Titre de l’invention : Méthode d’extraction non- invasive de composés d’au moins une partie aérienne d’une plante

[0001] La présente demande de brevet concerne une méthode d’extraction non-invasive de composés d’au moins une partie aérienne d’une plante terrestre, comprenant une étape de couverture de ladite au moins une partie aérienne d’une plante terrestre avec un matériau étanche ou semi-étanche, une étape où ladite au moins une partie aérienne de la plante terrestre est laissée couverte pendant une durée d’au moins 3 heures, à une température supérieure à 0°C, permettant la génération d’une solution sur les parois du matériau, et une étape de récupération de cette solution, comprenant les composés extraits.

[0002] Il existe aujourd’hui de très nombreuses méthodes pour extraire des composés de plantes. La plupart de ces méthodes sont invasives, et ne permettent donc pas la reproductibilité de l’extraction sur la même partie de la plante, ou tout simplement la même plante.

[0003] Le document US6254896 divulgue une méthode de collecte d'extrait ou d'essence à partir d'une fleur ou d'une autre partie d'une plante vivante non endommagée, la partie de la plante étant placé dans un récipient d'extraction qui peut être en plastique ou en tout autre matériau imperméable et l'extraction a lieu à la température ambiante naturelle pendant environ 3 heures à 2 semaines. Cependant, ce document décrit que ledit récipient d’extraction comprend un solvant d'extraction (eau, huile...) et la mise en contact de la solution d'extraction avec la partie de la plante vivante.

[0004] D’autres documents décrivent des méthodes d’extraction non-invasives, mais à chaque fois en utilisant un solvant pour extraire les composés des plantes.

[0005] L’utilisation de solvant peut détériorer la partie de la plante immergée, ainsi que les composants extraits ou complexifier le procédé d’extraction en nécessitant une étape d’extraction supplémentaire visant à éliminer le solvant pour concentrer la solution en composés désirés.

[0006] Ainsi, il perdure le besoin d’un procédé simplifié facilitant l’extraction de composés contenu dans des plantes, notamment sans avoir recours à un solvant.

[0007] Le Demandeur a résolu ce problème technique grâce aux différentes étapes de la méthode selon l’invention, permettant l’extraction de composés sans détériorer la plante, et sans utiliser de solvant extérieur de la plante. Ceci permet d’éviter, au moment d’isoler les composés extraits, l’utilisation d’une étape pouvant être complexe de retrait du solvant, et de limiter l’altération des composés extraits de plantes. Ceci permet également, grâce à la non détérioration de la plante, de pouvoir produire ces composés en continue, sans devoir couper et/ou tuer la plante ou une partie de celle-ci, et revêt ainsi un critère important d’un point de vue écologique. En outre, la méthode selon l’invention permet l’extraction de molécules qui ne sont pas obtenues par les méthodes existantes.

[0008] Ainsi, selon un premier aspect, l’invention concerne une méthode d’extraction non-invasive de composés d’au moins une partie aérienne d’une plante terrestre comprenant : a. une étape de couverture complète de ladite au moins une partie aérienne d’une plante terrestre avec un matériau étanche ou semi-étanche, un espace restant entre ladite au moins une partie aérienne d’une plante terrestre et ledit matériau ; b. une étape où ladite au moins une partie aérienne d’une plante terrestre est laissée couverte selon l’étape a. pendant une durée d’au moins 3 heures, à une température supérieure à 0°C, permettant la génération d’une solution sur les parois dudit matériau étanche ou semi-étanche ; c. une étape de récupération de ladite solution sur les parois du matériau, ladite solution comprenant les composés extraits.

[0009] Par extraction est entendu selon l’invention que la méthode permet d’obtenir des composés en solution qui étaient présents dans la plante.

[0010] Par plante est entendu un organisme photosynthétique et autotrophe, caractérisés par des cellules végétales, et faisant partie du règne eucaryote.

[0011] Par plantes terrestres sont entendus les embryophytes ou cormophytes, qui poussent sur la terre ferme. Cette super-division du règne végétal comprend les groupes des bryophytes (les mousses), des ptéridophytes (fougères) et des sper- matophytes (plantes à graines). Sont exclues de cette dénomination de plantes terrestres les algues vertes, les algues rouges et les glaucophytes.

[0012] Par parties aériennes de la plante terrestre, ou appareil végétatif, sont entendues les parties « visibles » de la plante à l’état naturel, à savoir donc la tige, les bourgeons, les feuilles, les fleurs, les fruits, les branches.

[0013] Par au moins une partie aérienne d’une plante terrestre est entendue qu’au moins une partie de la plante est couverte, ou plusieurs parties aériennes de la plante, ou l’ensemble des parties aériennes de la plante terrestre.

[0014] De manière préférée, ladite au moins une partie aérienne d’une plante terrestre est choisie parmi les fleurs, les feuilles, les tiges, les branches, les fruits, les bourgeons ou l’ensemble des parties aériennes de la plante terrestre.

[0015] Par « non-invasive » est entendu que la plante ou la partie de la plante vivante n’est pas détériorée, et continue donc sa vie sans être altérée. Quand il s’agit d’une partie de la plante, celle-ci n’est pas séparée du reste de la plante.

[0016] Par composé est entendu une substance chimique.

[0017] Par « étape de couverture » est entendu que ladite au moins une partie aérienne ou l’ensemble des parties aériennes de la plante terrestre est enfermée, autrement dit couverte, par le matériau selon l’invention, afin qu’elle ne soit plus exposée à l’air libre directement.

[0018] Par « matériau étanche » est entendu selon l’invention un matériau qui est hérmétique, et qui ne laisse donc pas passer les fluides et les gaz.

[0019] Par « matériau semi-étanche » est entendu selon l’invention un matériau qui permet de limiter à un certain seuil le passage des fluides et des gaz, le rendant hermétique pour les gaz ou fluides excédents ce seuil.

[0020] De manière préférée, ledit matériau étanche ou semi-étanche est choisi parmi le verre, le plastique, le tissu synthétique ou naturel, l’argile, le cuir, ou le métal. De manière préférée, ledit plastique est du Polytéréphtalate d'éthylène.

[0021] Par « Polytéréphtalate d'éthylène » est entendu le plastique plus communément désigné PET. Il est notamment utilisé pour la confection des bouteilles plastiques.

[0022] « Espace restant entre ladite au moins une partie aérienne d’une plante terrestre et ledit matériau » signifie selon l’invention qu’un espace est laissé entre ladite au moins une partie aérienne de la plante ou l’ensemble des parties aériennes de la plante terrestre et ledit matériau, c’est-à-dire que le matériau n’est pas « plaqué » à la partie de la plante.

[0023] Par « solution » est entendu la solution obtenue par la méthode selon l’invention, sur les parois dudit matériau, pouvant être la résultante de la transpiration de la plante terrestre ou de ladite au moins une partie de la plante terrestre.

[0024] Par « étape de récupération » est entendu une étape permettant de recueillir les gouttes de solution présentes sur les parois du matériau. Cette étape de récupération peut être effectuée de n’importe quelle façon que l’homme du métier pourrait être en mesure d’effectuer.

[0025] Plus la température est importante, meilleure est l’efficacité du procédé selon l’invention.

[0026] De manière préférée, la température à l’étape b. ne dépasse pas 50°C.

[0027] Selon un mode de réalisation préféré, la température à l’étape b. est comprise entre 5°C et 40°C, de manière plus préférée entre 10°C et 35°C, de manière encore plus préférée entre 20°C et 35°C.

[0028] De manière préférée, la durée maximale de l’étape b. est de deux semaines.

[0029] Selon un mode de réalisation préféré, la durée de l’étape b. est comprise entre 12 heures et deux semaines, de manière plus préférée entre 1 jour et 10 jours.

[0030] De manière préférée, ledit matériau est sous forme de cloche, de film, de sac, de tuyau, ou de cylindre, entourant ladite au moins une partie aérienne d’une plante ou la plante terrestre entière.

[0031] Selon un mode de réalisation, ledit matériau est une cloche en verre ou en PET entourant l’ensemble de la plante ou la plante entière.

[0032] Selon un mode de réalisation, ledit matériau est une cloche en PET entourant une ou des fleurs ou feuilles de la plante ou la plante entière.

[0033] Selon un mode de réalisation, ledit matériau est un sac en PET entourant une ou des fleurs ou feuilles de la plante, ou la plante entière.

[0034] Selon un mode de réalisation, ledit matériau est un film plastique entourant des fleurs ou feuilles de la plante, ou l’ensemble de la plante.

[0035] De manière préférée, lesdits composés extraits comprennent des huiles essentielles et/ou des composés volatiles et/ou terpines, et/ou des flavonoïdes et/ou des alcaloïdes, et/ou des protéines et/ou des acides gras et/ou des sucres.

[0036] Selon un mode de réalisation, lesdits composés obtenus comprennent des composés organiques : hydrocarbones aliphatiques, hydrocarbones aromatiques, alcools, amines, amides, acides carboxyliques, esters, quinones, anthraquinone, flavonoïdes, alcaloïdes, ester, amines, saponine, acide gras, terpines, 2-benzo- pyranes, thiazoles 4, 5 -di substitués, monoterpénoïdes acycliques, aldéhydes, composés carbonyles alpha, bêta-insaturés, anisoles, monoterpénoïdes aromatiques, benzène et dérivés substitués, benzodi-oxoles, benzofuranes, esters d'acide benzoïque, dérivés benzoyliques, monoterpénoïdes bicycliques, Al- canes ramifiés, hydrocarbures insaturés ramifiés, composés C-nitro, caprolac- tames, amides d'acides carboxyliques, esters d'acides carboxyliques, chloroben- zènes, cumenes, cycloalcanes, éthers dialkyliques, acides dicarboxyliques et dérivés, diméthoxybenzènes, esters d'acides gras, Esters méthyliques d'acides gras, Esters d'alcools gras, Alcools gras, Hémiacétals, Indoles, Acides jasmo- niques, Cétones, Alcools gras à longue chaîne, m-Xylènes, Mono-terpénoïdes de menthane, Méthoxyphénols, Méthylpyridines, N-vinylaziridines, Autres sulfures non métalliques, Oxanes, Phé-nol éthers, Phénylpropanes, phénylpro- pènes, hydrocarbures polycycliques, polyols, alcools primaires, alcools secondaires, sesquiterpénoïdes, styrènes, sulfones, chlorures de sulfonyle, alcools tertiaires, amines tertiaires, sels de tétraalkylammonium, tétrahydrofuranes, toluènes, trihalométhanes, chlorures de vinyle.

[0037] Ces composés peuvent notamment être extraits de la menthe poivrée.

[0038] Les composés obtenus et leurs concentrations dépendent de la plante terrestre utilisée et de ladite au moins une partie de la plante terrestre utilisée, ainsi que des conditions de stress et de température de la plante.

[0039] De manière préférée, l’étape c. de récupération de la solution est réalisée :

- par agitation dudit matériau, pour faire tomber les gouttes de solution dans un contenant ; et/ou

- grâce à une pompe aspirant ladite solution sur les parois dudit matériau, ou grâce à au moins un tuyau liés audit matériau, dans lequel ladite solution tombe, ledit au moins un tuyau étant relié à au moins un contenant ; et/ou

- grâce à au moins une valve permettant de collecter ladite solution.

[0040] Les tuyaux et les valves sont situées en bas du matériau, pour que les gouttes tombent par effet de gravité.

[0041] Les composés extraits, compris dans ladite solution, peuvent être utilisés directement.

[0042] Cette solution peut ainsi être utilisée en tant qu’eau florale, ou dans des formulations cosmétiques en tant qu’ agent aromatisant, parfumant ou pour les vertus thérapeutiques des composés contenus dans la solution.

[0043] Selon un mode de réalisation, ladite méthode comprend en outre une étape d. d’isolation desdits composés extraits.

[0044] Selon un mode de réalisation, ladite étape d. d’isolation desdits composés extraits est réalisée par une distillation de la solution obtenue à l’étape c.

[0045] Selon un mode de réalisation, ladite étape d. d’isolation desdits composés extraits est réalisée par extraction grâce à un solvant organique et ensuite évaporation de ce solvant.

[0046] Cette utilisation de solvant à ce stade est moins problématique qu’au moment de l’extraction des composés, car elle ne dégrade pas les composés qui seraient dégradés s’ils étaient extraits directement avec du solvant, et ne dégrade ainsi pas la plante.

[0047] Selon un mode de réalisation, ladite étape d. d’isolation desdits composés extraits est réalisée par chromatographie. Cette étape de chromatographe permet d’isoler par groupe de composés ou par composés spécifiques.

[0048] Selon un mode de réalisation, ladite étape d. d’isolation est réalisée par microextraction sur phase solide (SPME), de préférence sur une fibre DVB/CAR/PDMS préalablement conditionnée selon les recommandations du constructeur, d’après les conditions suivantes : incubation : 10min à 60°C, extraction : 10min à 60°C, désorption : 2min à 250°C.

[0049] L'étape d. permet de concentrer des composés qui étaient présents dès l’étape c. mais pas détectable dans l’analyse (par exemple par chromatographie), par effet de seuil. Ceci se retrouve dans l’exemple 2, ou les concentrations différentes entre l’échantillon 1 et 2, ce dernier résultant d’une étape de distillation prodiguée sur l’échantillon 1. Des composés qui n’étaient pas détectés dans l’échantillon 1 le sont pour l’échantillon 2, et des composés qui étaient présents dans l’échantillon 1 ne sont plus détectés dans l’échantillon 2, car ils ont été évaporés durant la distillation.

[0050] Selon un mode de réalisation, ladite plante terrestre est choisie parmi la rose, le romarin, la menthe poivrée, la mélisse.

Figures

[0051] [Fig 1] est un schéma représentant la méthode selon l’invention sur une partie aérienne de la plante, les feuilles. Sur le schéma sont représentés schématiquement le matériau entourant les feuilles, la plante et les gouttes de solution sur les parois du matériau.

[0052] [Fig 2] est un schéma représentant la méthode selon l’invention sur l’ensemble des parties aériennes de la plante terrestre. Sur le schéma sont représentés schématique le matériau entourant la plante, la plante et les gouttes de solution sur les parois du matériau.

[0053] [Fig 3] est un schéma représentant la méthode selon l’invention sur une partie aérienne de la plante, les feuilles, ledit matériau comprenant une valve permettant de récupérer la solution. Sur le schéma sont représentés schématiquement le matériau entourant les feuilles, la plante, une valve et les gouttes de solution.

[0054] [Fig 4] : chromatogramme de l’échantillon de mélisse détecté en UHPLC-UV à 280 nm et à 330 nm.

[0055] [fig 5] : chromatogrammes d’acide rosmarinique (a), d’acide ferulique + acide rosmarinique (b) et d’un extrait de melisse (c) a 330 nm.

[0056] [fig 6 : chromatogramme de l’échantillon 1 obtenu par spme GC-MS

[0057] [fig 7] : chromatogramme de l’échantillon 2 obtenu par spme GC-MS

Exemples

[0058] Exemple 1 : Méthode d’extraction non-invasive de composés d’au moins une partie aérienne d’une plante terrestre :

[0059] La méthode selon l’invention est utilisée afin d’extraire des composés de plantes.

[0060] Le tableau 1 récapitule les différents paramètres des méthodes utilisées dans les exemples 2 et 3 :

[0061] Tableau 1 : Périmètres des solutions utilisées dans les exemples 2 et 3.

[0062] L’échantillon 2 de l’exemple 2 est obtenu par distillation de l’échantillon 1. De manière analogue, l'échantillon de romarin distillé selon l’exemple 2 est obtenu par distillation de l’échantillon de romarin de l’exemple 2.

[0063] Exemple 2 : Analyse de solutions obtenues selon la méthode de l’invention, à partir de Mélisse (échantillon de mélisse) et de Menthe poivrée (échantillons 1 et 2) :

[0064] Un échantillon de solution de mélisse obtenu grâce à la méthode selon l’invention, tel qu’indiqué dans l’exemple 1, a été centrifugé pour éliminer les particules et le surnageant a été analysé en chromatographie liquide à haute performance couplée à un détecteur à barrettes de diodes (HPLC-UV).

[0065] Deux échantillons de solution de menthe poivrée obtenu grâce à la méthode selon l’invention, tel qu’indiqué dans l’exemple 1 ont été dilués au l/5 ^eme dans de l’eau distillée. Afin d’optimiser l’extraction des composés par micro-extraction sur phase solide (SPME), 2g de sel (NaCl) ont été ajoutés dans chaque échantillon. Un témoin d’extraction a également été ajouté dans chaque échantillon, le 3 -octanol, à une concentration de 75pg/L. Les deux échantillons de solution ont été analysés par chromatographie gazeuse couplée à un spectromètre de masse (GC-MS). L’échantillon 2 est la résultante de la distillation de l’échantillon 1.

[0066] Analyses HPLC-UV

[0067] L’analyse HPLC-UV a été réalisé en suivant un protocole de la pharmacopée européenne pour l’analyse des extraits de mélisse. Le protocole indique une détection UV à 330 nm, correspondant à la longueur d’onde de référence pour l’analyse des extraits de mélisse. Une détection à 280 nm (longueur d’onde de référence pour les composés phénoliques) a également été utilisée.

[0068] La Figure 4 montre les chromatogrammes de l’échantillon de mélisse analysé en HPLC-UV et détecté à 280 nm et à 330 nm.

[0069] La détection à 330 nm ne permet pas de détecter des composés. La détection à 280 nm montre quelques pics de très faible intensité ne correspondant à aucun des composés disponibles dans notre base de données. Ces pics correspondent probablement au bruit de fond de l’analyse.

[0070] A titre de comparaison, une analyse d’extrait de mélisse en HPLC-UV avait déjà été réalisée par le passé. L’échantillon a été extrait à l’EtOH et l’analyse montre la présence de composés phénoliques notamment l’acide rosmarinique dans l’extrait éthanolique de mélisse.

[0071] La Figure 5 montre une analyse d’extrait de mélisse avec un chromatogramme de l’étalon acide rosmarinique (a), un chromatogramme des étalons acide féru- lique et acide rosmarinique (b) et un chromatogramme d’un extrait de mélisse (c). Le chromatogramme (c) montre que l’acide rosmarinique est bien présent dans l’extrait de mélisse et est visible à 330 nm.

[0072] L’analyse par GC-MS (7890B Agilent/MS simple quadripole) a été réalisée sur une colonne DB-Wax (60m x 320pm x 0.5pm) préalablement conditionnée selon les recommandations constructrices. Les composés des deux échantillons ont été extraits par SPME sur une fibre DVB/CAR/PDMS préalablement conditionnée selon les recommandations du constructeur, d’après les conditions suivantes : incubation : 10min à 60°C, extraction : 10min à 60°C, désorption : 2min à 250°C.

[0073] Les composés sont identifiés par comparaison des spectres de masse avec la base NIST14 (MS) et les indices de rétention (RI). Un composé est identifié de façon putative lorsque sa similarité (le match factor) est supérieure à 80% et/ou que son indice de rétention est compris entre +/-30 par rapport à la littérature.

[0074] Analyses GC-MS

[0075] L’analyse par GC-MS (7890B Agilent/MS simple quadripole) a été réalisée sur une colonne DB-Wax (60m x 320pm x 0.5pm) préalablement conditionnée selon les recommandations constructrices. Les composés des deux échantillons ont été extraits par SPME sur une fibre DVB/CAR/PDMS préalablement conditionnée selon les recommandations du constructeur, d’après les conditions suivantes : incubation : 10min à 60°C, extraction : 10min à 60°C, désorption : 2min à 250°C.

[0076] Les composés sont identifiés par comparaison des spectres de masse avec la base NIST14 (MS) et les indices de rétention (RI). Un composé est identifié de façon putative lorsque sa similarité (le match factor) est supérieure à 80% et/ou que son indice de rétention est compris entre +/-30 par rapport à la littérature.

[0077] Le chromatogramme de l’échantillon 1, (Figure 6) montre les composés détectés par GC-MS. Le tableau 2 indique les composés identifiés, les descriptifs aromatiques ainsi que les concentrations relatives au standard interne (3 -octanol 75pg/L).

[0078] Tableau 2 : Composés de l’échantillon 1

0079] Le chromatogramme de l’échantillon 2, Figure 7, montre les composés détectés par GC-MS. Le tableau 3 indique les composés identifiés, les descriptifs aromatiques ainsi que les concentrations relatives au standard interne (3 -octanol

75pg/L).

[0080] Tableau 3 : Composition de l’échantillon 2

[0081] Bilan :

[0082] Analyses HPLC-UV

[0083] L’analyse de l’échantillon de mélisse en HPLC-UV montre la présence de composés phénoliques notamment l’acide rosmarinique dans l’extrait éthanolique.

[0084] Analyses GC-MS

[0085] L’analyse par SPME GC-MS des échantillons a permis d’identifier 110 composés dans l’échantillon 1 et 164 composés dans l’échantillon 2.

[0086] Ceci démontre que l’étape de distillation utilisée afin d’obtenir l’échantillon 2, à partir de l’échantillon 1 résultant du procédé selon les étapes a, b et c, permet de concentrer davantage certains composés, et de permettre leur apparition (après le dépassement du seuil limite de concentration) dans l’analyse par GC- MS.

[0087] Des composés qui étaient présents dans l’échantillon 1 ne sont plus détectés dans l’échantillon 2, car ils ont été évaporés durant la distillation.

[0088] Le procédé selon l’invention permet ainsi bien d’extraire des composés de plantes, sans être invasif.

[0089] Exemple 3 : Analyse des composés extraits de Romarin, de Rose, de Romarin distillé, de Menthe poivrée et de Mélisse :

[0090] La même étude réalisée dans l’exemple 2 concernant les deux échantillons, a cette fois été réalisée sur des échantillons de solution obtenu grâce au procédé selon l’invention (paramètres explicités dans l’exemple 1), à partir de Romarin, de Rose, de Romarin distillé, de Menthe poivrée et de Mélisse.

[0091] Les échantillons 1, 2, 4, et 5 de cet exemple ont obtenus selon la méthode de l’invention avec les étapes a, b et c.

[0092] L’échantillon 3 est un échantillon obtenu par la distillation de l’échantillon 1 de cet exemple.

[0093] Les composés obtenus à partir de ces plantes sont indiqués dans le tableau 3.

[0094] Tableau 3 : Composition des différents échantillons (Concentration pg/L équivalent 3 -octanol)