[0001] 本发明属于医药技术领域， 涉及一类小分子化合物的医药应用， 具体涉及 N-( 苯基氨基硫代甲酰基)苯甲酰胺类化合物或其� �药用盐在制备用于治疗与 MIF相 关的炎症性疾病的药物， 特别是 MIF抑制剂中的用途。

背景技术

[0002] 巨噬细胞移动抑制因子 （Macrophage migration inhibitory factor, MIF) 是一种 集细胞因子、 酶活性、 神经内分泌激素于一身的多功能蛋白质。 作为一种细胞 因子， MIF几乎参与所有炎症性疾病过程， 它通过活化巨噬细胞和 T细胞来促进 先天性和获得性免疫响应， 是先天性免疫系统的重要调节因子， 被认为是连接 内分泌系统和免疫体系的介导剂。 MIF与多种免疫性和炎症性疾病的发病机制密 切相关， 如 MIF在单核 /巨噬细胞的血管壁粘附、 跨膜移动、 内皮下聚集、 泡沫 细胞形成及斑块稳定中的作用， 涉及到类风湿性关节炎、 动脉粥样硬化发生和 发展的多个方面。 MIF还直接影响正常细胞的分裂和瘤基因诱导的 恶性转化， 或 间接通过调节机体免疫反应， 促进细胞增殖、 迁移以及血管增生等。

[0003] 由于具有广泛的生物活性， MIF与多种免疫、 炎症以及肿瘤等疾病密切相关， 已经成为治疗这些疾病的一个重要靶点。 在与 MIF相关的抗炎药物研究方面， 国 外许多医药公司和科研机构正在幵发新的具有 抗炎效果的 MIF抑制剂， 但目前还 没有成功上市的 MIF抑制剂。 因此， 积极寻找和设计新的 MIF抑制剂， 并探索其 抗炎效果， 具有重要的临床意义和广阔的应用前景。

技术问题

问题的解决方案

技术解决方案

[0004] 针对上述情况， 本发明提供了 N- (苯基氨基硫代甲酰基)苯甲酰胺类化合物或其 可药用盐在制备用于治疗与 MIF相关的炎症性疾病的药物中的用途， 其中所述 N- (苯基氨基硫代甲酰基)苯甲酰胺类化合物具有� ��式 I所示的结构： [0005]

[0006] 其中：

[0007] R i为氢或卤素；

[0008] R ₂ 为氢、 卤素、 甲基或甲氧甲酰基；

[0009] R 3

为氢、 卤素、 甲基、 异丙基、 甲氧甲酰基、 苯氧基甲基、 三氟甲基、 苯基、 3,5- 二氟苯基、 3,5-二氯苯基或 3,5-二三氟甲基苯基；

[0010] R ₄ 为氢、 卤素、 甲基、 甲氧基或甲氧甲酰基；

[0011] R ₅ 为氢、 卤素、 乙酰基、 羧基或羟甲基；

[0012] R ₆ 为氢、 羟基、 羧基、 乙酰基、 乙酰氨基、 甲氧甲酰基、 乙氧甲酰基、 氨基甲 酰基或苯甲酰氨基；

[0013] R ₇ 为氢或羧基。

[0014] 优选的， 在上述技术方案中， 所述 N- (苯基氨基硫代甲酰基)苯甲酰胺类化合物 选自化合物 I ,~1 ₄ 。中的任意一种。

[0015] 1 _{1 ;}

N-(3-羧基苯基氨基)硫代甲酰基 -4-苯基苯甲酰胺；

[0016] 1 ₂ ，

N-(2-甲基 -5-羧基苯基氨基)硫代甲酰基 -4-苯基苯甲酰胺;

[0017] 1 ₃ ，

f 'Ρ¾.· ； '級 ■

Ν-(4-羧基苯基氨基)硫代甲酰基 -4-苯基苯甲酰胺；

[0018] 1 ₄ ，

■¾

Ν-(4-乙酰氨基苯基氨基)硫代甲酰基 -4-苯基苯甲酰胺； [0019] 1 ₅ ，

Ν-(4-羟基苯基氨基)硫代甲酰基 -4-苯基苯甲酰胺； 1 ₆ ，

N-(4-甲氧甲酰基 -4-苯基苯甲酰胺； [0021] 1 ₇ ，

N-(3-羟甲基苯基氨基)硫代甲酰基 -4-苯基苯甲酰胺； 1 ₈ ，

N-(2-氯 -5-羧基苯基氨基)硫代甲酰基 -4-苯基苯甲酰胺；

[0023] I

N-(2-甲氧甲酰基苯基氨基)硫代甲酰基 -4-苯基苯甲酰胺； 1 ₁₀ ， N-(2-甲氧基 -5-羧基苯基氨基)硫代甲酰基 -4-苯基苯甲酰胺；

[0025] 1„，

_N -(3-乙酰基苯基氨基)硫代甲酰基 -4-苯基苯甲酰胺;

[0026] 1 ₁₂ ，

N-(3-羧基苯基氨基)硫代甲酰基 -4-(3， 5-二三氟甲基苯基)苯甲酰胺； [0027] 1 ₁₃ ，

N-(3-羧基苯基氨基)硫代甲酰基 -4-(3， 5-二氯苯基)苯甲酰胺；

[0028] 1 ₁₄ ，

N-(3-羧基苯基氨基)硫代甲酰基 -4-(3， 5-二氟苯基)苯甲酰胺；

[0029] 1 ₁₅ ，

N-(3-羧基苯基氨基)硫代甲酰基 -4-甲基苯甲酰胺；

[0030] 1 ₁₆ ，

N-(4-羧基苯基氨基)硫代甲酰基 -4-甲基苯甲酰胺；

[0031] 1

N-(2-甲基 -3-羧基苯基氨基)硫代甲酰基 -4-苯氧基甲基苯甲酰胺;

[0032] 1 ₁₈ ，

N-(4-羧基苯基氨基)硫代甲酰基苯甲酰胺；

[0033] 1 ₁₉ ，

N-(2-甲基 -3-羧基苯基氨基)硫代甲酰基 -4-异丙基苯甲酰胺;

[0034] 1 ₂₀ ，

Ν-(4-羧基苯基氨基)硫代甲酰基 -3-甲基苯甲酰胺；

[0035] I

Ν-(3-氯 -4-羧基苯基氨基)硫代甲酰基 -4-氟苯甲酰胺；

擔 "

N-(3-乙酰基苯基氨基)硫代甲酰基苯甲酰胺；

[0037] 1 ₂₃ ，

N-(4-甲氧甲酰基苯基氨基)硫代甲酰基苯甲酰胺 ； [0038] 1 ，

N-(4-乙酰基苯基氨基)硫代甲酰基苯甲酰胺； [0039] 1 ₂₅ ，

N-(4-甲氧甲酰基苯基氨基)硫代甲酰基 -3-甲基苯甲酰胺;

[0040] 1 ₂₆ ，

Ν-(4-苯甲酰氨基苯基氨基)硫代甲酰基 -4-甲基苯甲酰胺；

[0041] I 27，

N-(4-乙氧甲酰基苯基氨基)硫代甲酰基苯甲酰胺 ；

[0042] I 28，

N-(4-乙酰氨基苯基氨基)硫代甲酰基 -3-甲基苯甲酰胺；

[0043] I 29，

N-(4-氨基甲酰基苯基氨基)硫代甲酰基 -3-甲氧甲酰基苯甲酰胺;

[0044] I 30，

Ν-(4-氨基甲酰基苯基氨基)硫代甲酰基 -4-甲氧甲酰基苯甲酰胺； [0045] 1 ₃₁ '

N-(4-乙酰氨基苯基氨基)硫代甲酰基 -4-甲基苯甲酰胺； [0046] 1 ₃₂ ，

N-(2-甲氧甲酰基苯基氨基)硫代甲酰基 -3-甲基苯甲酰胺;

[0047] 1 ₃₃ ，

1 B 言

N-(2-甲氧甲酰基苯基氨基)硫代甲酰基 -4-甲基苯甲酰胺;

[0048] 1 ₃₄ ，

&Γ -、 ：、

N-(3-羧基苯基氨基)硫代甲酰基 -4-溴苯甲酰胺；

[0049] 1 ₃₅ ，

N-(3-羧基苯基氨基)硫代甲酰基 -4-三氟甲基苯甲酰胺;

[0050] 1 ₃₆ ，

N-(3-羧基苯基氨基)硫代甲酰基 -4-氯苯甲酰胺； [0051] 1 ₃₇ ，

N-(3-羧基苯基氨基)硫代甲酰基 -4-氟苯甲酰胺；

[0052] I

N-(3-羧基苯基氨基)硫代甲酰基 -3-氟苯甲酰胺； [0053] 1 ₃₉ ，

N-(3-羧基苯基氨基)硫代甲酰基 -3-氯苯甲酰胺； [0054] 1 ₄₀ ，

N-(3-羧基苯基氨基)硫代甲酰基 -2-氯苯甲酰胺。

[0055] 优选的， 在上述技术方案中， 所述可药用盐包括 （但不限于） N- (苯基氨基硫 代甲酰基)苯甲酰胺类化合物 （特别是化合物 I ^l J 与盐酸、 磷酸、 硫酸等无机 酸形成的酸加成盐以及与醋酸、 马来酸、 枸橼酸、 苯磺酸、 甲基苯磺酸、 富马 酸、 酒石酸等有机酸形成的酸加成盐。

[0056] 优选的， 在上述技术方案中， 所述与 MIF相关的炎症性疾病包括 （但不限于） 类风湿性关节炎、 动脉粥样硬化和败血症。

[0057] 优选的， 在上述技术方案中， 所述用于治疗与 MIF相关的炎症性疾病的药物为

MIF抑制剂。

[0058] 本发明对上述 N- (苯基氨基硫代甲酰基)苯甲酰胺类化合物进行� ��生物学活性测 定， 发现其对 MIF具有明显的酶抑制活性， 对小鼠腹腔巨噬细胞 RAW264.7中的 糖皮质激素具有负向调节效果， 可以显著抑制脂多糖 （Lipopoly saccharide , LPS ) 诱导的炎性因子 （TNF-ot和 NO) 的释放， 这些化合物还可以抑制 MIF引起的 巨噬细胞的趋化迁移。 此外， MTT法检测证实这些化合物在 10、 20和 40μΜ三个 浓度下对小胶质细胞 BV-2和巨噬细胞 RAW264.7的活力均没有显著影响。 在此基 础上， 进一步研究化合物抗炎作用是否与抑制 MIF对 ERK1/2的活化有关， 发现 这些化合物可以抑制 ERK1/2的磷酸化。

发明的有益效果

有益效果

[0059] 本发明中的 Ν- (苯基氨基硫代甲酰基)苯甲酰胺类化合物具备 MIF抑制剂的功能 ， 对与 MIF相关的炎症性疾病具有明显的抑制作用， 可以用于制备与 MIF相关的 抗炎药物。

对附图的简要说明

附图说明

[0060] 图 1为实施例 1中化合物 I ₅ 、 I ₈ 、 Uni tMIF的酶抑制活性曲线， 其中上述化 合物 1 ₅ 、 1 ₈ 、 1 ₁₃ 和1 ₁₅ 依次对应图中的 （a) 、 (b) 、 (c) 和 （d) 。

[0061] 图 2为实施例 2中化合物 I ^tMIF引起的巨噬细胞趋化迁移的影响效果图。

[0062] 图 3为实施例 3中化合物 1 ₅ 对培养细胞的敏感性效果图。 [0063] 图 4为实施例 4中化合物 1 ₅ 、 1 ₈ 、 1 ₁₃ 和1 ₁₅ 对小胶质细胞中 LPS诱导炎性因子的影 响效果图。

[0064] 图 5为实施例 5中化合物 I ^tMIF刺激的 RAW264.7巨噬细胞中 ERK活化的影响效 果图。

本发明的实施方式

[0065] 下面将结合附图及具体实施例对本发明做出进 一步的描述。

[0066]

[0067] 实施例 1 : 化合物对 MIF的酶抑制活性实验。

[0068] 实验原理： MIF具有多巴色素互变异构酶活性， 可以将橙色的 D， L型多巴色 素甲酯转化为无色的吲哚衍生物， 吸光度采用 Tecan Infinite M1000酶标仪在 475 nm波长下进行 3分钟吸光度测试。

[0069] 实验试剂的准备： 脂多糖 （大肠杆菌血清型 055:B5) 、 （L)-3,4-二羟基苯丙酮酸 甲酯和高碘酸钠购买自西格玛奥德里奇 （美国密苏里州东部城市圣路易斯） ； （S ,R)-3-(4-羟苯基 )-4,5-二氢 -5-异恶唑乙酸甲酯 （ISO-1) 为 MIF的典型抑制剂， 购 买自德国 Merck公司旗下的生化试剂品牌 Calbiochem公司， 在这里作为阳性对照 ； 将化合物溶解在 10mM的 DMSO储备溶液中， 最后在缓冲液中 DMSO的浓度低 于 0.25%情况下， 将 RAW264.7巨噬细胞在 37。C条件下添加 5%热灭活胎牛血清 ( Fetal bovine serum, FBS) ， 庆大霉素 （50g/ml) 和 5<¾CO ₂ 的达尔伯克改良伊格 尔培养基 （Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM) 中生长和维持， 重组 人类 MIF在大肠杆菌中表达， 并且进行纯化。

[0070] 实验步骤： 为了制备 (L)-多巴色素甲酯， 将等体积 L-3,4-二羟基苯甲基丙氨酸甲 酯 （4mM) 和高碘酸钠 （10mM) 混合， 并且在室温下培养 3~5分钟， 然后将 (L) -多巴色素甲酯 （30μϋ 添加到包含重组人类 MIF (l20nM) 和 10mM磷酸钾缓冲 液的 96孔板中， 另外添力 TO.5mM EDTA并保持 pH=6.2。 为了测试化合物对 MIF互 变异构酶活性的抑制效应， 将浓度为 1、 5、 10、 25、 50和 ΙΟΟμΜ的化合物分别添 加到包含重组人类 MIF (l20nM) 的 96孔板中， 在添加 (L)-多巴色素甲酯之前培 养 30分钟， 将孔板中的气泡去掉， 采用 Tecan InfiniteMlOOO酶标仪在 475nm波长 下进行 3分钟吸光度测试。

[0071] 实验结果： 将浓度为 1、 5、 10、 25、 50和 ΙΟΟμΜ的 N- (苯基氨基硫代甲酰基)苯 甲酰胺类化合物进行 MIF的酶抑制活性实验， 发现大多数化合物具有较好的抑制 活性， 其半抑制浓度 TIC ₅ 。见表 1， 其中化合物 1 ₅ 、 1 ₈ 、 1 ₁₃ 和1 ₁₅ 的1¾： ₅ 。曲线图参 见图 1。

[0072] 表 1.化合物对 MIF互变异构酶的抑制活性 （ TIC so) 以及 TIC ₅ 。<10μΜ的化合物 对 LPS诱导的 RAW 264.7巨噬细胞分泌 NO的影响 （N IC _so )

[]

[0073] 实施例 2: 化合物对 MIF引起的巨噬细胞趋化迁移的影响。 [0074] 实验原理： MIF对巨噬细胞有趋化迁移作用， 抑制剂作用于 MIF， 可以在一定 程度上抑制 MIF引起的巨噬细胞的趋化迁移。

[0075] 实验步骤： 将重组人类 MIF在添加或者缺失 MIF互变异构酶抑制剂的情况下， 分别置于 CIM-16板的下室， 然后在上室将 RAW264.7巨噬细胞接种于包含 20000 个细胞的无血清培养基中。 然后将 CIM-16孔板转移到 xCELLigence RTCA-DP中 (德国曼海姆罗氏诊断公司） ， 在 4小吋的检测周期内每隔 15分钟采集一次数据 ， 最后通过 RTCA 1.2软件进行数据分析。

[0076] 实验结果： 以化合物 1 ₅ 为例， Hit MIF表示热灭活的 （Heat-inactivated) MIF, 在这里作为阴性对照， 图 2中左边第一列柱状图表示没有添加 MIF吋， RAW264.7 巨噬细胞的趋化迁移程度； 第二列表示添加了热灭活的 MIF吋巨噬细胞的趋化迁 移程度； 第三列表示添加 MIF之后引起巨噬细胞明显的趋化迁移； 第四列表示添 加阳性对照化合物 ISO-1之后可以显著抑制 MIF引起的巨噬细胞的趋化迁移； 第 五列表示添加化合物 1 ₅ 吋， 同样显著抑制 MIF引起的巨噬细胞的趋化迁移， 而且 相比阳性对照化合物具有更好的抑制效果。 （*) ρ<0.05， （**) ρ<0.01表示与 单独用 MIF处理吋做的比较。

[0077] 实施例 3: 细胞敏感性实验。

[0078] 实验原理： MTT分析法以活细胞代谢物还原剂 MTT噻唑蓝为基础， 利用酶标仪 测定 490nm处的光密度 OD值， 以反映出活细胞数目， 从而测定化合物对培养细 胞的杀伤效果。

[0079] 实验步骤： 细胞活性通过 MTT实验进行测定， BV-2小神经胶质细胞， THP-1细 胞或者 RAW264.7巨噬细胞接种于一式三份的密度为 5x104的细胞 /板中， 将细胞 在 glycocalyixns和 LPS中处理 24小吋， MTT添加到每个板中并且在 37°C下培养 4小 吋， 在培养基废弃之后， 将 DMSO添加到溶解的甲瓒燃料中， 在 540 nm下测试光 学密度， 所有的实验结果采用 M±S.D.表示， 所有数据采用 SPSS程序 （版本 14.0 ) 进行单向方差分析和 Student Newman Keul's分析， p< 0.01认为具有统计显著 性。

[0080] 实验结果： 以化合物 1 ₅ 为例， 图 3中左边第一列表示没有添加任何其他物质吋 ， 细胞的活性； 第二列表示添加脂多糖 LPS后细胞的活性； 第三列表示同吋添加 LPS和 DEX之后细胞的活性， DEX (Dexamethasone) 是上市的抗炎药地塞米松 ， 在这里作为对照； 第四列表示添加完 LPS、 DEX和 MIF之后细胞的活性； 第五 列表示添加完 LPS、 DEX、 MIF和 ISO- 1之后细胞的活性； 第六列表示添加完 LPS 、 DEX、 MIF和化合物 1 ₅ 之后细胞的活性。 总体来说， 化合物 I tBV-2小神经胶 质细胞、 THP-1细胞和 RAW264.7巨噬细胞均没有明显毒性。

[0081] 实施例 4: 化合物对小胶质细胞中 LPS诱导炎性因子的影响。

[0082] 实验原理： MIF分子与抗体分子共价结合， 此种结合不会改变抗体的免疫学特 性， 也不影响 MIF的生物学活性。 此种 MIF标记抗体可与吸附在固相载体上的抗 原或抗体发生特异性结合。 滴加底物溶液后， 底物可在 MIF作用下使其所含的供 氢体由无色的还原型变成有色的氧化型， 出现颜色反应。 因此， 可通过底物的 颜色反应来判定有无相应的免疫反应， 颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗 原的量呈正比。

[0083] 实验步骤： 将 96孔板用鼠抗大鼠 TNF-ot抗体包被， 并使用 250μ1含有 1%牛血清 蛋白、 5%蔗糖及 0.05<¾ N _a N ^ PBS阻断抗体的非特异性结合位点， 在 4°C孵育 16 小吋。 然后用洗涤液洗涤平板 3次， 加入大鼠 TNF-ot标准血清及测试血清样本， 孵育 2小吋后进行检测。 检测抗体为生物素标记的大鼠 TNF-ot抗体。 通过次级反 应物链霉亲和素 -辣根过氧化物酶， 与四甲基联苯胺反应显色。

[0084] 实验结果： 以化合物 1 ₅ 、 1 ₈ 、 1 ₁₃ 和1 ₁₅ 为例， 图 4中第一列表示， 没有添加其他 物质吋 TNF-ot的含量； 第二列表示添加脂多糖 LPS之后可以显著诱导 TNF-ot的释 放； 第三、 四、 五、 六列表示添加完化合物 1 ₅ 、 1 ₈ 、 1 ₁₃ 、 1 ₁₅

之后可以显著抑制 LPS诱导的炎性因子 TNF-ot的释放， 其中化合物 1 ₅ 具有最好的 抑制效果。

[0085] 实施例 5： 化合物对 MIF刺激的 RAW264.7巨噬细胞中 ERK活化的影响实验。

[0086] 实验原理： 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳， "探针 "是抗体， "显色 "用标记的二抗。

经过 PAGE (聚丙烯酰胺凝胶电泳） 分离的蛋白质样品， 转移到固相载体 （例如 硝酸纤维素薄膜） 上， 固相载体以非共价键形式吸附蛋白质， 且能保持电泳分 离的多肽类型及其生物学活性不变。 以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原， 与对应的抗体起免疫反应， 再与酶或同位素标记的第二抗体起反应， 经过底物 显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目 的基因表达的蛋白成分。

[0087] 实验步骤： 将 BV-2小胶质细胞以 2.0x10 ⁵ 密度接种于 6孔板中， 在 37°C培养 24小 吋后用于实验。 加药处理 16小吋后弃去培养基， 用 4°C的 PBS清洗 2次， 再向每孔 中加入 ImL PBS , 将细胞吹下收集到离心管中， 离心 5分钟， 弃去上清。 加入细 胞裂解液， 震荡混匀反应 10分钟， 再离心 15分钟， 收集上清液到离心管中。 采 用 BCA法测定每个样品中蛋白质的含量， 并通过 western blot对蛋白质进行定性 定量分析。

[0088] 实验结果： 以化合物 1 ₅ 为例， 采用 western blot方法检测了 RAW264.7细胞胞浆 中 ERK1/2的蛋白质表达变化， 以 a-球管蛋白作为内参， 发现该化合物可以抑制 E RK1/2的磷酸化 （如图 5所示） 。