina 100 μg/ml. El DNA plasmídico se obtuvo con el kit Wizard plus SV de Promega siguiendo las indicaciones del fabricante: Se resuspendió el pellet obtenido por centrifugación de 5 mi de cultivo en 250 mi de tampón de resuspensión al que se añadieron 250 μl de tampón de lisis. Se mezclaron las dos soluciones hasta que se obtuvo un sobrenadante transparente y se añadieron 10 μl de proteasa alcalina. Las muestras se incubaron durante 5 min a temperatura ambiente añadiendo a continuación 350 μl de solución de neutralización. Se invirtieron los tubos y se centrifugaron a 13.000 r.p.m. durante 10 min. El sobrenadante resultante se recogió y se purificó en una columna Wizard plus SV minipreps spin, que se lavó con 750 μl de solución de lavado. A continuación se centrifugaron las columnas y se añadieron 100 μl de agua libre de nucleasas para extraer el DNA retenido. Se centrifugaron las columnas nuevamente a 13.000 rpm durante 10 min y se recogió Ia solución con el plásmido purificado.

El fragmento de PCR obtenido y el DNA del plásmido pCSN73 se digirieron con las endonucleasas de restricción Bam\λ\ y Hind\\\, empleando 100 ng de DNA en cada caso, para obtener extremos cohesivos, religables entre si. Las muestras se digirieron en un volumen final de 25 μl, añadiendo a cada tubo 2.5 μl de tampón de Ia enzima, 1 μl de enzima y agua destilada estéril hasta completar el volumen final. Ambos fragmentos se purificaron en un gel de agarosa de bajo punto de fusión al 1% siguiendo el procedimiento descrito por Parro, V y Mellado, R.P [Parro V. y Pérez Mellado R. (1997). "Procedimiento para Ia sobreproducción, purificación y utilización de Ia agarasa de Streptomyces coelicolor." Patente Nacional n° 9700090].

Se defosforilaron los extremos 5'P del plásmido con fosfatasa alcalina

(Amersham) que rompe los enlaces fosfato de los extremos 5' del DNA para evitar Ia recircularización del plásmido. En un volumen final de reacción de 20 μl se incubaron 100 ng de plásmido, 2 μl de tampón fosfatasa y 1 μl de fosfatasa alcalina durante 1 h a 37 ⁰ C.

El fragmento de DNA de 1965 pb se liga al plásmido, empleando 100 ng de DNA plasmídico y 5 veces Ia cantidad de DNA que se quiere ligar al plásmido y se añadieron los mililitros necesarios para asegurar Ia proporción adecuada de cada fragmento de DNA en un volumen final de 10 μl. Se añadió 1 μl de tampón de Ia enzima y 1 μl de T4 DNA ligasa. Cada reacción se incubó entre 4 y 16 h a 16 ⁰ C. Se transformaron 5 μl de Ia ligación en E. coli MC1061 y se plaquearon las células en medio LB con 100 μg/ml de ampicilina para seleccionar los transformantes.

Se seleccionaron 100 transformantes que se replicaron en agar LB con 100 μg/ml de ampicilina. Los clones seleccionados se inocularon en 5 mi de medio LB con ampicilina (100 μg/ml) y se incubaron a 37 ⁰ C y 250 rpm durante 12 h. Para comprobar Ia presencia y orientación del inserto se digirieron los plásmidos obtenidos mediante minipreparaciones, como se ha descrito anteriormente. Los plásmidos se digirieron con BamHI y con Hindlll y los fragmentos de restricción se comprobaron en un gel de agarosa del 1 %.

Se seleccionó un clon llamado pCyvbx.

El plásmido así obtenido se utilizó para transformar Bacillus subtilis'lGS seleccionando los transformantes en placas de LB con kanamicina (10 μg/ml) tal y como se ha descrito anteriormente para los clones de E. coli. Se secuenciaron los fragmentos de ADN clonados en un secuenciador automático comprobando que correspondían a Ia secuencia del fragmento clonado y que no contenían errores.

EJEMPLO 3: Ensayos de producción de quitinasa.

Se utilizaron filtros circulares Hybond-N+ (Amersham Biosciences) sobre placas de medio YPG suplementadas con el antibiótico correspondiente, donde se sembró el cultivo de B. subtilis crecido hasta una DOβoonm de 0.8. Se incubó durante toda Ia noche a 37 ⁰ C , periodo suficiente para que el microorganismo libere las proteínas de secreción al medio entre las que se encuentra Ia quitinasa y que son capaces de atravesar el filtro.

Posteriormente se retiró el filtro (con Ia biomasa bacteriana) y se sembró el hongo a ensayar sin diluir (SD) y en diluciones seriadas (1/5, 1/10, 1/20, 1/50 y 1/100) para observar el efecto en el crecimiento. Cuando se ensayaron los hongos levaduriformes se utilizó Ia muestra sin diluir (SD) y diluciones de mayor rango (10 v ^" 1', 1(T -2, 1( vT3, 1(T y 1

Los hongos utilizados en los ensayos de actividad in vivo se relacionan en Ia siguiente tabla 1 y los resultados obtenidos se indican en Ia Tabla2.

Tabla 1 : Relación de hongos utilizados

Tabla 2. Ensayo in vivo de Ia actividad fungicida de Ia quitinasa sobreproducida.

+++ Buen crecimiento en medio sólido. N. D. = no determinado.

Estos resultados se completan con los mostrados en las figuras 1 y 2 donde se observa Ia actividad fungicida de Ia quitinasa sobre los hongos Fusaríum proliferatum y Aspergillus ochraceus respectivamente.

EJEMPLO 4: Cuantificación de Ia sobreproducción de quitinasa

La actividad de Ia quitinasa producida por Ia bacteria recombinante se valoró por ensayo de sobrenadantes de los cultivos de Ia bacteria productora en crudo utilizando el sustrato cromogénico chitin-azure (Sigma) en buffer 0.1 M fosfato a pH 6.9 durante 3h en un volumen final de 2 mi y estimación de Ia liberación del cromógeno en el espectofotómetro a una densidad óptica de 560 nm. Una unidad de quitinasa se define como el incremento de 0.01 en Ia medida de densidad óptica. La bacteria recombinante produce hasta 4 veces más quitinasa activa que Ia bacteria control que propaga el plásmido vector sin el gen insertado.

Además, se comprobó Ia presencia de Ia quitinasa en el medio extracelular mediante geles de electroforesis PAGE-SDS al 10% observando una banda mayoritaria de 31 kDa de masa molecular relativa que estaba ausente en las fracciones equivalentes de Ia bacteria no sobreproductora y que corresponde con el tamaño molecular esperado para Ia quitinasa extracelular madura.