deren Verwendung

Beschreibung Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Klasse nichtglykosidischer und nichtpeptidischer Selektininhibitoren mit niedrigem Molekulargewicht. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen, diese enthaltende Arzneimittel und deren Verwendung bei der Behandlung von Erkrankungen.

Hintergrund der Erfindung Selektine sind Kohlenhydrat bindende Adhäsionsmoleküle, die im Prozeß der Immunabwehr zur gesteigerten Adhäsion von Leukozyten am Gefäßendothel des entzündeten Gewebes beitragen. Sie werden entsprechend ihrer Ursprungszellen in L-(Leukozyten), E-(Endothel) und P-Selektin (Plättchen und Endothel) eingeteilt. Durch ihre Proteinstruktur und ihre speziellen molekularen Bindungseigenschaften initiieren sie die Leukozytenadhäsion; nach vorübergehender Bindung der korrespondierenden Liganden erfahren die Leukozyten aus dem fließenden Blutstrom eine "rollende Verlangsamung" entlang der Gefäßwand. Anschließend vermitteln andere Adhäsionsmoleküle die feste Bindung der Leukozyten am Endothel sowie deren Extravasation zur Erfüllung ihrer Abwehrfunktion.

Die Selektine wurden schon kurz nach ihrer Entdeckung und strukturellen Aufklärung zu Beginn der neunziger Jahre zu attraktiven Zielstrukturen für die pharmazeutische Forschung. Neben ihrer physiologischen Funktion im Immungeschehen wurden auch eine Dysregulation der Selektinexpression bei pathologischen Prozessen wie rheumatoider Arthritis, Asthma, Diabetes mellitus und Ischämie/Reperfusion und eine Beteiligung an der Gewebeinvasion metastasierender Krebszellen beobachtet. Dies motivierte zu einer intensiven Suche nach Selektin-inhibierenden Substanzen. Selektinliganden Zu den beschriebenen Selektinen sind nur einzelne hoch affine Liganden bekannt. Prinzipiell sind dies mucinähnliche Strukturen, das heißt lang gestreckte Glykoproteine, an deren Serin- oder Threonin-reichem Proteingrundgerüst viele Kohlenhydrat-Seitenketten als die eigentlichen Bindungsepitope glykosidisch geknüpft sind. Durch schnelle Ausbildung und Dissoziation der Rezeptorbindungen an den hoch flexiblen Liganden wird im Scherstrom der Gefäße das Zellrollen vermittelt. Die für die Bindung essentiellen Kohlenhydrat-Epitope sind N-Acetyllaktosamin-basierende Oligosaccharide in spezieller Verknüpfung mit Fucose und einer terminalen Sialinsäure (N-Acetyl-Neuraminsäure). Herausragende Bedeutung als Bindungsepitop hat das Tetrasaccharid Sialyl LewisX (sLeX ).

Obwohl alle Selektine das sLeX nur mit sehr geringer Affinität (etwa 1 mM) binden, wurden bisher keine besser bindenden Kohlenhydrate gefunden, so daß die hohe Bindungsstärke zu den natürlichen Mucinliganden (etwa 100 nM) strukturell nicht erklärt werden kann. Vor diesem Hintergrund wurde das sLeX als Standardligand für Struktur- Wirkungs-Beziehungen zur Charakterisierung der Bindungseigenschaften sowie für die Suche nach Selektininhibitoren herangezogen.

Abwandlung der Leitstruktur Sialyl Lewis X Da das Tetrasaccharid Sialyl Lewis X (sLeX) an alle drei Selektine binden kann, fungiert es als zentrale Leitsubstanz für die Suche nach selektininhibierenden Stoffen. Aufbauend auf den Röntgenstrukturdaten des E-Selektins (Graves, B. J., et al., Insight into E-selectin/ligand interaction from the crystal structure and mutagenesis of the lec/EGF domains. Nature 367 (1994) 532-538.) und verschiedenen NMR-Untersuchungen des gelösten oder am E-Selektin gebundenen sLeX (Cooke, R. M., et al., The conformation of the sialyl Lewisx ligand changes upon binding to E-Selectin. Biochemistry 33 (1994) 10591-10596; Kogan, T. P., et al., A Single amino acid residue can determine the ligand specificity of E-Selectin. J. Biol. Chem. 270 (1995) 14047-14055.) konnten die für die Bindung der Lektindomäne essentiellen Strukturelemente identifiziert werden: die negative Ladung der Sialinsäure, die 2-, 3- und 4- ständige Hydroxygruppe der Fucose sowie die 6-ständige Hydroxygruppe der Galaktose. Mit strukturellen Abwandlungen unter Beibehaltung der eben genannten Strukturmerkmale versuchte man zu besser bindenden Selektininhibitoren zu gelangen. Nachteile bei glykosidischen Inhibitoren sind der komplexe Syntheseweg, der hohe Preis der Ausgangsstoffe, die schwierige Strukturaufklärung, die hydrolytische Instabilität und die relativ geringe Bindungsaffinität. Für eine umfangreiche Übersicht über synthetische Selektininhibitoren sei auf Simanek et al. (Simanek, E. E., et al., Selectin-carbohydrate interactions: From natural ligands to designed mimetics. Chem. Rev. 98 (1998) 833-862.) verwiesen.

Die einfachste synthetische Modifizierung des sLeX besteht im Ersatz der negativ geladenen Sialinsäure durch einfachere negativ geladene Strukturelemente. So sind Schwefel-, Phosphor-, und Carbonsäure-Derivate am C3 der Galaktose beschrieben. Diese strukturellen Variationen ergaben ähnliche Bindungsaffinitäten wie die des sLeX selbst (Ohmoto, H., et al., Studies on selectin blockers 1 : Structure activity relationships of Sialyl Lewis x analogs. J. Med. Chem. 39 (1996) 1339-1343.).

Eine stärkere Vereinfachung besteht im Ersatz der N-acetylierten Glucose, die keinen Bindungsbeitrag leistet, sondern nur für die optimale Ausrichtung der Gesamtstruktur verantwortlich ist. Der Ersatz der Glucose durch Alkandiole oder Cyclohexandiole ohne oder mit gleichzeitiger Sialmsäuresubstitution erbrachte Derivate, die vereinzelt auch die Wirkstärke des sLeX übertreffen (Norman, K. E., et al., Sialyl Lewis X (sLex) and an sLex mimetic, CGP69669A, disrupt E-Selectin-dependent leukocyte rolling in vivo. Blood 91 (1998) 475-483.). Der gleichzeitige Ersatz von Glucose und Galaktose führte zwar zu rigiden und stabilen Fucose-Sialinsäure-Derivaten, die aber auf Grund der fehlenden Galaktose-6- Hydroxygruppe keine Wirkverbesserung ergaben.

Die zahlenmäßig größte Gruppe von getesteten sLeX-Analoga besteht aus Monosaccharid- Verbindungen, bei denen unter Beibehaltung der Fucose die anderen essentiellen Bindungsepitope durch nicht glykosidische Strukturen im Molekül ersetzt wurden. Am erfolgreichsten sind Moleküle, bei denen spezielle Peptide an der Fucose den Bindungsbeitrag der Galaktose und der negativen Sialinsäure simulieren. Einige Substanzen weisen eine ähnliche, vereinzelt sogar eine deutlich bessere Bindungsaffmität zu den Selektinen als das sLeX auf (Wong, C. H., et al., Small molecules as structural and functional mimics of sLex tetrasaccharide in selectin Inhibition: A remarkable enhancement of inhibition by additional negative Charge and for hydrophobic groups. J. Am. Chem. Soc. 119 (1997) 8152-8158.). Ausgehend vom sLeX wurde nach zusätzlichen Bindungsepitopen gesucht. Die Derivatisierung des sLeX und die Computersimulation der Bindung an der Lektindomäne ergaben, daß eine hydrophobe Substitution an der glykosidischen Hydroxygruppe oder am Amin des Glucosamins die Bindungseigenschaften deutlich verstärkt. Neue Derivate mit aromatischen Ringsystemen am Amin oder verzweigtkettigen Fettsäuren am glykosidischen Rest des Glucosamins oder auch vereinfachte sLeX- Analoga mit Fettsäuresubstitution wurden erfolgreich getestet (Ramphai, J. Y., et al., Ligand interactions with E-Selectin. Identification of a new site for recognition of N-Acyl Aromatic Glucosamine substituents of Sialyl Lewis x. J. Med. Chem. 39 (1996) 1357-1360.) und wiesen teilweise eine über zehnfach stärkere Bindung als sLeX auf.

Eine andere Theorie zur Bindungsverstärkung geht von dem summarischen Zusammenwirken mehrerer Einzelbindungen aus. Diese Multivalenzhypothese wird auch als Ursache und Wirkprinzip der natürlichen Selektinliganden diskutiert. Auf dieser Basis wurden verschiedene oligo- und polymere Derivate synthetisiert, in denen sLeX-Moleküle (Renkonen, O., et al., Synthesis of new nanomolar saccharide inhibitors of lymphocyte adhesion: Different polylactosamine backbones present multiple Sialyl Lewis X determinants to L- Selectin in high affinity mode. Glycobiology 7 (1997) 453-461.) oder deren strukturell vereinfachten Glykoside (Manning, D. D., et al., Neoglycopolymer inhibitors of the selectins. Tetrahedron 53 (1997) 11937-11952.) über unterschiedliche Trägermoleküle räumlich eng in Verbindung stehen. Trotz der teilweise besseren Bindungswerte wird die Multivalenzhypothese unterschiedlich diskutiert. Bindungsstudien mit einer multimeren, nicht kovalent fixierten sLeX-Anordnung in Liposomen (Stahn, R., et al., Multivalent sLex ligands of defmite structure as inhibitors of E-Selectin mediated cell adhesion. Glycobiology 8 (1998) 311-319) oder in planaren Modellmembranen (Vogel, J., et al., The role of glycolipids in mediating cell adhesion: A flow chamber study. Biochim. Biophys. Acta 1372 (1998) 205- 215.) unterstützen die Hypothese.

Erschwerend für einen wertenden Vergleich aller synthetisierten Selektininhibitoren wirken sich die unterschiedlichen Testsysteme aus, die von den einzelnen Arbeitsgruppen angewendet werden.

Bisher befindet sich mit dem Pan-Selektinantagonist Bimosiamose (l,6-bis[3-(3- carboxymethylphenyl)-4-(2-alpha-D-mannopyranosyloxy)phenyl]h exan), welches eine wesentliche höhere Affinität zu den Selektinen als sLeX besitzt, nur eine Selektin inhibierende Substanz mit glycosidischer Struktur in der klinischen Prüfung (Phase IIa). Die Revotar AG testet Bimosiamose zur Behandlung von Psoriasis und atopischer Dermatitis (Ulbrich H, et al. Leukocyte and endothelial cell adhesion molecules as targets for therapeutic interventions in inflammatory disease. Trends Pharmacol Sei. (2003) 640-647.).

Es ist somit eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Selektininhibitoren zur Verfügung zu stellen, die die Nachteile der im Stand der Technik bekannten Selektininhibitoren überwinden und außerdem stabiler und synthetisch leichter zugänglich sind.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch das zur Verfügung stellen von Verbindungen der allgemeinen Formel 1

gelöst, worin n 0 oder 1 ist, R1 bis R6 unabhängig voneinander H, COOH, COOCH3, COOC2H5 oder Halogen sind, und X C=N-O-(CH2)m-Y oder N-C(=O)-(CH2)m-Y ist, worin m 5 oder 6 ist, und Y

worin R7H oder O(CH2)9CH3 ist,

oder Derivaten davon, deren Diastereomeren und pharmazeutisch verträglichen Salzen dieser Verbindungen. Bevorzugt sind dabei Verbindungen, die aus der Formel 2 abgeleitet sind, wobei Formel 2

ist, worin Ri H, R2 H, COOH, COOCH3 oder Halogen, R3 H, COOH oder COOCH3, R4 H, R5 H, COOH, COOCH3 oder Halogen, R6 H, und R7 H oder O(CH2)9CH3 ist,

oder Derivate davon, deren Diastereomeren und pharmazeutisch verträglichen Salzen dieser Verbindungen.

Weiterhin bevorzugt werden Verbindungen, die aus der Formel 3 abgeleitet sind, wobei Formel 3

ist, worin n θ oder 1, R1 H, COOH oder COOCH3, R2 H, COOH, COOCH3 oder COOC2H5, R3 H, COOH oder COOCH3, R4 H, COOH oder COOCH3, R5 H, COOH, COOCH3 oder COOC2H5, R6 H, und R7 H oder O(CH2)9CH3 9CH3 ist,

oder Derivate davon, deren Diastereomeren und pharmazeutisch verträglichen Salzen dieser Verbindungen.

Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellen pharmazeutische Zusammensetzungen dar, die mindestens eine Verbindung gemäß der Formeln 1-3 und geeignete Zusatz- oder Hilfsstoffe umfassen. Solche geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffe sind dem Fachmann und im Stand der Technik bekannt.

In diesen pharmazeutischen Zusammensetzungen können die Verbindungen in Form einer Depotsubstanz oder als Vorläufer zusammen mit einer geeigneten, pharmazeutisch verträglichen Verdünnungslösung oder Trägersubstanz vorliegen.

Es wird bevorzugt, daß die Verbindungen in einer Menge von 0,1 bis 1000 mg, bevorzugterweise von 1 bis 100 mg, pro Dosiseinheit in einer pharmazeutischen Zusammensetzung vorliegen.

Es können auch weitere Selektininhibitoren in den pharmazeutischen Zusammensetzungen enthalten sein. Diese weiteren Selektininhibitoren können die dem Fachmann bekannten üblichen Selektininhibitoren umfassen, wie beispielsweise Sialyl LewisX (sLeX), eine Vielzahl von sLeX- Analoga, wie z.B. Monosaccharid- und Oligosaccharid-Verbindungen, und glykosidische Selektininhibitoren, wie z.B. Bimosiamose. Synthetische Selektininhibitoren können verwendet werden (siehe dazu auch: Simanek, E. E., et al., Selectin-carbohydrate interactions: From natural ligands to designed mimetics. Chem. Rev. 98 (1998) 833-862.).

Bevorzugte Formen der pharmazeutischen Zusammensetzungen sind Tabletten, Dragees, Kapseln, Tropflösungen, Suppositorien, Injektions- oder Infusionszubereitungen zur peroralen, rektalen oder parenteralen Verwendung. Solche Darreichungsformen und deren Herstellung sind dem Fachmann bekannt. Es wird bevorzugt, daß die Verbindung in der pharmazeutischen Zusammensetzung in einer solchen Menge vorliegt, daß eine Menge in einem Konzentrationsbereich zwischen 0,1 und 100 μM bei der Behandlung in vivo vorliegt.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Synthese einer Verbindung gemäß der Formeln 1 bis 3 umfaßt bevorzugterweise die Synthese aus l-(6-Bromhexyloxy)-3,5-didecyloxybenzol und einer Verbindung ausgewählt aus der Gruppe aus Bis(4-methoxycarbonylphenyl)methanon, N,N-Bis(4-methoxycarbonylphenyl)amin und 7V-(4-Carboxybenzyi)-iV-(4-carboxyphenyi)- amin.

Dabei wird bevorzugt, daß eine Verbindung gemäß der Formel 2 aus Bis(4- methoxycarbonylphenyl)methanon (Verbindung 6 in Schema 1) und l-(6-Bromhexyloxy)- 3,5-didecyloxybenzol (Verbindung 10 in Schema 1) synthetisiert wird.

Es wird weiterhin bevorzugt, daß die Herstellung einer Verbindung gemäß der Formel 3 die Synthese aus N,iV-Bis(4-methoxycarbonylphenyl)amin (Verbindung 15a in Schema 2) oder 7V-(4-Carboxybenzyl)-iV-(4-carboxyphenyl)amm (Verbindung 15b in Schema 2) und l-(6- Bromhexyloxy)-3,5-didecyloxybenzol (Verbindung 10 in Schema 1) umfaßt.

Bevorzugterweise erfolgt eine Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen, wie in den Schemata 1 und 2 dargestellt.

Die vorliegende Erfindung stellt eine neue Klasse nichtglykosidischer und nichtpeptidischer Selektininhibitoren mit niedrigem Molekulargewicht zur Verfügung. Diese wurden anhand eines Pharmakophormodells unter Einbeziehung von Molecular Modeling Verfahren als Liganden für die Inhibition der Selektin-vermittelten Leukozytenadhäsion nach unterschiedlichen Strategien synthetisiert (Schema 1 + 2). Schema 1

8 9, 37% 10, 69%

αReagenzien und Reaktionsbedingungen: (a) i-PrMgCl, THF, 40 min, -30°C bis -20°C; (b) 4- Formylbenzoesäuremethylester (16), THF, -2O0C; RT, über Nacht; (c) PCC, CH2Cl2, 24 h, RT; (d) HCl-H2N-OH, EtOH, NaOAc, 24 h, Rückfluß; (e) 1-Decanol, HCl-Gas, 3 h, 70°C; (f) 1,6-Dibromhexan, K2CO3, Cyclohexanon, 24 h, Rückfluß; (g) NaH, DMF; 10, W-Bu4NI, 2 h, RT; (h) 0,5 M NaOH, EtOH/THF, 24 h, RT; (siehe Beispiel 8). Schema 2

16 17 18, 94%

a) n = 1, b) n = 0

"Reagenzien und Reaktionsbedingungen: (a) Cu, CuI, K2CO3, n-Bu2O, 4 d, Rückfluß; (b)

NaOCH3, CH3OH, 1,5 h, Rückfluß; (c) MeOH, 1 h, Rückfluß; (d) NaBH4, MeOH, 24 h, RT;

(e) NaH, n-Bu2O, 2 h, RT; 6-Bromhexansäurechlorid, 4 h, Rückfluß; (f) 9, K2CO3, KI5

Cyclohexanon, 5 h, Rückfluß; (g) 0,5 M LiOH, THF, 8 h, 5°C, dann 16 h, 15 0C;

(siehe Beispiel 8).

Die erfindungsgemäß dargestellten Verbindungen können anschließend derivatisiert werden.

Bevorzugte Derivatisierungen umfassen die Bildung von Ester-, Amid- und Hydroxamsäure-

Derivaten der erfindungsgemäßen Verbindungen.

Bevorzugte Vertreter der Verbindungen, die aus den Formeln 1-3 abgeleitet werden können,

umfassen die Verbindungen, die in den Formelübersichten 1 und 2 gezeigt werden. Formelübersicht 1

Formelübersicht 2

T21:

4-(N-(6-(3,5-Bis(decyloxy)phenoxy)hexyl)-N-(4-carboxyl-ph enyl)amino)benzoesäure;

C46H67NO7 (T21)

Diese 4-[(N-4-Carboxyphenyl-N-acyl)amino]benzoesäure-Derivate bzw. 4-[(N-4-

Carboxyphenyl-N-acyl)imino]benzoesäure-Derivate haben als Mimetika von sLeX eine wesentlich höhere Affinität (f ~6 im statischen Assay, siehe Beispiel 1) zu den Selektinen als das oben genannte Bimosiamose selbst. Diese Mimetika enthalten funktionelle Gruppen, wie z.B. Hydroxylgruppen und Säureeinheiten um Fucose und Sialinsäure nachzuahmen, aromatische Bereiche als Ersatz für Lactosamin, mit einem definierten Abstand von lipophilen und hydrophilen Strukturelementen.

Die Ergebnisse eines statischen Leukozyten-Adhäsions-Assays mit den erfindungsgemäßen Verbindungen Tl bis T27 (siehe Figur 1 sowie Beispiel 1) zeigen deutlich, daß es sich bei den potentesten der erfindungsgemäßen Verbindungen um Carbonsäuren handelt. Es wurden daher verschiedene Carbonsäuren, die jeweils ein Amid-, Oxim-, bzw. Amino- Strukturelement aufweisen, dargestellt und getestet. Mit Ausnahme von T25 besitzen alle Ester nur einen schwachen Effekt auf die Adhäsionsminderung. Zum Vergleich: Bimosiamose weist in einer Konzentration von 600 μM etwa die gleiche Potenz auf wie T3 in einer Konzentration von 100 μM.

Zusätzlich konnte in einem Maus-Peritonitis-Modell, einem akuten Entzündungsmodell, exemplarisch gezeigt werden, daß die erfindungsgemäßen Substanzen zu einer Verringerung der polymorphonuklearen Leukozyten (PMN)-Infiltration ins Peritoneum führen (siehe Figur 2 und Beispiel 7) und damit anti-inflammatorisch wirksam sind.

Außerdem wurden in Toxizitäts-Untersuchungen bereits die Struktur-Elemente identifiziert, die für eine Zytotoxozität der erfindungsgemäßen Verbindungen verantwortlich sein können (siehe Figur 3 und Beispiel 6).

Die erfindungsgemäßen Verbindungen, die von den Formeln 1-3 abgeleitet werden können, können als Arzneimittel verwendet werden.

Bevorzugt wird dabei die Verwendung zur Behandlung von Erkrankungen, in denen die S elektin- vermittelte Leukozytenadhäsion dysreguliert ist.

Weiterhin bevorzugt wird die Verwendung zur Behandlung von entzündlichen Erkrankungen. Die entzündlichen Erkrankungen, die erfindungsgemäß behandelt werden können, umfassen Peritonitis und rheumatoide Arthritis. Weiterhin ist die Behandlung von Tumorerkrankungen möglich. Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden bevorzugt als Selektininhibitoren und zur Inhibierung der Selektin-vermittelten Leukozytenadhäsion verwendet.

Zusammenfassend läßt sich sagen, daß die vorliegende Erfindung eine neue Klasse untoxischer, in vivo anti-inflammatorisch wirksamer, nichtglykosidischer und nichtpeptidischer Selektininhibitoren umfaßt, welche nicht die Nachteile der glykosidischen Inhibitorkomplexe wie 1. den komplizierten Syntheseweg, 2. den hohen Preis der Ausgangsstoffe 3. die schwierige Strukturaufklärung. 4. die hydrolytische Instabilität, und 5. die relativ geringe Bindungsaffinität aufweisen und zudem in vitro potenter sind, als der derzeit in die klinische Phase II befindliche Wirkstoff Bimosiamose.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung soll unter einem "Derivat" eine von einer der allgemeinen Formeln 1, 2 oder 3 abgeleitete Verbindung sein, die zum Beispiel durch verschiedene der oben für R1 bis R6 und X oder Y angegebenen Restgruppen substituiert ist, sowie Gemische verschiedener dieser Verbindungen, die zum Beispiel zu einem auf die jeweils zu therapierende Erkrankung und/oder den Patienten auf Basis von diagnostischen oder Daten über den Behandlungserfolg oder -verlauf abgestimmten "personalisierten" Medikament verarbeitet werden können. Unter einem Derivat wird auch eine Verbindung verstanden, die auf einem anderen Syntheseweg dargestellt werden kann, als den hier (beispielhaft) erwähnten. Bevorzugte Derivatisierungen umfassen die Bildung von Ester-, Amid- und Hydroxamsäure-Derivaten der erfindungsgemäßen Verbindungen.

Unter einem "Vorläufer" einer Substanz soll im Rahmen der vorliegenden Erfindung zum einen eine Substanz verstanden werden, die im Laufe ihrer Verabreichung zur Behandlung durch die Bedingungen im Körper (z. B. pH im Magen, oder ähnliches) so verändert wird, oder aber durch den Körper nach Aufnahme so metabolisiert wird, daß sich als wirksame Substanz der erfindungsgemäßen Verbindungen oder deren Derivate bilden. Figuren und Beispiele

Die vorliegende Erfindung soll durch die folgenden Beispiele unter Bezugnahme auf die beigefugten Figuren weiter verdeutlicht werden, ohne jedoch auf diese Beispiele beschränkt zu sein. In den Figuren zeigen

Figur 1 die Testung von T1-T27 im statischen Adhäsions-Assay, wobei

sind. Die Adhäsionsminderung von anhaftenden Leukozyten an dem mit TNF-α stimulierten Monolayer wurde gleich 0 %, die in den unbehandelten Kontroll- Wells gleich 100% gesetzt. Figur 2 die Verminderung der Polymorphonuklearen Leukozyten (PMN)-Infiltration durch T25 in einem Maus-Peritonitis-Modell.

Figur 3 die Ergebnisse des XTT-Viabilitätstests gegenüber MM6-Zellen zur Untersuchung des zytotoxischen Verhaltens von Verbindungen mit unterschiedlichen Strukturelementen, wobei

sind.

Beispiel 1 : Statischer Adhäsionsassay Die Untersuchung der Adhäsion wurde an (Rinderaortenendothelzellen) BAEC Monolayern der Zellpassage 1-3 sieben Tage nach dem Aussähen in 24 Wellplatten durchgeführt. Vor Durchführung des Assays wurden die Vollständigkeit und die Gleichförmigkeit der BAEC- Monolayer mikroskopisch sichergestellt. Das Kulturmedium (500 ml Medium M199, dem 6 ml Penicillin/Streptomycinlösung 1%, 6 ml L-Glutamin (200 mM) und 100 ml (20%ig) fötales Kälberserum, Sigma, München, zugegeben wurden) wurde entfernt und der Monolayer zweimal mit DPBS gewaschen (1000 μl/Well, 37°C). Nach dem Waschen, wurden die Zellen mit dem Zellkulturmedium, das 20 ng/ml rekombinanten Tumornekrose-Faktor-alpha (TNFα) enthält (in Gegenwart der jeweiligen Testsubstanz gelöst in Dimethylsulfoxid (DMSO) oder nur mit DMSO als Vehikel) für 20 Minuten bei 37 0C und 5% CO2 für 4 Stunden behandelt. Nach erneutem zweimaligen Waschen mit DPBS (1000 μl/Well, 37 0C) wurden 900 μl des Kulturmediums und 100 μl einer PMN-Suspension (106 Zellen pro ml) pro Well hinzugefügt und für 30 Minuten bei 37 °C und 5% CO2 inkubiert. Nicht anhaftende Zellen wurden durch zweimaliges Waschen mit DPBS entfernt (1000 μl/Well, 37 0C). Kulturmedium (1000 μl/Well, 37 °C) wurde vor der mikroskopischer Auswertung hinzugefügt, als Konzentrationen der Testsubstanzen wurden 10"4-10"7 mol/1 verwendet. Die Vitalität der BAEC nach der Inkubation mit Zytokinen oder Testsubstanzen wurde durch Trypan-Blau-Ausschluß und mikroskopische Prüfung bestätigt (siehe Beispiel 2 und 3).

In Figur 1 ist die Testung der Verbindungen Tl bis T27 im statischen Assay zusammengefaßt (Ulbrich'H., Prech, P., Luxenburger, A. and Dannhardt, G. Charaterization of a computerized assay for rapid and easy determination of leukocyte adhesion to endothelial cells. Eur. J. Phar. Sei. submitted; Dannhardt, G. and Ulbrich, H., In- vitro test System for the evaluation of cyclooxygenase-1 (COX-I) and cyclooxygenase-2 (COX-2) inhibitors based on a single HPLC run with UV detection using bovine aortic coronary endothelial cells (BAECs). Inflamm. Res. (2001) 262-269.). Die Adhäsionsminderung von anhaftenden Leukozyten an dem mit TNF-α stimulierten Monolayer wurde gleich 0 %, die in den unbehandelten Kontroll- Wells gleich 100% gesetzt.

Man erkennt in Figur 1 deutlich, daß es sich bei den potentesten Verbindungen in jedem Fall um Carbonsäuren handelt. Dabei wurden verschiedene Carbonsäuren, die jeweils ein Amid-, Oxim-, bzw. Aminostrukturelement aufweisen, dargestellt und getestet. Mit Ausnahme von T25 besitzen alle Ester nur einen schwachen Effekt auf die Adhäsionsminderung. Zum Vergleich: Bimosiamose weist in einer Konzentration von 600 μM etwa die gleiche Potenz auf wie T3 in einer Konzentration von 100 μM.

Beispiel 2: Bilddarstellung und Zeil-Zählung Die BAEC-Ausschnitte wurden mit einem inversen Leica DM IRB-Mikroskop (Leica, Bensheim, Deutschland) bei 100 facher Vergrößerung analysiert. Die Analyse wurde in der Mitte von jedem Monolayer durchgeführt, wo die BAEC-Schicht mit den anhaftenden PMNs in scharfen Fokus gebracht werden kann. Die Bilder von den BAEC-Ausschnitten wurden in einer Auflösung von 1200 x 1000 Pixeln mit Hilfe einer Leica DC 200 Digitalkamera, die an das Mikroskop angeschlossen wurde, aufgenommen und auf einem PC als Bitmap (bmp) oder als tagged image file format (tiff) mittels Leica Bildarchiv-Software (Leica Mikrosysteme, Bensheim, Deutschland) gespeichert. Für das manuelle Zählen von PMNs wurden mehrere zufällig gewählte 0,25 mm2 große Ausschnitte aus der Mitte des jeweiligen Wells der Wellplatte ausgezählt. Das Zählen erfolgte mit Hilfe der Bildarchiv-Software IM 1000. (Leica Mikrosysteme, Bensheim, Deutschland). Dazu wurde jedes PMN im gewählten Bereich durch einen PC-Mausklick gezählt und die gezählten Zellen markiert. Dieses manuelle Zählen wurde durch zwei unabhängige Beobachter verbündet durchgeführt. Die manuelle Zählmethode besitzt eine mittlere Abweichung von ± 10 %.

Beispiel 3: Bildanalyse Die Bildanalyse wurde mit Hilfe der öffentlich zugänglichen ImageJ-Sofware (verfügbar auf http://rsb.info.nih.gov/ij), die auf einem Standard-PC installiert ist, durchgeführt (Maxdata, Mergel, Deutschland). Alle erhaltenen Bilder von einem Probelauf wurden in einer Reihe gruppiert und danach in einem automatisierten Verfahren mit einem speziell programmierten Makro analysiert. Während der Analyse wurde das Farbbild zunächst umgewandelt in ein 8- bit Bild. Anschließend wurde die Verteilung der Grauwerte von jedem Bild geplottet, der Schwellenwert der Grauwerte festgelegt und schließlich die Zellen gezählt. Dafür wurde der Makro "des kundenspezifischen Partikelanalysators" (Autoren: Roos, G., Rasband, W.; http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/particle-analyzer.html) verwendet. Gezählte PMNs wurden als gefüllte schwarze Kreise angezeigt. Für alle Partikel wurden die folgenden Parameter aufgezeichnet: Fläche in Pixeln, Minimurn/Maximum/Durchschnitt der grauen Werte und die Kreisförmigkeit (47r*(Fläche/Umfang2)). Begrenzungen für den Bereich und die KreisfÖrmigkeitsparameter wurden auf die Werte eingestellt, die der Größe und der Form der PMNs entsprechen, die im Experiment verwendet wurden.

Beispiel 4: Durchflußkammer-Zellen-Adhäsions-Assay Dynamische laminare Durchflußuntersuchungen wurden auf BAEC durchgeführt, die zuvor in einem Brutschrank bei 5% CO2 und 37° C in 6- Wellplatten zur Konfluenz gewachsen sind. Dazu wurden die Zellen 4 Stunden lang mit Medium (500 ml Medium Ml 99, dem 6 ml Penicillin/Streptomycinlösung 1%, 6 ml L-Glutamin (200 mM) und 100 ml (20%ig) fötales Kälberserum zugegeben wurden) alleine (Kontrolle) oder mit Medium das 10 ng/ml TNFoΛL-l|8 enthält (R&D Systeme) in Gegenwart/ Abwesenheit von Testsubstanzen, die zuvor in DMSO aufgelöst wurden (10-100 μM Endkonzentration) inkubiert. In einer anderen experimentellen Versuchsreihe wurden die Leukozyten 4 Stunden lang mit Medium allein (Kontrolle) oder mit Medium, das 10 ng/ml TNFo/IL-1/3 in Gegenwart/Abwesenheit der Testsubstanzen enthält, die zuvor in DMSO aufgelöst wurden (10-100 μM abschließende Konzentration), inkubiert.

Nach der Inkubation wurden die Endothelzellen mit PBS gewaschen und eine flach-polierte Durchflußkammer (Glycotech) wurde auf den BAEC-Monolayer aufgebracht. MM6 oder PMNs (1,0 x 106 Zellen /ml), suspendiert in RPMI Medium plus 1% FCS, wurden durch den Flußraum bei einer konstanten Scherbeanspruchung von 1 dyne/cm2 für 4 Minuten perfundiert. Das Rollen und die anhaftenden Leukozyten wurden sichtbar gemacht und in der ersten Minute in vier unterschiedlichen nach dem Zufallsprinzip ausgewählten Bereichen jedes Wells der 6-Wellplatte gezählt. Dies erfolgte mit einem inversem Mikroskop, das an eine Videokamera angeschlossen (Kappa CF 15/2) und mit einem Videorecorder (Panasonic SVHSTL700) verbunden ist. Alle Daten wurden mit Microsoft Excel analysiert. IC50Werte wurden mit dem Programm GRAFIT, Erithacus Software Ltd., Großbritannien errechnet.

Beispiel 5: E-Selektin P-Selektin-Zelladhäsions-Assay Die Fähigkeit der Substanzen, die Adhäsion von MM6 Zellen an rekombinante Selektin- Proteinen zu hemmen, wurde in einem "Zell-Selektin"-Assay gemessen. Rekombinantes lösliches P- bzw. E-Selektin-Protein, die von R&D (Minneapolis, Mangan) gekauft wurden, wurden zu 5,0 μg/ml in Dulbeccos PBS, das Kalzium und Magnesium (PBS+) enthält verdünnt. Um mit Zelladhäsionsmolekülen (CAMs) beschichtete Platten zu erhalten, wurde jeweils 50μl des entsprechenden humanen rekombinanten CAM (5μg/ml; R&d Systeme, MN) in die Mitte eines jedes Loches der 6-Wellplatte aufgebracht und über Nacht bei 4 0C inkubiert. Die Platten wurden dreimal mit lOOμl PBS+ gewaschen und für 60 Minuten mit 100 μl einer Lösung der Testsubstanz (oder des Vehikels) in RMPI (1% FCS und 1 % DMSO) in verschiedenen Endkonzentrationen inkubiert. Für die Testsubstanzen wurden jeweils Doppel- oder Dreifachbestimmungen durchgeführt. Anschließend wurden die Platten für den Zelladhäsionsassay dreimal mit 100 μl PBS+ gewaschen und eine flach-polierte Durchflußkammer (Glycotech) wurde auf den BAEC Monolayer aufgebracht. MM6 oder PMNs (1,0 x 106 Zellen /ml), suspendiert in RPMI Medium plus 1% FCS5 wurden durch den Flußraum bei einer konstanten Scherbeanspruchung von 1 dyne/cm2 für 4 Minuten perfundiert. Das Rollen und die anhaftenden Leukozyten wurden sichtbar gemacht und in der ersten Minute in vier unterschiedlichen nach dem Zufall ausgewählten Bereichen jedes Wells der 6- Wellplatte gezählt. Man zeichnet dies mit einem inversem Mikroskop, das an eine Videokamera angeschlossen (Kappa CF 15/2) und mit einem Videorecorder (Panasonic SVHSTL700) verbunden ist auf. Alle Daten wurden mit Microsoft Excel analysiert. IC5oWerte wurden mit dem Programm GRAFIT, Erithacus Software Ltd., Großbritannien errechnet.

Beispiel 6: Assays zur Untersuchung der Toxizität Aufgrund der gegebenen Struktur der Substanzen und der Tatsache, daß heutzutage bereits zu einem frühen Stadium der Targetfindung die Toxizität der neu entwickelten Subtanzen untersucht wird, wurden Toxizitätsuntersuchungen in verschiedenen Zelltypen mittels unterschiedlicher Testkits durchgeführt.

1) XTT-Assay zur Untersuchung der Zeilproliferation Der XTT-Assay (Cell Proliferation Kit II (XTT), Roche molekulare Biochemikalien, Mannheim, Deutschland) wurde für die Quantifikation der anti-proliferativen oder zytotoxischen Effekte der synthetisierten Substanzen verwendet. Der Assay basiert auf der Umwandlung des gelben Tetrazolium Salzes XTT in einen orangenen Formazan Farbstoff durch metabolisch aktive Zellen. Der XTT-Formazan-Farbstoff ist in wäßrigen Lösungen löslich und kann mit einem ELISA-Lesegerät direkt quantitativ bestimmt werden. Die Inkubationszeit schwankt mit der jeweiligen experimentellen Einstellung (z.B. der Zellart und den Zellkonzentrationen, die verwendet werden). Die Absorption wurde bei 490 nm bestimmt, zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Zugabe des fertigen XTT-Reagenzes (z.B. 30 Minuten, 4, 6, 8, 12 und 18 Stunden). Alle Daten wurden mit Microsoft Excel analysiert. IC50WeIIe wurden mit dem Programm GRAFIT, Erithacus Software Ltd., Großbritannien errechnet.

Ergebnisse des XTT-Viabilitätstests (Figur S) Mit Hilfe des kommerziell erhältlichen XTT-Testkits, wurde das zytotoxische Verhalten von Substanzen mit unterschiedlichen Strukturelementen gegenüber MM6-Zellen nach 1,5 Stunden untersucht. Es konnten Strukturelemente, die für die Zytotoxizität verantwortlich sind, identifiziert werden. Als besonders zytotoxisch erwies sich die Amid-Funktion in Kombination mit freien Carbonsäure-Funktionen. Durch Reduktion der Amid-Funktion von T3 unter Beibehaltung aller anderen Strukturelemente gelangt man zu der völlig untoxischen aber hochpotenten Verbindung T21 (Figur 4). Zu beachten bleibt jedoch, daß aber auch Rofecoxib, das längst am Markt etabliert ist, zytotoxische Effekte besitzt. 2) ATP-lite-Assay ATPLiteTM (ATPLite™, Perkin Eimer Life Sciences, Boston MA, USA) ist ein Monitoringtest des Adenosin-Triphosphats (ATP), das auf der Leuchtkäfer (Photinus pyralis)- Luciferase basiert. Dieser Lumineszenzassay wurde für die quantitative Auswertung der Proliferation und Zytotoxizität von kultivierten Säugetierzellen entwickelt. Das ATP- Monitoring kann verwendet werden, um die zytostatischen und proliferativen Effekte von verschiedenen Substanzen zu untersuchen. Die Testung wurde entsprechend den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.

Beispiel 7: Proteose-Pepton-induzierte Peritonitis bei Mäusen Neun Mäuse (drei in jeder Gruppe) wurden betäubt. Anschließend erhielten jeweils 3 Mäuse die Testsubtanz in 100 μl Maisöl gelöst, 100 μl Maisöl alleine oder HBSS i.p. injiziert. Nach 1 Stunde bekam jede Maus 3 ml einer 3 % Proteose-Pepton-Lösung in HBSS i.p. injiziert. Nach 6 Stunden wurden die Tiere getötet und die Leukozyten mit 3 ml kaltem HBSS, das 5 mM EDTA enthielt, gesammelt. Die Proben wurden zentrifugiert (2000 U/min für 5 Minuten), mit 5μl FITC-konjugiertem Ratte- Anti-Maus Macrophagen/Monocyten Antikörper (MOMA- 2, ImmunoKontact), Anti-Maus PMN Antikörper (Anti-PMN, ImmunoKontact) und Anti¬ Maus T-Lymphozyten Antikörper (Anti-CD2, ImmunoKontact) für 20 Minuten bei 4° C inkubiert. Anschließend wurde zweimal gewaschen und in HBSS resuspendiert. Die Intensität der Fluoreszenz der Leukozyten wurde mittels FACS analysiert.

Die Ergebnisse mit Verbindung T25 sind in Figur 2 dargestellt und zeigen exemplarisch, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen zu einer Verringerung der PMN-Infiltration ins Peritoneum führen und damit anti-inflammatorisch wirksam sind.

Beispiel 8: Allgemeine Synth esevorschrift Zur Synthese der Dicarbonsäure 1 (Schema 1) setzt man im ersten Reaktionsschritt 4- Jodbenzoesäuremethylester 3 mit /-PrMgCl bei tiefen Temperaturen unter -20°C um (Schema 1). Dabei findet eine Halogen-Magnesium-Austauschreaktion ((a) Jensen, A. E.; Dohle, W.; Sapountzis, I; Lindsay, D. M.; Vu V. A.; Knöchel P. Synthesis 2002, 565-569. (b) Boudier, A.; Bromm, L. O.; Lotz, M.; Knöchel, P. Angew. Chem. Int. Ed. 2000, 39, 4414-4435. (c) Knöchel, P.; Dohle, W.; Gommermann, N.; Kneisel, F. F.; Knopp, F.; Korn, T.; Sapountzis, L; Anh Vu, V. Angew. Chem. Int. Ed. 2003, 42, 4302-4320.) statt, wodurch das Grignard- Intermediat 4 selektiv in Gegenwart der Methylesterfunktion gebildet wird. Die darauffolgende Reaktion mit 4-Formylbenzoesäuremethylester (16) liefert schließlich den gewünschten Benzylalkohol 5 in einer Ausbeute von 71%. Dieser wird dann durch Pyridiniumchlorochromat (PCC) zum entsprechenden Benzophenon-Derivat 6 oxidiert und anschließend durch Reaktion mit Hydroxylaminhydrochlorid in Gegenwart von Natriumacetat in Ethanol in das Oxim 7 in einer Ausbeute von 80% in zwei Stufen überführt. Das für den folgenden Reaktionsschritt benötigte Phloroglucin-Fragment 10 wird in zwei Stufen dargestellt. Dazu wird zunächst Phloroglucin 8 in 1-Decanol suspendiert und durch Einleiten von HCl-Gas zu 9 verethert (Bringmann, G.; Härtung, T.; Göbel, L.; Schupp, O.; Ewers, C. L. J.; Schöner, B.; Zagst, R.; Peters, K.; von Schnering, H. G.; Burschka, C. Liebigs Ann. Chem. 1992, 225-232.). Li einem zweiten Veretherungsschritt wird die Verbindung 9 dann mit 1,6- Dibromhexan umgesetzt, so daß die Bromverbindung 10 in einer Ausbeute von 26% in zwei Stufen dargestellt werden kann. Um die beiden Fragmente 7 und 10 miteinander zu kuppeln, wird das Oxim 7 zunächst durch Natriumhydrid in DMF deprotoniert und anschließend mit dem Phloroglucin-Baustein 10 und einer katalytischen Menge W-Bu4NI bei RT umgesetzt. Der dabei gebildete Dimethylester 11 kann in einer Ausbeute von 91% isoliert werden. Durch Einwirkung einer 0.5 M wäßrigen Natriumhydroxidlösung in einer Mischung aus Ethanol und THF bei RT wird 11 schließlich zur gewünschten Dicarbonsäure 1 in einer Ausbeute von 95% verseift. Damit kann 1 in einer Gesamtausbeute von 52% in fünf Stufen synthetisiert werden.

Für die Synthese der Dicarbonsäure 2a (Schema 2) wird 4-Jodbenzoesäureethylester 12 mit 4- Acetamidobenzoesäureethylester 13 in einer Ullmann-Reaktion entsprechend den beschriebenen Reaktionsbedingungen (Hellwinkel, D.; Gaa, H. G.; Gottfried, R. Z. Naturforsch. 1986, 41 b, 1045-1060.) zu 14 umgesetzt. Die Einwirkung von Natriummethanolat in Methanol führt zur Bildung der entsprechenden Methylester- Funktionen unter gleichzeitiger Abspaltung der Acetyl-Gruppe, so daß der gewünschte Dimethylester 15a in einer Ausbeute von 81% erhalten wird. Im nächsten Reaktionsschritt wird Verbindung 15a dann zunächst durch Natriumhydrid in /J-Bu2O deprotoniert und anschließend mit 6-Bromhexansäurechlorid versetzt, was Verbindung 19a in einer Ausbeute von 88% liefert (S0rensen, J. L.; Huusfeldt, P. O.; Knutsen, L. J. S.; Lau, J.; Lundt, B. F., Petersen, H.; Suzdak, P. D.; Swedberg M. D. B. J. Med. Chem. 1999, 42, 4281-4291.). Erhitzt man 19a zusammen mit dem Phloroglucin-Derivat 10 in Gegenwart von Kaliumkarbonat und einer katalytischen Menge Kaliumjodid in Cyclohexanon gelingt die Kupplung zum Dimethylester 20a in einer Ausbeute von 66%. Im letzten Syntheseschritt werden die Esterfunktionen in 20a durch Rühren mit einer 0,5 M LiOH-Lösung in THF verseift, so daß die gewünschte Dicarbonsäure 2a in einer Ausbeute von 89% bzw. in einer Gesamtausbeute von 42% in vier Stufen ausgehend von 14 erhalten wird.

Zur Darstellung der Dicarbonsäure 2b (Schema 2) geht man von 4-Formylbenzoesäure- methylester 16, sowie 4-Aminobenzoesäuremethylester 17 aus, die im ersten Reaktionsschritt zum Imin 18 kondensiert werden. Reduktion der Doppelbindung in 18 durch Einwirkung von NaBH4 in MeOH bei RT liefert das Amin 15b in einer Ausbeute von 82% über zwei Stufen (Schema 2) (Albright, J. D.; DeVries, V. G; Largis, E. E.; Miner, T. G.; Reich, M, F.; Schaffer, S. A.; Shepherd, R. G.; Upeslacis, J. J. Med. Chem. 1983, 26, 1378-1393). Die weiteren Syntheseschritte werden analog der bereits beschriebenen Synthese der Dicarbonsäure 2a durchgeführt. Danach wird Verbindung 15b durch Natriumhydrid deprotoniert und anschließend durch Zugabe von 6-Dibromhexansäure in das Amid 19b überführt (Ausbeute von 91%). Nachfolgende Umsetzung mit dem Phloroglucin-Baustein 9 liefert das Kupplungsprodukt 20b in 85% Ausbeute. Die Verseifung des Dimethylesters 20b mit einer 0.5 M LiOH-Lösung in THF ergibt schließlich die gewünschte Dicarbonsäure 2b in einer Ausbeute von 80% und einer Gesamtausbeute von 51% in fünf Stufen ausgehend von 16.

Beispiel 9: Allgemeine synthetische Methoden Schmelzpunkte sind unkorrigiert angegeben und wurden mit einem Apparat nach Dr. Tottoli der Firma Büchi bestimmt. Infrarotspektren wurden an dem Gerät PerkinElmer 1310 Lifrared Spectrometer aufgenommen. Η-NMR-Spektren wurden an dem Gerät AC 300 der Firma Bruker gemessen. Chemische Verschiebungen sind relativ zu Tetramethylsilan als internem Standard angegeben. Massenspektren wurden mit den Geräten MAT 95 (FD, 70 eV) der Firma Finnigan oder MAT 311 A (EI, 70 eV) der Firma Varian gemessen. Elementaranalysen wurden mit dem Gerät Carlo Erba Strumentazione 1106 am Institut für Organische Chemie der Johannes Gutenberg-Universität in Mainz durchgeführt. Die erhaltenen Werte liegen innerhalb einer Abweichung von + 0.4%. Der Ablauf der Reaktionen, sowie die Reinheit der Produkte wurden mittels Dünnschichtchromatographie unter Verwendung der stationären Phase Kieselgel 60 F254 (0,2 mm beschichtete Platten) der Firma Merck überprüft. Säulenchromatographie wurde an Kieselgel der Korngröße 60-200 μm der Firma J.T. Baker durchgeführt. Die verwendeten Lösungsmittel und Reagenzien wurden, soweit erforderlich, nach gängigen Labormethoden gereinigt und getrocknet oder verwendet, wie sie von der entsprechenden Firma geliefert wurden. Umsetzungen in wasserfreien Lösemitteln wurden standardgemäß unter trockenem Stickstoff durchgeführt. Verbindung 14 wurde nach der in Hellwinkel et al. (Hellwinkel, D.; Gaa, H. G.; Gottfried, R. Z Naturforsch. 1986, 41 b, 1045- 1060.) beschriebenen Methode dargestellt.

Beispiel 10: Spezifische Synthesevorschriften

1) Bis(4-methoxycarbonylphenyi)methanol (5). (Andersen, K. E.; Mane, R. B.; Desai, U. V.; Hebbaikar, G. D. Collection Czechoslovak Chem. Commun. 1988, 53, 646-657.) Man löst 4-Jodbenzoesäure 3 (5,00 g, 19,1 mmol) in wasserfreiem THF (60 ml), kühlt die Lösung in einem /so-Propanol/Trockeneisbad auf eine Innentemperatur von -30°C ab und tropft /-PrMgCl (2 M in THF; 10,5 ml, 21,0 mmol) so langsam zu, daß die Innentemperatur zwischen -2O0C und -300C liegt. Nachdem man die Reaktionsmischung weitere 40 min bei einer Temperatur von -250C gerührt hat, setzt man eine Lösung von 4-Formylbenzoesäuremethylester (16; 4,07 g, 24,8 mmol) in wasserfreiem THF (25 ml) tropfenweise zu, so daß die Innentemperatur -2O0C nicht überschreitet. Man rührt die Mischung für weitere 30 min bei -250C und läßt diese dann über Nacht auf RT auftauen. Anschließend gibt man Methanol (30 ml) zu, gießt die Mischung in Wasser (500 ml) und extrahiert mit Et2O. Die organischen Phasen werden vereinigt, mit gesättigter NaCl- Lösung gewaschen und über MgSO4 getrocknet. Man entfernt das Lösemittel und kristallisiert das erhaltene Rohprodukt aus Chloroform/P etrolether um, so daß man 4,05 g (71%) der Verbindung 5 als farblosen Feststoff erhält. Schmp. 116°C (Andersen, K. E.; Mane, R. B.; Desai, U. V.; Hebbaikar, G. D. Collection Czechoslovak Chem. Commun. 1988, 53, 646-657.) 1230C). Die spektroskopischen Daten der isolierten Verbindung 5 entsprechen den publizierten Werten (Andersen et al. 1988, siehe oben).

2) Bis(4-methoxycarbonylphenyl)methanon (6). (Kirste, B.; Grimm, M.; Kurreck, H. J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 108-114.) Zu einer Suspension von PCC (3,10 g, 14,4 mmol) in wasserfreiem CH2Cl2 (25 ml) tropft man bei RT langsam eine Lösung des Benzylalkohols 5 (2,70 g, 8,99 mmol) in wasserfreiem CH2Cl2 (10 ml) und rührt den Ansatz bei dieser Temperatur über Nacht. Anschließend filtert man die Mischung durch eine kleine Menge Kieselgel (CH2Cl2 als Eluent). Nach Abdestillieren des Lösemittels konnten 2,44 g (91%) der Verbindung 6 in Form eines farblosen Feststoffs isoliert werden. Schmp. 228-2300C (Kirste et al. 1989, siehe oben, 229,5-2300C); IR (KBr) 1705, 1630 cm"1; 1H-NMR (CDCl3) δ 8,17 (d, 8,4 Hz5 4H), 7,85 (d, 8,4 Hz, 4H), 3,98 (s, 6H); MS (EI) m/z 298 (M+). Anal. ber. für C17Hi4O5: C, 68,45; H, 4,73. Gefunden C, 68,30; H, 4,69.

3) Bis(4-methoxycarbonylphenyl)methanon-oxim (7). Eine Mischung von 6 (2,33 g, 7,81 mmol), HCl-H2NOH (1,63 g, 23,4 mmol) und Natriumacetat (1,92 g, 23,4 mmol) in Ethanol (80 ml) wird 24 h unter Rückfluß erhitzt. Man läßt anschließend auf RT abkühlen und setzt halbkonzentrierte NaHCO3-Lösung (200 ml) zu. Die wäßrige Phase wird mit Et2O extrahiert, die vereinigten organischen Phasen werden mit gesättigter NaHCO3- und NaCl-Lösung gewaschen und über Na2SO4 getrocknet. Das Solvens wird entfernt und das Rohprodukt wird aus Ethanol umkristallisiert. Man erhält 2,15 g (88%) der Verbindung 7 als farblosen Feststoff. Schmp. 177-178°C; IR (KBr) 3190, 2920, 1700, 1585 cm"1; 1H-NMR (CDCl3) δ 8,50 (sbr, IH), 8,16 (d, 8,6 Hz, 2H), 8,00 (d, 8,6 Hz, 2H), 7,51 (d, 8,6 Hz, 2H), 7,47 (d, 8,6 Hz, 2H), 3,96 (s, 3H), 3,93 (s, 3H); MS (EI) m/z 313 (M+). Anal, ber. für C17Hi5NO5: C, 65,17; H, 4,83; N, 4,47. Gefunden C, 65,14; H, 4,78; N, 4,47.

4) 3,5-Didecyloxyphenol (9). In eine Suspension von Phloroglucin 8 (5,00 g, 39,7 mmol) in 1-Decanol (80 ml) leitet man 40 min lang trockenes HCl-Gas ein und erhitzt die orange/rote Mischung anschließend weitere 3,5 h auf 70°C. Nach Beendigung der Reaktion wird das überschüssige 1-Decanol im Vakuum abdestilliert und der Reaktionsrückstand mittels Säulenchromatographie gereinigt (Kieselgel, CH2Cl2). Man erhält 5,92 g (37%) der Verbindung 9 als farblosen Feststoff. Schmp. 48-5O0C; IR (KBr) 3340, 2880, 2810 cm"1; 1H-NMR (CDCl3) δ 6,06 (t, 2,1 Hz, IH), 5,99 (d, 2,1 Hz, 2H), 4,80 (s, IH, OH), 3,89 (t, 6,7 Hz, 4H), 1,80-1,69 (m, 4H), 1,48-1,23 (m, 28H), 0,88 (t, 6,8 Hz, 6H); MS (FD) m/z 407 (M+). Anal. ber. für C26H46O3: C, 76,79; H, 11,40. Gefunden C, 76,74; H, 11,44.

5) l-(6-Bromhexyloxy)-3,5-didecyIoxybenzoI (10). Eine Mischung von 9 (2,70 g, 6,64 mmol), 1,6-Dibromhexan (15,0 ml, 98,4 mmol), K2CO3 (2,29 g, 16,6 mmol) in Cyclohexanon (50 ml) wird 16 h unter Rückfluß erhitzt. Anschließend läßt man auf RT abkühlen, filtert von den anorganischen Salzen ab und wäscht mit Aceton nach. Das Lösemittel, sowie das überschüssige 1,6-Dibromhexan werden i. Vak. abdestilliert und der Rückstand wird durch SäulenchiOmatographie (Kieselgel, Chloroform/Petrolether 1:2) gereinigt. 2,62 g (69%) der Verbindung 10 konnten in Form eines hell gelben Öls isoliert werden. IR (Film) 2895, 2810, 1575 cm"1; 1H-NMR (CDCl3) δ 6,05 (s, 3H), 3,94-3,86 überlagerte Signale (3,91, t, 6,4 Hz, 2H und 3,90, t, 6,7 Hz, 4H), 3,42 (t, 6,7 Hz, 2H), 1,95- 1,83 (m, 2H), 1,81-1,69 (m, 6H), 1,52-1,21 (m, 32H), 0,88 (t, 6,8 Hz, 6H); MS (FD) m/z 571 (M+ für Br81), 569 (M+ für Br79). Anal. ber. für C32H57BrO3: C, 67,46; H, 10,08. Gefunden C, 67,67; H, 10,12.

6) 0-[6-(3,5-Didecyloxyphenyloxy)-hexyl]-bis(4-methoxycarbonylp henyl)methanon-oxim (H). Zu einer Suspension von Natriumhydrid (60% in Mineralöl; 140 mg, 3,51 mmol) in wasserfreiem DMF (5 ml) setzt man das Oxim 7 (1,00 g, 3,19 mmol) portionsweise bei 0°C zu und rührt weitere 15 min. Anschließend wird eine Lösung des Bromids 10 (1,81 g, 3,19 mmol) in wasserfreiem DMF (3 ml), sowie eine katalytische Menge R-Bu4NI der intensiv roten Reaktionsmischung zugegeben. Nachdem man eine Stunde bei RT gerührt hat (DC- Kontrolle), gießt man den Ansatz in Wasser und extrahiert mit Et2O. Die vereinigten organischen Phasen werden mit Wasser und gesättigter NaCl-Lösung gewaschen und über Na2SO4 getrocknet. Nach Entfernen des Lösemittels reinigt man den Rückstand säulenchrornatographisch an Kieselgel (Ethylacetat/Petrolether 1:4). Man erhält 2.81 g (91%) der Verbindung 11 als farblosen Feststoff. Schmp. 55-56°C; IR (KBr) 2890, 2820, 1705, 1580 cm4; 1H-NMR (CDCl3) δ 8,11 (d, 8,4 Hz, 2H), 7,99 (d, 8,4 Hz, 2H), 7,52 (d, 8,4 Hz, 2H), 7,40 (d, 8,4 Hz5 2H), 6,05 (s, 3H), 4,22 (t, 6,7 Hz, 2H), 3,95 (s, 3H), 3,92 (s, 3H), 3,89 (t, 6,7 Hz, 6H), 1,80-1,67 (m, 8H), 1,49-1,21 (m, 32H), 0,88 (t, 6,8 Hz, 6H); MS (FD) m/z 802 (M+). Anal. ber. für C49H71NO8: C, 73,37; H, 8,92; N, 1,75. Gefunden C, 73,87; H, 8,67; N, 1,74.

7) O-[6-(3,5-DidecyloxyphenyIoxy)-hexyl]-bis(4-carboxyphenyl)me thanon-oxim (l). Man löst den Diethylester 11 (500 mg, 0,623 mmol) in einer Mischung aus Ethanol (5,10 ml) und THF (12,3 ml) und rührt diese 24 h mit einer wäßrigen NaOH-Lösung (0,5 M, 3,75 ml) bei RT. Nach beendeter Reaktion wird Wasser (30 ml) zugesetzt und einmal mit Et2O extrahiert (zur Phasentrennung läßt man die Mischung in einen Erlenmeyerkolben ab und stellt diesen für ca. 24h in einen Kühlschrank). Anschließend trennt man die klare wäßrige Phase ab und verwirft die organische Phase zusammen mit der restlichen Mischphase. Die wäßrige Phase wird solange langsam und tropfenweise mit einer 1 M Salzsäurelösung versetzt bis ein pH- Wert von 6-5 eingestellt ist. Man extrahiert mit Et2O, vereinigt die organischen Phasen, wäscht mit Wasser und gesättigter NaCl-Lösung und trocknet über Na2SO4. Nach Entfernen des Solvens werden 458 mg (95%) der Verbindung 1 als farbloses Harz isoliert. IR (KBr) 3250, 2890, 2820, 2640, 2520, 1670, 1580 cm"1; 1H-NMR (CDCl3) δ 8,21 (d, 8,4 Hz, 2H), 8,09 (d, 8,4 Hz, 2H), 7,58 (d, 8,4 Hz, 2H), 7,45 (d, 8,4 Hz, 2H), 6,05 (s, 3H), 4,24 (t, 6,4 Hz, 2H), 3,89 (t, 6,4 Hz, 6H), 1,81-1,68 (m, 8H), 1,51-1,22 (m, 32H), 0,87 (t, 6,7 Hz, 6H); MS (FD) m/z 774 (M+). Anal. ber. für C47H67NO8: C, 72,93; H, 8,72; N, 1,81. Gefunden C, 72,47; H, 8,96; N, 1,79.

8) ΛyV-Bis(4-methoxycarbonylphenyl)amin (15a). Nachdem man Natrium (971 mg, 42,2 mmol) in wasserfreiem Methanol (75 ml) aufgelöst hat, setzt man Verbindung 14 (Walter, R. I. J. Am. Chem. Soc. 1955, 77, 5999-6002.) (5,00 g, 14,1 mmol) portionsweise zu und erhitzt die resultierende Reaktionsmischung 1,5 h unter Rückfluß. Anschließend läßt man auf RT abkühlen und gießt den Ansatz auf Eis. Der gebildete Feststoff wird abgesaugt und aus Methanol umkristallisiert, so daß 3,25 g (81%) der Verbindung 15a als farblose Nadeln anfallen. Schmp. 174-1750C (Walter et al. 1955, siehe oben, 177-178°C); IR (KBr) 3280, 3260, 2920, 1695, 1665, 1570 cm"1; 1H-NMR (CDCl3) δ 7,98 (d, 8,8 Hz, 4H), 7,14 (d, 8,8 Hz, 4H), 6,42 (sbr., IH, NH), 3,90 (s, 6H); MS (EI) m/z 285 (M+). Anal. ber. für C16H15NO4: C, 67,36; H, 5,30; N, 4,91. Gefunden C, 67,42; H, 5,09; N, 4,97.

9) 6-Bromhexansäure-iVyV-bis(4-methoxycarbonylphenyl)ainid (19a). Zu einer Suspension von Natriumhydrid (60% in Mineralöl; 77,1 mg, 1,93 mmol) in wasserfreiem W-Bu2O (5 ml) gibt man 15a (500 mg, 1,75 mmol) portionsweise zu und rührt die Mischung zwei weitere Stunden bei RT. Anschließend versetzt man mit 6- Bromhexansäurechlorid (0,314 ml, 2,10 mmol) und erhitzt den Ansatz 4 h unter Rückfluß. Man läßt auf RT abkühlen, gießt in Eiswasser und extrahiert mit CH2Cl2. Die organischen Phasen werden vereinigt, mit gesättigter NaHCO3- (2x) und gesättigter NaCl-Lösung gewaschen und über MgSO4 getrocknet. Schließlich destilliert man das Lösemittel ab und kristallisiert das Rohprodukt aus Methanol um. Man erhält 713 mg (88%) der gewünschten Verbindung 19a als farblosen Feststoff. Schmp. 133-135°C; IR (KBr) 2920, 1700, 1645, 1580 cm'1; 1H-NMR (CDCl3) δ 8,06 (d, 8,6 Hz, 4H), 7,30 (d, 8,6 Hz, 4H), 3,92 (s, 6H), 3,38 (t, 6,7 Hz, 2H), 2,29 (t, 7,4 Hz, 2H), 1,88-1,77 (m, 2H), 1,76-1,64 (m, 2H), 1,49-1,35 (m, 2H); MS (FD) m/z 464 (M++l für Br81), 462 (M++l für Br79).

10) 6-(3,5-Didecyloxyphenoxy)-hexansäure-i\yV-bis(4-methoxycarb onylphenyl)amid (20a). Eine Mischung aus 19a (600 mg, 1,30 mmol), Phenol 9 (528 mg, 1,30 mmol), K2CO3 (449 mg, 3,25 mmol) und einer katalytischen Menge KI in Cyclohexanon (9 ml) werden 5 h refluxiert. Man läßt auf RT abkühlen, filtert von den anorganischen Salzen ab, wäscht mit Aceton nach und destilliert das Lösemittel weitgehend ab. Schließlich wird der erhaltene Rückstand durch Säulenchromatographie an Kieselgel gereinigt (Ethylacetat/Petrolether 1:2), so daß 673 mg (66%) der Verbindung 20a als farbloser Feststoff isoliert werden konnten. Schmp. 58-59°C; FR (KBr) 2890, 2820, 1705, 1665, 1585 cm"1; 1H-NMR (CDCl3) δ 8,05 (d, 8,6 Hz, 4H), 7,29 (d, 8,6 Hz, 4H), 6,05 (t, 2,1 Hz, IH), 6,02 (d, 2,1 Hz, 2H), 3,92 (s, 6H), 3,91-3,84 (m, 6H), 2,29 (t, 7,4 Hz, 2H), 1,80-1,66 (m, 8H), 1,52-1,21 (m, 30H), 0,88 (t, 6,7 Hz, 6H); MS (FD) m/z 788 (M+). Anal. ber. für C48H69NO8: C, 73,16; H, 8,83; N, 1,78. Gefunden C, 72,90; H, 8,82; N, 1,72.

11) 6-(3,5-Didecyloxyphenoxy)-hexansäure-ΛVV-bis(4-carboxyphen yl)amid (2a). Der Dimethylester 20a (500 mg, 0,635 mmol) wird in THF (16 ml) gelöst und anschließend mit einer wäßrigen LiOH-Lösung (0,5 M, 3,81 ml, 1,90 mmol) 8 h bei 5°C und 16 h bei 15°C gerührt. Nach beendeter Verseifung (DC-Kontrolle) setzt man Wasser (50 ml) zu und extrahiert einmal mit Et2O. Man läßt diese Mischung in einen Erlenmeyerkolben ab und wartet die Phasentrennung über Nacht in einem Kühlschrank ab. Die Etherphase sowie die Mischphase werden verworfen. Die klare wäßrige Phase wird durch langsame und tropfenweise Zugabe einer 1.0 M Salzsäurelösung auf pH 1 gebracht. Man extrahiert mit Et2O, vereinigt die organischen Phasen, wäscht mit Wasser und gesättigter NaCl-Lösung und trocknet über MgSO4. Das Lösemittel wird abdestilliert und das angefallene Rohprodukt aus Methanol umkristallisiert. 428 mg (89%) der Verbindung 2a wurden als farbloser Feststoff isoliert. Schmp. 158-160°C; IR (KBr) 3030, 2890, 2820, 2640, 2520, 1660, 1580 cm"1; 1H- NMR (CDCl3) δ 8,13 (d, 8,6 Hz, 4H), 7,33 (d, 8,6 Hz, 4H), 6,06 (t, 2,1 Hz, IH), 6,03 (d, 2,1 Hz, 2H), 3,88 (d, 6,4 Hz, 6H), 2,33 (t, 7,2 Hz, 2H)5 1,81-1,67 (m, 8H), 1,51-1,21 (m, 30H), 0,87 (t, 6,7 Hz, 6H); MS (FD) m/z 760 (M+). Anal. ber. für C46H65NO8: C, 72,70; H, 8,62; N, 1,84. Gefunden C, 72,68; H, 8,61; N, 1,84.

12) iV-(4-carboxybenzyl)-iV-(4-carboxyphenyl)amin (15b). Eine Mischung aus 4-Formylbenzoesäurmethylester 16 (2,00 g, 12,2 mmol), 4- Aminobenzoesäuremethylester 17 (1,84 g, 12,2 mmol) in wasserfreiem MeOH (20 ml) wird 1 h unter Rückfluß erhitzt. Man läßt den Ansatz auf RT abkühlen, saugt den gebildeten Feststoff ab, wäscht diesen mit MeOH nach und trocknet das Produkt schließlich im Hochvakuum. 3,41g der Verbindung 18 (94%) wurden als farbloser Feststoff isoliert. Das Produkt wurde in der folgenden Reaktion direkt und ohne weitere spektroskopische Charakterisierung eingesetzt.

Zu einer Suspension von Imin 18 (3,41 g, 11,5 mmol) in wasserfreiem MeOH (107 ml) gibt man NaBH4 (564 mg, 14,9 mmol) portionsweise bei RT zu und rührt weitere 24 h bei RT. Anschließend gießt man die Reaktionsmischung in Eiswasser (200 ml) und extrahiert mit Et2O. Die organischen Phasen werden vereinigt, mit Wasser und gesättigter NaCl-Lösung gewaschen und über MgSO4 getrocknet. Schließlich wird das Solvens entfernt und das Rohprodukt aus MeOH umkristallisiert, so daß 2,99 g (87%) der Verbindung 15b als farblose Nadeln erhalten werden. Schmp. 133-135°C; IR (KBr) 3685, 2905, 1720, 1585 cm"1; 1H- NMR (CDCl3) δ 8,01 (d, 8,4 Hz, 2H), 7,85 (d, 8,8 Hz, 2H), 7,41 (d, 8,4 Hz, 2H), 6,57 (d, 8,8 Hz, 2H), 4,65 (Sb, IH), 4,46 (s, 2H), 3,91 (s, 3H), 3,84 (s, 3H); MS (EI) m/z 299 (M+). Anal, ber. für C17H17NO4: C, 68,21; H, 5,72; N, 4,68. Gefunden C, 68,42; H, 5,84; N, 4,64.

13) 6-Bromhexansäure-Λr-(4-methoxycarbonylbenzyl)-iV-(4-methox ycarbonylphenyl)- amid (19b). Unter Verwendung der Reaktionsvorschrift zur Darstellung von Verbindung 19a, wird das Amin 15b (856 mg, 2,86 mmol) zunächst einer Suspension von Natriumhydrid (60% in Mineralöl; 126 mg, 3,15 mmol) in wasserfreiem n-Bu2O (12 ml) zugegeben und die resultierende Mischung wird anschließend mit 6-Bromhexansäurechlorid (0,51 ml, 3,43 mmol) versetzt. Das nach Aufarbeiten erhaltene Rohprodukt wird durch Säulenchromatographie (Kieselgel, Ethylacetat/Petrolether 1:2) gereinigt. Man erhält 1,24 g (91%) der Verbindung 19b als farblosen Feststoff. Schmp. 190-1910C; IR (Film) 2970, 2920, 2840, 1705, 1645, 1590 cm"1; 1H-NMR (CDCl3) δ 8,02 (d, 8,6 Hz, 2H), 7,94 (d, 8,4 Hz, 2H), 7,25 (d, 8,4 Hz, 2H), 7,05 (d, 8,4 Hz, 2H), 4,95 (s, 2H), 3,92 (s, 3H), 3,90 (s, 3H), 3,36 (t, 6,7 Hz, 2H), 2,11 (t, 7,4 Hz, 2H), 1,85-1,72 (m, 2H), 1,71-1,57 (m, 2H), 1,42-1,29 (m, 2H); MS (FD) m/z 477 (M+ für Br81), 475 (M+ für Br79).

14) 6-(3,5-DidecyIoxyphenoxy)hexansäure-iV-(4-methoxycarbonyIbe nzyl)-iV-(4- methoxycarbonylphenyl)amid (20b). Eine Mischung von Verbindung 19b (540 mg, 1,13 mmol), Phenol 9 (461 mg, 1,13 mmol), K2CO3 (392 mg, 2,83 mmol) und einer katalytischen Menge KI in Cyclohexanon (6,50 ml) wird analog der bereits beschriebenen Reaktionsvorschrift zur Synthese der Verbindung 20a umgesetzt. Anschließende säulenchromatographische Reinigung (Kieselgel, Ethylacetat/Petrolether 1:2) liefert 768 mg (85%) der Verbindung 20b als farbloses Öl. IR (Film) 2900, 2830, 1710, 1650, 1590 cm"1; 1H-NMR (CDCl3) δ 8,00 (d, 8,6 Hz, 2H), 7,94 (d, 8,4 Hz, 2H), 7,25 (d, 8,4 Hz, 2H), 7,05 (d, 8,6 Hz, 2H), 6,05 (t, 1,9 Hz, IH), 6,02 (d, 1,9 Hz, 2H), 4,95 (s, 2H), 3,92 (s, 3H), 3,91-3,82 überlagerte Signale (3,90, s, 3H und m, 6H), 2,12 (t, 7,4 Hz, 2H), 1,80-1,61 (m, 8H), 1,47-1,20 (m, 30H), 0,88 (t, 6,7 Hz, 6H); MS (FD) m/z 802 (M+). Anal. ber. für C49H71NO8: C, 73,37; H, 8,92; N, 1,75. Gefunden C, 73,25; H, 8,78; N, 1,87.

15) 6-(3,5-Didecyloxyphenoxy)hexansäure-N-(4-carboxybenzyl)-iV- (4-carboxyphenyl)- amid (2b). Verbindung 20b (443 mg, 0,552 mmol) in THF (14 ml) wird mit einer wäßrigen LiOH- Lösung (0,5 M, 3,31 ml, 1,66 mmol) entsprechend der Darstellung von Verbindung 2a behandelt. Man erhält 343 mg (80%) der gewünschten Dicarbonsäure 2b als farbloses Harz. IR (KBr) 3030, 2890, 2820, 2640, 2520, 1700, 1655, 1575 cm"1; 1H-NMR (CDCl3) δ 8,08 (d, 8,6 Hz, 2H), 8,01 (d, 8,4 Hz, 2H), 7,29 (d, 8,4 Hz, 2H), 7,10 (d, 8,6 Hz, 2H), 6,05 (t, 1,9 Hz, IH), 6,02 (d, 1,9 Hz, 2H), 5,01 (s, 2H), 3,92-3,83 (m, 6H) 2,16 (t, 7,4 Hz, 2H), 1,80-1,62 (m, 8H), 1,49-1,21 (m, 30H), 0,87 (t, 6,7 Hz, 6H); MS (FD) m/z (%) 774 (M+). Anal. ber. für C47H67NO8: C, 72,93; H, 8,72; N, 1,81. Gefunden C, 72,65; H, 8,77; N, 1,77.