技术领域

[0001] 本发明属于医药技术领域， 涉及一种小分子化合物的医药应用， 具体涉及 3-(3- (苯并呋喃 -2-羰基)硫脲基 )-4-甲氧基苯甲酸或其可药用盐在制备用于治� �与 MIF 相关的炎症性疾病的药物， 特别是 MIF抑制剂中的用途。

背景技术

[0002] 巨噬细胞移动抑制因子 （Macrophage migration inhibitory factor, MIF) 是一种 集细胞因子、 酶活性、 神经内分泌激素于一身的多功能蛋白质。 作为一种细胞 因子， MIF几乎参与所有炎症性疾病过程， 它通过活化巨噬细胞和 T细胞来促进 先天性和获得性免疫响应， 是先天性免疫系统的重要调节因子， 被认为是连接 内分泌系统和免疫体系的介导剂。 MIF与多种免疫性和炎症性疾病的发病机制密 切相关， 如 MIF在单核 /巨噬细胞的血管壁粘附、 跨膜移动、 内皮下聚集、 泡沫 细胞形成及斑块稳定中的作用， 涉及到类风湿性关节炎、 动脉粥样硬化发生和 发展的多个方面。 MIF还直接影响正常细胞的分裂和瘤基因诱导的 恶性转化， 或 间接通过调节机体免疫反应， 促进细胞增殖、 迁移以及血管增生等。

[0003] 由于具有广泛的生物活性， MIF与多种免疫、 炎症以及肿瘤等疾病密切相关， 已经成为治疗这些疾病的一个重要靶点。 在与 MIF相关的抗炎药物研究方面， 国 外许多医药公司和科研机构正在幵发新的具有 抗炎效果的 MIF抑制剂， 但目前还 没有成功上市的 MIF抑制剂。 因此， 积极寻找和设计新的 MIF抑制剂， 并探索其 抗炎效果， 具有重要的临床意义和广阔的应用前景。

技术问题

问题的解决方案

技术解决方案

[0004] 针对上述情况， 本发明提供了一种小分子化合物一 3-(3- (苯并呋喃 -2-羰基)硫 脲基) -4-甲氧基苯甲酸或其可药用盐在制备用于治疗 与 MIF相关的炎症性疾病的 药物中的用途， 其中所述 3-(3- (苯并呋喃 -2-羰基)硫脲基 )-4-甲氧基苯甲酸的结构 式如下:

[0006] 优选的， 在上述技术方案中， 所述可药用盐包括 （但不限于） 3-(3- (苯并呋喃 -2 -羰基)硫脲基 )-4-甲氧基苯甲酸与盐酸、 磷酸、 硫酸等无机酸形成的酸加成盐以 及与醋酸、 马来酸、 枸橼酸、 苯磺酸、 甲基苯磺酸、 富马酸、 酒石酸等有机酸 形成的酸加成盐。

[0007] 优选的， 在上述技术方案中， 所述与 MIF相关的炎症性疾病包括 （但不限于） 类风湿性关节炎、 动脉粥样硬化和败血症。

[0008] 优选的， 在上述技术方案中， 所述用于治疗与 MIF相关的炎症性疾病的药物为

MIF抑制剂。

[0009] 本发明对上述小分子化合物进行了生物学活性 测定， 发现其对 MIF具有明显的 酶抑制活性， 对小鼠腹腔巨噬细胞 RAW264.7中的糖皮质激素具有负向调节效果 ， 可以显著抑制脂多糖 （Lipopolysaccharide, LPS) 诱导的炎性因子 （TNF-α和 NO) 的释放， 该化合物还可以抑制 MIF引起的巨噬细胞的趋化迁移。 此外， MT T法检测证实该化合物在 10、 20和 40μΜ三个浓度下对小胶质细胞 BV-2和巨噬细 胞 RAW264.7的活力均没有显著影响。 在此基础上， 进一步研究化合物抗炎作用 是否与抑制 MIF对 ERK1/2的活化有关， 发现这个化合物可以抑制 ERK1/2的磷酸 化。

发明的有益效果

有益效果

本发明中的小分子化合物 3-(3- (苯并呋喃 -2-羰基)硫脲基 )-4-甲氧基苯甲酸具备 Μ IF抑制剂的功能， 对与 MIF相关的炎症性疾病具有明显的抑制作用， 可以用于制 备与 MIF相关的抗炎药物。

对附图的简要说明

附图说明

[0011] 图 1为实施例 1中化合物对 MIF的酶抑制活性曲线。

[0012] 图 2为实施例 2中化合物对 MIF引起的巨噬细胞趋化迁移的影响效果图。

[0013] 图 3为实施例 3中化合物对培养细胞的敏感性效果图。

[0014] 图 4为实施例 4中化合物对小胶质细胞中 LPS诱导炎性因子的影响效果图。

[0015] 图 5为实施例 5中化合物对 MIF刺激的 RAW264.7巨噬细胞中 ERK活化的影响效 果图。

本发明的实施方式

[0016] 下面将结合附图及具体实施例对本发明做出进 一步的描述。

[0017] 实施例 1 : 化合物对 MIF的酶抑制活性实验。

[0018] 实验原理： MIF具有多巴色素互变异构酶活性， 可以将橙色的 D、 L型多巴色 素甲酯转化为无色的吲哚衍生物， 吸光度采用 Tecan Infinite

M1000酶标仪在 475nm波长下进行 3分钟吸光度测试。

[0019] 实验试剂的准备： 脂多糖 （大肠杆菌血清型 055:B5) 、 （L)-3,4-二羟基苯丙酮酸 甲酯和高碘酸钠购买自西格玛奥德里奇 （美国密苏里州东部城市圣路易斯） ； （S ,R)-3-(4-羟苯基 )-4,5-二氢 -5-异恶唑乙酸甲酯 （ISO-1) 为 MIF的典型抑制剂， 购 买自德国 Merck公司旗下的生化试剂品牌 Calbiochem公司， 在这里作为阳性对照 ； 将化合物溶解在 10mM的 DMSO储备溶液中， 最后在缓冲液中 DMSO的浓度低 于 0.25%情况下， 将 RAW264.7巨噬细胞在 37。C条件下添加 5%热灭活胎牛血清 ( Fetal bovine serum, FBS) ， 庆大霉素 （50g/ml) 和 5<¾CO ₂ 的达尔伯克改良伊格 尔培养基 （Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM) 中生长和维持， 重组 人类 MIF在大肠杆菌中表达， 并且进行纯化。

[0020] 实验步骤： 为了制备 (L)-多巴色素甲酯， 将等体积 (L)-3,4-二羟基苯甲基丙氨酸 甲酯 （4mM) 和高碘酸钠 （10mM) 混合， 并且在室温下培养 3~5分钟， 然后将（ L)-多巴色素甲酯 （30μϋ 添加到包含重组人类 MIF (!20nM) 和 10mM磷酸钾缓 冲液的 96孔板中， 另外添力 TO.5mM EDTA并保持 pH=6.2。 为了测试化合物对 MIF 互变异构酶活性的抑制效应， 将浓度为 1、 5、 10、 25、 50和 ΙΟΟμΜ的化合物分别 添加到包含重组人类 MIF ( l20nM) 的 96孔板中， 在添加 (L)-多巴色素甲酯之前 培养 30分钟， 将孔板中的气泡去掉， 采用 Tecan InfiniteMlOOO酶标仪在 475nm波 长下进行 3分钟吸光度测试。

[0021] 实验结果： 将浓度为 1、 5、 10、 25、 50和 ΙΟΟμΜ的 3-(3- (苯并呋喃 -2-羰基)硫脲 基) -4-甲氧基苯甲酸进行 MIF的酶抑制活性实验， 发现该化合物有很好的抑制活 性， 其半抑制浓度 IC _5Q 为 7.47μΜ/ί (如图 1所示） 。

[0022] 实施例 2: 化合物对 MIF引起的巨噬细胞趋化迁移的影响实验。

[0023] 实验原理： MIF对巨噬细胞有趋化迁移作用， 抑制剂作用于 MIF， 可以在一定 程度上抑制 MIF引起的巨噬细胞的趋化迁移。

[0024] 实验步骤： 将重组人类 MIF在添加或者缺失 MIF互变异构酶抑制剂的情况下， 分别置于 CIM- 16板的下室， 然后在上室将 RAW264.7巨噬细胞接种于包含 20000 个细胞的无血清培养基中。 然后将 CIM- 16孔板转移到 xCELLigence RTCA-DP中 (德国曼海姆罗氏诊断公司） ， 在 4小吋的检测周期内每隔 15分钟采集一次数据 ， 最后通过 RTCA 1.2软件进行数据分析。

[0025] 实验结果： Hit MIF表示热灭活的 （Heat-inactivated) MIF , 在这里作为阴性对 照， 图 2中左边第一列柱状图表示没有添加 MIF吋， RAW264.7巨噬细胞的趋化迁 移程度； 第二列表示添加了热灭活的 MIF吋巨噬细胞的趋化迁移程度； 第三列表 示添加 MIF之后引起巨噬细胞明显的趋化迁移； 第四列表示添加阳性对照化合物 ISO- 1之后可以显著抑制 MIF引起的巨噬细胞的趋化迁移； 第五列表示添加化合 物 3-(3- (苯并呋喃 -2-羰基)硫脲基 )-4-甲氧基苯甲酸吋， 同样可以明显抑制 MIF引 起的巨噬细胞的趋化迁移。 （*) ρ < 0·05， (**) ρ < 0.01表示与单独用 MIF处 理吋做的比较。

[0026] 实施例 3 : 细胞敏感性实验。

[0027] 实验原理： MTT分析法以活细胞代谢物还原剂 MTT噻唑蓝为基础， 利用酶标仪 测定 490nm处的光密度 OD值， 以反映出活细胞数目， 从而测定化合物对培养细 胞的杀伤效果。 [0028] 实验步骤： 细胞活性通过 MTT实验进行测定， BV-2小神经胶质细胞、 THP-1细 胞或者 RAW264.7巨噬细胞接种于一式三份的密度为 5x104的细胞 /板中， 将细胞 在 glycocalyixns和 LPS中处理 24小吋， MTT添加到每个板中并且在 37°C下培养 4小 吋， 在培养基废弃之后， 将 DMSO添加到溶解的甲瓒染料中， 在 540nm下测试光 学密度， 所有的实验结果采用 M±S.D.表示， 所有数据采用 SPSS程序 （版本 14.0 ) 进行单向方差分析和 Student Newman Keul's分析， p< 0.01认为具有统计显著 性。

[0029] 实验结果： 图 3中左边第一列表示没有添加任何其他物质吋� � 细胞的活性； 第 二列表示添加脂多糖 LPS后细胞的活性； 第三列表示同吋添加 LPS和 DEX之后细 胞的活性， DEX (Dexamethasone) 是上市的抗炎药地塞米松， 在这里作为对照 ； 第四列表示添加完 LPS、 DEX和 MIF之后细胞的活性； 第五列表示添加完 LPS 、 DEX、 MIF和 ISO- 1之后细胞的活性； 第六列表示添加完 LPS、 DEX、 MIF和化 合物 ₃ -(3- (苯并呋喃 -2-羰基)硫脲基 )-4-甲氧基苯甲酸之后细胞的活性。 总的来说 ， 化合物 3-(3- (苯并呋喃 -2-羰基)硫脲基 )-4-甲氧基苯甲酸对 BV-2小神经胶质细胞 、 THP-1细胞和 RAW264.7巨噬细胞均没有明显毒性。

[0030] 实施例 4: 化合物对小胶质细胞中 LPS诱导炎性因子的影响实验。

[0031] 实验原理： MIF分子与抗体分子共价结合， 此种结合不会改变抗体的免疫学特 性， 也不影响 MIF的生物学活性。 此种 MIF标记抗体可与吸附在固相载体上的抗 原或抗体发生特异性结合。 滴加底物溶液后， 底物可在 MIF作用下使其所含的供 氢体由无色的还原型变成有色的氧化型， 出现颜色反应。 因此， 可通过底物的 颜色反应来判定有无相应的免疫反应， 颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗 原的量呈正比。

[0032] 实验步骤： 将 96孔板用鼠抗大鼠 TNF-ot抗体包被， 并使用 250μ1含有 1%牛血清 蛋白、 5%蔗糖及 0.05<¾ NaN PBS阻断抗体的非特异性结合位点， 在 4°C孵育 16 小吋。 然后用洗涤液洗涤平板 3次， 加入大鼠 TNF-ot标准血清及测试血清样本， 孵育 2小吋后进行检测。 检测抗体为生物素标记的大鼠 TNF-ot抗体。 通过次级反 应物链霉亲和素 -辣根过氧化物酶， 与四甲基联苯胺反应显色。

[0033] 实验结果： 图 4a和 4b中第一列表示， 没有添加其他物质吋 NO和 TNF-ot的含量； 第二列表示添加脂多糖 LPS之后可以显著诱导 NO和 TNF-ot的释放； 第三列表示 添加抗炎药地塞米松 （DEX) 之后可以抑制 LPS诱导的炎性因子 NO和 TNF-ot的 释放； 第四列表示添加 MIF之后又可以促进炎性因子 NO和 TNF-ot的释放； 第五 列表示添加 MIF的典型抑制剂 ISO-1之后可以在一定程度上抑制炎性因子 NO和 T NF-ot的释放； 第六列表示添加化合物 3-(3- (苯并呋喃 -2-羰基)硫脲基 )-4-甲氧基苯 甲酸可以有效抑制 LPS和 MIF弓 I起的炎性因子 NO和 TNF-a的释放， 而且相比 DEX 和 ISO-1具有更好的抑制效果。

[0034] 实施例 5： 化合物对 MIF刺激的 RAW264.7巨噬细胞中 ERK活化的影响实验。

[0035] 实验原理： 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳 （PAGE) ， "探针 "是抗体， "显色 "用标 记的二抗。 经过分离的蛋白质样品转移到固相载体 （例如硝酸纤维素薄膜） 上 ， 固相载体以非共价键形式吸附蛋白质， 且能保持电泳分离的多肽类型及其生 物学活性不变。 以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原， 与对应的抗体进行免 疫反应， 再与酶或同位素标记的第二抗体进行反应， 经过底物显色或放射自显 影来检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋 白成分。

[0036] 实验步骤： 将 BV-2小胶质细胞以 2.0x10 ⁵ 密度接种于 6孔板中， 在 37°C培养 24小 吋后用于实验。 加药处理 16小吋后弃去培养基， 用 4°C的 PBS清洗 2次， 再向每孔 中加入 lmL PBS , 将细胞吹下收集到离心管中， 离心 5分钟， 弃去上清。 加入细 胞裂解液， 震荡混匀反应 10分钟， 再离心 15分钟， 收集上清液到离心管中。 采 用 BCA法测定每个样品中蛋白质的含量， 并通过 western blot方法对蛋白质进行 定性定量分析。

[0037] 实验结果： 采用 western blot方法检测了 RAW264.7细胞胞浆中 ERK1/2的蛋白质 表达变化， 以 a-球管蛋白作为内参， 发现该化合物可以抑制 ERK1/2的磷酸化 ( 如图 5所示） 。