本発明におけるYNU嫌気培地は、表1に示す 組成からなる培地であり、嫌気性細菌の培養 に適した培地である。各試薬は、通常市販さ れているものを用いることができる。例えば 、日本製薬社製のカゼインペプトン、和光純 薬工業社製のDried Yeast Extract-S、純正化学社� ��のL-システイン塩酸塩―水和物、純正化学� �製のメルカプト酢酸、及び、和光純薬工業� �製のD(+)-グルコースを用いることができる。 グルコースの濃度は、培養条件等により、適 宜決定することができる。また、カゼインペ プトンに代えて、カザミノ酸を用いてもよい 。

 本発明のクロストリジウム属菌、特にク� ��ストリジウム・ペルフリンゲンスは、YNU嫌� ��培地で、47℃、pH6.0の条件で回分培養するこ とにより、グルコースを基質として、1Lの培� ��液で1時間当たり60mmol以上の水素を生産する ことを特徴とする水素発生菌である。50℃前� ��で水素生産を行うことにより、30~38℃の場� �よりも、水素発酵の反応速度が速くなり、� �り効率よく水素を生産できると考えられる� �めである。また、水素生産速度が、1Lの培養 液で1時間当たり60mmol以上であるような、水� �生産能の優れた水素発生菌であれば、多種� �様な物質を含むバイオマスを生成源とした� �合であっても、従来に無く大量の水素を生� �することができるためである。水素生産能� �、水素生産速度として、1Lの培養液で1時間� �たり60mmol以上であれば、特に限定されない� �、80mmol以上であることが好ましく、100mmol以� ��であることが特に好ましい。

 本発明のクロストリジウム属菌は、例え� ��以下の方法により得ることができる。まず� ��自然界から採取した試料から菌株を分離し� ��該菌株の中から、50℃前後の温度条件にお� �て、水素生産速度として、1Lの培養液で1時� �当たり60mmol以上である水素生産能を有する� �株を選択することにより、本発明のクロス� �リジウム属菌を得ることができる。

 以下、さらに詳細に説明する。
1.菌株の取得
 下水排水等から採取した液や泥等の試料を� ��表2に示す組成のABCM半流動培地(栄研化学株� ��会社製)の高層培地に植え付けた後、50℃の� ��温槽で培養してガス発生の活発な試料を選� ��した。該選別した試料を、ABCM寒天培地(栄� �化学株式会社製)に塗布し、50℃で嫌気培養� �てコロニーを得た。さらに該コロニーから� �菌した菌を、同様に嫌気培養することによ� �、純粋単離された菌株を得た。該純粋単離� �れた菌株を、YNU嫌気培地に植え付け、50℃の 恒温槽でさらに培養することにより、ガスを 活発に生産する菌株を選別した。さらに、該 選別した菌株の中から、水素生産能が、水素 生産速度として、1Lの培養液で1時間当たり60m mol以上である菌株を選別し、このうち1株をHN 001と名付け、水素生産能についてさらに詳細 に検討した。なお、水素生産速度は後記実施 例1に記載の方法で行った。

2.HN001株の同定及び生化学的性状
 HN001株の遺伝学的性質を調べるため、HN001株 の16S rDNAの塩基配列を常法により同定した。 該塩基配列を配列表の配列番号1に示す。国� �塩基配列データベース(GenBank/DDBJ/EMBL)上で、� ��塩基配列について相同性検索を行ったとこ� ��、クロストリジウム・ペルフリンゲンス AT CC 13124と98%の相同性を有していた。従って、 HN001株はクロストリジウム・ペルフリンゲン� ��に属する微生物と推定された。

 さらに、偏性嫌気性菌の同定キットであ� ��アピケンキAPI20A(ビオメリューS.A.社製、輸� �販売元:日本ビオメリュー社製)を用いて、製 造者のマニュアルに従い、HN001株の生化学的� ��状を調べた。具体的には、基質が含有され� ��いる各チューブに、HN001株の菌浮遊液を分� �し、24時間嫌気培養する。その後、各チュー ブの色調変化から、アポラボソフト(ビオメ� �ューS.A.社製)を用いて、HN001株の糖分解能等� ��判断した。

 表3は、アピケンキAPI20Aを用いた独立した 5回の実験の、アポラボソフトによる解析結� �をまとめたものである。表には、各菌株の� �待される測定結果も併せて記載した。表中� �段は、各チューブに含有されている基質を� �している。INDはトリプトファン、UREは尿素� �GLUはブドウ糖、MANはマンニット、LACは乳糖� �SACは白糖、MALは麦芽糖、SALはサリシン、XYL� �キシロース、ARAはアラビノース、GELはゼラ� �ン、ESCはエスクリンクエン酸鉄、GLYはグリ� �リン、CELはセロビオース、MNEはマンノース� �MLZはメレジトース、RAFはラフィノース、SOR� �ソルビット、RHAはラムノース、及びTREはト� �ハロースをそれぞれ示している。

 この結果、HN001株は、クロストリジウム� �ペルフリンゲンスと同様に、グルコース分� �能、スクロース分解能、マルトース分解能� �及びマンノース分解能を有していた。一方� �HN001株は、公知のクロストリジウム・ペルフ リンゲンスと異なり、ラフィノース分解能を 有していたが、ラクトース分解能及びトレハ ロース分解能を有していなかった。アポラボ ソフトによる判定では、HN001株は、生化学的� ��状においては、クロストリジウム・ペルフ� ��ンゲンスよりも、アクチノマイシス・ヴィ� ��コサス(Actinomyces viscosus)に近いと判断され� �。

 遺伝学的性質から、HN001株はクロストリ� �ウム・ペルフリンゲンス菌種であることが� �認された。また、相同性が98%であり、完全� �一致している既知微生物が検索されなかっ� �こと、及び、生化学的性状において、ラフ� �ノース分解能を有するが、ラクトース分解� �及びトレハロース分解能を有さなかったこ� �から、公知の菌株とは異なる性質を有する� �とが明らかである。

 そこで、出願人は、2007年2月23日に、HN001� ��を、独立行政法人製品評価技術基盤機構特� ��微生物寄託センター(〒292-0818日本国千葉県� ��更津市かずさ鎌足2-5-8)に、国内寄託(受託番 号:NITE P-318;原寄託)として寄託した。さらに� ��出願人は、2008年3月3日に、該原寄託につい� ��、同国際寄託機関にブダペスト条約上の国� ��寄託への移管申請を行い、2008年3月7日付で� ��寄託についての受託証(受託番号:NITE BP-318)� ��発行された。

3.増殖の至適温度
 クロストリジウム・ペルフリンゲンスHN001� �の増殖に対する温度の影響を調べるために� �32、37、41、44、47、及び50℃の各温度条件下� �培養した。
 具体的には、まず、クロストリジウム・ペ� ��フリンゲンスHN001株を、pH6.0のABCM半流動培� �の高層培地入りの試験管に植菌した後、30℃ で16時間嫌気培養したものを前培養液として� ��製した。350mLのpH6.0のYNU嫌気培地に、該前培 養液を8mLずつ、それぞれ添加した後、各温度 条件下でそれぞれ培養し、培養液中の菌体量 の経時変化を観測した。培養は、30rpmの攪拌� ��度で行った。また、培養液中の菌体量の測� ��は、各培養液を遠心処理することにより、� ��殿物として菌体を回収した後、該沈殿物の� ��燥重量を測定することにより行った。

 図1は、クロストリジウム・ペルフリンゲン スHN001株の増殖に対する温度の影響を表した� ��のである。図1Aは、各温度における乾燥菌� �重量の経時変化の測定結果を示した図であ� �。縦軸は培養液1L当たりの乾燥菌体重量(g/L)� ��あり、横軸は培養時間(h)である。◆が32℃� �件下、□が37℃条件下、△が41℃条件下、×� �44℃条件下、●が47℃条件下、及び、▲が50� �条件下の結果を示している。図1Bは、該測定 結果から、各温度における最大増殖速度を算 出した結果を表したものである。この結果か ら、クロストリジウム・ペルフリンゲンスHN0 01株の増殖温度は、44~47℃であることが好ま� �いことが明らかである。
 なお、クロストリジウム・ペルフリンゲン� ��HN001株は、51℃では増殖が確認されたが、53� ��では増殖が確認されなかった。この結果か� ��、クロストリジウム・ペルフリンゲンスHN00 1株は、32℃~51℃において増殖可能であること が分かった。

3.水素生産能の測定
 クロストリジウム・ペルフリンゲンスHN001� �を、16mLのABCM半流動培地の高層培地入りの試 験管に植菌し、30℃で16時間嫌気培養した。� �の後、高温に順化させるため、該試験管を45 ℃で30分間嫌気培養したものを前培養液とし� ��。該前培養液を、pH6.0のYNU嫌気培地、若し� �は、グルコース濃度を2.0%として調製したpH6. 0のYNU嫌気培地に、それぞれ植菌し、後記実� �例1と同様に、47℃で回分培養を行い、水素� �生産させた。生産された水素量を、後記実� �例1に記載の方法により測定し、水素収率(mol /mol-monosaccharide)と最大水素生産速度を算出し� ��。ここで、水素収率とは、1molの単糖から生 産された水素のモル数を示したものである。 また、最大水素生産速度は、培養液1L当たり� ��最大水素生産速度(mmol/Lh)と、該培養液中の� ��燥菌体重量1g当たりの最大水素生産速度(mmol /gh)の2種類で示した。

 得られたクロストリジウム・ペルフリン� ��ンスHN001株の水素収率及び最大水素生産速� �を、代表的な公知の水素発生菌と比較した� �該比較の結果を表4に示す。なお、HN001株以� �の菌株の水素収率等は、非特許文献1を元に� ��載したものである。文献上に対応するデー� ��が記載されていなかった箇所は空欄とした� ��

 クロストリジウム・ペルフリンゲンスHN00 1株は、47℃、pH6.0の条件で回分培養した場合� ��、水素収率が2.4であった。すなわち、1molの グルコースから2.4molの水素を生産することが できる菌株であった。また、培養液1L当たり� ��最大水素生産速度が、160mmol/Lhであり、培養 液中の乾燥菌体重量1g当たりの最大水素生産� ��度が、44mmol/ghであった。

 一方、表記載の他の菌株では、培養液1L� �たりの最大水素生産速度は、エンテロバク� �ー・アエロゲネスHU-101mAY-2の58mmol/Lhが最も速 く、培養液中の乾燥菌体重量1g当たりの最大� ��素生産速度は、エンテロバクター・クロア� ��エ(Enterobacter cloacae)IIT-BT08の29mmol/Lhが最も速 かった。文献値との比較であり、各実験条件 が異なることから、単純に比較することはで きないものの、クロストリジウム・ペルフリ ンゲンスHN001株は、公知の他の水素発生菌よ� ��も、最大水素生産速度が非常に速いことが� ��らかである。また、水素収率も十分に良好� ��ある。したがって、クロストリジウム・ペ� ��フリンゲンスHN001株、すなわち、本発明の� �ロストリジウム属菌は、公知の他の水素発� �菌よりも、はるかに優れた水素生産能を有� �ていることが明らかである。

 上記のことから、本発明のクロストリジ� ��ム属菌、特にクロストリジウム・ペルフリ� ��ゲンスとしては、YNU嫌気培地で、47℃、pH6.0 の条件で回分培養することにより、グルコー スを基質として、1Lの培養液で1時間当たり60m mol以上の水素を生産することを特徴とする水 素発生菌が用いられる。さらに、本発明のク ロストリジウム属菌の水素生産能は、水素生 産速度として、1Lの培養液で1時間当たり80mmol 以上であることがより好ましく、100mmol以上� �あることが特に好ましい。これら範囲の水� �生産能を有するクロストリジウム属菌を用� �ることにより、従来に無く効率よく水素を� �産することができる。

 また、本発明のクロストリジウム属菌は� ��上記培養条件において、その水素生産速度� ��1Lの培養液で1時間当たり60mmol以上であれば� ��その上限は特に限定されず、より高い水素� ��産速度を有している方が好ましいが、上述� ��方法により得られる本発明のクロストリジ� ��ム属菌は、通常、同条件下において、60~250m molの水素生産速度を有する。また、好ましい 該水素生産速度の範囲としては、80~200mmol、� �り好ましくは100~180mmol、最も好ましくは100~16 0mmolの範囲である。

4.水素生産の至適温度
 前記3.水素生産能の測定と同様に前培養液� �調製した。pH6.0又は6.5のYNU嫌気培地を350mL入� ��た500mL容のフラスコに、該前培養液を8mLず� �、それぞれ添加した後、後記実施例1と同様� ��、30rpmの攪拌速度で回分培養を行い、水素� �生産させた。培養温度は、41、44、47及び50℃ でそれぞれ行った。また、自動調節によって pHを一定に保った。生産された水素量を、後� ��実施例1に記載の方法により測定し、水素収 率と培養液1L当たりの最大水素生産速度を算� ��した。

 表5は、各培養温度における水素収率と培 養液1L当たりの最大水素生産速度を示したも� ��である。pH6.0とpH6.5のいずれにおいても、41� ��において最大水素生産速度は最も遅かった� ��、それぞれ59.8mmol/Lhと41.1mmol/Lhであった。こ れらの値は、他の培養温度における最大水素 生産速度に比較すると遅いものの、表4との� �較から明らかであるように、十分に良好な� �大水素生産速度である。したがって、クロ� �トリジウム・ペルフリンゲンスHN001株は、47~ 50℃において、良好に水素を生産し得ること� ��明らかである。

 また、表5より明らかであるように、最大 水素生産速度はpH6.0とpH6.5のいずれにおいて� �47℃で最速となり、水素収率はpH6.0とpH6.5の� �ずれにおいても50℃が最高となった。つまり 、クロストリジウム・ペルフリンゲンスHN001� ��、すなわち、本発明のクロストリジウム属� ��の水素生産は、47℃~50℃が最も適している� �とが明らかである。また、増殖の至適温度� �44~47℃であることから、増殖速度は、必ずし も水素生産速度と比例しないことがわかった 。

 本発明のクロストリジウム属菌は、下水� ��水等から採取した液や泥等、すなわちバイ� ��マス中に元々生息していた菌の中から、水� ��発生能、特に水素生産速度に優れた菌を選� ��して得られたものである。したがって、本� ��明のクロストリジウム属菌は、バイオマス� ��生成源とした場合においても、従来に無く� ��率よく、大量の水素を生産することができ� ��。

 本発明のクロストリジウム属菌は、通常� ��クロストリジウム属菌の培養に用いられて� ��る方法により、培養することができる。嫌� ��培養をすることが好ましい。回分培養(batch� �culture)であってもよく、連続培養(continuous cu lture)であってもよい。コンタミネーションの リスクが軽減され、かつ、特別な装置等も必 要ないため、少量の水素を生産させる場合に は、回分培養であることが好ましい。一方、 培養環境を常に一定に保ちやすく、生産性が 安定するため、工業的な生産等の大量に水素 を生産する場合には、連続培養であることが 好ましい。連続培養を行う場合には、本発明 のクロストリジウム属菌を、通常用いられて いる担体等に固定してもよい。

 本発明のクロストリジウム属菌の培養に� ��いられる培養液は、特に限定されるもので� ��なく、市販されている嫌気性細菌用の培地� ��の、通常、クロストリジウム属菌の培養に� ��いられている培養液を用いることができる� ��該培地として、例えば、ABCM半流動培地やYNU 嫌気培地がある。培養液のグルコースの濃度 は、培養条件等により、適宜決定することが できる。また、培養温度は本発明のクロスト リジウム属菌が培養可能な温度であれば特に 限定されるものではないが、44~47℃であるこ� ��が好ましい。

  本発明のクロストリジウム属菌を常法� �より培養することにより、効率よく水素を� �産することができる。水素生産時の培養液� �、通常、クロストリジウム属菌の培養に用� �られている培養液であれば、特に限定され� �ものではないが、YNU嫌気培地であることが� �ましい。また、本発明のクロストリジウム� �菌であれば、本発明の効果を損なわない限� �、生ごみ等の食品廃棄物その他産業廃棄物� �培養液の原料とすることもできる。このよ� �な原料を用いた場合であっても、本発明の� �ロストリジウム属菌によれば、従来にない� �率で水素を生産することができる。

 また、水素生産時の培養温度は、その水� ��生産効率の観点から、47~50℃であることが� �ましい。また、水素生産時の培養液のpHは、 特に限定されないが、5.8~6.5であることが好� �しく、6.0~6.2であることが特に好ましい。

 また、水素生産時の培養液又は当該発酵� ��地としての食品廃棄物等に含まれる糖成分� ��しては、本発明のクロストリジウム属菌に� ��る水素発酵の基質となるものであれば特に� ��定されないが、例えば、グルコース、マル� ��ース、スクロース等の単糖類、デンプン等� ��多糖類等が挙げられる。これら水素発酵の� ��質となる成分の濃度は、培養条件等により� ��適宜決定可能であるが、培養液中0.5~5重量%� ��あることが好ましく、1.5~2.5重量%であるこ� �がより好ましい。

さらに、水素生産時のその他培養条件は、 本発明の効果を損なわない限り特に限定され るものでもないが、上記培養温度、培養液等 の条件も含めて、水素生産速度が、60~250mmol/L ・h、好ましくは80~200mmol/L・h、さらに好まし� ��は100~180mmol/L・hとなる範囲で本発明のクロ� �トリジウム属菌を培養することが好ましい� �

 次に実施例を示して本発明をさらに詳細� ��説明するが、本発明は以下の実施例に限定� ��れるものではない。