【발명의 명칭】

신규한 카테콜 유도체 및 이를 포함하는 약학적 조성물

【기술분야】

본 발명은 신규한 카테콜 유도체 및 이를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로， 본 발명에 따른 카테콜 유도체는 간 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

【배경기술】

간 섬유화 (Liver fibrosis)는 모든 원인의 만성 간 손상에 대한 일반적인 치유 반웅이다. 손상된 조직을 치유하기 위하여, 간 조직은 상처에 새로운 교원질을 침착하지만 시간이 지날수록 이러한 과정은 간의 경화로 이어진다. 간 섬유화는 일반적으로 감염, 약물， 대사 장애, 또는 자가 면역의 불균형에 의해 발생하는 만성 간 질환과 연관되어 있다. 장기간 실질 세포 (parenchymal cell)의 사멸 및 괴사로 인한 간 섬유화는 염증 반웅과 연관되어 있어， 면역 세포들을 불러오고 섬유화 세포 (fibrogenic eel Is)를 활성화 및 축적시키며， 세포 외 기질 (extracellular matrix)의 축적을 유발한다. 지속적인 간 손상에 따른 섬유화의 진행은 섬유성 격막 (fibrotic septa)의 팽창과 관련되어 궁극적으로 간경화 (cirrhosis)를 일으킨다. 간 섬유화는 1-10년 사이에 간경화로 발전할 수 있고， 그 10년 이내에 간 관련 사망률 원인의 12%에서 25%로 증가된다 (Farrell, G. C. & Larter, C. Z. Nonalcohol ic fatty liver disease: from steatosis to cirrhosis. Hepatol ogy 43, S99-S112 (2006)). 그러나， 불행하게도 효과적인 임상 치료법은 여전히 부족한 상태이다. 따라서 효율적인 항 섬유화 치료 방법은 간 질환 치료에서 좋은 표적이 되고 있다. 현재 간 섬유화에 이르게 하는 여러 단계를 표적으로 한 항 섬유화 전략이 인정되었다. 즉， 간 세포의 세포 사멸을 억제하거나 간 염증의 억제， 또는 섬유화 세포의 세포 사멸을 추진하거나 표현형 (phenotype) 섬유화 세포를 정지 상태 (quiescent state)로 돌려놓는 방법이 있다. 그러나 현재까지 간 섬유화의 치료에 사용되는 특정 약물은 여전히 제한되어 있다. 한편， 자가소 ^' 화작용 (autophagy)은 하나의 대사 과정으로 진핵 세포가 자신의 세포 기관과 오래된 단백질들을 소화시키는 과정이다. 그 과정은 세포의 성장， 분화와 항상성 (homeostasis)에 밀접히 연관되어 있다. 그리고 "오래된" 또는 "파손된" 세포 기관을 소화시키는 유일한 방식이다 (Klionsky, D. J. & Emr, S. D. Autophagy as a regulated pathway of cellular degradation. Science 290, 1717-1721 (2000)， Levine, B. & Klionsky, D. J. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological funct ions of autophagy. Developmental cell 6, 463ᅳ 477 (2004)) . 자가소화작용은 생리적 및 병리적 조건 하의 간 항상성 (homeostasis)에서 중요한 조절인자로 작용하고 있다 (Codogno, P. & Meijer, A. J. Autophagy in the liver. Journal of hepatology 59, 389-391 (2013). Rautou, P.-E. et al . Autophagy in liver diseases. Journal of hepatology 53, 1123- 1134 (2010) . Czaja, M. J. et al . Funct ions of autophagy in normal and diseased liver. Autophagy 9, 1131-1158 (2013)). 현재 autophagy는 aggregated protein, damaged/excess organelles, lipid 등 세포 내 특정 구성 요소들을 선택적으로 타겟팅하여 lysosomal pathway를 통하여 분해시킴으로써， 항상성과 에너지 생산에 필요한 기질 공급을 조절하는 중요 pathway로 인식되고 있다 (Autophagy. 2013 Aug;9(8)； 1131-58) . 또한 최근 연구결과 자가소화작용은 간 섬유화에서 한가지 새로운 조절 경로인 것으로 나타났다. 자가소화작용은 간 섬유화를 유도하는 hepatic stellate cells (HSCs)의 활성화 과정에 직접적으로 기여하거나 또는 가능하게 다른 섬유화 세포에 대한 간접적 작용으로 간 섬유화를 촉진시켜 준다.

Autophagy 연구의 대표적인 모델이기도 한 간은， 1) 재생 능력이 매우 뛰어난 속성을 지니고 있으며， 2) 중요한 대사 기관이며， 3) liver trophic virus에 의한 감염에 노출된 기관이다. 따라서 이러한 재생， 대사， 면역 등 기관의 핵심 기능이 autophagy와 밀접히 관련되어 있다 (Autophagy. 2013 Aug;9(8): 1131-58). Liver ischemia— reper fusion은 임상적으로 liver transplant at km, trauma, chock , elective liver resect ion시 발생한다. 허혈 재산소화 (Ischemia-reoxygenation)시에는 미토콘드리아 내부에는 활성 산소종 (reactive oxygen species)과 Ca ²⁺ 양이 증가하며， 미토콘드리아 막전이 (mitochondria permeability transition) 되어 산화적 인산화 (oxidative phosphorylat ion)가 uncoupling되고, 궁극적으로 에너지 및 ATP 고갈과 함께 세포 사멸이 유도된다. Anoxia/reoxygenation시 autophagy protein들이 저하되어 있기 때문에, 손상된 미토콘드리아들이 제거되지 못한다. 따라서 autophagy를 활성화시켜 ischemia-reper fusion에 대한 tolerance를 키우고자 하는 전략이 전임상 모델에서 시도되고 있다. 한편 급성 간 손상 (acute liver injury) 모델에서 autophagy는 stress 상황에서 세포 생존을 증가시키기 위해 활성화되어 있다.

PI3K/AKT/mT0R 신호전달 경로는, 세포 성장이나 증식， 운동성 (motility), 생존 (survival), 세포 사멸, 단백질 합성 및 전사와 같은 다양한 세포 과정을 조절한다 (Hay, N. & Sonenberg, N. Upstream and do腿 stream of mTOR. Genes & development 18, 1926-1945 (2004) . Yang, Q. & Guan, K.-L. Expanding mTOR signaling. Cell research 17, 666ᅳ 681 (2007) . Schmelzle, T. & Hall, M. N. TOR, a central controller of cell growth. Cell 103， 253-262 (2000). Sarbassov, d. D. , Ali, S. M. & Sabat ini , D. M. Growing roles for the mTOR pathway. Current opinion in cell biology 17, 596-603 (2005)). 그리고 자가소화작용에서 PI3K/AKT/mT0R 신호전달 경로는 주요한 경로로 잘 알려져 있다. 영양 또는 성장 인자의 결핍으로 mTOR 신호 전달이 억제되면 자가소화작용이 유도된다. 반대로 영양 또는 성장 인자가 풍부하면 mTORCl이 활성화되면서 ULK1 complex를 통한 자가소화작용을 억제시키고 세포의 성장과 신진대사 활동을 촉진한다. 많은 실험 데이터에서 AKT/mTOR 신호전달 경로는 HSCs 활성화의 중심에 있다고 보고되었다 (Reif, S. et al. The role of focal adhesion kinaseᅳ phosphat idyl inositol 3-kinase-akt signaling in hepatic stellate cell prol i ferat ion and type I collagen expression. Journal of Biological Chemistry 278, 8083-8090 (2003). Gabele, E. et al. The role of p70S6K in hepatic stellate cell collagen gene expression and cell proliferation. Journal of Biological Chemistry 280, 13374-13382 (2005). Gabele, E. , Brenner , D. A. & Rippe, R. A. Liver fibrosis: signals leading to the amplification of the f ibrogenic hepatic stellate cell. Front Biosci 8， 69— d77 (2003)). 그리고 mTOR 억제제인 Rapamycin에 의한 mTOR 신호전달 경로의 저해는 간경화 동물 모델에서 섬유 조직의 성장을 감소시켰고， 간 기능을 개선하였으며 문맥압 (portal pressure)을 낮주었다고 보고 되었다 (Biecker , E. et al . Long-term treatment of bile duct- 1 i gated rats with rapamycin (sirol imus) significantly attenuates liver' fibrosis: analysis of the underlying mechanisms. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeut ics 313, 952—961 (2005) . Neef , M. , Ledermann, M. , Saegesser , H. , Schneider , V.& Reichen, J . Low-dose oral rapamycin treatment reduces f ibrogenesis, improves liver function, and prolongs survival in rats with established liver cirrhosis. Journal of hepatology 45, 786—796 (2006). Patsenker, E. et al. Potent antif ibrotic activity of mTOR inhibitors sirol imus and everol imus but not of cyclospor ine A and tacrolimus in experimental liver fibrosis. Journal of hepatology 55， 388-398 (2011)). 또한 Rapamycin은 간 이식 환자에게서 중요한 면역 억제제로 사용되고 있다. 그 외에도 mTOR 억제제인 Siroli腿 s와 Everol i隱 s는 실험적 조건 하에서 간의 섬유화의 진행 및 portal hyper tens ion을 감소시킨다고 보고된 바가 있다. 이에 본 발명자들은 상기와 같은 선행 연구에 의하여 autophagy가 간 질환에 결정적인 역할을 한다는 사실을 알게 되었고， 이를 근거로 autophagy의 활성을 유도하는 화합물을 개발하기 위하여 예의 연구한 결과， 후술할 바와 같은 신규한 카테콜 유도체가 우수한 autophagy 활성화 효과 및 간질환을 억제하는 활성을 갖는다는 것을 확인하여， 본 발명을 완성하였다.

【발명의 내용】

【해결하려는 과제】 본 발명은 신규한 카테콜 유도체 및 이를 포함하는 약학적 조성물을 제공하기 위한 것이다. 또한， 본 발명은 상기 카테콜 유도체의 제조 방법을 제공하기 위한 것이다.

【과제의 해결 수단】

상기 과제를 해결하기 위하여， 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물， 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다:

[화학식 1]

상기 화학식 1에서，

및 ¾는 각각 독립적으로 d- ₄ 알킬이거나， 또는 ¾ 및 ¾가 함께 연결되어 d- ₄ 알킬렌을 형성하고，

¾는 알킬， C ₅ - ₁₀ 헤테로아릴로 치환된 d- ₄ 알킬， C ₆ — ₁₀ 아릴， 또는 C ₅ -io 헤테로아릴이고，

X는 CH, 또는 N이고，

Y는 NH , 또는 0이다. 바람직하게는， ¾ 및 ¾는 메틸이거나, 또는 및 ¾가 함께 연결되어 메틸렌 (-CH ₂ -) , 또는 에탈렌 (-C¾-CH ₂ -)을 형성한다. 또한 바람직하게는， R ₃ 의 정의에 포함되는 C ₆ - ₁₀ 아릴은 페닐이고， C ₅ -

10 헤테로아릴은 피리딘이다. 보다 바람직하게는， R ₃ 는 메틸， 에틸， 이소프로필, 이소부틸， 피리디닐메틸， 페닐， 또는 피리딘이다. 또한 바람직하게는， ¾ 및 _¾ 는 각각 독립적으로 d- ₄ 알킬이거나， 또는 및 ¾가 함께 연결되어 d- ₄ 알킬렌을 형성하고; ¾는 d- ₄ 알킬， C ₅ - ₁₀ 헤테로아릴로 치환된 d- ₄ 알킬， C ₆ - ₁₀ 아릴， 또는 C ₅ - ₁₀ 헤테로아릴이고; X는 CH이고; Y는 NH이다. 또한 바람직하게는， 및 가 함께 연결되어 d- ₄ 알킬렌을 형성하고; ¾는 d— ₄ 알킬 또는 C ₆ - ₁₀ 아릴이고; X는 N이고; Y는 NH이다. 또한 바람직하게는， ¾ 및 R ₂ 는 메틸이거나， 또는 ¾ 및 가 함께 연결되어 메틸렌을 형성하고; ¾는 이소프로필， 이소부틸， 또는 페닐이고; X는 CH이고; Y는 NH이다. 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 대표적인 예는 다음과 같다: 1) 5-(34-디메톡시페닐) -N-이소프로필티오펜 -2-카르복스아미드,

2) 5- (벤조 [d] [1,3]디옥솔 -5-일) -N-이소프로필티오펜 -2- 카르복스아미드,

3) 5-(23—디하이드로벤조 [b][l,4]디옥신 -6-일) -N- 이소프로필티오펜 -2-카르복스아미드，

4) 5-(34-디메특시페닐) -N-이소부틸티오펜 2-카르복스아미드，

5) 5- (벤조 [d] [1,3]디옥솔 -5—일) -N-이소부틸티오펜 -2- 카르복스아미드，

6) 5-(23-디하이드로벤조 [b][l,4]디옥신 -6-일) -N- 이소부틸티오펜 -2-카르복스아미드，

7) 5-(34-디메록시페닐) -N-페닐티오펜 -2-카르복스아미드，

8) 5- (벤조 [d] [1 ,3]디옥솔 -5-일 )-N-페닐티오펜 -2-카르복스아미드，

9) 5-(23-디하이드로벤조 [b][l,4]디옥신 -6-일) -N-페닐티오펜 -2- 카르복스아미드,

10) 5- (벤조 [d] [1,3]디옥솔 -5-일) -N— (피리딘 -2-일)티오펜 -2- 카르복스아미드，

11) 5- (벤조 [d] [1,3]디옥솔 -5-일) -N- (피리딘 -2-일메틸)티오펜 -2- 카르복스아미드，

12) 5-(2,3-디하이드로벤조[1)][14]디옥신-6-일)-1^-(피 리딘-2- 일메틸)티오펜 -2-카르복스아미드，

13) 2- (벤조 [d][l,3]디옥솔 -5-일) -N-이소프로필티아졸 -5- 카르복스아미드,

14) 2-(2 ,3-디하이드로벤조[13] [ 1，4]디옥신-6—일) - 이소프로필티아졸 -5-카르복스아미드，

15) 2- (벤조 [d] [ 1 , 3]디옥솔 -5-일 )-N-이소부틸티아졸 -5- 카르복스아미드，

16) 2-(2，3-디하이드로벤조 [b] [ l ,4]디옥신 6-일) -N- 이소부틸티아졸 -5-카르복스아미드，

17) 2- (벤조 [d] [ 1， 3]디옥솔 -5-일 )-N-페닐티아졸 -5-카르복스아미드，

18) 2-(2 ,3-디하이드로벤조[1)] [ 1，4]디옥신-6-일) -페닐티아졸-5- 카르복스아미드，

19) 메틸 5- (벤조 [d] [ l , 3]디옥솔 -5-일)티오펜 -2-카르복실레이트， 犬

20) 에틸 2- (벤조 [d] [ l , 3]디옥솔 -5-일)티아졸 -5-카르복실레이트. 또한， 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 필요에 따라 본 발명이 속하는 분야의 통상적인 방법들을 사용하여 약학적으로 허용가능한 염으로 제조할 수 있다. 일례로， 염기를 사용하여 통상적인 방법으로 약학적으로 허용가능한 금속염을 얻을 수 있으며， 상기 금속염의 예로 나트륨염， 칼륨염 또는 칼슴염을 들 수 있다. 다른 예로, 약학적으로 허용가능한 유리산 ( free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할. 수 있다. 무기산으로는 염산， 브름산， 황산, 인산 등을 사용할 수 있고， 유기산으로는 구연산， 초산， 젖산, 말레인산， 글루콘산， 메탄술폰산， 숙신산, 4-를루엔술폰산， 글루탐산， 또는 아스파르트산등을사용할 수 있다. 본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은， 이의 약학적으로 허용 가능한 염뿐 아니라 이로부터 제조될 수 있는 가능한 용매화물 및 수화물을 모두 포함한다. 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 용매화물 및 수화물은 본 발명이 속하는 분야의 통상적인 방법들을 사용하여 화학식 1로 표시되는 화합물로부터 제조하여 사용할 수 있다. 또한， 본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물은 결정 형태 또는 비결정 형태로 제조될 수 있으며， 화학식 1로 표시되는 화합물이 결정 형태로 제조될 경우, 임의로 수화되거나 용매화될 수 있다. 본 발명에서는 화학식 1로 표시되는 화합물의 화학양론적 수화물뿐만 아니라 다양한 양의 물을 함유하는 화합물이 포함될 수 있다. 본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물의 용매화물은 화학양론적 용매화물 및 비화학양론적 용매화물 모두를 포함한다. 또한, 본 발명은 하기 반웅식 1과 같이， 하기 화학식 2로 표시되는 화합물과 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물을 반웅시켜， 본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조하는 단계를 포함하는, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조 방법을 제공한다:

[반웅식 1]

상기 반웅식 1에서， ， R ₂ , ， X 및 Y는 앞서 정의한 바와 같고， 는 할로겐이다. 바람직하게는, 는 클로로， 또는 브로모이다. 상기 반웅은 탄산나트륨, 그리고 팔라디움 ( I I ) 아세테이트의 존재하에 수행하는 것이 바람직하다. 또한， 상기 화학식 2로 표시되는 화합물과 상기 화학식 3으로 표시되는 화합물의 반응 몰비는 10 : 1 내지 10: 1이 바람직하다. 또한， 상기 반웅의 용매로는 1 ,2-디메록시에테인， 물， 또는 이의 흔합 용매를 사용하는 것이 바람직하다. 또한， 상기 반웅은 20 내지 200 ^° C에서 수행하는 것이 바람직하며, 반웅시 초음파 처리를 함께 병행하는 것이 바람직하다. 또한， 상기 반웅은 10분 내지 10시간 동안 수행하는 것이 바람직하다. 상기 반웅 후, 필요에 따라 정제 과정이 포함될 수 있다. 또한， 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물， 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는， 아토파지 (autophagy) 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 또한， 본 발명은 아토파지 (autophagy) 관련 질환의 예방 또는 치료 용도를 위한 상기 화학식 1로 표시되는 화합물， 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다. 또한， 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물， 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을， 아토파지 (autophagy) 관련 질환이 있는 개체， 또는 의심되는 개체에 투여하는 단계를 포함하는， 아토파지 (autophagy) 관련 질환을 가지는 개체의 예방또는 치료 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물， 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은， 아토파지 (autophagy) 활성을 높일 수 있으며 이에 따라 아토파지 관련 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다. 상기 아토파지 관련 질환의 예로， 간 질환을 들 수 있다. 또한， 상기 간 질환의 예로， 간섬유화증， 간경변증， 간염， 알코올성 간질환， 지방간， 또는 비알콜올성지방간염 (non-al chol ic steatohepat i t i s , NASH)을 들 수 있다. 본 발명의 용어 "예방 "은 본 발명의 약학적 조성물의 투여로 아토파지 관련 질환의 발생， 확산 및 재발을 억제시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고， "치료' '는 본 발명의 약학적 조성물의 투여로 상기 질환의 증세가호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 표준 약학적 실시에 따라 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 유효성분 이외에 약학적으로 허용가능한 담체， 보조제 또는 회석액 등의 첨가물을 함유할 수 있다ᅳ 적당한 담체로는 예를 들어， 생리식염수， 폴리에틸렌글리콜， 에탄올, 식물성 오일 및 아이소프로필미리스테이트 등이 있고， 희석액으로는 예를 들어 락토즈， 텍스트로즈， 수크로즈， 만니를， 솔비를， 셀를로즈 및 /또는 글리신 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 또한， 본 발명의 화합물들은 주사 용액의 제조에 통상적으로 사용되는 오일， 프로필렌글리콜 또는 다른 용매에 용해시킬 수 있다. 또한， 국소 작용을 위해 본 발명의 화합물을 연고나 크림으로 제형화할 수 있다. 본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중， 질병의 정도, 약물의 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만， 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나， 바람직한 효과를 위해서， 본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물을 1일 0.0001 내지 100 mg/kg (체중)， 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg (체중)으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 1일 1회 또는 분할하여 경구 또는 비경구적 경로를 통해 투여될 수 있다. 투여 방법에 따라， 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 0.001 내지 99 중량 %， 바람직하게는 0.01 내지 60 중량 ¾함유할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 쥐， 생쥐， 가축 및 인간 등을 비롯한 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데， 예를 들어， 경구， 직장 또는 정맥， 근육， 피하， 자궁내 경막 또는 뇌혈관 ( intracerbroventr icular ) 주사에 의해 투여될 수 있다.

【발명의 효과】

본 발명에 따른 화합물， 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은， 우수한 autophagy 활성화 효과 및 간질환을 억제하는 활성이 나타내어， 아토파지 (autophagy) 관련 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다. 【도면의 간단한 설명】

도 1 및 도 2는, Pr imary hepatocyte를 이용한 Ischemi a와 reperfusion 모델에서， 본 발명의 일실시예에서 제조한 화합물 처리에 의하여 autophagy가 현저히 증가됨을 LC3-I I 증가로 확인한 결과를 나타낸 것이다. ^■

도 3은， Hepatocyte는 i schemi a와 reperfusion 모델에서， 본 발명의 일실시예에서 제조한 화합물 처리에 의하여 mTOR의 활성화 억제되는 것을 나타낸 것으로， mTOR의 2448번 위치에 인산화가 현저히 억제됨을 확인함으로써 보여주는 결과를 나타낸 것이다.

도 4는， 사염화탄소에 의한 급성 간손상 및 본 발명의 일실시예에서 제조한 화합물의 치료 효능을 H&E 염색을 통해 조직학적으로 확인한 결과를 나타낸 것이다. 도 4 내의 화살표는 간문맥을 나타낸다.

도 5는， 급성 간손상 유도 후 부검시 간의 형태학적 이상을 관찰한 결과를 나타낸 것이다.

도 6은， 간섬유화를 유도하는 티오아세트아마이드 및 본 발명의 일실시예에서 제조한 화합물 투여 후 부검시 간의 형태학적 이상을 관찰한 결과를 나타낸 것이다. ^'

도 7은, 티오아세트아마이드 및 본 발명의 일실시예에서 제조한 화합물 투여 후 적출한 간조직 절편에서 Masson ' s Tr i chrome 염색을 통해 콜라겐의 침착을 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 8은， 티오아세트아마이드에 의해 손상된 간조직내 염증세포의 침윤을 H&E 염색을 통해 조직학적으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 9는， 간섬유화를 유도하는 사염화탄소 및 본 발명의 일실시예에서 제조한 화합물 투여 후 부검시 간의 형태학적 이상을 관찰한 결과를 나타낸 것이다.

도 10은, 사염화탄소 및 본 발명의 일실시예에서 제조한 화합물 투여 후 적출한 간조직 절편에서 Masson ' s Tr i chrome 염색을 통해 콜라겐의 침착을 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 11은， 담관결찰을 시술하여 간섬유화 유도후 부검시 간의 형태학적 이상을 관찰한 결과를 나타낸 것이다. 도 12는， 담관결찰을 시술 후 적출한 간조직 절편에서 Masson's Tri chrome 염색을 통해 콜라겐의 침착을 확인한 결과를 나타낸 것이다. 도 13은， 담관결찰을 시술 후 적출한 간조직을 이용해 히드록실프를린 정량 실험을 시행한 결과를 나타낸 것이다.

【발명을 실시하기 위한 구체적인 내용】

이하， 하기 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단， 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐， 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다. 실시예 1: 5-(3,4-디메특시페닐) -N-이소프로필티오펜 -2- 카르복

1,2-디메록시에테인 (8 mL), 2차 증류수 (2 mL)에 5-클로로 -N- 이소프로필티오펜 -2-카르복스아미드 (2.015 隱 ol), 3,4- 디메특시페닐보론산 (3.022 隱 ol), 탄산나트륨 (1281.4 mg, 12.09 mmol) 및 팔라디움 (II) 아세테이트 (27.56 mg, 0.05 mmol)을 첨가 후， 초음파와 함께 120 ^° C에서 200분 동안 교반하였다. 디클로로메테인으로 3번에 걸쳐 추출하였다. 추출한 용액을 무수황산마그네슘으로 탈수하고 유기 용매를 감압 농축하고， 플래쉬 컬럼 크로마토그래피 (n-Hx:Et0Ac = 3:1)로 정제한 후， 진공 펌프에서 건조시켜 표제 화합물을 흰색 고체로 수득하였다 (수율 66.70%).

¾ NMR (400 MHz, DMS0-d6) δ 8.18 (d, 1H, J = 7.8 Hz), 7.73 (d, 1H, J = 3.9 Hz), 7.42 (d, 1H, J = 3.9 Hz), 7.24 - 7.17 (m, 2H), 6.98 (d, 1H, J = 8.3 Hz), 4.10 - 3.97 (m, 1H), 3.82 (s, 3H), 3.77 (s, 3H), 1.15 (d, 6H, J = 6.6 Hz); ¹³ C NMR (100 MHz, DMS0-d6) δ 160.5, 149.6, 149.5, 147.9, 138.6, 129.2, 126.5, 123.5， 118.6, 112.6, 109.6, 56.0， 56.0, 41.4， 22.8， 22.8； ESI (m/z) 306 (MH ⁺ ) 실시예 2: 5- (벤조 [d] [1,3]디옥솔 -5-일) -N-이소프로필티오펜 -2- 카르복

1,2-디메특시에테인 (8 inL), 2차 증류수 (2 mL)에 5-클로로 -N- 이소프로필티오펜 -2-카르복스아미드 (2.015 mmol), 벤조 [d] [1,3]디옥솔 -5- 일보론산 (3.022 隱 ₀ 1)， 탄산나트륨 (1281.4 mg, 12.09 隱 ol) 및 팔라디움 (II) 아세테이트 (27.56 mg, 0.05 mmol)을 첨가 후， 초음파와 함께 120 ^° C에서 200분 동안 교반하였다. 디클로로메테인으로 3번에 걸쳐 추출하였다. 추출한 용액을 무수황산마그네슴으로 탈수하고 유기 용매를 감압 농축하고, 플래쉬 컬럼 크로마토그래피 (n-Hx:EtOAc = 3:1)로 정제한 후， 진공 펌프에서 건조시켜 표제 화합물을 갈색 고체로 수득하였다 (수율 64.41%).

¾ NMR (400 MHz, DMS0_d6) δ 8.19 (d, 1H, J = 7.7 Hz), 7.70 (d, 1H, J = 3.9 Hz), 7.38 (d, 1H, J = 3.9 Hz, 1H), 7.27 (d, 1H, J = 1.7 Hz), 7.16 (dd, 1H, J _A = 8.1 Hz, J _B = 1.7 Hz), 6.94 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 6.05 (s, 2H), 4.07 - 3.99 (m, 1H), 1.14 (d, 6H, J = 6.6 Hz); ¹³ C NMR (100 MHz, DMS0-d6) δ 160.5, 148.5, 147.9， 147.5, 138.9, 129.1， 127.9， 123.8， 120.0, 109.2, 106.4, 101.8, 41.4， 22.8, 22.8； ESI (m/z) 290 (腿 ⁺ ) 실시예 3: 5-(2，3-디하이드로벤조[1)][1，4]디옥신-6-일)-^ 이소프 의 제조

1，2-디메톡시에테인 (8 mL), 2차 증류수 (2 mL)에 5-클로로 -N- 이소프로필티오펜 -2-카르복스아미드 (2.015 匪ᄋ 1 )， 2,3- 디하이드로벤조 [b][l, 4]디옥신 -6-일보론산 (3.022 誦 ol), 탄산나트륨 (1281.4 mg, 12.09 隱 ol) 및 팔라디움 (II) 아세테이트 (27.56 mg, 0.05 瞧 ol)을 첨가 후 초음파와 함께 120 ^° C에서 200분 동안 교반하였다. 디클로로메테인으로 3번에 걸쳐 추출하였다. 추출한 용액을 무수황산마그네슴으로 탈수하고 유기 용매를 감압 농축하고， 플래쉬 컬럼 크로마토그래피 (n-Hx:EtOAc = 3:1)로 정제한 후, 진공 펌프에서 건조시켜 표제 화합물을 흰색 고체로 수득하였다 (수율 45.52%).

¾ NMR (400 MHz, DMS0_d6) δ 8.18 (dᅳ 1H, J = 7.7 Hz), 7.70 (d, 1H, J = 3.9 Hz), 7.36 (d, 1H, J = 3.9 Hz), 7.18 - 7.09 (m, 2H), 6.89 (d, 1H, J = 8.3 Hz), 4.25 (s, 4H), 4.10 - 3.97 (m, 1H), 1.14 (d, 5H, J = 6.6 Hz); ¹³ C NMR (100 MHz, DMS0-d6) δ 160.5, 147.3, 144.2, 144.1, 138.8, 129.2, 127.1， 123.6, 119.2， 118.1， 114.5, 64.6, 64.5, 41.47, 22.8， 22.8； ESI (m/z) 304 (丽 +) 실시예 4: 5-(3， 4-디메특시페닐) -N-이소부틸티오펜 -2- 카르복스 드의 제조

5-클로로 -N-이소프로필티오펜— 2-카르복스아미드 대신 5-클로로 -N- 이소부틸티오펜 -2-카르복스아미드을 사용하는 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법을 사용하여 표제 화합물을 노란색 고체로 수득하였다 (수율 55.01%).

¾ NMR (400 MHz, DMS0-d6) δ 8.42 (t, 1H, J = 5.8 Hz), 7.72 (d, 1H, J - 3.9 Hz), 7.42 (d, 1H, J = 3.9 Hz), 7.23 - 7.17 (m, 2H), 6.98 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 3.82 (s, 3H), 3.77 (s, 3H) , 3.04 (t, 2H, J = 6.4 Hz), 1.87 - 1.73 (m, 1H), 0.87 (d, 6H, J = 6.7 Hz); ¹³ C NMR (100 MHz, DMS0-d6) δ 161.4, 149.6, 149.5, 147.9, 138.5, 129.2， 126.5, 123.6， 118.7， 112.6, 109.7, 56.0， 56.0， 47.0, 28.6， 20.6, 20.6； ESI (m/z) 320 (MH ⁺ ) 실시예 5: 5- (벤조 [d] [1,3]디옥솔 -5-일) -N-이소부틸티오펜 -2- 카르복스아미드의 제조

5-클로로 -N-이소프로필티오펜 -2-카르복스아미드 대신 5-클로로 -N- 이소부틸티오펜 -2-카르복스아미드을 사용하는 것을 제외하고는， 실시예 2와 동일한 방법을 사용하여 표제 화합물을 흰색 고체로 수득하였다 (수율 37.68%).

¾ NMR (400 MHz, DMS0-d6) δ 8.43 (t, 1H, J = 5.7 Hz), 7.70 (d, 1H, J = 3.8 Hz), 7.38 (d, 1H, J = 3.8 Hz), 7.27 (s, 1H), 7.15 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 6.95 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 6.05 (s, 2H), 3.04 (t, 2H, J = 6.4 Hz), 1.91 - 1.74 (m, 1H), 0.87 (d, 6H, J = 6.7 Hz); ¹³ C NMR (100 MHz, DMS0-d6) δ 161.4, 148.5， 147.9, 147.5, 138.7, 129.1, 127.9, 123.9, 120.1， 109.2, 106.4， 101.8， 47.0， 28.6, 20.6, 20.6； ESI (m/z) 304 (MH ⁺ ) 실시예 6: 5-(2,3-디하이드로벤조[1)][1，4]디옥신-6-일)-1^- 이소부 -2-카르복스아미드의 제조

5-클로로 -N-이소프로필티오펜 -2-카르복스아미드 대신 5—클로로 -N- 이소부틸티오펜 -2-카르복스아미드을 사용하는 것을 제외하고는， 실시예 3과 동일한 방법을 사용하여 표제 화합물을 흰색 고체로 수득하였다 (수율 37.11%).

¾ 匿 (400 MHz, DMS0-d6) δ 8.42 (t, 1H, J = 5.6 Hz), 7.70 (d, 1H, J = 3.8 Hz), 7.36 (d, 1H, J = 3.8 Hz), 7.16 (s, 1H), 7.13 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 6.89 (d, 1H, J = 8.3 Hz), 4.25 (s, 4H) , 3.04 (t, 2H, J = 6.3 Hz), 1.89 - 1.72 (m, 1H) , 0.87 (d, 6H, J = 6.6 Hz); ¹ C NMR (100 MHz, DMS0-d6) δ 161.4, 147.3， 144.2, 144.1, 138.7， 129.2, 127.1, 123.7, 119.3, 118.1, 114.5， 64.6, 64.5, 47.0, 28.6, 20.6, 20.6； ESI (m/z) 318 (MH ⁺ ) 실시예 7: 5-(3，4-디메톡시페닐) -N-페닐티오펜 -2-카르복스아미드의 제조

5-클로로 -N-이소프로필티오펜 -2-카르복스아미드 대신 5-클로로 -N- 페닐티오펜 -2-카르복스아미드를 사용하는 것을 제외하고는， 실시예 1과 동일한 방법을 사용하여 표제 화합물을 노란색 고체로 수득하였다 (수율 66.53%).

¾ NMR (400 MHz, DMS0-d6) δ 10.18 (s, 1H), 7.99 (d, 1H, J = 3.9 Hz), 7.73 (d, 2H, J = 8.0 Hz), 7.53 (d, 1H, J = 3.9 Hz), 7.34 (t, 2H, J = 7.8 Hz), 7.28 - 7.22 (m, 2H), 7.08 (t, 1H, J = 7.3 Hz), 7.00 (d, 1H, J = 8.3 Hz), 3.84 (s, 3H)， 3. ^' 78 (s, 3H); ¹³ C NMR (100 MHz, DMS0-d6) δ 160.1， 149.8， 149.5， 149.3, 139.2, 138.1, 130.6， 129.1, 129.1, 126.3, 124.1, 123.8, 120.7， 120.7, 118.8, 112.5, 109.7， 56.0, 56.0； ESI (m/z) 340 (MH ⁺ ), 362 (MNa ⁺ ) 실시예 8： 5- (벤조 [d] [1,3]디옥솔 -5-일) -N-페닐티오펜 -2- 카르복

5-클로로 -N-이소프로필티오펜 -2-카르복스아미드 대신 5-클로로 -N- 페닐티오펜 -2-카르복스아미드를 사용하는 것을 제외하고는, 실시예 2와 동일한 방법을 사용하여 표제 화합물을 흰색 고체로 수득하였다 (수율 15.66%).

¾ NMR (400 MHz, DMS0-d6) δ 10.18 (s, 1H), 7.97 (d, 1H, J = 3.9 Hz), 7.72 (d, 2H, J = 7.8 Hz), 7.49 (d, 1H, J = 3.9 Hz), 7.40 - 7.28 (m, 3H), 7.22 (dd, 1H, J _A = 8.1 Hz, J _B = 1.6 Hz), 7.09 (t, 1H, J = 7.3 Hz), 6.97 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 6.07 (s, 2H); ESI (m/z) 346 (顺 a ⁺ ) 실시예 9: 5-(2，3-디하이드로벤조[1)][1，4]디옥신-6-일)-1^ - 페닐티

5-클로로 -N-이소프로필티오펜— 2-카르복스아미드 대신 5-클로로 N- 페닐티오펜 -2-카르복스아미드를 사용하는 것을 제외하고는， 실시예 3과 동일한 방법을 사용하여 표제 화합물을 흰색 고체로 수득하였다 (수율 44.53%).

¾ NM (400丽 z, DMS0-d6) δ 10.18 (s, 1H), 7.97 (d, 1H, J = 3.7 Hz), 7.72 (d, 2H, J = 8.0 Hz), 7.47 (d, 1H, J = 3.7 Hz), 7.34 (t, 2H, J = 7.7 Hz), 7.22 (s, 1H), 7.19 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 7.08 (t, 1H, J = 7.2 Hz), 6.91 (d, 1H, J = 8.3 Hz), 4.26 (s, 4H); ¹³ C NMR (100 MHz, DMS0-d6) δ 160.1, 148.7, 144.4, 144.1, 139.1, 138.3, 130.6, 129.1， 129.1， 126.8, 124.1， 123.9, 120.7， 120.7, 119.4, 118.2, 114.7, 64.6, 64.5； ESI (m/z) 338 (丽 +)， 360 (丽 a ⁺ ) 실시예 10: 5- (벤조 [d][l, 3]디옥솔 -5-일) -N- (피리딘 -2-일)티오펜 -2- 카르복

5-클로로 -N-이소프로필티오펜 -2-카르복스아미드 대신 5-클로로 -N- (피리딘 -2-일)티오펜 -2-카르복스아미드를 사용하는 것을 제외하고는， 실시예 2와 동일한 방법을 사용하여 표제 화합물을 노란색 고체로 수득하였다 (수율 13.54%).

¾ NMR (400 MHz, DMS0-d6) δ 10.86 (s, 1H), 8.37 (d, 1H, J = 4.6 Hz), 8.18 (d, 1H, J = 4.0 Hz), 8.13 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 7.81 (t, 1H, J = 7.8 Hz), 7.47 (d, 1H, J = 3.9 Hz), 7.34 (s, 1H), 7.22 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 7.14 (t, 1H, J = 7.6 Hz), 6.97 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 6.07 (s, 2H); ¹ C NMR (100 MHz, DMS0-d6) δ 160.6, 152.3, 149.6, 148.5, 148.3, 148.2, 138.6, 137.7, 131.6, 127.6, 124.4, 120.4, 120.1， 115.0, 109.3, 106.5, 101.9； ESI (m/z) 325 (MH+), 347 (MNa ⁺ ) 실시예 11: 5- (벤조 [d] [1,3]디옥솔 -5-일) -N- (피리딘 -2- 일메틸)

5-클로로 -N-이소프로필티오펜 -2-카르복스아미드 대신 5-클로로 -N- (피리딘 -2-일메틸)티오펜 -2-카르복스아미드를 사용하는 것을 제외하고는， 실시예 2와 동일한 방법을 사용하여 표제 화합물을 흰색 고체로 수득하였다 (수율 24.12%).

¾ NMR (400 MHz, DMS0-d6) δ 9.12 (t, 1H, J = 5.9 Hz), 8.50 (d, 1H, J = 4.2 Hz), 7.78 (d, 1H, J = 3.9 Hz), 7.75 (td, 1H, , J _A = 7.8 Hz, J _B = 1.7 Hz), 7.42 (d, 1H, J = 3.9 Hz), 7.35 - 7.29 (m, 2H) , 7.25 (dd, 1H, J _A = 7.0 Hz, J _B = 5.2 Hz), 7.18 (dd, 1H, J _A = 8.1 Hz, J _B = 1.7 Hz), 6.96 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 6.06 (s, 2H) , 4.53 (d, 2H, J = 6.0 Hz); ¹³ C NMR (400 MHz, DMS0_d6) δ 161.6， 159.0, 149.3, 148.5, 148.0， 148.0, 138.0， 137.2, 129.7， 127.8, 124.1， 122.6, 121.5， 120.2， 109.3， 106.5， 101.9， 44.9； ESI (m/z) 339 (MH ⁺ ) 실시예 12: 5-(2，3-디하이드로벤조 [b][l,4]디옥신 -6-일) -N- (피리딘- 2-일메틸)티오펜 -2-카르복스아미드의 제조

5-클로로 -N-이소프로필티오펜 -2-카르복스아미드 대신 5-클로로 -N- (피리딘 -2-일메틸)티오펜 -2-카르복스아미드를 사용하는 것을 제외하고는, 실시예 3과 동일한 방법을 사용하여 표제 화합물을 흰색 고체로 수득하였다 (수율 59.09%).

¾ NMR (400 MHz, DMS0-d6) δ 9.11 (t, 1H, J = 6.0 Hz), 8.50 (d, 1H, J = 4.2 Hz), 7.78 (d, 1H, J = 3.9 Hz), 7.75 (td, 1H, ， J _A = 7.8 Hz, J _B = 1.7 Hz), 7.40 (d, 1H, J = 3.9 Hz), 7.31 (d, 1H, J = 7.8 Hz), 7.25 dd, 1H, J _A = 7.1 Hz, J _B = 5.1 Hz), 7.19 (d, 1H, J = 2.1 Hz), 7.15 (dd, 1H, J _A = 8.4 Hz, J _B = 2.2 Hz), 6.90 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 4.53 (d, 2H, J = 6.0 Hz), 4.26 (s, 4H); ¹³ C NMR (100 丽 z, DMSOd6) δ 161.6, 159.0， 149.3， 147.8, 144.3， 144.1, 138.0， 137.2, 129.7, 127.0, 123.9, 122.6, 121.5, 119.3， 118.2, 114.6， 64.6， 64.5, 44.9； ESI (m/z) 353 (MH+) 실시예 13: 2- (벤조 [d][l, 3]디옥솔 -5-일) -N-이소프로필티아졸 -5- 카르복

5-클로로 -N-이소프로필티오펜 -2-카르복스아미드 대신 2-클로로 -N- 이소프로필티아졸 -5-카르복스아미드를 사용하는 것을 제외하고는， 실시예 2와 동일한 방법을 사용하여 표제 화합물을 노란색 고체로 수득하였다 (수율 66.33%).

¾ NMR (400 MHz, DMS0-d6) δ 8.41 (d, 1H, J = 7.6 Hz), 8.35 (s, 1H), 7.51 - 7.44 (m, 2H)， 7,01 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 6.10 (s, 2H), 4.10 - 3.96 (m, 1H), 1.15 (d, 6H, J = 6.6 Hz); ¹³ C NMR (100 MHz, DMS0-d6) δ 169.9, 159.2, 150.0， 148.5, 143.8, 135.5, 127.4, 121.8, 109.3, 106.5, 102.3, 41.6， 22.7, 22.7； ESI (m/z) 291 (MH ⁺ ) 실시예 14: 2-(2，3-디하이드로벤조 [b][l,4]디옥신 -6-일) -N- 이소프로필티아졸 -5-카르복스아미드의 제조

5-클로로 -N-이소프로필티오펜 -2—카르복스아미드 대신 2-클로로 -N- 이소프로필티아졸 -5-카르복스아미드를 사용하는 것을 제외하고는， 실시예 3과 동일한 방법을 사용하여 표제 화합물올 흰색 고체로 수득하였다 (수율 65.40%).

¾ NMR (400 MHz, DMS0-d6) δ 8.41 (d, 1H, J = 7.6 Hz), 8.35 (s, 1H), 7.44 - 7.40 (m, 2H), 6.95 (d, 1H, J = 7.9 Hz), 4.28 (s, 4H)， 4.13 - 3.94 (m, 1H), 1.15 (d, 6H, J = 6.6 Hz); ¹³ C NMR (100 MHz, DMS0-d6) δ 169.8, 159.3, 146.3, 144.1, 143.9, 135.5, 126.5, 120.3， 118.2, 115.2, 64.8， 64.5, 41.6, 22.7, 22.7； ESI (m/z) 305 (MH ⁺ ) 실시예 15: 2- (벤조 [d] [1，3]디옥솔 -5-일) -N-이소부틸티아졸 -5- 카르복스아미드의 제조

5-클로로 -N-이소프로필티오펜 -2-카르복스아미드 대신 2-클로로 -N- 이소부틸티아졸 _ ₅ _카르복스아미드를 사용하는 것을 제외하고는， 실시예 2와 동일한 방법을 사용하여 표제 화합물을 흰색 고체로 수득하였다 (수율 58.92%). ¾ NMR (400 MHz, DMS0-d6) δ 8.64 (t, 1H, J = 5.8 Hz), 8.36 (s, 1H), 7.53 - 7.45 (m, 2H) , 7.01 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 6.10 (s, 2H) , 3.05 (t, 2H, J = 6.4 Hz), 1.88 - 1.70 (m, 1H), 0.87 (d, 6H, J = 6.7 Hz); ¹³ C NMR (100 MHz, DMS0-d6) δ 170.0， 160.1, 150.0， 148.5, 143.8， 135,3； 127.4, 121.8, 109.3, 106.5, 102.3， 47.0, 28.6， 20.6, 20.6； ESI (m/z) 305 (MH ⁺ ) 실시예 16: 2-(2，3-디하이드로벤조[1][1,4]디옥신-6-일)-^ 이소부 -5-카르복스아미드의 제조

5-클로로 -N-이소프로필티오펜 -2-카르복스아미드 대신 2-클로로 -N- 이소부틸티아졸 -5-카르복스아미드를 사용하는 것을 제외하고는， 실시예 3과 동일한 방법을 사용하여 표제 화합물을 흰색 고체로 수득하였다 (수율 65.87%).

Ή 匿 (400 MHz, DMS0-d6) δ 8.63 (t, 1H, J = 5.8 Hz), 8.36 (s

1H), 7.45 - 7.38 (m, 2H)， 6.95 (d, 1H, J = 8.6 Hz), 4.28 (s, 4H)， 3.05 (t, 2H, J = 6.4 Hz), 1.86 - 1.73 (m, 1H), 0.87 (d, 6H, J = 6.7 Hz); ¹³ C NMR (100 MHz, DMS0-d6) δ 169.9, 160.1, 146.3, 144.1， 143.9, 135.3, 126.5, 120.3, 118.3, 115.2, 64.8, 64.5, 47.0， 28.6, 20.6， 20.6； ESI (m/z) 319 (MH ⁺ ) 실시예 17: 2- (벤조 [d] [1，3]디옥솔 -5-일) -N-페닐티아졸 -5- 카르

5-클로로 -Ν [·-이소프로필티오펜 -2-카르복스아미드 대신 2-클로로 -N- 페닐티아졸 _ ₅ _카르복스아미드를 사용하는 것을 제외하고는， 실시예 2와 동일한 방법을 사용하여 표제 화합물을 노란색 고체로 수득하였다 (수율 75.82%).

¾ NMR (400 MHz, DMS0-d6) δ 10.39 (s, 1H), 8.59 (s, 1H)ᅳ 7.70 (d, 2H, J = 7.8 Hz), 7.55 (dd, 1H, J _A = 8.1， J _B = 1.7 Hz), 7.52 (d, 1H, J = 1.5 Hz), 7.35 (t, 2H, J = 7.9 Hz), 7.11 (t, 1H, J = 7.4 Hz), 7.03 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 6.12 (s, 2H); ¹³ C NMR (100 MHz, DMS0-d6) δ 170.9, 158.9, 150.2， 148.6, 144.9, 138.8, 135.2, 129.1， 129.1, 127.2， 124.4, 122.0， 120.8, 120.8， 109.3, 106.6, 102.3； ESI (m/z) 325 (MH ⁺ ) 실시예 18: 2-(2,3-디하이드로벤조[1)][1,4]디옥신-6-일) - 페닐티아졸 -5-카르복스아미드의 제조

5-클로로 -N-이소프로필티오펜ᅳ2-카르복스아미드 대신 2-클로로 -N- 페닐티아졸 -5-카르복스아미드를 사용하는 것을 제외하고는， 실시예 3과 동일한 방법을 사용하여 표제 화합물을 노란색 고체로 수득하였다 (수율 45.13%).

¾ NMR (400 MHz, DMS0-d6) δ 10.39 (s, 1H), 8.59 (s, 1H), 7.70 (d, 2H, J = 7.9 Hz), 7.51 - 7.45 (m, 2H), 7.35 (t, 2H, J = 7.8 Hz), 7.11 (t, 1H, J = 7.3 Hz), 6.98 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 4.29 (s, 4H); ¹³ C NMR (100 MHz, DMS0-d6) δ 170.8, 158.9, 146.5, 145.0， 144.2, 138.8, 135.2, 129.1， 129.1, 126.4, 124.4, 120.8, 120.8, 120.4, 118.3, 115.3, 64.8, 64.5； ESI (m/z) 339 (MH ⁺ ), 337 (MH— ) 실시예 19: 메틸 5- (벤조 [d] [1,3]디옥솔 -5-일)티오펜 -2- 카르복실레이트의 제조

1，2-디메톡시에테인 (4 mL), 2차 증류수 (1 mL)에 메틸 5_ 클로로티오펜 -2-카르복실레이트 (176 mg, 0.996 誦 ol), 벤조 [d] [1,3]디옥솔- 5-일보론산 (248.03 mg, 1.495 隱 ol), 탄산나트륨 (633/70 mg, 5.979 隱 ol) 및 팔라디움 (π) 아세테이트 (34.97 mg, 0.05 腿 ol)를 첨가 후， 초음파와 함께 120 ^° C에서 200분 동안 교반하였다. 디클로로메테인으로 3번에 걸쳐 추출했다. 추출한 용액을 무수황산마그네슘으로 탈수하고 유기 용매를 감압 농축하고， 플래쉬 컬럼 크로마토그래피 (n-Hx:Et0Ac = 3:1)로 정제한 후， 진공펌프에서 건조시켜 표제 화합물을 흰색 고체로 수득하였다 (수율 27.47%).

¾ NMR (400 MHz, DMS0-d6) δ 7.74 (d, 1H, J = 5.2 Hz), 7.48 (d 1H, J = 3.2 Hz), 7.35 (s, 1H), 7.23 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 6.97 (d, 1H J = 8.0 Hz), 6.07 (s, 2H), 3.81 (s, 3H) 실시예 20: 2- (벤조 [d] [ 1， 3]디옥솔 -5-일 )티아졸 -5- 카르복

1,2-디메록시에테인 (4 mL), 2차 증류수 (1 mL)에 에틸 2- 브로모티아졸 -5-카르복실레이트 (200 mg, 0.847 隱 ol), 벤조 [d] [1,3]디옥솔- 5-일보로닉에시드 (210.86 mg, 1.271 隱 ol), 탄산나트륨 (538.73 mg, 5.083 画 ol) 및 팔라디움 (π) 아세테이트 (27.73 mg, 0.042 mmol)를 첨가 후， 초음파와 함께 120 ^° C에서 200분 동안 교반하였다. 디클로로메테인으로 3번에 걸쳐 추출했다. 추출한 용액을 무수황산마그네슴으로 탈수하고 유기 용매를 감압 농축하고 ^' ， 플래쉬 컬럼 크로마토그래피 (n-Hx:Et0Ac = 3:1)로 정제한 후， 진공펌프에서 건조시켜 표제 화합물을 흰색 고체로 수득하였다 (수율 Ή NMR (400 MHz, DMS0-d6) δ 8.40 (s, 1H), 7.57 (dd, 1H, J _A = 8.1 Hz, J _B = 1.5 Hz), 7.52 (d, 1H, J = 1.4 Hz), 7.04 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 6.12 (s, 2H), 4.31 (q, 2H, J = 7.1 Hz), 1.29 (t, 3H, J = 7.1 Hz); ESI (m/z) 278 (MH ⁺ ) 실험예 1 ： 아토파지 (autophagy) 활성화효과

1) 아토파지 (autophagy) 활성화 방법

Primary hepatocyte는 공지의 방법 (Gastroenterology 2011， 141, 2188)인 collagenase per fusion법에 따라 male C57BL/6 mice에서 분리하였다. 분리된 세포의 생존율은 trypan blue exclusion법으로 즉정하였다. Autophagy^- ischemia와 reper fusion 방법으로 유도되었다 (Gastroenterology 2011, 141， 2188). 구체적으로， ischemia를 유도하기 위하여 hepatocyte를 37 ^° C Krebs- Ringer-HEPES(KRH) 완층액 (pH 6.2)에서 anaerobic chamber에서 2시간 동안 배양하였다. 각 hepatocyte들은 DMS0, 상기 실시예에서 제조한 화합물 또는 대조 물질인 Rapamycin으로 처리한 후 pH 7.4의 KRH 완충액을 aerobic 조건에서 1시간 동안 처리하여 Reperfusion이 유도되었다. 이후， hepatocyte 세포를 단백질 분해 효소 저해제 칵테일 (Roches)을 함유한 추출 완충액 (0.5% triton X-100, 1 mM Na3V04 등을 함유한 PBS 용액)으로 용해시킨 후， 소니케이션 (sonication)하여 DNA를 조각내었다. 단백질량은 소혈청알부민 (bovine serum albumin)을 표준으로 하여 Bio-Rad 사의 protein assay kit(Cat No. 500-0002)를 이용하여 측정하였다. 세포 총 단백 10~50yg을 0.1% SDS를 함유한 8~12%(w/v) 폴리아크릴아마이드 겔 (polyacrylamide gel)에서 전기영동한 후에 겔에 존재하는 단백질을 일렉트로블로팅 (electrobloUing) 방법으로 PVDF 멤브레인에 옮긴 후， 비특이적인 결합을 차단하기 위하여 PVDF 멤브레인을 5 ^< ¾ 탈지분유를 함유한 TBS-tween(tris-buffered sal ine-tween, Sigma 사) 용액에 넣고 실온에서 1시간 동안 반웅시켰다. 필터를 LC3 단백질에 대한 항체 (Cell signaling)를 함유한 TBS-tween 용액에 넣고 4 ^° C에서 12시간 동안 방치한 후에 HRP(horseradi sh peroxidase , Sigma 사， Cat No . P0889)로 표지된 2차 항체로 표지하였으며， ECL( Enhanced chemi luminescence , Thermo scient i f i c 사ᅳ Cat No . 34080)을 이용하여 밴드들을 측정하였다. 2) 아토파지 (autophagy) 활성화측정 결과

Autophagy의 유도는 특이적인 LC3-I I 분자의 증가로 확인할 수 있다. LC3 전구체들은 평상시 세포질에 흩어져 존재하며， proteolyt ic cleavage되어 LC3-I의 형태로 존재한다. Autophagy가 활성화되면 C_ terminal glycin이 modi f i cat ion되어 ΙΧ3-Π가 형성되고 autophagosome으로 이동하여 puncta 형태로 분포하게 된다. 상기 측정한 결과를 하기 표 1에 나타내었다. 화합물 처리에 의하여 증가된 LC3-I I의 양은 band densi ty를 측정하여 정량화 하였으며， 대조물질로 사용한 rapamycin 처리에 의한 LC3-I I 증가량과 상대 비교한 값을 표에 나타내었다. 즉， 대조물질로 사용한 Rapamycin ^' 과 동일한 정도의 autophagy 유도능인 경우는 1， rapamycin보다 autophagy 유도능이 우수한 경우 1보다 큰 값， 그리고 rapamycin 대비 autophagy 유도능이 미약한 경우는 1보다 작은 값으로 표시하였다.

【표 1】

상기 표 1에 나타난 바와 같이， ischemia와 reperfusion 모델에서 대조물질로 사용한 rapamycin 처리에 의하여 hepatocyte는 autophagy가 유도됨을 LC3-II증가로 확인할 수 있었다. 또한， 본 발명에 따른 화합물들이 대조물질로 사용한 rapamycin에 비하여 2배 이상의 LC3-II의 증가를 나타내었다. 따라서， 본 발명에 따른 화합물들이 rapamycin보다 우수한 autophagy유도능이 있음을 알수 있다. - 또한, 도 1 및 도 2는 autophagy 유도능이 우수한 몇몇 화합물의 western immunoblott ing 결과를 나타낸 것이다. 도 1 및 도 2와 같이， hepatocyte는 ischemia와 reperfusion 모델에서 실시예 1 및 5의 화합물 처리에 의하여 autophagy 유도가 현저히 증가됨을 LC3-II증가로 확인할 수 있었다. 실험예 2: mTOR효소 활성 억제 효과

1) mTOR효소 활성 측정 방법

상기 실험예 1에서 얻은 세포 파쇄액을 이용하여 western i隱 unoblotting을 수행하였다. 전기영동하고 일렉트로블로팅 (electroblotting) 방법으로 얻은 PVDF 멤브레인을 mTOR 또는 p-mT0R(Ser 2448) 단백질에 대한 항체 (Cell Signal ing)를 함유한 TBS- tween 용액에 넣고 4 ^° C에서 12시간 동안 방치한 후에 HRP( horseradish peroxidase, Sigma 사， Cat No. P0889)로 표지된 2차 항체로 표지하였으며， ECL(Enhanced chemi luminescence, Thermo scientific 사, Cat No. 34080)을 이용하여 밴드들을 측정하였다. 2) mTOR효소 활성 측정 결과

상기 측정 결과를 도 3에 나타내었다. mTOR는 autophagy를 조절하는 주요 단백질 중의 하나로 알려져 있다. mTOR는 정상 상태에서 autophagy를 저해하는 작용을 하고 있으나 _ser i _n e 2448 위치의 인산화는 이러한 mTOR의 기능을 저해하여 결과적으로 autophagy가 활성화된다. 도 3에 나타난 바와 같이， hepatocyte는 ischemia와 reperfusion 모델에서 실시예 1의 화합물 처리에 의하여 mTOR의 2448번 위치에 인산화가 현저히 억제됨을 확인할 수 있다. 실험예 3: 급성 간손상유도모델에서의 효과

급성 간손상에 의한 간섬유화를 유도한 동물모델에서 자가소화작용 활성제 (Autophagy act ivator)의 간손상 억제 효과를 확인하고자 하였다. 급성 간손상 억제 효과를 확인하기 위해 C57BL/6 마우스에 사염화탄소 (carbon tetrachloraide , CC1 ₄ )를 투여하여 급성 간손상 유도 후 본 발명에 따른 화합물을 투여하여 간손상을 억제하는지 확인하였다.

1) 실험 방법

5주령의 암컷 C57BL/6 마우스를 도입하여 1주 순화 후 각각 정상 대조군， 사염화탄소 투여군， 본 발명에 따른 화합물 (실시예 1， 2， 5 및 7)을 투여하는 그룹으로 총 6그룹으로 나누었다. 본 발명에 따른 화합물 각각을 옥수수 기름에 녹여 50 mg/kg 몸무게 용량으로 12시간 간격으로 총 3회 구강 투여하였다. 마지막으로 구강 투여한 시점에서 30분이 지난 후， 사염화탄소를 5 mL/kg 몸무게 용량으로 복강 투여하여 24시간 후 부검하였다. 부검시 간을 적출하여 고정한 후， 조직 표본을 제작하였다. 슬라이드 제작후 H&E 염색을 수행하여 현미경으로 간손상을 확인하였다.

2) 실험 결과

사염화탄소에 의해 유도된 급성 간손상은， 간문맥 인접부위에서 간세포들의 괴사가 특징적이며 손상된 간 세포내에. 지방소립이 축적되어 있는 것을 관찰할 수 있다. 실험 동물에서 사염화탄소 및 본 발명에 따른 화합물 4종 투여 후 부검하여 간 조직표본 제작하여 H&E 염색을 통해 간손상을 및 자가소화작용 활성제의 간손상 억제 효능을 확인하였다 (도 4) . 도 4에 나타난 바와 같이， 사염화탄소만 투여한 그룹에서 간문맥 인접부위에 위치한 간세포들의 괴사를 확인하였으며， 손상된 간세포내 지방소립이 관찰되는 것으로 보아 사염화탄소에 의해 급성 간손상이 유도된 것을 확인하였다. 본 발명에 따른 실시예 1 및 5를 투여한 그룹에서는 간손상이 확연히 회복되는 것을 관찰하였으며， 실시예 2 및 7을 투여한 그룹에서는 간손상의 회복 효과가 상대적으로 적었다. 또한, 부검시 간손상 유뮤를 육안으로 확인하였으며 모든 그룹들의 간에서 형태학적 이상이 관찰되지 않았다 (도 5) . 실험예 4: 간섬유화유도모델에서의 효과

만성 간손상에 의한 간섬유화 억제 효과를 확인하기 위해 티오아세트아마이드 (thioacetamide , TAA)를 C57BL/6 마우스에 투여하여 만성 간손상을 유발시켜 간섬유화를 유도 후 본 발명에 따른 화합물을 투여하여 만성 간손상을 억제하는지 확인하였다.

1) 실험 방법

5주령의 암컷 C57BL/6 마우스를 도입하여 1주 순화 후 각각 정상 대조군， 티오아세트아마이드 투여군, 본 발명에 따른 화합물 (실시예 2， 5 및 7)을 투여하는 그룹으로 총 5그룹으로 나누었다. 티오아세트아마이드를 인산 완충 식염수에 녹여 200 mg/kg 몸무게로 1주에 3회로， 총 6주간 복강 투여하였다. 본 발명에 따른 화합물 3종은 마지막 6주째에 옥수수 기름에 녹여 50 mg/kg 몸무게 용량으로 1일 1회 총 8일간 구강 투여하였다. 마지막 구강 투여 시점에서 24시간 후， 부검하여 간 적출 및 고정 후 조직 표본을 제작하였다. 조직 표본으로 슬라이드 제작 후 H&E 염색을 시행하여 현미경하에서 간조직 손상 및 간조직내 염증 세포 침윤을 확인하였다. 또한 Masson' s Tr i chrome 염색을 시행하여 현미경으로 간조직내 콜라겐 침착을 확인하였다.

2) 실험 결과

조직학적으로 간섬유화는 간조직내 모세혈관망에 콜라겐이 침착되며 주로 간의 중심 정맥을 둘러싼 소엽의 형태로 침착된다. 이는 Masson' s Tr i chrome 염색법을 이용하여 관찰할 수 있다. 티오아세트아마이드 및 본 발명에 따른 화합물을 투여한 후 부검시 간 손상 유뮤를 육안으로 확인하였다. 형태학적으로 대조군의 간은 표면이 매끄럽고 이상이 관찰되지 않는 반면 티오아세트아마이드에 의해 간 손상이 유도된 모든 그룹들은 간의 표면에서 미세결절들이 관찰되며 간의 크기는 모두 유사하였다 (도 6) . 6주간의 티오아세트아마이드 투여에 의해 간섬유화가 유도되었음을 Masson' s Tr i chrome 염색으로 현미경 관찰하여 확인하였으며 본 발명에 따른 화합물의 투여에 의해 섬유화가 완화된 것을 확인하였다 (도 7) . 특히， 본 발명에 따른 실시예 2 및 5에 의해 섬유화가 확연히 완화된 것을 관찰하였다 (도 7) . 또한， 섬유화에서 중요한 역할을 하는 염증세포들의 침침윤이 본 발명에 따른 화합물을 처리함에 따라 줄어드는 결과를 관찰하였다 (도 8) . 실험예 5: 간섬유화유도모델에서의 효과

만성 간손상에 의한 간섬유화 억제 효과를 확인하기 위해 사염화탄소를 C57BL/6 마우스에 투여하여 만성 간손상을 유발시켜 간섬유화를 유도 후 본 발명에 따른 화합물을 투여하여 만성 간손상을 억제하는지 확인하였다. 1) 실험 방법

5주령의 암컷 C57BL/6 마우스를 도입하여 1주 순화 후 각각 정상 대조군， 사염화탄소 투여군， 본 발명에 따른 화합물 (실시예 1 및 5)을 투여하는 그룹으로 총 4그룹으로 나누었다. 사염화탄소를 옥수수 기름에 녹여 0.8 mL/kg 몸무게 용량으로 1주에 2회로， 총 8주간 복강 투여하였다. 본 발명에 따른 화합물 마지막 8주째에 옥수수 기름에 녹여 50 mg/kg 몸무게 용량으로 1일 1회 총 8일간 구강 투여하였다. 마지막 투여 시점에서 24시간 후 부검하여 간 적출 및 고정 후 조직 표본을 제작하였다. 조직 표본으로 슬라이드 제작 후 H&E 염색을 시행하여 현미경하에서 간조직 손상 및 간조직내 염증세포 침윤을 확인하였다. 또한 Masson ' s Tr i chrome 염색을 시행하여 현미경으로 간조직내 콜라겐 침착을 확인하였다. 2) 실험 결과

사염화탄소 및 자가소화작용 활성제 투여 후 부검시 간 손상 유뮤를 육안으로 확인하였다. 형태학적으로 대조군의 간은 표면이 매끄럽고 이상이 관찰되지 않는 반면， 사염화탄소에 의해 간 손상이 유도된 모든 그룹들은 간의 표면에서 미세결절들이 관찰되며 간의 크기는 모두 유사하였다 (도 9) .

8주간의 사염화탄소 처리에 의해 간섬유화가 유도된 것을 간 조직 슬라이드 절편에서 Masson ' s Tr i chrome 염색으로 확인하였으며 본 발명에 따른 화합물 (실시예 1 및 5)의 투여에 의해 섬유화가 완화된 것을 확인하였다 (도 10) . 또한 실시예 1을 처리한 그룹에서 실시예 5를 처리한 그룹에 비해 콜라겐의 침착이 더 적은 것으로 보아， 상대적으로 실시예 1의 효과가 더 큰 것을 확인하였다 (도 10) . 실험예 6: 간섬유화유도모델에서의 효과

만성 간손상에 의한 간섬유화 억제 효과를 확인하기 위해 Sprague

Daw ley (SD) 래트에서 담관결찰 (bi le duct l igat ion, BDL)을 수행하여 만성 간손상 유발시켜 간섬유화를 유도 후 본 발명에 따른 화합물을 투여하여 만성 간손상을 억제하는지 확인하였다. 1) 실험 방법

7주령의 암컷 SD 래트를 도입하여 1주 순화 후 각각 대조군， 담관결찰 시술군， 담관결찰 시술 및 본 발명에 따른 화합물 (실시예 1)의 3가지 용량 ( 12.5， 25， 50 mg/kg 몸무게) 투여군으로 총 5그룹으로 나누었다. 대조군은 개복 후 담관을 노출시키나 결찰은 하지 않고， 나머지 그룹은 담관결찰을 시술하였다. 담관결찰 1주 후 본 발명에 따른 화합물 (실시예 1)을 옥수수 기름에 녹여 각 용량별로 1일 1회 총 14일간 구강 투여하였다. 마지막 투여 시점에서 24시간미 지난 후， 부검하여 간 적출 및 고정 후 조직 표본을 제작하였다. 조직 표본으로 슬라이드 제작 후 Masson' s Tr i chrome 염색올 시행하여 현미경으로 간조직내 콜라겐 침착을 확인한다. 또한 적출한 간의 일부 (10 mg)를 분해하여 콜라겐의 주요 성분언 히드록시프를린 정량 실험을 시행하여 침착된 콜라겐의 양을 정량화하여 본 발명에 따른 화합물의 효과를 확인하였다.

2) 실험 결과

담관결찰 시술 및 본 발명에 따른 화합물 투여 후， 부검시 간 손상 유무를 육안으로 확인하였다. 형태학적으로 대조군의 간은 표면이 매끄럽고 이상이 관찰되지 않는 반면, 담관결찰에 의해 간 손상이 유도된 모든 그룹들은 간의 표면에서 미세결절들이 관찰되며 대조군에 비해 크기가 커진 것을 확인하였다 (도 11) . 담관결찰만 시술한 그룹과 담관결찰 시술 및 본 발명에 따른 화합물을 처리한 그룹들과 유의한 차이는 없었다 (도 11) . 담관결찰에 의해 간손상과 섬유화가 유도된 것을 간조직 슬라이드 절편에서

Mas son' s Tr ichrime 염색으로 확인하였으며 본 발명에 따른 화합물을 투여함에 따라 증심정맥 주변에서 진행된 간섬유화가 완화되는 것을 확인하였다 (도 12) . 이와 유사하게 간조직 내에 침착된 콜라겐의 양을 정량적으로 측정하는 히드록시프를린 정량 실험을 시행한 결과， 본 발명에 따른 화합물 (실시예 1)의 용량이 높을수록 콜라겐의 침착이 감소하는 것을 확인하였다 (도 13) . 또한 본 발명에 따른 화합물을 처리한 모든 그룹에서 간문맥에 인접한 손상된 간세포들의 수가 처리하지 않은 그룹에 비해 현저히 줄어든 것으로 보아 조직학적으로 간손상이 완화된 것으로 확인하였다 (도 11) .