L'invention concerne l'utilisation de la protéine α ₂ δ ₂ ou un fragment de celle-ci comme biomarqueur du cancer de la prostate d'un sujet.

Le cancer de la prostate est un des types de cancer les plus fréquents chez les hommes, et est l'une des principales causes de morbidité et mortalité cancéreuse dans le monde. Le cancer de la prostate constitue un problème de santé publique de plus en plus important en partie du fait de l'augmentation de la durée de vie. Il se situe par exemple en France au premier rang des cancers avec environ 71 000 nouveaux cas en 2011 (1).

Actuellement, la technique la plus répandue pour diagnostiquer le cancer de la prostate est basée sur des critères anatomo-pathologiques habituellement obtenus à partir de biopsies de la prostate indiquées suite à une élévation du taux sanguin de PSA (Prostate Spécifie Antigen) et/ou un toucher rectal. Cette protéine PSA est sécrétée par la prostate et son taux s'élève lorsqu'il existe une pathologie prostatique inflammatoire ou tumorale bénigne ou maligne (cancer). La mesure du taux de PSA dans le sang indique ainsi la probabilité de développer un cancer de la prostate, mais il peut y avoir des erreurs, notamment dans le screening de la PSA, ou encore à cause du fait que ce test n'est pas spécifique du cancer de la prostate. Le toucher rectal, quant à lui, aboutit à de grandes divergences selon le praticien, et est plus utilisé pour la détection de stades avancés du cancer de la prostate.

Il existe donc toujours un besoin pour de nouvelles méthodes, de préférence non- invasives, de détection du cancer de la prostate et de détermination du stade du cancer de la prostate.

Les canaux calciques représentent une des principales voies d'entrée du calcium dans la cellule nerveuse, participant activement à l'excitabilité cellulaire et aux processus moléculaires de la transmission synaptique. Les canaux calciques sont des complexes glycoprotéiques dont le composant central est la sous-unité a _1; formant le pore, associée à des sous-unités auxiliaires α ₂ δ, β et γ. La sous-unité α ₂ δ est formée de deux unités, a ₂ et δ, codées par le même gêne. Ces deux parties sont reliées entre elles via deux ponts disulfures. La sous- unité α ₂ δ est essentiellement extracellulaire et est ancrée à la membrane plasmique par la partie δ de la protéine au moyen d'un groupement GlycosylPhosphatidylInositol (GPI).

Quatre sous-parties de α ₂ δ ( ₂ ôi à α ₂ δ ₄ ), chacune codée par un gène, ont ainsi été découvertes.

Alors que l'implication des canaux calciques dans les maladies cardiovasculaires, neurologiques ou métaboliques est connue depuis longtemps, leur rôle dans d'autres pathologies comme le cancer n'a été admis que récemment. Des études in vivo ou in vitro ont ainsi démontré l'implication des canaux calciques dans le développement cancéreux de différents tissus ou organes, comme la prostate, le sein, ou le cerveau (2, 3). Les canaux calciques participeraient en effet à l'invasion cellulaire, la migration, la différenciation et/ou à la prolifération (4, 5, 6). Il a ainsi été mis en évidence que différents canaux calciques, et notamment les canaux calciques voltage-dépendant, pouvaient être impliqués, soit en étant surexprimés, soit en étant sous-exprimés, dans la tumorigénèse. Dans la plupart des cas, la surexpression des canaux calciques accélère la prolifération cellulaire tandis que l'inhibition et la régulation à la baisse des canaux calciques diminuent la croissance cellulaire.

II a, par exemple, été précédemment démontré par les inventeurs que les canaux calciques de type T voltage-dépendants Cav3.2 sont surexprimés dans les lignées cellulaires du cancer de la prostate, aboutissant vers un phénotype plus agressif (5).

Il a également précédemment été démontré par les inventeurs que ces canaux permettent la sécrétion de facteurs paracrines comme la sérotonine ou la phosphatase prostatique acide, pouvant jouer un rôle dans la progression cancéreuse.

Par ailleurs, les sous-unités des canaux calciques voltage-dépendants ou leur gène sont souvent considérés comme des facteurs sérieux dans la croissance tumorale.

La demande de brevet EP 2 062 591 décrit ainsi la possibilité d'utiliser le gène CACNA1E d'un canal calcique voltage-dépendant, codant pour la protéine α^, en tant que marqueur pour le diagnostic de cancers, en ce qu'il serait surexprimé dans de nombreux cancers, comme le lymphome, le cancer du sein, du foie, du poumon, du colon, le cancer rectal, le cancer des ovaires, du pancréas, de la prostate, de la peau, de l'utérus.

De la même façon, le gène CACNA1H, codant pour la sous-unité am, a été identifié dans la demande de brevet US 2008/0160009 Al comme cible pour le traitement du cancer de la prostate et du sein.

Le gène CACNA2D2 a, lui aussi, fait l'objet de plusieurs études. Ce gène code pour les deux sous-unités a ₂ et δ _2. Le gène CACNA2D2 a notamment été localisé sur le locus 3p21.3, identifié par de nombreuses recherches comme un locus de gènes suppresseurs de tumeurs (WO0204511, US 2003/0044911). En effet, des mutations de la région 3p21 du chromosome 3 sont retrouvées dans les cancers du poumon, du rein, du sein, du pancréas et de l'utérus. Il a été montré que ce locus subit de nombreuses modifications génétiques. L'identification de mutations dans la région 3p21 est ainsi la première anomalie génétique détectée actuellement dans les cancers du poumon, suggérant qu'un ou plusieurs gènes de cette région agiraient comme suppresseurs de tumeurs. Il a par ailleurs été découvert par ces chercheurs que l'expression de la sous-unité α ₂ δ est inhibée dans la majorité des cellules du cancer du poumon, indiquant ainsi que l'altération de l'homéostasie du calcium dans les cellules cancéreuses conduit à une tumeur maligne. La sous-unité a ainsi été considérée comme suppresseur de tumeur, induisant l'apoptose des cellules (7, 8) et l'origine du cancer, notamment le cancer du poumon et du sein. Les inventeurs ont à présent découvert, de manière très surprenante et après de nombreuses recherches, que la protéine α ₂ δ ₂ a un lien étroit avec la tumorigénèse et l'angiogénèse dans le cancer de la prostate. Cette action sur la croissance tumorale va à l'encontre des recherches démontrant que le gène CACNA2D2, codant pour cette protéine, est localisé dans la région 3p21.3 qui serait un cluster de gènes suppresseurs de tumeurs.

II a ainsi été découvert que la protéine α ₂ δ ₂ ou un fragment de celle-ci pouvait servir de biomarqueur au cancer de la prostate.

DEFINITIONS Le terme «α ₂ δ ₂ », tel qu'utilisé ici, se réfère à la protéine α ₂ δ ₂ de la famille des sous- unités α ₂ δ des canaux calciques voltages-dépendants et englobe tous les synonymes se référant à cette sous-unité comme Cacna2d2, la sous-unité 2 des canaux calciques voltages- dépendants alpha 2/delta (ou α ₂ δ), alpha 2/delta 2, a2d2. Cette protéine est codée par le gène CACNA2D2 (Gene ID: 9254).

Le terme « fragment » tel qu'utilisé ici se réfère, sauf indication contraire, à un fragment de la protéine α ₂ δ ₂ et peut par exemple concerner la sous-partie a ₂ ou la sous-partie δ ₂ , de préférence la sous-partie a ₂ . Le terme « CANA2D2 », tel qu'utilisé ici, se réfère au gène codant pour la sous-unité α ₂ δ ₂ , et englobe tous les synonymes se référant à ce gène (Gene ID: 9254).

Le terme « cancer de la prostate », tel qu'utilisé ici, se réfère à une tumeur de la prostate, par exemple une tumeur maligne, chez un sujet donné, dans laquelle la tumeur est généralement d'origine épithéliale.

Le terme « métastase » doit être entendu dans sa signification générale de l'état de la technique, et se réfère à l'étendue d'une tumeur de la prostate à un autre organe ou élément non-adjacent.

On entend ainsi par « cancer de la prostate » aussi bien l'adénocarcinome (95% des tumeurs malignes de la prostate) que les variantes morphologiques plus rares, comme le précurseur du cancer de la prostate, connu comme la néoplasie intraépithéliale prostatique, ou encore les tumeurs neuroendocrines (par exemple, carcinome à petites cellules, tumeurs carcinoïdes, adénocarcinome avec différenciation neuroendocrine). On peut ainsi se référer à Chang et al. (9) pour les différentes formes de cancer.

L' « agressivité » du cancer de la prostate, qui peut permettre de déterminer le stade d'avancement du cancer, peut être quantifiée selon la classification de Gleason fondée sur le degré de différenciation, c'est-à-dire l'écart existant entre un tissu tumoral et un tissu prostatique sain, et le nombre de mitoses. La classification de Gleason est notée selon une agressivité croissante du grade 1 au grade 5, plus le grade étant élevé, plus le cancer étant agressif et plus le pronostic étant pessimiste. Le grade, indiqué dans la demande avant la parenthèse, correspond au grade de Gleason de la coupe étudiée. L'addition des deux grades les plus fréquemment observés sur les différentes biopsies provenant d'un patient permet de déterminer le Score de Gleason pour chaque patient (entre 0 et 10) et est indiqué entre parenthèses (par exemple « 2+3 »).

Pour éviter toute confusion, les phases de cycles cellulaires habituellement connues et définies par « G0 », « Gl », « G2 » sont ici identifiées par « Go », « G », « G ₂ », sauf indication contraire.

Les termes « anticorps anti-a ₂ ô ₂ » se rapportent à un anticorps ou un fragment de celui-ci qui reconnaît spécifiquement α ₂ δ ₂ ou un fragment de α ₂ δ ₂ , par exemple un épitope de a ₂ ou δ ₂ . Les termes « valeur prédéterminée » se rapportent ici à la quantité de α ₂ δ ₂ ou d'un fragment de α ₂ δ ₂ dans les échantillons biologiques obtenus de la population en général ou d'une population sélectionnée de sujets.

Selon un exemple, la population sélectionnée peut être comprise de sujets apparemment sains, par exemple des sujets n'ayant jamais présenté auparavant de signes ou de symptômes indiquant la présence d'un cancer de la prostate.

Selon un autre exemple, la valeur prédéterminée peut être la quantité de α ₂ δ ₂ ou d'un fragment chez des sujets ayant un cancer de la prostate dont le stade est établi.

La valeur prédéterminée peut être un seuil ou une fourchette.

La valeur prédéterminée peut être établie sur la base de mesures comparatives entre des sujets sains et des sujets ayant un cancer de la prostate établi.

Les termes « sujet » ou « patient », tels qu'entendus ici, désignent un singe, un chimpanzé ou un humain. De préférence, il s'agit d'un humain.

Les termes « normal » ou « sain » peuvent être utilisés ici pour désigner un sujet, patient, échantillon, tissu, organe ou autre ne présentant pas de cancer.

Les termes « échantillon biologique » désignent tout échantillon biologique issu du patient, par exemple mais de façon non limitative, des fluides biologiques. De manière préférentielle, il s'agit de fluides biologiques comme le sang, le sérum, le plasma, l'urine ou le sperme. De préférence encore, il s'agit d'un échantillon d'urine ou de sperme.

Le terme « biomarqueur » désigne en général une molécule, i.e. un gène (ou un acide nucléique codant pour ce gène), protéine, dont l'expression peut être déterminée dans un échantillon biologique d'un sujet par des méthodes connues de l'état de la technique (aussi bien que celles décrites ici) et qui permet de prédire ou déduire l'état du sujet duquel elle a été obtenue.

On entend ici par « siRNA » un petit ARN interfèrent bicaténaire non codant qui interfère avec la traduction de l'ARN messager en protéine et le détruit, inhibant ainsi l'expression génique au stade post-transcriptionnel.

Ainsi, on entend par « si-a ₂ ô ₂ » l'ARN interférant contre la séquence codant α ₂ δ ₂ .

« LNCaP » désigne une lignée cellulaire humaine de cancer de la prostate provenant d'un ganglion sus-claviculaire d'un patient atteint d'un cancer de prostate androgénorésistant. Les lignées LNCaP surexprimant la protéine α ₂ δ ₂ par rapport aux lignées LNCaP normales sont désignées par « LNCaP-a ₂ ô ₂ ».

La lignée cellulaire « PC3 », lignée cellulaire du cancer de la prostate, est obtenue à partir d'une métastase osseuse d'un patient atteint de cancer androgénorésistant.

La lignée cellulaire « DU 145 » est obtenue à partir d'une métastase cérébrale chez un patient atteint d'un cancer de la prostate.

DESCRIPTION DE L'INVENTION La présente invention concerne une méthode de détection in vitro d'un cancer de la prostate et/ou d'une métastase prostatique chez un sujet comprenant les étapes consistant à :

(i) mesurer la concentration de α ₂ δ ₂ , ou un fragment de α ₂ δ ₂ , dans un échantillon biologique obtenu dudit sujet,

(ii) comparer la concentration de α ₂ δ ₂ , ou un fragment de α ₂ δ ₂ , mesurée à l'étape (i) à une valeur prédéterminée de la concentration en α ₂ δ ₂ , ou un fragment de α ₂ δ ₂ ,

dans laquelle une concentration de α ₂ δ ₂ , ou d'un fragment de α ₂ δ ₂ , dans l'échantillon biologique supérieure à ladite valeur prédéterminée indique la présence d'un cancer de la prostate chez ledit sujet, et une concentration de α ₂ δ ₂ , ou d'un fragment de α ₂ δ ₂ , inférieure à ladite valeur prédéterminée indique l'absence d'un cancer de la prostate chez ledit sujet.

De manière avantageuse, la valeur prédéterminée se rapporte à la quantité de α ₂ δ ₂ ou d'un fragment de α ₂ δ ₂ dans les échantillons biologiques obtenus de sujets apparemment sains, par exemple des sujets n'ayant jamais présenté auparavant de signes ou de symptômes indiquant la présence d'un cancer de la prostate.

Une méthode de détection in vitro d'un cancer de la prostate et/ou d'une métastase prostatique chez un sujet peut ainsi consister à effectuer les étapes consistant à :

(i) mesurer la concentration de α ₂ δ ₂ , ou d'un fragment, dans un échantillon biologique obtenu dudit sujet,

(ii) comparer la concentration de α ₂ δ ₂ , ou d'un fragment de α ₂ δ ₂ , mesurée à l'étape (i) à une valeur prédéterminée dérivée de la concentration en α ₂ δ ₂ , ou d'un fragment de α ₂ δ ₂ , dans un échantillon biologique d'un sujet sain ne souffrant pas de cancer de la prostate, un niveau élevé de α ₂ δ ₂ , ou d'un fragment de α ₂ δ ₂ , dans l'échantillon biologique par rapport à ladite valeur prédéterminée indiquant que le sujet souffre d'un cancer de la prostate. Les inventeurs ont montré que la protéine α ₂ δ ₂ est exprimée de façon plus forte dans les stades avancés du cancer (voir figure 6, G2 et G3) que dans les stades normaux et précoces du cancer (voir figure 6, stades normaux, BPH et métastase). La présente invention concerne donc également une méthode pour déterminer in vitro le stade d'un cancer de la prostate chez un sujet comprenant les étapes consistant à :

(i) mesurer la concentration de α ₂ δ ₂ , ou un fragment de α ₂ δ ₂ , dans un échantillon biologique obtenu dudit sujet,

(ii) comparer la concentration de α ₂ δ ₂ , ou un fragment de α ₂ δ ₂ , mesurée à l'étape (i) à une valeur prédéterminée de la concentration en α ₂ δ ₂ , ou un fragment de α ₂ δ ₂ ,

dans laquelle, lorsque la concentration de α ₂ δ ₂ , ou d'un fragment de α ₂ δ ₂ , dans l'échantillon biologique est supérieure à ladite valeur prédéterminée de la concentration en α ₂ δ ₂ , ou un fragment de α ₂ δ ₂ , l'écart entre ladite concentration de α ₂ δ ₂ , ou d'un fragment de α ₂ δ ₂ , dans l'échantillon biologique obtenu dudit sujet et ladite valeur prédéterminée indique le stade du cancer de la prostate chez ledit sujet.

Selon un mode de réalisation, la valeur prédéterminée se rapporte ici à la quantité de α ₂ δ ₂ ou d'un fragment de α ₂ δ ₂ dans les échantillons biologiques obtenus de sujets apparemment sains, par exemple des sujets n'ayant jamais présenté auparavant de signes ou de symptômes indiquant la présence d'un cancer de la prostate.

Selon un autre mode de réalisation, la valeur prédéterminée est ici la quantité de α ₂ δ ₂ ou d'un fragment de α ₂ δ ₂ chez des sujets ayant un cancer de la prostate dont le stade est établi.

La concentration de la protéine α ₂ δ ₂ , ou d'un fragment, dans un échantillon biologique obtenu du sujet, selon les méthodes de l'invention, permet ainsi de déterminer le niveau d'expression du gène CACNA2D2.

L'échantillon biologique est avantageusement un fluide biologique, de préférence un échantillon de sang, un échantillon de sérum, un échantillon de plasma, un échantillon d'urine ou un échantillon de sperme, de préférence encore un échantillon d'urine ou de sperme. Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, il s'agit d'un échantillon d'urine éventuellement recueilli après massage de la prostate du sujet à tester.

Une fois que l'échantillon biologique est préparé, la concentration en protéines est mesurée au moyen de toute technique connue de l'homme du métier. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, une telle méthode comprend l'étape de mise en contact de l'échantillon avec une molécule de liaison capable de se lier spécifiquement avec la protéine α ₂ δ ₂ présente dans l'échantillon biologique. La molécule de liaison peut être spécifique de la forme mature de la protéine α ₂ δ ₂ . La molécule de liaison peut également reconnaître les deux parties a ₂ et δ ₂ de la sous-unité α ₂ δ ₂ . De manière également avantageuse, la molécule de liaison peut être capable de se lier spécifiquement avec un fragment de la protéine α ₂ δ ₂ , par exemple avec la partie a ₂ ou avec la partie δ ₂ de la sous-unité α ₂ δ ₂ . La molécule de liaison peut être un anticorps polyclonal ou monoclonal, de préférence monoclonal. La molécule de liaison peut également être un aptamère.

Des anticorps polyclonaux de l'invention, ou des fragments de ceux-ci, peuvent être déterminés au moyen de méthodes connues de l'homme du métier, en administrant par exemple un antigène ou un épitope approprié à un animal, par exemple un cochon, une vache, un cheval, un lapin, une chèvre, un mouton, une souris ou autre. Des adjuvants connus de l'état de la technique peuvent être utilisés pour améliorer la production d'anticorps. Des anticorps polyclonaux, permettant de reconnaître α ₂ δ ₂ , et pouvant être utilisés dans la présente invention sont, par exemple mais de manière non limitative, H210 (Santa Cruz) ou A01 (Abnova). Bien que les anticorps polyclonaux soient pratiques à la réalisation de l'invention, les anticorps monoclonaux sont préférés.

Des anticorps monoclonaux de l'invention, ou des fragments de ceux-ci, peuvent être préparés et isolés au moyen de méthodes connues de l'homme du métier. Les molécules de liaison de l'invention, comme les anticorps ou aptamères, peuvent être marquées au moyen d'une molécule ou substance, par exemple une molécule fluorescente, une enzyme capable de produire un produit coloré, une molécule radioactive ou d'autres marqueurs connus de l'état de l'art. Ainsi, selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la concentration de la protéine α ₂ δ ₂ , ou d'un fragment de α ₂ δ ₂ , est mesurée en utilisant un anticorps ou un fragment de celui-ci, spécifique de ladite protéine α ₂ δ ₂ , ou d'un fragment de α ₂ δ ₂ .

La concentration en protéines peut être mesurée au moyen de techniques standards connues de l'homme du métier, généralement des techniques d'immunodiagnostic comprenant des immunoessais comme la compétition, la réaction directe ou les tests de type sandwich. De tels tests incluent, sans y être limité, les tests d'agglutination, les immunoessais médiés et marqués par enzyme comme les tests ELISA, les tests de type biotine/avidine, les immunoessais par radio, l'immunoélectrophorèse, l'immunoprécipitation.

La mesure de la concentration en protéines peut aussi comprendre une étape de séparation des composés comme par HPLC (basé sur hydrophobie), par chromatographie avec exclusion par taille (basée sur la taille), et/ou par affinité de phase solide (basé sur l'affinité du composé pour la phase solide utilisée).

Une fois séparée, la protéine α ₂ δ ₂ peut être identifiée au moyen de profils de séparation connus pour la protéine, par exemple le temps de rétention, et mesurée selon des techniques standards. Selon un autre mode de réalisation, il peut s'agir d'une identification et d'une mesure d'un fragment, par exemple a ₂ ou δ ₂ .

De manière alternative, les composés séparés peuvent être détectés et mesurés par exemple par spectrométrie de masse.

Selon un mode de réalisation de l'invention, une valeur témoin ou une normalisation peut être utilisée. Par exemple, selon un mode de réalisation particulier de l'invention dans lequel l'échantillon biologique est un échantillon d'urine, la quantité de créatinine peut être utilisée pour normaliser le résultat obtenu. En effet, la créatinine étant un bon indicateur de la fonction rénale, elle est par exemple utilisée comme standard en matière de dosage de stupéfiant ou de produits dopants pour évaluer si l'échantillon d'urine est dilué, ou encore comme standard pour les intoxications aux métaux lourds. Sa valeur peut donc être utilisée dans les méthodes de détection de la présente invention. Une fois les urines récoltées (par exemple sur une durée de 24h) et précipitées, la concentration en protéine α ₂ δ ₂ , ou un fragment, est mesurée. La valeur de l'augmentation du ratio de a ₂ ô ₂ /créatinine (ou d'un fragment de a ₂ ô ₂ /créatinine) par rapport au ratio de a ₂ ô ₂ /créatinine (ou d'un fragment de a ₂ ô ₂ /créatinine) d'un sujet sain indique la présence d'un cancer de la prostate. Une augmentation de 50% peut par exemple indiquer que le sujet souffre d'un cancer de la prostate. Les méthodes de détection selon l'invention peuvent également être utilisées en complément d'une autre méthode de détection connue de l'homme du métier, par exemple, mais de façon non limitative, l'analyse du dosage de PS A. La présente invention se rapporte également à un agent anticancéreux pour son utilisation dans le traitement du cancer de la prostate chez un sujet, caractérisé en ce qu'on détecte ledit cancer de la prostate au moyen d'une méthode comme précédemment décrite.

Une méthode de traitement du cancer de la prostate chez un sujet peut ainsi comprendre les étapes consistant à :

détecter la présence d'un cancer dudit sujet au moyen d'une méthode de détection selon la présente invention,

administrer audit sujet un traitement apte à traiter le cancer de la prostate. « Traiter le cancer de la prostate » peut être entendu comme tout traitement capable, par exemple, de supprimer la tumeur ou les métastases, réduire le risque de récidive, ralentir le développement de la tumeur ou des métastases, et/ou traiter les symptômes de la maladie.

Tout agent anticancéreux connu de l'homme du métier peut ainsi être utilisé. Le traitement peut, par exemple mais sans s'y limiter, consister en un traitement hormonal, par exemple des agonistes de l'hormone de libération des gonadotrophines (LHRH) (comme leuprolide, goserelin ou buserelin), un traitement par antiandrogènes (comme flutamide, ou nilutamide), un traitement par des médicaments empêchant les glandes surrénales de produire des androgènes (comme ketoconazole ou aminoglutethimide), ou encore par des œstrogènes.

La présente invention concerne également une méthode pour surveiller un traitement d'un sujet atteint d'un cancer de la prostate et/ou d'une métastase prostatique comprenant la détermination de la concentration de α ₂ δ ₂ , ou d'un fragment, dans un échantillon biologique obtenu dudit sujet, et éventuellement la comparaison de ladite concentration de α ₂ δ ₂ , ou d'un fragment, à une valeur prédéterminée représentant un stade prédéterminé du cancer de la prostate, la concentration de α ₂ δ ₂ , ou d'un fragment, par rapport à ladite valeur prédéterminée indiquant l'évolution du cancer de la prostate, et ainsi l'efficacité du traitement.

La présente invention concerne enfin l'utilisation de la protéine α ₂ δ ₂ , ou d'un fragment, comme biomarqueur du cancer de la prostate d'un sujet. De préférence, ledit fragment est α ₂ . Il a en effet été mis en évidence que la détection de la protéine α ₂ δ ₂ ou d'un fragment permet de conclure sur la présence ou l'absence d'un cancer de la prostate, ainsi que sur le stade du cancer de la prostate. FIGURES

Figure 1 : Représentation de la fluorescence de l'anticorps secondaire en fonction de la concentration de peptide α ₂ δ ₂ sur toute la gamme de concentration du peptide α ₂ δ ₂ (de 6,25μg/ml à 3 pg/ml) (« Alexa488 » : fluorescéine).

Figure 2 : A : Analyse de l'expression de α ₂ δ _1; α ₂ δ ₂ et α ₂ δ ₃ dans les lignées cellulaires LNCaP et DU145 par criblage par RT-PCR. La Pactine et un échantillon contrôle positif (« cerveau ») sont utilisés comme témoin.

B : Analyse de l'expression de α ₂ δ ₂ dans les lignées cellulaires LNCaP,

PC3 et DU! 45 par criblage par RT-PCR. La Pactine est utilisée comme témoin.

Figure 3 : Analyse de l'expression de a ₂ ô ₂ dans 10 tissus cancéreux (numérotés de Cl à C10) et 10 tissus non-cancéreux (numérotés de NI à N10) de la prostate par RT-PCR. La Pactine est utilisée comme témoin.

Figure 4 : Analyse par western-blot montrant que si-a ₂ ô ₂ (50 nM, 4 jours) inhibe bien l'expression de a ₂ ô ₂ dans les cellules LNCaP. La calnexine est utilisée comme témoin. Figure 5 : Analyse de l'expression de α ₂ δ ₂ dans les tissus cancéreux (« non cancer », n=18) et non cancéreux (« cancer », n=20) de prostate humaine par criblage.

Figure 6 : Analyse de l'expression de α ₂ δ ₂ à différentes stades du cancer de la prostate par analyse immunohistochimique.

A et B : aperçu de tissus de la prostate provenant de tissus normaux, hyperplasiques et cancéreux (A : objectif *5, B : objectif *40). Les grades indiqués avant la parenthèse correspondent aux grades de Gleason le plus fréquent de la coupe montrée. Entre-parenthèses sont indiqués les scores de Gleason du patient correspondant. M : métastase rectale, BPH : hyperplasie, N : tissu prostatique normal. La coloration immunohistochimique contre α ₂ δ ₂ a été révélée par réaction DAB-peroxydase. C : a) aperçu de tissus de la prostate provenant de tissus normaux (« normal »), de métastase (« métastase »), tissu hyperplasique (« BHP ») ou tissus cancéreux (« cancer »). Les images colorées ont été déconvolutionnées et l'intensité de coloration de la cellule a été analysée et convertie en densité optique. La densité optique est augmentée dans les acini entourant les cellules des tissus cancéreux ;

b) histogramme montrant la densité optique moyenne (OD _DAB ) pour différents stades de cancer. Le nombre de cellules analysées est représenté sur chaque barre.

Figure 7 : Analyse de l'effet de la protéine α ₂ δ ₂ sur la prolifération cellulaire.

A : a) Effet d'un traitement de 4 jours utilisant si-a ₂ ô ₂ (50 nM) sur la croissance cellulaire (méthode MTS) par rapport à un témoin, si-ctl, qui, à la même concentration, n'a aucune influence sur la prolifération cellulaire ;

b) Effet d'un traitement de 4 jours utilisant si-a ₂ ô ₂ (50 nM) sur le nombre de cellules (comptage manuel des cellules extradées par Tryptan Blue) ;

B : Effet de si-a ₂ ô ₂ sur la prolifération cellulaire de deux autres lignées cellulaires du cancer de la prostate (PC3 et DU! 45).

C : Expériences cinétiques sur l'inhibition en fonction du temps par si-a ₂ ô ₂ de la croissance cellulaire de LNCaP par rapport à un témoin (si-ctl).

D : Analyse FACS de l'effet de si-a ₂ ô ₂ sur le nombre de cellules LNCaP en phase Go/Gi (représenté « G0/G1 sur la figure), G ₂ /M et S par rapport à un témoin, si-ctl

E : Effet de la gabapentine (100 μΜ) sur la prolifération cellulaire par méthode

MTS.

F : a) Cinétique de la prolifération cellulaire chez deux clones différents de LNCaP-a ₂ ô ₂ (C9 et Ci l).

b) Analyse FACS de l'effet de LNCaP-a ₂ ô ₂ (clone Ci l) sur le nombre de cellules en phase Go/Gi, G ₂ /M et S par rapport à une lignée cellulaire LNCaP ne surexprimant pas α ₂ δ ₂ .

Figure 8 : Analyse in vivo de la croissance cellulaire induite par la protéine α ₂ δ ₂ . A : Poids en gramme des tumeurs LNCaP (témoin) et LNCap-a ₂ ô ₂ (clone Ci l) au sacrifice ;

B : Cinétique de croissance des tumeurs LNCaP (témoin) et LNCap-a ₂ ô ₂ (clone Ci l) ; C : Temps moyen de multiplication par 2 des tumeurs LNCaP (témoin) et LNCap-a ₂ ô ₂ (clone Ci l). Figure 9 : Analyse histologique des tumeurs LNCaP et LNCaP-a ₂ ô ₂ A : Différentes vues à grossissement *20 de : a : la tumeur LNCaP témoin ; c : la tumeur LNCaP-a ₂ ô ₂ . Les images b (LNCaP témoin) et d (tumeur LNCaP-a ₂ ô ₂ ) montrent au moyen des flèches les foyers de nécroses et d'inflammation.

B : Quantification du pourcentage des noyaux positifs à l'analyse par immunofluorescence par PCNA (noyaux des cellules en division), normalisé par rapport au nombre total de noyaux (DAPI).

Figure 10 : Analyse de l'effet de α ₂ δ ₂ sur la formation de vaisseaux sanguins dans les tumeurs LNCaP xénogreffées.

A : Coloration immunohistochimique (peroxydase/DAB) de CD31 (a : tumeur LNCaP, b : tumeur LNCaP-a ₂ ô ₂ ) ;

B : Pourcentage de tissus positifs au CD31 dans les tumeurs LNCaP et LNCaP-a ₂ ô ₂ .

Figure 11 : Analyse de l'effet de α ₂ δ ₂ sur l'angiogénèse par la sécrétion de VEGF. A : a. Western blots de CD31 et VEGF dans 8 tumeurs différentes provenant de 4 souris différentes (Ml à M4) (Tumeurs LNCaP : « T-LNCaP », Tumeurs LNCaP-a ₂ ô ₂ : « T- α ₂ δ ₂ »). La Pactine est utilisée comme témoin.

b. Densité relative des bandes CD31 observées par Western blot (fig lOA.a.) normalisées par rapport à Pactine (10 échantillons pour chaque tumeur).

c. Densité relative des bandes VEGF observées par Western blot (fig lOA.a.) normalisées par rapport à Pactine (10 échantillons pour chaque tumeur).

B : Sécrétion de VEGF mesurée au moyen du test ELISA dans les cellules LNCaP et LNCaP-a ₂ ô ₂ (clones C9 et Ci l).

Figure 12 : Analyse de la sécrétion de a ₂ dans les cellules LNCaP-a ₂ ô ₂

A : Western blot de a ₂ dans le milieu de culture des cellules LNCaP, de deux clones surexprimant α ₂ δ ₂ (clone Ci l et C16) et dans le milieu de culture seul (« RPMI »), sans DTT (6 jours d'incubation) ou avec DTT, i.e. en conditions réductrices (15 min d'incubation).

B : Western blot pour deux autres milieux de culture contenant soit 2% de SVF (sérum de veau fœtal), soit 10% de SVF (conditions courantes de culture).

Figure 13 :

A : Représentation de la fluorescence de l'anticorps secondaire en fonction de la concentration de peptide α ₂ δ ₂ dans la gamme de concentration proche du seuil de détection, avec représentation de la concentration de peptide α ₂ δ ₂ dans l'urine totale et dans les protéines obtenues à partir d'urine (protéines précipitées à l'acétone et suspendues dans tampon PBS) d'un homme atteint d'un cancer de la prostate (cf. B).

B : Concentrations de la protéine α ₂ δ ₂ codée par le gène CACNA2D2 dans les urines totales et dans les protéines obtenues à partir d'urine d'un homme atteint d'un cancer de la prostate.

EXEMPLES Matériels et méthodes

Cultures cellulaires

Les lignées cellulaires LNCaP, DU 145 et P3 proviennent de la « American Type Culture Collection » et ont été cultivées, selon les recommandations du fournisseur, dans du RPMI 1640 (GIBCO, Life Technologies, France) additionné de 10% de sérum fœtal bovin (FBS, Sigma, L'Isle d'Abeau, France) et de 2 mM de L-glutamine (Sigma, L'Isle d'Abeau, France). Les cellules ont été systématiquement cultivées dans des récipients de 75 cm ² (Nunc, Poly-Labo, France) en atmosphère humidifiée à 37°C (95% d'air - 5% de C02). Le milieu de culture a ensuite été changé tous les trois jours.

Des lignées cellulaires LNCaP stables exprimant la protéine α ₂ δ ₂ (ci-après désignées sous le terme « LNCaP-a ₂ ô ₂ ») ont été conçues comme précédemment reporté dans la publication de Florian Gackière et al (10).

Production de si-RNAs et préparation cellulaire

Les petits ARN interférents proviennent de Eurogentech (France).

Les si-a ₂ ô ₂ ont été validés dans les cellules LNCaP. Pour cela, il a été montré par western-blot que si-a ₂ ô ₂ diminue l'expression de la protéine α ₂ δ ₂ dans les cellules LNCaP (figure 3).

Les siRNAs utilisés ici comprennent un siRNA témoin non- spécifique contre la luciférase (ci-après désigné sous le terme « si-ctl » ou « siCTL »).

Les siRNAs sont présentées dans le tableau 1. siRNA Position

siCTL Luciferase 153-171

si-a ₂ ô ₂ 1868-1850

Tableau 1

Les cellules ont été transfectées avec 20 ou 50 nM de siRNA en utilisant HiPerFect Transfection Reagent (Qiagen) comme précédemment reporté dans la publication de Florian Gackière et al (10).

Analyse de l'expression du gène de la sous-unité α ₂ δ ₂ par RT-PCR ou RT-PCR quantitative

L'extraction de l'ARN a été effectuée avec du Trizol® au moyen d'une méthode décrite à l'origine par Chomczynski et Sacchi (11). La méthode de RT-PCR est équivalente à celle décrite dans la publication de Florian Gackière et al (10).

Pour chaque réaction de PCR, 1 μg d'ARNm total a été traité avec du DNAse II, incubé à 70°C et a subi une transcription inverse avec la polymérase MULV RNA (Applied Biosystems, 50υ/μί) en présence de 0,5 μΜ de dNTP et d'un inhibiteur de la ribonucléase (Applied Biosystems).

L'ADNc obtenu a été utilisé pour l'amplification par PCR au moyen d'un kit Taq Gold (Applied Biosystems).

Les conditions opératoires de la PCR sont présentées dans le tableau 2.

Tableau 2

Les amorces sens et antisens (Invitrogen) utilisées pendant l'amplification sont présentées dans le tableau 3. Protéine Gène Taille (bp)

α2δ1 CACNA2D1 400

α ₂ δ ₂ CACNA2D2 505

500

α ₂ δ ₃ CACNA2D3

439

Pactine 220

Tableau 3

Les produits de la PCR ont été analysés sur un gel d'agarose (1,5% ou 2%) comprenant du bromure d'éthidium (0,5 μg/ml) puis visualisés sous UV. Les images ont ensuite été capturées au moyen d'un logiciel Gelcapture (Bio-imaging System).

Western blotting

Après un lavage dans une solution saline tamponnée au phosphate, les cellules ont été collectées par grattage dans du tampon de lyse (Triton X-100 1%, Na déoxycholate, 1%, NaCl 150 mM, P0 ₄ NaK 10 mM, pH 7,2) avec un mélange d'anti-protéases, puis ont été incubées dans de la glace pendant 45 min. Les lysats ont été centrifugés à 12000G pendant 10 min à 4°C. La concentration en protéines du supernageant a été déterminée par test BCA (Pierce Chemical Compagny). Les analyses par Western-blot de l'expression des protéines a été effectuée comme décrit dans la publication de Florian Gackière et al (10).

Les anticorps, utilisés pour le western blotting ainsi que pour les identifications immunohistochimiques et par immunofluorescence, sont présentés dans le tableau 4.

Anticorps Nom Entreprise Dilution Dilution Anticorps MW dans WB dans IMH secondaire (kDa) α ₂ δ ₂ H210 Santa Cruz 1/200 ⁶ 1/100 ⁶ ou Rabbit 130 l/50 ^e

α ₂ δ ₂ A01 Abnova / l/50 ^e Mouse 130

PCNA Sc-56 Santa Cruz 1/200 ⁶ / Mouse 36 β-actin A-5441 Sigma 1/4000 ⁶ / Mouse 43

Calnexine mab 3126 Millipore 1/2000 ⁶ / Mouse 95

Ki-67 Sc-101861 Santa Cruz / 1/100 ⁶ Rabbit

Tableau 4

Prolifération cellulaire et tests de viabilité

La viabilité des cellules a été testée par méthode colorimétrique (CellTiter 96 Aqueous Non-Radioactive Cell Prolifération Assay, Promega, USA) selon les recommandations du fournisseur.

La prolifération cellulaire a également été testée par comptage manuel des cellules extradées par Tryptan Blue.

La coloration des anticorps Ki-67 ou PCNA (« Proliferating Cell Nuclear Antigen ») a également été utilisée pour discriminer les cellules en quiescence (phase Go) et les cellules cycliques.

Analyse du cycle cellulaire

Les cellules ont été cultivées dans trois puits de 60mm par état, et les traitements ou siRNA ont été appliqués comme précédemment décrit. Après traitement, les cellules ont été trypsinisées, récoltées et remises en suspension dans 0,2 ml de PBS stérile. 1 ml d'éthanol froid 70% a été ajouté sur les cellules en suspension pendant l'étape dans le vortex. Les échantillons ont été centrifugés, lavés dans du PBS stérile puis incubés avec de la ribonucléase (2 μg/ml) pendant 15 min à température ambiante. Du iodure de propidium (25 μg/ml final dans du PBS-triton X-100 0,1%) a été ajouté et mis à incuber pour 30 min supplémentaires à température ambiante. Le contenu en ADN a été mesuré par excitation d'iodure de propidium à 488 nm et mesure de l'émission à 520 nm au moyen d'un cytomètre en flux (Beckman coulter Epies XL4-MCL avec acquisition Expo32). L'interprétation des données a été effectuée avec Multicycle pour Windows (Phoenix Flow System).

Immunocoloration et analyse confocale

L'analyse de l'expression de protéine dans les cellules et les tissus du cancer de la prostate (PCA) a été effectuée au moyen d'analyse d'immunofluorescence indirecte sur des cellules fixées à l'acétone et des tissus fixés dans du formol et enrobés de paraffine.

Des puces à ADN (« microarrays ») de tissus et des tissus tumoraux de souris ont été étudiées au moyen de méthodes immunohistochimiques.

Les lames de puces à ADN de tissus multi-tumoraux proviennent de Biomax (USA). 30 tumeurs ont été analysées, ainsi que les tissus normaux correspondants. Le fournisseur (Biomax) fournit les informations cliniques (âge des patients, grades des cancers et grades de

Gleason des coupes) correspondant aux différents tissus. Toutes les tumeurs ont été fixées dans du formol et enrobées de paraffine. L'activité peroxydase endogène a été inhibée au moyen d'un traitement avec 0,3% de H ₂ 0 ₂ . Les lames de tissus ont été passées au micro-onde pendant 20 min, et lavées trois fois dans 10 mM de tampon au citrate (pH 6,0). Afin d'inhiber les liaisons non-spécifiques des anticorps et de perméabiliser les cellules, les lames ont été incubées avec du PBS contenant 0,2% de BSA, 0,1% de Triton X-100 et 5% de sérum d'âne pendant 30 min à température d'ambiante. Ils ont ensuite été incubés toute la nuit à 4°C avec PBS/5 % de sérum non-immunisé contenant les anticorps pertinents. Les dilutions sont présentées dans le tableau 4. Les cellules ont ensuite été lavées avec du PBS.

Pour les analyses d'immunofluorescence, les cellules ont été incubées avec le IgG secondaire Alexa fluor labellisé-488 anti-lapin (A-21206 ; Tests moléculaires ; dilution 1 :2000) dilué dans du PBS pendant lh à température ambiante. Après trois rinçages dans du PBS, les lames ont été montées avec du Mowiol ^® . La technique de détection DAB- peroxydase de raifort a été utilisée dans les analyses immunohistochimiques. De l'azuré B a été utilisé pour contre-colorer les lames de tissus.

Les observations confocales et d'immunocoloration ont été réalisées comme précédemment décrit au moyen d'un microscope confocal Zeiss LSM 510 (Cari Zeiss, Le Pecq, France) relié à un microscope inversé pour diascopie et épifluorescence Zeiss Axiovert 200 M avec une lentille d'objectif à immersion en huile x63 (ouverture numérique 1.4).

L'anticorps anti-Ki67 a été utilisé pour évaluer le pourcentage de cellules proliférantes. Au moins 500 cellules par lame et trois lames par état ont été comptées. L'anticorps anti-PCNA a été utilisé pour évaluer le pourcentage de cellules en phase S dans les échantillons de tumeurs. Une immunofluorescence de l'anti-CD31 a été utilisée pour évaluer le nombre de vaisseaux sanguins dans les tumeurs xénogreffées. Les anticorps polyclonaux anti-a ₂ ô ₂ ont été utilisés pour étudier l'expression de α ₂ δ ₂ dans les tissus et les cellules de la prostate.

Analyse de la sécrétion de VEGF

La sécrétion de VEGF a été mesurée in vitro au moyen d'une technique ELISA comme décrit par le fournisseur (Abcam). Après mise en culture, les cellules ont été cultivées dans plaques à 12 puits pendant 3 jours avant changement du milieu de culture. VEGF a ensuite été analysé dans le milieu de culture après 24 heures d'incubation (3 puits par état, et l'expérience a été répétée au moins trois fois). Analyse de la sécrétion de α ₂ δ ₂

Afin de déterminer si α ₂ δ ₂ est sécrétée dans le milieu de culture, les cellules ont été incubées pendant 6 jours sans changement du milieu de culture. A la fin de cette période, le milieu de culture a été retiré et centrifugé (milieu de culture cellulaire).

Les cellules ont ensuite été incubées pendant 15 min avec 10 mM de DTT afin de cliver les ponts disulfure et le milieu a encore une fois été retiré et centrifugé. Les protéines des deux supernageants (avec et sans DTT) ont été précipitées avec de l'acétone. Le concentré a été remis en suspension dans RIPA. Le contenu en protéines a été mesuré et α ₂ δ ₂ a été analysée après une électrophorèse SDS-page (6 ou 8% d'acrylamide) et un western-blot. L'expression de α ₂ δ ₂ dans le milieu de culture cellulaire a été comparé au milieu de culture seul (sans cellules).

Essais in vivo

Des souris Swiss nude mâles âgées de 6 semaines (Laboratoires Charles River, France) ont reçues une injection sur chaque flanc de cellules LNCaP ou de cellules LNCaP surexprimant α ₂ δ ₂ . Six millions de cellules ont été injectées sur les deux flancs de chaque souris. Les cellules ont été préparées dans un mélange composé de 50% de PBS et de 50% de BD-Matrigel ^® . Les tumeurs ont été mesurées deux fois par semaine et les animaux ont été sacrifiés quand la taille de la tumeur a atteint 10% du poids de l'animal. Le jour du sacrifice, les tumeurs ont été pesées et divisées pour des analyses immunohistochimiques, par western blot et par PCR-RT supplémentaires. Au moins 10 animaux par état ont été utilisés.

Analyses statistiques

Des graphiques ont été reproduits au moyen de Origin 7.0 (Microcal Software, Inc., Northampton, MA). Les résultats ont été exprimés en moyenne ± écart-type moyen. Des analyses statistiques ont été effectuées au moyen de tests t non appariés (pour comparer deux groupes) ou des tests ANOVA suivis de Dunnett (pour contrôle multiple vs tests de comparaisons) ou de post-tests de Student-Newman-Keuls (pour les comparaisons multiples) ou de tests du Chi2 (pour comparer des proportions). Les différences ont été considérées comme significatives avec p<0,05 : *, p<0,01 : **, p<0,001 :

Test d'ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) Indirect pour la détection de α ₂ δ ₂ dans les urines des patients atteints de cancers prostatiques

Gamme de détection du peptide o^ô? Le test a été conduit selon Da Silva et al. (2000) avec quelques modifications. Les puits des plaques (de 96 puits) ont été incubés avec 200μ1 PBS (phosphate-buffered saline solution) contenant le peptide α ₂ δ ₂ (AVIVA SYSTEM BIOLOGY de référence AAP64646) dilué à différentes concentrations (de 6,25μg/ml à 3 pg/ml) à l'exception des puits du contrôle contenant uniquement 200 μΐ du tampon PBS. Les plaques ont par la suite été incubées pendant lh à 37° C puis à 4°C pendant une nuit.

Les plaques ont été ensuite lavées 3 fois avec du tampon de lavage PBS. Puis, les puits ont été incubés avec 200 μΐ du tampon de blocage des sites aspécifiques (PBS + 1% BSA) pendant 1 heure à la température ambiante. Puis, les puits sont vidés et incubés avec l'anticorps anti-a ₂ ô ₂ (anticorps AVIVA SYSTEM BIOLOGY de référence ARP64646_P050) (développé chez le lapin) dilués à l/500e dans du tampon de blocage (100 μΐ). Les plaques sont incubées à 4°C pendant la nuit. Deux expériences contrôles sont effectuées ; un contrôle en absence des anticorps primaires et secondaires et un contrôle en absence de l'anticorps primaire avec la concentration la plus haute de la gamme (6,25μg/ml), ce dernier afin d'estimer la fixation aspécifique de l'anticorps secondaire.

Après 3 lavages avec du tampon de lavage, les puits sont incubés lh à 4°C en présence d'un anticorps secondaire (Goat Anti-Rabbit IgG, Jackson Immunoreasearch Lab) conjugué à la fluorescéine (Alexa Fluor 488 de Lifetechnologies) à une dilution de l/2000e dans un volume total de 100 μΐ du tampon de blocage. Après cette incubation, les puits sont lavés trois fois avec du tampon de lavage (PBS) et la fluorescence est mesurée au niveau des puits à l'aide d'un lecteur de plaque fluorescence. Après la soustraction de la fluorescence des contrôles, la variation de la fluorescence est tracée en fonction des concentrations du peptide α ₂ δ ₂ . Ceci a permis d'estimer la sensibilité de la méthode de dosage.

La figure 1 montre la fluorescence de l'anticorps secondaire en fonction de la concentration de peptide α ₂ δ ₂ sur toute la gamme de concentration du peptide α ₂ δ ₂ . La figure 13 A montre un agrandissement de cette courbe dans la gamme de concentration proche du seuil de détection. Ce seuil, déterminé par dérivation de la courbe expérimentale obtenue, est d'environ 10 ng/ml. Dosage de la protéine o^dans les urines

Les échantillons urinaires des patients obtenus sans massage de la prostate (20 ml) sont concentrés 10 fois en utilisant la méthode de la concentration à l'acétone. Après le dosage des protéines des échantillons urinaires, 4μg de chaque échantillon urinaire sont incubés dans les puits (plaque 96 puits) dans un volume total de 100 μΐ PBS (« protéines d'urine »). Afin de vérifier si un dosage direct d'a ₂ ô ₂ est possible dans les urines, parallèlement,

50 μΐ d'urines de chaque patient sont déposés dans des puits dans un volume total de 100 μΐ en présence de PBS (« urine totale ») . A partir de cette étape, toutes les opérations pour tous les échantillons sont effectuées comme décrites précédemment pour la réalisation de la gamme de détection du peptide α ₂ δ ₂ .

Résultats

Expression de α ₂ δ ₂ dans les tissus et les lignées cellulaires du cancer de la prostate II a été démontré dans des études précédentes que les canaux calciques voltage- dépendants Cav3.2 sont exprimés dans les lignées cellulaires du cancer de la prostate et dans les tumeurs de la prostate humaine (5). Il a ici été recherché si les sous-unités régulatrices supposées peuvent aussi être exprimées dans ces cellules. L'attention a été portée sur les sous- unités α ₂ δ étant donné que deux d'entre elles (α ₂ δ ₂ et α ₂ δ ₃ ) sont suspectées d'agir comme suppresseurs de tumeurs dans différents organes.

Comme montré à la figure 2, il a été mis en évidence par RT-PCR que les lignées cellulaires du cancer de la prostate étudiées (cellules LNCaP, DU145, PC3) expriment un produit de la transcription de α ₂ δ ₂ . Les autres sous-unités α ₂ δ recherchées ( ₂ ôi et α ₂ δ ₃ ) ne sont pas exprimées dans les lignées cellulaires de la prostate étudiées.

De la même façon, et comme montré à la figure 3, les analyses par RT-PCR ont démontré que α ₂ δ ₂ est présente dans les tissus normaux et cancéreux de la prostate. Des tests d'immunodétection ont également été effectués pour mettre en évidence l'expression des protéines α ₂ δ ₂ dans les lignées cellulaires du cancer de la prostate et dans les coupes de tissus de la prostate. Les analyses par immunofluorescence ont montré que les lignées cellulaires du cancer de la prostate LNCaP, DU! 45 et PC3 sont fortement colorées par les anticorps anti-a ₂ ô ₂ . Π est en outre observé que la coloration α ₂ δ ₂ est évidente sur la cellule mais elle est particulièrement prononcée sur la périphérie, c'est-à-dire près de la membrane plasmique, lieu d'ancrage des protéines α ₂ δ ₂ (non représenté).

De plus, par western blot, il a été observé, au moyen d'anticorps anti-a ₂ ô ₂ , l'expression de deux bandes autour de 160 kD (cf. figure 4). L'expression de ces bandes est fortement réduite lorsque les cellules LNCaP sont mises en présence de si-a ₂ ô ₂ . Ces bandes de 160 kD observées par western blot correspondent à la taille attendue de α ₂ δ ₂ , ce qui démontre que les anticorps utilisés ici détectent bien la protéine α ₂ δ ₂ .

Des colorations par immunofluorescence (IF) et immunohistochimiques (IH) de coupes du cancer de la prostate obtenus des sujets ont été effectuées sur des coupes de tissus de la prostate congelées (IF) ou des coupes en paraffine (réaction peroxydase IH). Il a été montré qu'il y a une forte coloration des structures glandulaires épithéliales. Les acini sont fréquemment colorés avec les anticorps anti-a ₂ ô ₂ (non représenté). De plus, les membranes apicales de l'épithélium sont plus fortement colorées que des membranes basolatérales (non représenté).

L'immunocoloration des cellules épithéliales du cancer de la prostate dans le milieu de culture primaire a donc mis en évidence une forte coloration de α ₂ δ ₂ sur la périphérie des cellules. L'expression de α ₂ δ ₂ augmente avec le développement du cancer de la prostate

Afin d'évaluer les éventuelles différences d'expression de α ₂ δ ₂ entre les tissus normaux et les tissus tumoraux, une comparaison de l'expression de α ₂ δ ₂ au moyen de la technique RT-PCR a été effectuée dans 18 tissus du cancer de la prostate et dans 20 tissus non-cancéreux de la prostate. Comme montré aux figures 3 et 5, α ₂ δ ₂ est plus fréquemment exprimée dans les tissus cancéreux (95% des tissus cancéreux expriment α ₂ δ ₂ ) que dans les tissus non-cancéreux (40% des tissus non-cancéreux expriment α ₂ δ ₂ ) (différence significative, p<0,001, test du Chi2).

De la même façon, l'expression de α ₂ δ ₂ a été comparée sur des macroarrays de 24 tissus différents dont 16 tissus cancéreux et 8 tissus non cancéreux. Comme montré à la figure 6, les cellules épithéliales recouvrant les acini sont colorées par les anticorps anti-a ₂ ô ₂ dans les échantillons normaux, hyperplasiques et cancéreux. Dans les stades avancés de cancer, un certain nombre de cellules colorées quittent les acini (cf. figure 6B, G3, Métastase). Plusieurs grades de différenciation ont été analysés. La surface colorée ainsi que l'intensité de coloration augmentent dans les stades avancés du cancer de la prostate en comparaison à la prostate normale ou hyperplasique.

Comme montré à la figure 6, la localisation dans la cellule est différente entre les stades normaux, BPH et précoces (Gl) du cancer et les stades avancés du cancer (G2, G3). Dans les stades BPH et précoces du cancer (Gl), la coloration est majoritairement apicale et intracellulaire, alors que dans les stades avancés du cancer (G2 et G3), la coloration augmente dans tous les compartiments de la cellule, et plus particulièrement dans le noyau des cellules. La densité de coloration a également été analysée au moyen de la déconvolution de couleur pour extraire la coloration DAB de contre-coloration (Bleu azuré) et il a été montré que la densité DAB est plus importante dans les stades avancés du cancer, mettant ainsi en évidence que l'expression de a ₂ ô ₂ est augmentée dans les cancers avancés de la prostate (figure 6C).

L'inhibition de α ₂ δ ₂ réduit la prolifération cellulaire alors que sa surexpression induit la prolifération cellulaire

Etant donné que α ₂ δ ₂ est exprimée dans les cellules épithéliales du cancer de la prostate, il a été recherché si la protéine peut participer à la croissance cellulaire.

Différentes approches ont été utilisées pour évaluer la prolifération cellulaire. L'utilisation de ligands ou de si-a,2Ô2 réduit la tumorigénèse

Premièrement, il a été démontré par une méthode MTS que la prolifération cellulaire est réduite de 20% au bout de 4 jours d'incubation dans 50 nM de si-a ₂ ô ₂ en comparaison avec si-ctl (cf. figure 7A a). De la même façon, la prolifération cellulaire est diminuée en présence de si-a ₂ ô ₂ dans les lignées DU 145 et PC3 (cf. figure 7B).

Des résultats similaires ont été obtenus avec un comptage manuel de cellules, ce qui montre qu'une incubation de 4 jours dans si-a ₂ ô ₂ diminue de 30% le nombre de cellules LNCaP (cf. figure 7 A b). Des expériences cinétiques (figure 7C) illustrent le fait que si-a ₂ ô ₂ est un inhibiteur significatif de la prolifération cellulaire après seulement trois jours d'incubation et qu'un effet maximal est atteint après 5 jours à 6 jours (40% de réduction de la prolifération cellulaire). Des analyses FACS du cycle cellulaire montrent que cette action inhibitrice de si-a ₂ ô ₂ sur la prolifération cellulaire est corrélée à une augmentation du nombre de cellules en phase G _1; ainsi qu'à une diminution du nombre de cellules en phase G ₂ /M et en phase S (figure 7D).

La gabapentine a été testée sur la prolifération cellulaire, celle-ci étant connue pour inhiber différents canaux calciques voltage-dépendants par son action sur la sous-unité régulatrice α2δ. En effet, la gabapentine a été démontrée comme étant un ligand des deux sous-unités ₂ ôi et α ₂ δ ₂ (12). Dans les présents essais, la gabapentine, qui a été ajoutée au milieu de culture cellulaire à 100 μΜ, réduit de 35% la prolifération cellulaire d'incubation

(figure 7E). L'inhibition induite par la gabapentine diminue ensuite légèrement jusqu'à 20% après 4 jours, ce qui peut être dû soit à une désensibilisation de la gabapentine, soit à une dégradation de la gabapentine.

Les lignées LNCaP-a,2Ô2 induisent la prolifération cellulaire

Des clones de LNCaP surexprimant de manière stable α ₂ δ ₂ ont été utilisés de manière similaire dans les essais de prolifération cellulaire. Il a été montré que deux clones différents surexprimant α ₂ δ ₂ (clone 9 « C9 », et clone 11 « Ci l ») produisent des taux de prolifération plus rapides que les cellules témoins LNCaP, avec un temps de multiplication par 2 de 47,5h pour LNCaP contre 40,5h pour le clone 9 et 36h pour le clone 11 (cf. figure 7F a).

Des essais d'immunofluorescence colorant Ki-67 sur des lignées cellulaires LNCaP et LNCaP surexprimant α ₂ δ ₂ (clone 11) ont été effectués (cf. figure 7F b). Ki-67 est un marqueur de cellules proliférantes. Il est seulement exprimé pendant les phases G _1; S, G ₂ et M. Les cellules en phase Go n'expriment pas Ki-67 de façon significative. Il peut y avoir soit une présence ponctuelle dans le noyau pendant les phases G _\ et S, soit une localisation plus homogène dans le noyau pendant les phases G ₂ et M. Il a ici été démontré que α ₂ δ ₂ est associée à une diminution du nombre de cellules pendant la phase Go du cycle cellulaire. Dans ces essais, les cellules non proliférantes représentent 35,6 ± 1,6% de la population cellulaire LNCaP totale, alors qu'elles ne représentent que 21,6% ± 3,5% de la population cellulaire LNCaP-a ₂ ô ₂ totale. Ce résultat est corrélé avec une augmentation du nombre de cellules pendant les phases Gi/S et G ₂ /M du cycle cellulaire des cellules LNCaP-a ₂ ô ₂ . Au vu de tous ces résultats, il est donc démontré que α ₂ δ ₂ augmente la prolifération des cellules LNCaP.

La surexpression de a,2Ô2 induit le développement tumoral in vivo

Des essais in vivo ont été effectués sur des souris nude immunodéficientes. Les souris ont subi une injection sur chaque flanc de cellules LNCaP ou de cellules LNCaP surexprimant α ₂ δ ₂ (figure 5). Les tumeurs obtenues sont respectivement nommées ci-après « tumeur de LNCaP » et « tumeur de LNCaP- ₂ δ ₂ ». La taille des tumeurs, qui a été mesurée deux fois par semaine, a commencé à augmenter habituellement après 4-6 semaines. Une fois que la tumeur était détectable, elles ont grandi avec un temps de multiplication par 2 de 12,2 ± 1,9 jours (cf. figure 8a) pour les tumeurs des LNCaP, pour atteindre une taille moyenne de 940 ± 146 mm (1,26 ± 0,22 g) (cf. figures 8b et c). Les tumeurs des LNCaP-a ₂ ô ₂ ont grandi avec un temps de multiplication par 2 de 6,6 ± 0,8 jours (cf. figure 8a), pour atteindre une taille moyenne de 1760 ± 154 mm (2,3 ± 0,21 g) (cf. figures 8b et c). Pour les deux types de tumeurs, la taille maximale de la tumeur a été atteinte habituellement 4 semaines après le début de croissance de la tumeur pour chaque souris.

Par conséquent, il est mis en évidence in vivo que les tumeurs de LNCaP-a ₂ ô ₂ augmentent plus vite et sont plus grosses que les tumeurs de LNCaP. La surexpression de α ₂ δ ₂ induit la formation de vaisseaux sanguins et la sécrétion de VEGF.

Les deux tumeurs de LNCaP et LNCaP-a ₂ ô ₂ obtenues lors des essais in vivo décrits précédemment sont fortement irriguées et sont caractérisées par d'abondants vaisseaux sanguins mais aussi par des signes d'hémorragies avec des fuites de globules rouges dans les tissus voisins et de nombreux foyers d'inflammations et de nécroses (cf. figure 9A).

Aucune différence significative de surface nécrotique n'a été détectée entre les tumeurs de LNCaP et les tumeurs de LNCaP-a ₂ ô ₂ . Pourtant, les études d'immunofluorescence par PCNA, permettant l'identification des cellules en phase S du cycle cellulaire, montrent au contraire qu'm vivo, il y a plus de cellules proliférantes dans les tumeurs de LNCaP-a ₂ ô ₂ que dans les tumeurs de LNCaP (figure 9B). De plus, les lames histologiques montrent qu'il y a plus de vaisseaux sanguins dans les tumeurs de LNCaP-a ₂ ô ₂ que dans les tumeurs de LNCaP (figures 9 A et B). Les vaisseaux sanguins ont donc été colorés avec du CD31 (figure 10A) qui est un marqueur couramment utilisé pour colorer les cellules endothéliales et pour détecter l'angiogénèse dans les tumeurs. Il a été montré que la surface colorée dans les tumeurs de LNCaP-a ₂ ô ₂ est deux fois plus importante en comparaison avec celle des tumeurs de LNCaP (figure 10B). Ceci a été confirmé par des analyses par western blot qui ont montré une augmentation de 50% dans l'expression de CD31 (figure 11 A). Puisque α ₂ δ ₂ est associée à la formation de vaisseaux sanguins, l'expression et la sécrétion de VEGF dans les tumeurs et les cellules de la prostate ont été mesurées. Comme montré à la figure 11A, les analyses par western blot montrent que l'expression de VEGF est légèrement, mais significativement, augmentée dans les tumeurs surexprimant α ₂ δ ₂ . Des analyses ELISA de VEGF ont donc été effectuées pour déterminer si la sécrétion in vitro est altérée dans les cellules LNCaP surexprimant α ₂ δ ₂ . Comme montré à la figure 11B, les tests ELISA montrent que la surexpression de α ₂ δ ₂ augmente significativement la sécrétion de

VEGF chez deux différents clones de LNCaP-a ₂ ô ₂ . Ceci n'est pas dû à une stimulation générale non- spécifique de la sécrétion par les cellules LNCaP puisque la sécrétion de la phosphatase d'acide prostatique (PAP) n'est pas affectée par la surexpression de α ₂ δ ₂ , bien que la PAP soit stimulée par une augmentation en calcium intracellulaire. α ₂ δ ₂ peut être clivée dans les cellules LNCaP surexprimant α ₂ δ ₂ .

En conditions non-réductrices, α ₂ δ ₂ correspond à une bande simple de 175 kDa alors qu'en conditions réductrices, deux bandes de 150 et 22 kDa sont observées par western blots (13). Il a ainsi été montré que a ₂ et δ ₂ , dérivés du même gêne CACNA2D2, sont liés par des ponts disulfure. a ₂ est une sous-unité large extracellulaire (150kDa ou plus, dépendant de la glycosylation) reliée à δ ₂ , une plus petite protéine transmembranaire (environ 20kDa).

Afin d'évaluer si a ₂ ô ₂ peut être utilisée comme marqueur tumoral, il a été recherché si ces ponts disulfure peuvent être clivées dans les cellules LNCaP pour permettre à la protéine d'être libérée dans le milieu de culture. Pour cela, la présence de α ₂ δ ₂ , soit a ₂ en cas de clivage, a été recherchée dans le milieu de culture par western blot. La figure 12 montre que a ₂ est bien présente dans le milieu de culture dans lequel les cellules LNCaP-a ₂ ô ₂ ont été incubées pendant 6 jours, tandis que cette sous-unité est à peine détectable dans le milieu de culture des cellules témoins LNCaP. α ₂ δ ₂ peut être dosée dans les urines de patients atteints de cancer de la prostate.

La figure 13 B montre les concentrations de la protéine codée par le gène CACNA2D2 dans les urines totales et dans les protéines obtenues à partir d'urine d'un homme atteint d'un cancer de la prostate.

Cette concentration est d'environ 20 ng/ml, valeur supérieure au seuil de détection comme visible à la figure 13 A.

Discussion

La protéine α ₂ δ ₂ avait été détectée comme régulant l'activité des canaux calciques voltage-dépendants. Bien que de nombreuses recherches aient montré que le gène CACNA2D2, codant pour cette protéine, est localisé dans le locus 3p21, connu comme étant un cluster de gènes suppresseurs de tumeurs, il a ici été démontré que α ₂ δ ₂ est capable d'influer elle-même sur la prolifération cellulaire in vitro et sur la tumorigénèse in vivo. Cette protéine α ₂ δ ₂ , ou un fragment de celle-ci, représente un nouveau biomarqueur du cancer, et notamment du cancer de la prostate. Ceci est basé sur les observations suivantes : (1) La sous-unité de canaux calciques α ₂ δ ₂ , codée par le gène CACNA2D2, est exprimée dans les cellules de la prostate ;

(2) Cette protéine, ou son gène, est plus fréquemment exprimée dans les tissus cancéreux que dans les tissus non-cancéreux de la prostate ;

(3) Cibler cette protéine avec des ligands ou si-RNA peut réduire la tumorigénèse in vitro ;

(4) L'expression de α ₂ δ ₂ est associée à une sécrétion de VEGF et une formation de vaisseaux sanguins ;

(5) Sa surexpression induit le développement tumoral chez la souris nude ;

(6) α ₂ δ ₂ est surexprimée dans d'autres formes de cancers ;

(7) La protéine α ₂ δ ₂ peut être clivée et la sous-partie a ₂ de la protéine α ₂ δ ₂ libérée dans le milieu extracellulaire de cellules LNCaP-a ₂ ô ₂ . Elle est détectable avec des anticorps disponibles sur le marché. Ainsi, la protéine α ₂ δ ₂ a été détectée dans les cellules de la prostate à la fois cancéreuses et non-cancéreuses par PCR et immunodétection, en particulier sur les membranes apicales de l'épithélium (observation (1)). Des analyses PCR et immunohistochimiques ont ensuite montré que la protéine α ₂ δ ₂ est plus exprimée dans les tissus cancéreux de la prostate que dans les tissus non-cancéreux (observation (2)). En partant du constat, établi par des techniques de MTS, comptage manuel ou des expériences cinétiques, que le ciblage de la protéine avec si-a ₂ ô ₂ ou des ligands comme la gabapentine réduit la prolifération cellulaire (observation (3)), il a été montré in vitro et in vivo que cette surexpression de α ₂ δ ₂ induit le développement tumoral chez la souris nude (observation (5)). Des analyses histologiques, d' immunodétection, par western blot et des tests ELISA ont également montré que cette surexpression de α ₂ δ ₂ provoque la sécrétion de VEGF et l'angiogénèse (observation (4)). Il a enfin été mis en évidence que la protéine α ₂ δ ₂ peut être clivée, libérant ainsi la sous-partie a ₂ de la protéine α ₂ δ ₂ dans le milieu extracellulaire de cellules LNCaP-a ₂ ô ₂ . La protéine α ₂ δ ₂ ou les fragments de cette protéine, et plus particulièrement la sous-partie a ₂ , sont détectables avec des anticorps disponibles sur le marché (observation (7)).

Il est par ailleurs raisonnable d'affirmer que la protéine α ₂ δ _2> ou les fragments de cette protéine, puisse, de la même façon, être détectée dans le sang, le sérum, le plasma, le sperme et les urines.

Il est ainsi connu qu'm vivo, les protéines ancrées par des groupements GPI à la membrane peuvent être clivées par différentes enzymes, dont certaines phospholipases C ou D, hydrolysant ces groupements GPI et libérant ainsi les protéines dans le milieu extracellulaire. Il a ainsi été mis en évidence que la protéine α ₂ δ ₂ était bien présente dans les urines de patients atteints de cancer de la prostate.

Plus particulièrement le clivage in vivo de la sous-partie a ₂ de la protéine, libérant la sous-partie a ₂ dans le milieu extracellulaire, est fortement présumé. II est en effet connu que, dans le milieu extracellulaire, les ponts disulfures peuvent être clivés par de nombreuses enzymes comme la disulfure isomérase ou la phosphoglycérate kinase (14), libérant ainsi a ₂ dans le milieu extracellulaire des cellules épithéliales de la prostate. Or, il a déjà été montré que ces deux enzymes sont détectées dans la prostate et que leur expression est accrue lors du développement cancéreux (15, 16).

Ainsi, de façon similaire au présent cas, la protéine CD90 (Cluster of Differentiation 90) est une protéine de surface N-glycosylatée, ancrée à la membrane par un groupement GlycosylPhosphatidylInositol (GPI), comme la protéine α ₂ δ ₂ . Elle a été découverte initialement comme antigène de thymocytes (17), et a été décrite comme étant exprimée dans le tissu nerveux (18), les cellules progénitrices hématopoïétiques (19), et dans les fibroblastes de nombreux tissus tels que les poumons ou le myomètre lung (20). Des niveaux élevés de CD90 ont été détectés dans des gliomes malins et l'hépatocarcinome (21). La protéine CD90 est multipliée par un facteur 5 dans les tissus de cancers de la prostate par rapport aux tissus non cancéreux (22). Les mêmes auteurs ont étudié la présence de CD90 dans les urines afin de déterminer si cette protéine était sécrétée. Un peptide issu de CD90 a ainsi été identifié dans les urines de patients atteints de cancer de la prostate par spectrométrie de masse, confirmant que CD90 est sécrétée par le tissu cancéreux prostatique et peut donc servir de biomarqueur pour des tests non invasifs (22). II est connu que la libération de protéines par les cellules prostatiques dans le liquide séminal s'effectue d'une part par la sécrétion de protéines solubles par exocytose et d'autre part par la production de prostasomes, ou exosomes, libérés par exocytose à partir des corps multivésiculaires des cellules épithéliales. Ces exosomes, retrouvés dans le liquide séminal, contiennent un grand nombre de protéines, par exemple des protéines membranaires, comme GLUT5 (Glucose Transporter 5), VAT-1 (synaptic vesicle membrane protein homologue) ou SCA2 (synaptic carrier associated membrane protein). D'autre part, ces prostasomes, qui sont normalement libérés dans le liquide séminal peuvent se retrouver dans le plasma sanguin au cours du développement de cancers prostatiques (23). Ainsi, il est très probable que la protéine α ₂ δ ₂ soit libérée dans le liquide séminal ou le plasma sanguin par ces prostasomes et puisse être dosée dans d'autres liquides organiques que l'urine.

Enfin, il peut être appuyé le fait que, de la même façon que la PSA, l'architecture des tissus, et notamment la plus grande fragilité des vaisseaux sanguins, entraîne une fuite de PSA et d' ₂ δ ₂ dans le sang, permettant ainsi de retrouver cette protéine dans le plasma sanguin en plus grand quantité lors de développement tumoral.

Il a donc été ici mis en évidence que la protéine α ₂ δ ₂ , ou un fragment de celle-ci, peut être utilisée comme biomarqueur du cancer de la prostate, ainsi que pour détecter le stade d'avancement du cancer.

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