NOUVELLES MOLéCULES MULTIMéRIQUES, LEUR PROCéDé DE PRéPARATION, ET LEUR UTILISATION POUR LA PRéPARATION DE MéDICAMENTS

L'invention a pour objet de nouvelles molécules multimériques, leur procédé de préparation, ainsi que leur utilisation pour la préparation de médicaments.

L'invention a également pour objet des molécules capables d'activer ou d'inhiber la réponse immunitaire.

L'importance du couple CD40/CD40L dans la réponse immunitaire a amené de nombreux groupes à utiliser des anticorps dirigés contre ces deux molécules à des fins thérapeutiques, de manière à inhiber ou activer le système immunitaire. L'administration d'anticorps anti-CD40L a donné des résultats encourageants dans le traitement de maladies auto-immunes comme l'encéphalomyélite allergique expérimentale murine (un modèle de la sclérose en plaques humaine) (Howard et al, 1999) ou dans le traitement de rejet d'allogreffes rénales chez les singes (Kirk et al., 1999). Dans ces deux cas, les anticorps ont inhibé une activité néfaste du système immunitaire. Inversement, l'utilisation d'anticorps anti~CD40 agonistes a permis d'une part, d'améliorer fortement la réponse à des vaccins anti-tumoraux peptidiques chez la souris (Diehl et al., 1999) et d'autre part, d'augmenter l'efficacité des cellules T CD4 ⁺ dans la lutte contre des tumeurs murines (Sotomayor et al., 1999 ; Lode et al., 2000). Une régression de tumeur dans des modèles murins a été mise en évidence après injection de cellules dendritiques (CDs) transformées par un adénovirus codant le CD40L (Kikuchi et al., 2000). Enfin, une activation des cellules dendritiques par l'interaction de leur molécule CD40 avec CD40L est capable de protéger des souris d'une infection par un parasite, Trypanosoma Cruzi (Chaussabel et al., 1999). Dans tous ces travaux, la valence particulière de la molécule CD40L, qui s'associe sous forme de trimère pour former avec le CD40 des complexes hexavalents, rend difficile la production d'anticorps fonctionnels capables d'interférer avec les fonctions du couple

CD40/CD40L. Le développement des adénovirus codant pour CD40L répond en partie à cet inconvénient. Cependant, leur utilisation n'est pas sans poser de problèmes chez l'homme. Enfin, la valence particulière du système rend difficile la découverte de molécules de synthèse capables d'interférer avec l'interaction CD40/CD40L.

L'invention a pour but de fournir des ligands multimériques conçus pour interférer dans des interactions protéine-protéine.

La présente invention a également pour but la préparation de molécules pouvant interférer avec des interactions multivalentes protéines-protéines. La présente invention a également pour but la préparation de molécules pouvant moduler l'activité des membres des familles du TNF et du TNF-R.

La présente invention a pour but de fournir une molécule de synthèse agissant sur le système CD40/CD40L.

La présente invention concerne un composé répondant à la formule suivante (I) :

dans laquelle :

- k et j représentent indépendamment l'un de l'autre 0 ou 1, - Y représente un macrocycle dont le cycle comprend de 9 à 36 atomes, et est fonctionnalisé par trois fonctions aminés permettant l'accrochage de Rc par sa fonction carboxylique C-terminale et par une chaîne permettant l'accrochage du bras espaceur Z via une liaison X,

- R ₀ représente un motif de liaison à un récepteur de la superfamille du TNF ₅ et de préférence correspond à une séquence dérivée d'un ligand, choisie parmi les résidus formant l'interface avec le récepteur du ligand, laquelle séquence est susceptible d' interagir avec le récepteur, ledit ligand étant choisi parmi les ligands de récepteurs de la superfamille du TNF, et notamment parmi les ligands suivants : EDA, CD40L, FasL, OX40L, AITRL, CD30L, VEGI, LIGHT, 4-1BBL, CD27L, LTa, TNF, LTβ, TWEAK, APRIL, BLYS, RANKL et TRAIL,

- X représente une fonction chimique permettant de relier le groupe Y au bras espaceur et est choisi parmi les fonctions suivantes :

thioether-2 thioether-3

(5') (6') (T) (8') ^a ' S' _b disulfure oxime-1 oxime-2 (9') (10') (H')

1,2,3-triazole 1,2,3-triazole 1,2,3-triazole 1,2,3-triazole

1 ,4-disubstitué- 1 1 ,4-disubstitué-2 1 ,5-disubstitué- 1 1 ,5-disubstitué-2 (12') (13') (14') (15')

a représentant la liaison avec le groupe Y et b représentant la liaison avec le groupe Z,

- Z représente un bras espaceur bi-, tri- ou tétrafonctionnel permettant la

R~Y — R _c dimérisation, trimérisation ou tétramérisation de | par la formation d'une liaison de type X, les bras espaceurs Z réponda Knt à l'une des formules suivantes : lorsque j ^ k = O :

* lorsque X représente un groupe de formule (1 '), (8'), (9'), (5'), (6'), (T), (13') et (15'), Z répond à l'une des formules suivantes :

_. --- _\ ^o O -(CH ₂ )Ii- m m étant un nombre entier variant de 1 à 40, n étant un nombre entier variant de 1 à 10,

* lorsque X représente un groupe de formule (2'), (3') et (4') , Z répond à l'une des formules suivantes :

H

O N-(CH ₂ )n—N

H m H ² H

* lorsque X représente un groupe de formule (12') et (14') , Z répond à l'une des formules suivantes :

m et n étant tels que définis ci-dessus, p étant un nombre entier variant de 1 à 6, u étant un nombre entier variant de 1 à 4,

W représentant un groupe de formule ou un groupe de formule ^/ _] τ'a'

O le groupe W se liant au groupe NH via la liaison en pointillés a',

* lorsque X représente un groupe de formule (1 '), (2')» (8'), (9'), (5'), (6'), (7'), (10'), (11 '), (13') et (15'), Z répond à l'une des formules suivantes :

m et n étant tels que définis ci-dessus, p étant un nombre entier variant de 1 à 6 u étant un nombre entier variant de 1 à 4 a,-

W représentant un groupe de formule ^vV _] r étant un nombre entier variant de 1 à 4 ^ le groupe W se liant au groupe NH via la liaison en pointillés a',

lorsque j = 1 ou k = 1

* lorsque X représente un groupe de formule (12') et (14'), Z répond à l'une des

u étant un nombre entier variant de 1 à 4 n étant un nombre entier variant de 1 à 10

W représentant un groupe de formule ou un groupe de formule ¹ Ji' ^''

O le groupe W se liant au groupe NH via la liaison en pointillés a',

* lorsque X représente un groupe de formule (1'), (2'), (8'), (9'), (5'), (6'), (7'), (10'), (11 '), (13') et (15'), Z répond à l'une des formules suivantes :

u étant un nombre entier variant de 1 à 4 n étant un nombre entier variant de 1 à 10

W représentant un groupe de formule S^ ψn'k r étant un nombre entier variant de 1 à 4 le groupe W se liant au groupe NH via la liaison en pointillés a',

* Z pouvant également représenter l'une des formules suivantes

dans laquelle :

- lorsque X représente un groupe de formule (I ⁵ ), (8'), (9'), (5 ^! ), (6'), (7'), (13') et (15') :

R représente l'un des groupes suivants :

à 10

le groupe R se liant au groupe NH via la liaison en pointillés a',

- lorsque X représente un groupe de formule (2'), (3') et (4') :

R représente l'un des groupes suivants :

n représentant un nombre entier variant de 1 à 10 u représentant un nombre entier variant de 1 à 4 le groupe R se liant au groupe NH via la liaison en pointillés a',

- lorsque X représente un groupe de formule (12') et (14') :

R représente l' un des groupes suivants :

W-NH-(CH ₂ -CH ₂ -O)ITI-CH ₂ -CH ₂ -CO- m variant de 3 à 6 le groupe R se liant au groupe NH via la liaison en pointillés a',

W" W-(Pro)n— W- n représentant un nombre entier variant de 1 à 10

W représentant un groupe de formule

le groupe W se liant au groupe NH via la liaison en pointillés a',

- lorsque X représente un groupe de formule (1'), (T), (8'), (9'), (5'), (6'), (7'), (10'), (11 '), (13') et (15') : R représente l'un des groupes suivants :

W-NH-(CH ₂ -CH ₂ -O)m-CH ₂ -CH ₂ -CO- m variant de 3 à 6

W-- W-(Pro)n— W~

u et n étant tels que définis ci-dessus,

JJ ai. W représentant un groupe de formule ^V 'r [] ^' r étant un nombre entier variant de 1 à 4 le groupe W se liant au groupe NH via la liaison en pointillés a'.

Ainsi, la présente invention concerne des dimères (lorsque j = k = 0), des trimères (lorsque j = l ou k = l) et des tétramères (lorsque j = k = 1) du motif ^c | ^c .

Selon un mode de réalisation avantageux, les composés de l'invention sont caractérisés en ce que R ₀ représente un peptide dérivé du ligand du récepteur CD40 humain ou murin (CD40L), ledit peptide appartenant à la séquence primaire du ligand CD40L de CD40 et dont le nombre d'acides aminés est compris entre 3 et 10.

Selon un mode de réalisation avantageux, les composés de l'invention sont caractérisés en- ce que R _c représente un peptide dérivé du ligand du récepteur CD40 humain ou murin (CD40L), ledit peptide appartenant à la séquence primaire du ligand

CD40L et dont le nombre d'acides aminés est compris entre 3 et 10 choisi parmi les séquences suivantes (LQWAEKGYYTMSNN (séquence humaine SEQ ID NO : 1) ; LQWAICKGYYTMKSN (séquence murine SEQ ID NO : 2) ; PGRFERILLRAANTH

(séquence humaine SEQ ID NO : 3) ; SIGSERILLKAANTH (séquence murine SEQ ID NO : 4).

La présente invention concerne des composés tels que définis ci-dessus, caractérisés en ce que R ₀ représente un groupe de formule H-X _a -(Xb)i-X _c -Xd-Xe-(Xf)i- ou H-XVL-XVX _c -X _d -X _e -(Xf)i-, dans laquelle :

• 1 représente O ou 1 ,

• i représente O ou 1,

• X _a est choisi parmi les résidus d'acides aminés suivants :

- lysine ; - arginine ;

- ornithine ;

- les β-acides aminés correspondant à la lysine, l'argmine ou l'omithine, portant la substitution en position α ou β ;

- acide tranéxamique ; - acide N-méthyl -tranéxamique ;

- acide 8-amino-3,6-dioxaoctanoïque ;

- acide 4(pipéridin-4-yl)butanoïque ;

- acide 3(pipéridin-4-yl)propionique ;

- N-(4-aminobutyl)-glycine ; - NH ₂ -(CH ₂ ) _n -COOH, n variant de 1 à 10 ;

- NH ₂ -(CH ₂ -CH ₂ -O) _m -CH ₂ CH ₂ COOH, m variant de 3 à 6 ;

- 4-carboxyméthyl-pipérazine ;

- acide 4-(4-aminophényl)butanoïque ;

- acide 3-(4-aminophényl)propanoïque ; - acide 4-aminophénylacétique ;

- 4-(2aminoéthyl)-l-carboxyméthyl-pipérazine ;

- acide trans-4-aminocyclohexanecarboxylique ;

- acide cis-4-aminocyclohexanecarboxylique ;

- acide cis-4-aminocyclohexane acétique ; - acide trans-4-aminocyclohexane acétique ;

- 4-amino-l-carboxyméthyl pipéridine ;

- acide 4-aminobenzoïque ;

- acide 4(2-aminoéthoxy)benzoïque ;

• Xb est choisi parmi les résidus d'acides aminés suivants :

- glycine ;

- isoleucine ;

- leucine ; - valine ;

- asparagine ;

- D-alanine ;

- D-valine ;

- L-proline substituée ou non en position β, γ ou δ ; - D-proline substituée ou non en position β, γ ou δ ;

- acides aminés naturels N-alkylés, le groupe alkyle étant un groupe méthyle, éthyle ou benzyle ;

- acides aminés dialkylés acycliques de formule suivante :

R représentant H, Me, Et, Pr ou Bu ;

- acides aminés dialkylés cycliques de formule suivante :

k représentant 1, 2, 3 ou 4 ;

• X ₀ est choisi parmi les résidus d'acides aminés suivants :

- tyrosine ; - isoleucine ;

- leucine ;

- valine ;

- phénylalanine ;

- 3-nitro-tyrosine ; - 4-hydroxyméthyl-phénylalanine ;

- 3,5-dihydroxy-ρhénylalanine ;

- 2,6-diméthyl-tyrosine ;

- 3,4-dihydroxy-phénylalanine (DOPA) ;

• Xd est choisi parmi les résidus d'acides aminés suivants :

- tyrosine ;

- isoleucine ;

- leucine ; - valine ;

- phénylalanine ;

- 3-nitro-tyrosine ;

- 4-hydroxyméthyl-phénylalanine ;

- 3,5-dihydroxy-phénylalanine ; - 2,6-diméthyl-tyrosine ;

- 3,4-dihydroxy-phénylalanine ;

• X _e est choisi parmi les résidus d'acides aminés suivants :

- arginine ;

- -(Gly)n-, n variant de 1 à 10 ; - -(Pro)n-, n variant de 1 à 10 ;

- NH ₂ -(CH ₂ )I ₁ -COOH, n variant de 1 à 10 ;

- NH ₂ -(CH ₂ -CH ₂ -O) _1n -CH ₂ CH ₂ COOH ₅ m variant de 3 à 6 ;

- acide 8-amino-3,6-dioxaoctanoïque ;

- acide tranéxamique ; - acide N-méthyl-tranéxamique ;

- acide 4(pipéridin-4-yl)butanoïque ;

- acide 3(pipéridin-4-yl)propionique ;

- N-(4-aminobutyl)-glycine ;

- 4-carboxyméthyl-pipérazine ; - acide 4-(4-aminophényl)butanoïque ;

- acide 3-(4-aminophényl)propanoïque ;

- acide 4-aminophénylacétique ;

- 4-(2aminoéthyl)-l-carboxyméthyl-pipérazine ;

- acide trans-4-aminocyclohexanecarboxylique ; - acide cis-4-aminocyclohexanecarboxylique ;

- acide cis-4-aminocyclohexane acétique ;

- acide trans-4-aminocyclohexane acétique ;

- 4-amino-l-earboxyméthyl pipéridine ;

- acide 4-aminobenzoïque ;

- acide 4(2-aminoéthoxy)benzoïque ;

• X _f est choisi parmi les résidus d'acides aminés suivants :

- -(GIy)Ii-;, n variant de 1 à 10 ; - -(Pro)n-, n variant de 1 à 10 ;

- NH ₂ -(CH ₂ ) _n -COOH, n variant de 1 à 10 ;

- NH ₂ -(CH ₂ -CH ₂ -O) ₀₁ -CH ₂ CH ₂ COOH, m variant de 3 à 6 ;

- acide 8-amino-3,6-dioxaoctanoïque ;

- acide tranéxamique ; - acide N-méthyl-tranéxamique ;

- acide 4(pipéridin-4-yl)butanoïque ;

- acide 3(pipéridin-4-yl)propionique ;

- N-(4-aminobutyl)-glycine ;

- 4-carboxyméthyl-pipérazine ; - acide 4-(4-aminophényl)butanoïque ;

- acide 3-(4-aminophényl)propanoïque ;

- acide 4-aminophénylacétique ;

- 4-(2aminoéthyl)-l-carboxyméthyl-pipérazme ;

- acide trans-4-aminocyclohexanecarboxylique ; - acide cis-4-aminocyclohexanecarboxylique ;

- acide cis-4-aminocyclohexane acétique ;

- acide trans-4-aminocyclohexane acétique ;

- 4-amino-l-carboxyméthyl pipéridine ;

- acide 4-aminobenzoïque ; - acide 4(2-aminoéthoxy)benzoïque ;

• -L- représente une liaison de nature pseudopeptidique entre les résidus X' _a et X' _b , choisie notamment dans la liste ci-dessous :

-L- = -ψ(CH ₂ CH ₂ > ; -ψ(CH(F _k )=CH(F _k '))s -ψ(CH ₂ NH)- ; -ψ(NHCO)- ; -ψ(NHCONH)- ; -ψ(CO-O)- ; -ψ(CS-NH)- ; -ψ(CH(OH)-CH(OH))- ; -ψ(S-CH ₂ )- ; -ψ(CH ₂ -S> ; -ψ(CH(CN)-CH ₂ > ; -ψ(CH(OH)> ; -ψ(COCH ₂ )- ; -ψ(CH(OH)CH ₂ )- ;

-ψ(CH(OH)CH ₂ NH)- ; -ψ(CH ₂ )- ; -ψ(CH(F _k ))- ; -ψ(CH ₂ O)- ; -ψ(CH ₂ -NHCONH)- ; -ψ(CH(F _k )NHCONF _k ')- ; -ψ(CH ₂ -CONH)- ; -ψ(CH(F _k )CONH> ;

-ψ(CH(F _k )CH(F _k ')CONH)- ;

ou -ψ(CH ₂ N> ; -ψ(NHCON)- ; -ψ(CS-N)- ; -ψ(CH(OH)CH ₂ N)- ; -ψ(CH ₂ -NHCON> ; -ψ(CH ₂ -CQN> ; -ψ(CH(F _k )CON> ; -ψ(CH(F _k )CH(F _k ')CON> lorsque X' _b représente la chaîne latérale d'une proline,

F _k et F _k ' représentant, indépendamment l'un de l'autre, un hydrogène, un halogène, un groupe alkyle de 1 à 20 atomes de carbone, ou un groupe aryle dont la structure du cycle contient de 5 à 20 atomes de carbone,

• X' _a représente la chaîne latérale de la lysine, de l'arginine ou de î'ornithine ; et

• X'b représente la chaîne latérale de l'un des résidus d'acides aminés suivants :

- glycine ; - isoleucine ;

- leucine ;

- valine ;

- asparagine ;

- D-alanine ; - D-valine ;

- L-proline substituée ou non en position β, γ ou δ ;

- D-proline substituée ou non en position β, γ ou δ ;

- acides aminés naturels N-alkylés, le groupe alkyle étant un groupe méthyle, éthyle ou benzyle ; - acides aminés dialkylés acycliques de formule suivante :

R représentant H, Me, Et, Pr ou Bu ;

- acides aminés dialkylés cycliques de formule suivante

k représentant 1, 2, 3 ou 4.

Ainsi, X _a est notamment choisi parmi les groupes suivants :

Xb est notamment choisi parmi les groupes suivants ^:

X _c et Xd sont notamment choisis parmi les groupes suivants :

X _e et X _f sont notamment choisis parmi les groupes suivants

La présente invention concerne également des composés de formule (I) tels que définis ci-dessus, caractérisés en ce que Y répond à la formule suivante (II) :

dans laquelle :

- A représente un résidu d'acide aminé ou un dérivé d'acide aminé choisi indifféremment parmi :

(1) (2) (3) (4)

(5) (6) (V) (8)

(9) (10) (H) (12)

. n représentant O, 1, 2 ou 3 ; . p représentant 0, 1, 2 ou 3 ; . E représentant NH ou O ;

- B ¹ est un résidu d'acide aminé ou un dérivé d'acide aminé choisi de manière indépendante parmi :

(13) (14) (15) (16)

(17) (18) (19) (20)

. n représentant 0, 1, 2 ou 3 ; . p représentant 0, 1, 2 ou 3 ; . E représentant NH ou O ;

. Ra représentant la chaîne d'un acide aminé protéinogénique, Cl -C 8 alkylé ;

- B est choisi de manière indépendante parmi les groupes suivants : la liaison c représentant la liaison au groupe X,

(15) (16) (19) (20)

. n représentant 0, 1, 2 ou 3 ;

. p représentant 0, 1 , 2 ou 3 ;

. E représentant NH ou O ;

. Rb représentant une chaîne alkyle comprenant de 1 à 6 atomes de carbone ;

. D' représentant l'un des groupes suivants :

-N-(CH ₂ )V-N-D

O H H

H 'm D

-- ^N - ^(CH ₂ M

----N ^' O H m

m représentant un nombre entier variant de 1 à 40 ; v représentant un nombre entier variant de 1 à 10 ; la liaison c' représentant la liaison au groupe X, D représentant l'un des groupes suivants : - un groupe de formule , 9 9

lorsque X représente un groupe de formule (13') et (15'),

u un groupe de ou de formule lorsque X représente un groupe de formule (1 '), (T), (8'), (9'), (5'), (6'), (7'), (10'), (H '), (12') et (14'), la liaison c' représentant la liaison au groupe X, q représentant un nombre entier variant de 2 à 6 ; Xg correspondant au résidu de l'un des groupes suivants :

-(Gly)n-, n variant de 1 à 10 ; -(Pro)n-, n variant de 1 à 10 ;

-NH ₂ -(CH ₂ ) _n -COOH, n variant de 1 à 10 ;

-NH ₂ -(CH ₂ -CH ₂ -O) _1n -CH ₂ CH ₂ COOH, m variant de 3 à 6 ; . acide 8-amino-3,6-dioxaoctanoïque ; acide tranéxamique ; acide N-méthyl-tranéxamique ; acide 4(pipéridin-4-yl)butanoïque ; acide 3(pipéridin-4-yl)-propionique ;

N-(4-aminobutyl)-glycine ;

4-carboxyméthyl-pipérazine ; acide 4-(4-aminophenyl)butanoïque ; acide 3-(4-aminophenyl)propanoïque ; acide 4-aminophénylacétique ;

4-(2-aminoéthyl)- 1 -carboxyméthyl-pipérazine ; acide trans-4-aminocyclohexane carboxylique ; acide cis-4-aminocyclohexane carboxylique ; acide cis-4-aminocyclohexane acétique ; acide trans-4-aminocyclohexane acétique ;

4-amino-l-carboxyméthyl pipéridine ; acide 4-aminobenzoïque ; acide 4(2-aminoéthoxy)benzoïque.

Selon un mode de réalisation avantageux, les composés de l'invention sont des composés de formule (I) telle que définie ci-dessus dans laquelle Y répond à l'une des formules suivantes :

(III) (IV)

(III-3) (iπ-4)

Ra, R _c , D, D', Xg, q, i et p étant tels que définis ci-dessus.

Les composés préférés selon l'invention sont des composés répondant à l'une des

R _c et m étant tels que définis ci-dessus.

Selon un mode de réalisation avantageux, les composés de l'invention sont caractérisé en ce que lequel R _c est choisi parmi l'un des groupes suivants :

- H-Lys-Gly-Tyr-Tyr-NH-(CH ₂ ) ₅ -CO-,

- H-Lys-(D)Pro-Tyr-Tyr-NH-(CH ₂ ) ₅ -CO-,

- Ahx-(D)Pro-Tyr-Tyr-NH-(CH ₂ ) ₅ -CO-,

- H-Lys-ψ(CH ₂ N)-(D)Pro-Tyr-Tyr-NH-(CH ₂ ) ₅ -CO-, -ψ(CH ₂ N)- correspondant à une liaison pseudopeptidique de type méthylène-amino,

- H-Lys~ψ(CH ₂ )-Gly-Tyr-Tyr-NH-(CH ₂ ) ₅ -CO-, -ψ(CH ₂ )- correspondant à une liaison pseudopeptidique de type méthylène,

- H-Lys-ψ(CH ₂ -CH ₂ )-Gly-Tyr-Tyr-NH-(CH ₂ ) ₅ -CO-, -ψ(CH ₂ CH ₂ )- correspondant à une liaison pseudopeptidique de type éthylène,

- H-Lys-Gly-DOPA-Tyr-NH-(CH ₂ ) ₅ -CO- et

- H-Arg-Ile-Ile-Leu-Arg- NH-(CH ₂ ) ₅ -CO.

La présente invention concerne également un composé tel que défini ci-dessus de

dans laquelle :

- n est égal à 1, 2 ou 6 ;

- R ₀ représente un groupe H-Lys-Gly-Tyr-Tyr-NH-(CH ₂ ) ₅ -CO-. La présente invention concerne également une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend, à titre de substance active un composé de formule (I) telle que définie ci-dessus, en association avec un vecteur pharmaceutiquement acceptable.

La présente invention concerne également une composition vaccinale caractérisée en ce qu'elle comprend, à titre de substance active un composé de formule (I) telle que définie ci-dessus, en association avec un adjuvant pharmaceutiquement acceptable.

La présente invention concerne également l'utilisation de composés tels que définis ci-dessus, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de pathologies impliquant l'inhibition ou l'activation de la réponse immunitaire.

La réponse immunitaire doit être inhibée au cours des maladies inflammatoires (rhumatismes inflammatoires), des maladies auto-immunes, des réactions d'hypersensibilités en général et des allergies en particulier, des rejets de greffes, des réactions du greffon contre l'hôte.

La réponse immunitaire doit être activée dans les vaccinations en général, dans l'immunothérapie des cancers, dans les maladies bactériennes ou virales induisant une immunosuppression (rougeole, SIDA, virus de l'herpès, cytomégalovirus...), dans le traitement des maladies bactériennes virales ou impliquant des agents infectieux non conventionnels (prions) chez les personnes présentant un déficit immunitaire primaire ou secondaire.

La présente invention concerne également l'utilisation de composés tels que définis ci-dessus, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de pathologies impliquant l'inhibition de la réponse immunitaire, telles que les rejets de greffes, les allergies ou les maladies auto-immunes. La présente invention concerne également l'utilisation telle que défmie ci-dessus, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de pathologies impliquant l'augmentation de la réponse immunitaire, telles que les cancers ou les infections parasitaires, bactériennes, virales ou impliquant des agents infectieux non conventionnels tels que les prions. Les maladies impliquant l'inhibition de la réponse immunitaire comprennent les maladies auto-immunes telles que les diabètes, la sclérose en plaques, le lupus érythémateux disséminé ou l'arthrite rhumatoïde, les rejets de greffes, notamment dans le cadre d'allogreffes, de xénogreffes ou les réactions du greffon contre l'hôte, ainsi que les réactions d'hypersensibilités telles que les allergies, notamment le rhume des foins et les dermatites atopiques, ou les granulomes.

Les composés selon la présente invention, utilisés dans le cadre de l'inhibition de la réponse immunitaire, peuvent être administrés par voie intraveineuse, par les voies muqueuses (orales, aériennes, nasales, vaginales), par voie sous-cutanée, intradermique ou épicutanée. La présente invention concerne également une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend un composé selon la présente invention, pour le traitement de pathologies impliquant l'inhibition de la réponse immunitaire, lequel composé est présent dans la composition pharmaceutique en quantités telles qu'il peut être administré à raison d'environ 100 ng à environ 5 mg par jour et par individu. La présente invention concerne également l'utilisation telle que mentionnée ci- dessus, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de pathologies impliquant l'augmentation de la réponse immunitaire, telles que les cancers ou les infections parasitaires, bactériennes, virales ou impliquant des agents infectieux non conventionnels tels que les prions. Les cas impliquant l'activation de la réponse immunitaire comprennent les vaccinations en général, notamment les vaccins contre la grippe ou contre les maladies infantiles, l'immunothérapie des cancers, notamment dans le cadre de mélanomes ou de cancers à métastases, ou les maladies bactériennes ou virales induisant une immunosuppression, notamment dans le cadre de la rougeole, du SIDA, du virus de

l'herpès ou du cytomégalovirus, ou les vaccins destinés aux personnes présentant un déficit immunitaire primaire ou secondaire.

Les composés selon la présente invention, utilisés dans le cadre de l'activation de la réponse immunitaire, peuvent être administrés par voie intraveineuse, par les voies muqueuses (orales, aériennes, nasales, vaginales), par voie sous-cutanée, intradeπnique ou épicutanée.

La présente invention concerne également une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend un composé selon la présente invention, pour le traitement de pathologies impliquant l'activation de la réponse immunitaire, lequel composé est présent dans la composition pharmaceutique en quantités telles qu'il peut être administré à raison d'environ 100 ng à environ 5 mg par jour et par individu.

La présente invention concerne également un procédé de préparation sur support solide d'un composé de formule (I) tel que défini ci-dessus, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - la formation d'un précurseur linéaire de Y tel que défini ci-dessus, lequel précurseur est constitué d'un enchaînement d'acides aminés formant une chaîne peptidique en croissance, synthétisée par des cycles successifs de couplage entre des résidus d'acides aminés N-protégés, dont trois portent un groupe de type aminé, et la fonction aminé de la chaîne peptidique en croissance, et de déprotection, le premier résidu d'acide aminé étant accroché sur un support solide, ledit précurseur linéaire de Y comprenant au moins un résidu D-Alanine, ledit résidu D-Alanine étant substitué par un résidu D-Lysine dont l'aminé ε-NH a été acylée par un acide carboxylique portant la fonction désirée correspondant au groupe X tel que défini ci-dessus,

- la cyclisation du précurseur linéaire de Y protégé susmentionné, afin d'obtenir un cycle fonctionnalisé protégé,

- la réaction dudit cycle fonctionnalisé protégé avec un bras espaceur dérivé de Z tel que défini ci-dessus, afin d'obtenir un cycle fonctionnalisé protégé dimérisé,

- le clivage des susdits groupes protecteurs, pour libérer les susdites fonctions aminés protégées et obtenir un cycle fonctionnalisé déprotégé dimérisé, - le couplage des fonctions aminés libérées susmentionnées avec un peptide déjà formé ou formé in situ par l'assemblage séquentiel des résidus d'acides aminés correspondant au groupe R ₀ tel que défini ci-dessus, et

- le clivage de la molécule du support solide, après la suppression de tous les groupements protecteurs présents sur les chaînes latérales fonctionnalisées du groupe R ₀ , afin d'obtenir le composé tel que défini ci-dessus.

La présente invention concerne également un procédé de préparation tel que défini ci-dessus d'un composé de formule (Ill-a) ou (III-b), ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :

- la réaction d'un cycle fonctionnalisé protégé de formule suivante :

GP représentant un groupe protecteur notamment choisi parmi : Boc, Z ou Alloc, X' représentant un groupe -SH ou

O ,z avec un groupe espaceur de formule Z" O n représentant un nombre entier variant de 1 à 10

afin d'obtenir un composé de formule (VIII) suivante

GP étant tel que défini ci-dessus et

étant entendu que Y' répond à la formule (A) lorsque Z' représente un groupe N ₃

et que Y' répond à la formule (B) lorsque Z' représente un groupe

— la déprotection des susdits groupes protecteurs GP, pour libérer les fonctions aminés protégées et le couplage de ces fonctions aminés libérées susmentionnées avec un peptide déjà formé ou formé in situ par l'assemblage séquentiel des résidus d'acides aminés correspondant au groupe R _c tel que défini ci-dessus, et

— le clivage de la molécule du support solide, après la suppression de tous les groupements protecteurs présents sur les chaînes latérales fonctionnalisées du groupe R _c , afin d'obtenir le composé de formule (Ill-a) ou (Ill-b) tel que défini ci-dessus.

DESCRIPTION DES FIGURES

La Figure 1 représente la synergie entre Ll (voir formule plus loin) et l'anticorps anti- CD40 agoniste 3/23. L'axe des ordonnées représente l'absorption de ³ H-thymidine en cpm.

La Figure 2 représente le profil HPLC de la réaction 1,3-dipolaire entre le macrocycle IV.23 et le diazoture IV.15 dans les conditions de l'entrée 6 et après traitement au TFA. (HPLC : gradient linéaire, 5-65% B, 20 min).

La Figure 3 représente le profil HPLC de la réaction 1,3-dipolaire entre le macrocycle IV.23 et le diazoture IV.14 dans les conditions de l'entrée 5 et après traitement au TFA. (HPLC : gradient linéaire, 5-65% B, 20 min).

La Figure 4 A représente le profil HPLC du brut réactionnel de la réaction de couplage entre le macrocycle dimérisé IV.25 et du pentapeptide protégé Pl après traitement au TFA. La Figure 4B représente le profil HPLC du ligand L41 après purification par HPLC préparative. (HPLC : gradient linéaire, 5-65% B, 20 min). La Figure 4C représente le profil MALDI-TOF du ligand L41 (masse attendue : 5529).

Les Figures 5 A et 5B représentent l'induction d'apoptose des cellules RAJI de lymphomes de Burkitt et la prolifération des cellules B par Ll et L41. Les colonnes blanches correspondent au ligand L41 et les colonnes noires au ligand Ll . Dans la Figure 5A, l'axe des ordonnées représente le pourcentage d'apoptose spécifique et l'axe des abscisses représente la concentration dix ligand en μM. Les résultats correspondent à la moyenne de trois expérimentations indépendante +/- SD. Dans la Figure 5B, l'axe des ordonnées représente l'index de stimulation correspondant aux cpm obtenus dans les cultures avec des analogues de CD40L divisés par les cpm obtenus dans les cultures sans analogues de CD40L et l'axe des abscisses représente la concentration de chaque analogue de CD40L (Ll et L41) en μM. Les carrés blancs correspondent au ligand L41 et les carrés noirs au ligand Ll .

En interagissant avec leurs ligands respectifs, les récepteurs de la superfamille du TNF transmettent un signal qui permet la survie, la prolifération et la différentiation cellulaire et/ou l'apoptose (mort cellulaire programmée). Suivant le récepteur de la superfamille du TNF considéré et/ou le type cellulaire, le degré d'oligomérisation nécessaire à la transduction du signal est différent : certains sont activés par le ligand homotrimérique sous forme soluble alors que d'autres sont activés uniquement par le ligand homotrimérique membranaire. Ainsi les ligands TWEAK, TNF et BAFF sont actifs sous formes solubles. En revanche, l'activation par FasL, TRAIL, CD40L ou CD30L nécessite le recrutement de deux ou plusieurs homotrimères spatialement proches (Holler, N.; Tardivel, A.; Kovacsovics-Bankowski, M.; Hertig, S.; Gaide, O.; Martinon,

F.; Tinel, A.; Deperthes, D.; Calderara, S.; Schulthess, T.; Engel, J.; Schneider, P.;

Tschopp, J. Molec. CeIl Biol. 2003, 23, 1428-1440; Schneider, P.; Holler N.; Bodmer,

J.L.; Hahne, M.; Frei, M.; Fontana, A.; Tschopp, J. J. Exp. Med 1998, 187, 1205-1213).

Dans le cas de la signalisation par CD40, il a été démontré que sur certains types cellulaires et notamment sur les cellules B, la formation du seul complexe hexamérique

3:3 n'était pas suffisante pour induire la transduction du signal. Dans ce cas, l'unité minimale de signalisation correspond, non pas à un, mais à plusieurs complexes hexamériques proche les uns les autres.

Cette observation a incité les biochimistes à développer des outils pour augmenter Poligomérisation du récepteur induite par le ligand soluble. Cette approche permet, d'une part d'augmenter l'effet biologique produit par l'engagement du récepteur, et d'autre part d'étudier les mécanismes par lesquels la multimérisation permet cette augmentation.

A ce jour, seules des approches biochimiques ont été décrites pour amplifier Poligomérisation de CD40. Essentiellement, deux stratégies ont été décrites. La première est basée sur l'utilisation de deux partenaires : le ligand et un agent amplificateur d'oligomérisation. La deuxième stratégie est basée sur la construction de protéines de fusion multimériques. Ces deux approches ont été utilisées pour amplifier l'effet biologique de CD40L et de FasL.

Dans le cas de la première stratégie, l'agent amplificateur peut être un anticorps monoclonal anti-récepteur (ex : màb anti-CD40) agissant en synergie avec le ligand soluble (Pound, J.D.; Challa, A.; Holder, M.J.; Armitage, RJ.; Dower, S.K.; Fanslow, W.C.; Kikutani, H.; Paulie, S.; Gregory, CD.; Gordon, J. Int. Immunol 1999, 11, 11-20 ; Schneider, P.; Holler, N.; Bodmer, J.L.; Hahne, M.; Frei, K.; Fontana, A.; Tschopp, J. J. Exp. Med. 1998, 187, 1205-1213) ou bien un anticorps monoclonal anti-Flag permettant

l'oligomérisation du ligand recombinant fusionné avec un peptide Flag (Haswell, L.E.; Glennie, MJ.; Al-Shamkhani, A. Ew. J. ïmmunol. 2001, 31, 3094-3100).

La deuxième stratégie consiste à construire des protéines de fusion constituées de plusieurs copies du ligand. A cette fin, le groupe de Jôrg Tschopp à l'université de Lausanne a construit une molécule dans laquelle FasL ou CD40L est fusionnée au domaine collagène de la protéine ACRP30. Cette protéine, membre de Ia superfamille du CIq, possède une géométrie particulière et deux têtes homotrimériques qui permettent d'associer par fusion deux domaines homotrimériques sur la même molécule. Dans une démarche similaire, Haswell et al. a décrit une molécule capable de présenter quatre homotrimères de CD40L. Ils ont pour cela remplacé le domaine lectine de la « lung surfactant protein-D » (SP-D : membre de la superfamille des lectines) par le domaine extracellulaire C-terminal de CD40L (Haswell, L.E.; Glennie, M.J.; Al- Shamkhani, A. Ew. J. ïmmunol 2001, 31, 3094-3100).

L'utilisation de ces protéines multimériques ACRP30 et SP-D fusionnées à CD40L homotrimérique a permis de démontrer que la plus petite unité active capable d'induire une prolifération robuste des lymphocytes B spléniques de souris est un dimère de CD40L homotrimérique. La combinaison des deux stratégies à savoir le « crosslinking » de la protéine de fusion CD40L:ACRP30 contenant un Flag avec un anticorps anti-Flag permet d'augmenter de manière significative l'effet de la protéine CD40L:ACRP30 sur les cellules B démontrant ainsi la nécessité d'amplifier le degré d'oligomérisation du récepteur pour une signalisation efficace.

PARTIE EXPéRIMENTALE A) CHIMIE

Comme la molécule CD40L soluble, les mimes synthétiques (ex : Ll tel que décrit dans la demande WO03/102207) n'induisent pas la prolifération des cellules B spléniques murines. Les résultats de la littérature discutés précédemment suggèrent l'intérêt que pourraient avoir des stratégies visant à augmenter encore davantage le pouvoir d'oligomérisation de nos ligands synthétiques. Ceci est conforté par les résultats obtenus au laboratoire avec l'anticorps monoclonal 3/23. En effet, nous avons pu montrer que l'action de Ll sur des cellules B spléniques, comme celle de CD40L homotrimérique soluble, est potentialisée par cet anticorps anti-CD40 agoniste. L'association de ces 2 molécules permet d'induire la prolifération des cellules B (Figure 1).

Parallèlement les Inventeurs ont cherché à développer la conception de molécules permettant de présenter au moins deux copies du ligand synthétique mimant CD40L homotrimérique. L'idée étant de mettre en évidence un effet amplificateur résultant de l'oligomérisation du ligand et d'identifier l'entité minimale permettant d'induire une prolifération des lymphocytes B. Pour cela, il a été choisi de synthétiser des dimères des ligands synthétiques.

DIMéRISATION DES LIGANDS SYNTHéTIQUES. 1) Approche rétrosynthétique générale

Les molécules dimérisées sont synthétisées à partir de deux architectures trimériques de type cyclo-D,L-α-peptide reliées l'une à l'autre par l'intermédiaire d'un bras espaceur de type n-alkyle ou polyéthylène glycol. Afin de créer ce lien, deux approches ont été envisagées : l'une utilise la chimie des thiols (réaction d'addition de Michael d'un thiol sur un maléimide) et l'autre la « click chemistry », réaction de cycloaddition [3+2] dipolaire (ou réaction de Huisgen) entre un alcyne et un azoture. Alors que dans la première approche, le lien introduit est un thioéther, l'approche par « click chemistry » génère un lien de type 1,2,3-triazole 1,4-disubstitué.

La stratégie générale utilisée repose sur la synthèse d'un macrocycle D,L-α-peptide sur lequel est accroché un groupement fonctionnalisé : soit un alcyne vrai dans le cas de l'approche par « click chemistry », soit un groupement thiol dans le cas de la seconde approche selon le schéma suivant :

dans le cas de la "click chemistry"

as de la chimie des thiols

Ce cycle fonctionnalisé est préparé suivant la stratégie suivante : un des trois résidus D-Alanine est substitué, au moment de la préparation du précurseur peptidique, par un résidu D-Lysine dont l'aminé ^ε NH a été acylée au préalable par un acide carboxylique portant la fonctionnalité désirée.

2) Dimérisation par la réaction d'addition de Michael entre un thiol et un maléimide

II a d'abord été envisagé de dimériser les mimes fonctionnels de CD40L par la réaction d'addition de Michael entre un ligand fonctionnalisé de manière exocyclique par un groupement thiol et un bras espaceur bismaléimide à 6 carbones (IV.l).

Ce bras espaceur est préparé à partir de la diamine correspondante, par réaction avec le iV-(Méthylcarbonyl)maléimide dans un mélange de THF et d'une solution saturée d'hydrogénocarbonate de sodium ((a) Bodanszky, M.; Bodanszky, A. In the

Practice ofPeptide Synthesis; Springer-Verlag: New York, 1984, 29-31. (b) Cheronis, J.C.; Whalley, E.T.; Nguyen, K.T.; Eubanks, S.R.; Allen, L.G.; Duggan, MJ.; Loy, S.D.; Bonham, K.A.; Blodgett, K. J. Med. Chem. 1992, 35, 1563-1572). Le produit désiré est obtenu par simple lavage, sans purification supplémentaire.

(a) N-(Méthylcarbonyl) maléimide, NaHCO ₃ /THF, 100%.

a. Synthèse du macrocycle fonctionnalisé

Une des étapes clé de cette synthèse est la préparation du macrocycle fonctionnalisé par un groupement thiol. Il a fallu dans un premier temps trouver un groupement protecteur approprié pour cette fonctionnalité, orthogonal au groupement Boc mais stable dans les conditions classiques de synthèse peptidique. Pour cela, le groupement acétamide

(Acm) a été utilisé. Ce groupement protecteur est, en effet, stable dans les conditions de déprotection du groupement Fmoc (20% pipéridine dans le DMF) mais également en présence d'acide trifmoroacétique.

La synthèse de l'intermédiaire acide 3-(Acétylamino-méthylsulfanyl) propionique (IV.2) nécessaire à la fonctionnalisation du macrocycle est présentée sur le schéma suivant : H

IV.2 (a) TFA, 100%.

La protection du dérivé thiol, de l'acide 3-mercaptopropanoïque, par le groupement protecteur acétamide, s'effectue dans l'acide trifluoroacétique en présence de N-(hydroxyméthyl)acétamide (Phelan, J.C.; Skelton, NJ.; Braisted, A.C.; McDowell, R.S. J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 455-460).

L'acide IV.2 est alors couplé sur l'aminé ⁶ NH du dérivé D-Lysine convenablement protégé IV.4. Le composé obtenu, IV.5, est ensuite déprotégé de ces groupements Fmoc et ester de benzyle. Puis, la partie N-terminale du zwitterion ainsi formé est à nouveau protégée par un groupement Fmoc afin d'obtenir le précurseur IV.7 nécessaire à l'assemblage du peptide linéaire en vue de la macrocyclisation.

1V.3 : R = Boc IV.5 IV.6 IV.7 b) \

1V.4 : R = NH ₃ ⁺ , TFA

(a) BnBr (3 eq.), KHCO ₃ (1.6 eq.), Bu ₄ NI (0.1 eq.), DMSO, 100% ; (b) TFA, 100% ; (c) IV.1, BOP, DIEA, DMF, 90% ; (d) LiOH IN (1 eq.), DMF, 91% ; (e) FmocOSu (1 eq.), K ₂ CO ₃ (2 eq.), acétone/H ₂ O, 66%.

Ce monomère contenant un groupement thiol protégé est alors incorporé lors de la synthèse sur support solide de l'hexapeptide linéaire IV.8. La synthèse s'effectue à partir de la résine chlorure de 2-chlorotrityle selon la stratégie Fmoc comme illustré ci-après :

I — IV.9 : R ≈ Boc

•— "- IV ₁ I O I R = NH ₃ ⁺ , TFA ^"

(a) Fmoc-Lys(Boc)-OH (2 eq.), DIEA (6 eq.), CH ₂ Cl ₂ ; (b) 25% pipéridine/DMF; (c) SPPS : Fmoc-Xaa-OH (5 eq.), BOP (5 eq.), HOBt (5 eq.), DIEA (15 eq.), DMF ; (d) HFIP/CH ₂ C1 ₂ (60/40 v/v) ; (e) EDCHCl (1.2 eq.), HOBt (1.2 eq.), DIEA (1.5 eq) , DMF, 77% ; (f) TFA, 85%.

La cyclisation du précurseur linéaire IV.8 s'est avérée problématique. En effet, les premiers essais effectués dans les conditions standards utilisées lors de la synthèse du macrocycle 11.2 ont abouti à des profils HPLC du produit macrocyclisé brut, après déprotection, accompagné de quantités importantes de produits de polymérisation. Une étude plus détaillée des conditions de macrocyclisation a donc été nécessaire. Pour cela, nous avons fait varier la nature des réactifs de couplage, la concentration du milieu réactionnel ainsi que le temps de réaction. Les résultats de cette étude sont résumés dans le tableau 1. Dans ce tableau, le pourcentage de pureté correspond à la pureté estimée à partir du profil HPLC du composé IV.10 brut obtenu après de traitement de IV.9 au TFA. En effet, l'analyse HPLC du cycle complètement protégé IV.9 est impossible car ce composé est très peu soluble dans les solvants utilisés classiquement en HPLC.

Tableau 1 : Différentes conditions utilisés pour la réaction de macrocyclisation

II apparaît que cette réaction est très sensible aux conditions expérimentales employées. Dans un premier temps, nous avons pu remarquer que la concentration à laquelle s'effectue la réaction est très importante. En effet, suivant la dilution du milieu réactionnel, la pureté du macrocycle IV.10 varie fortement (entrées 1, 2 et 4 du tableaul). Une concentration de 4.10 ^"3 M semble être adaptée pour former le macrocycle IV.10 avec une pureté satisfaisante. De même, l'issue de la réaction est fortement influencée par le réactif de couplage utilisé ainsi que par le pH auquel est réalisée la réaction (pH ~ 7 pour le couplage à 1εDC.HC1, pH ~ 8-9 pour le couplage au BOP). En effet, le réactif BOP donne un résultat très nettement inférieur à l'EDC.HCl (entrées 4 et 5). Enfin, le temps de réaction a été évalué. Dans le cas du

couplage à l'EDC.HCl, 72 heures sont nécessaires pour une macrocyclisation totale (entrées 3 et 4).

Une différence de réactivité a également été observée en fonction de la température à laquelle s'effectue la réaction. A une température de 40°C, les produits de polymérisation sont très largement majoritaires.

Le macrocycle IV.10 ainsi obtenu est couplé au pentapeptide protégé Boc- Lys(Boc)-Gly-Tyr(OtBu)-Tyr (OfBu)-AhX-OH Pl en présence de BOP sans purification supplémentaire pour conduire au ligand trimérique entièrement protégé. Les groupements protecteurs Boc et tBu ainsi que l'Acm sont éliminés dans une même étape

IV.10 L38

(a) Boc-Lys(Boc)-Gly-Tyr(Ofl3u)-Tyr(0?Bu)-Ahx-OH Pl (3.3 eq.), BOP (3.3 eq.), DIEA (15 eq.), DMF ; (b) CF ₃ COOAg (100 eq/Acm), TFA/Anisole puis DTT, AcOH

En principe, le groupement acétamide peut être éliminé dans différentes conditions qui pour certaines sont orthogonales aux conditions d'élimination des groupements protecteurs Boc/ffiu. On citera notamment le traitement du peptide par des sels de mercure dans un milieu acide (Hg[OAc] ₂ dans une solution tampon à pH 4) (Veber, D.; Milkowski, J.D.; Varga, Varga, S.L.; Denkewalter, R.G.; Hirschmann, R. J. Am. Chem. Soc. 1972, 94, 5456-5461), l'utilisation de sels d'argent (ex : CF ₃ SO ₃ Ag en présence d'anisole dans l'acide trifluoroacétique)(Fujii, N.; Otaka, A.; Watanabe, T.; Okamachi, A.; Tamamura, H.; Yajima, H.; Inagaki, Y.; Nomizu, M.; Asano, K. J. Chem. Soc, Chem. Comm. 1989, 283-284), le traitement par des sels de thalium (Tl(CF ₃ CO ₂ ) ₂ )(Fujii, N. et al. Chem. Pharm. Bull. 1987, 36, 2339) ou par de l'iode (Kamber, B. et al. HeIv. Chim. Acta 1980, 63, 899) (dans ces deux derniers cas un pont disulfure est formé).

II a été choisi d'utiliser du trifluoroacétate d'argent CF ₃ CO ₂ Ag dans l'acide trifluoroacétique en présence d'anisole. Ces conditions de déprotection permettent d'éliminer à la fois le groupement protecteur acétamide et les groupements tert- Butyloxycarbonyle (Boc) et éthers /ert-butyliques (YBu) présents sur le peptide ((a) Albericio, F. et al. in "Fmoc solid phase peptide synthesis : a practical approach", W. C.

Chan & P.D. White (Eds.), Oxford University Press, Oxford, 2000, pp.104 ; (b) catalogue Novabiochem 2004/5 pp 3.21). Le ligand est ensuite traité par une solution de 1,4-dithiothréitol (DTT) dans l'acide acétique afin de réduire d'éventuels ponts disulfure formés. Après purification par HPLC préparative sur colonne C ₁₈ , le ligand L38 est rapidement engagé dans la réaction de dimérisation.

b. Réaction d'addition de Michael entre le ligand thiol et le bras espaceur bismaléimide La réaction d'addition de Michael s'effectue dans un mélange eau/acétonitrile. Une solution du bismaléimide IV.l (1 eq.) dans l'acétonitrile est ajoutée à une solution du ligand L38 (3 eq) dans l'eau. Bien que la réaction d'addition de Michael soit rapide, il a été préféré effectuer la réaction dans des conditions relativement diluées (2,5.10 ^'3 M) afin de prévenir la formation éventuelle de ponts disulfure entre deux ligands L38. Réaction de dimérisation par réaction d'addition de Michael de L38 sur IV.l

(a) H ₂ O/CH ₃ CN

La réaction a été suivie par HPLC analytique et il a été observé qu'après 15 minutes de réaction, une nette proportion de ligand monoadduit L39' est déjà formé. Il reste cependant du bismaléimide IV.l et du ligand thiol L38 qui est mis en excès. Au bout de 24 heures, on voit apparaître la formation du produit de dimérisation L39.

Cependant, ce n'est qu'après dix jours que la réaction arrive à complétion. On remarque que la totalité du composé monoadduit a réagit avec le ligand L38 mis en excès pour former le dimère attendu L39.

c. Conclusions

L'étape clé de cette stratégie de synthèse est la préparation du macrocycle fonctionnalisé. L'issu de cette réaction de macrocyclisation s'est révélée très sensible aux choix des conditions expérimentales. Leur optimisation a néanmoins permis d'obtenir le macrocycle avec une pureté satisfaisante et suffisante pour l'engager dans la suite de la synthèse sans purification préalable.

La réaction d'addition de Michael est simple à mettre en œuvre puisqu'elle ne nécessite que de mettre en solution le ligand fonctionnalisé par un groupement thiol et le bras espaceur bismaléimide dans un mélange eau/acétonitrile. Un ajustement du pH (pH~7) peut permettre d'accélérer la réaction et de diminuer le temps de formation du dimère. La purification du brut réactionnel par HPLC préparative permet d'obtenir le ligand dimérisé. Cependant, des difficultés de purification du produit de dimérisation ont été rencontrées lorsque d'autres bismaléimides ont été utilisés. En effet, cette réaction a également été effectuée à partir d'un bras espaceur bismaléimide de type polyéthylène glycol IV.ll.

IV.11

3) Dimérisation des ligands par Ia voie « click chemistry »

Parallèlement à l'approche utilisant la réaction de Michael, la dimérisation de nos ligands synthétiques par une stratégie de « click chemistry » a été envisagée. a) La réaction de « click chemistry »

La réaction de cycloaddition 1,3-dipolaire entre un alcyne et un azoture a été découverte dans les années 1960 par Huisgen et al. (Huisgen, R.; Szeimies, G.; Moebius, L. Chem. Ber. 1967, 100, 2494-2507 ; Huisgen, R. Pure Appl. Chern. 1989,

61, 613-628). Cette réaction permet de former des motifs triazoles selon le schéma

1 : 1 Récemment, le groupe de Sharpïess et al. a découvert que l'utilisation de Cuivre I en quantité catalytique permet d'adoucir les conditions de la réaction (réaction à température ambiante) et d'améliorer les rendements ainsi que la sélectivité de la réaction (formation préférentielle du régioisomère 1,4) (KoIb, H.C.; Finn, M.G.; Sharpïess, K.B. àngew. Chem. Int. Ed. 2001, 40, 2004-2021 ; Rostovtsev, V.V.; Green, L.G.; Fokin, V.V.; Sharpïess, K.B. Angew. Chem. Int. Ed. 2002, 41, 2596-2599). Cette réaction catalysée au cuivre permet une grande variété de conditions, que ce soit au niveau du solvant, du pH ou bien encore de la source de cuivre. Habituellement, la réaction s'effectue à l'aide de Cu(SO ₄ ).5H ₂ O qui est réduit in situ par un réducteur tel que l'ascorbate de sodium ou l'acide ascorbique. Cependant, dans le cas où ces conditions ne donnent pas de résultats, une source de cuivre I (CuI, CuBr, CuOTfC ₆ H ₆ ...) peut être directement utilisée. Dans ce cas, la réaction est plus sensible à l'oxydation, et la formation de produits secondaires est parfois observée. Afin d'éviter ces réactions parasites, la réaction doit être protégée de l'air et une base tel que la 2,6-lutidine doit être ajoutée.

De manière concomitante à Sharpïess, le groupe de Meîdaï décrit l'utilisation de sels de cuivre I (CuI) pour la préparation en phase solide de peptides 1 ,4-triazole à partir d'azotures organiques et d'un alcyne accroché à l'extrémité d'un peptide-résine (Tornoe, C.W.; Christensen, C; Meldal, M. J. Org. Chem. 2002, 67, 3057-3064). Comme en solution, cette réaction tolère toutes sortes de solvants (acétonitrile, N,N- diméthylformamide, toluène, dichlorométhane) et permet d'accéder facilement et dans d'excellentes puretés au peptide triazole désiré.

Depuis cette découverte, la réaction de Huisgen 1,3-dipolaire est aujourd'hui utilisée dans de nombreux champs d'applications : que ce soit en chimie combinatoire (Lober, S.; Rodriguez-Loaiza, P.; Gmeiner, P. Org. Lett. 2003, 5, 1753-1755 ; KoIb, H.C. et al. Préparation of 1,2,3 -triazole carboxylic acids from azides and β-ketoesters in the présence of base. US2003135050), en chimie organique ((a) Fazio, F.; Bryan, M.C.;

Blixt, O.; Paulson, J.C.; Wong, C-H. J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 14397-14402; (b) Bodine, K.D.; Gin, D. Y.; Gin, M.S. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 1638-1639; (c) Seo, T.S.; Li, Z.; Ruparel, H.; Ju, J. J. Org. Chem. 2003, 68, 609-612; (d) Zhou, Z.; Fahrni, CJ. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 8862-8863; (e) Jin, T.; Kamijo, S.; Yamamoto, Y.

Ew. J. Org. Chem. 2004, 3789-3791) ou encore dans la synthèse de bioconjugués ((a) Wang, Q.; Chan, T.R.; Hilgraf, R.; Fokin, V.V.; Sharpless, K.B.; Finn , M.G. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 3192-3193. (b) Link, AJ.; Tirell, D. A. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 11164-11165. (c) Speers, A.E.; Adam, G.C.; Cravatt, B.F. J. Am. Chem. Soc. 2003, 5 125, 4686-4687. (d) Seo, T.S.; Li, Z.; Ruparel, H.; Ju, J. J. Org. Chem. 2003, 68, 609-

612. (e) Speers, A.E.; Cravatt, B.F. Chem. Biol. 2004, 11, 535-546. (f) Lee, L.V.; Mitchell, MX.; Huang, S.-J.; Fokin, V.V.; Sharpless, K.B.; Wong, C-H. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 9588-8589).

10 h. Préparation des deux réactifs nécessaires à la réaction de « click chemistry » : le diazoture et le macrocycle fonctionnalisé par un alcyne yrai

Les bras espaceurs diazotures sont préparés en deux étapes à partir des chaînes polyéthylène glycol correspondantes comme suit :

IV.13 : n = 2 IV.16 : n = 2

IV.14 : n = 6 IV.17 : n = 6

] 5 (a) MsCl (2.5 eq.), NEt ₃ (3 eq.) ou DEEA (2.5 eq.), CH ₂ Cl ₂ , 74-96%; (b) NaN ₃ (2.5 eq.), DMF, 70-96%.

Le diol est tout d'abord transformé en dimésylate et celui-ci est ensuite substitué par addition d'azoture de sodium. Afin de pouvoir évaluer l'importance de la longueur du bras espaceur, trois diazotures de taille différente (IV.15-IV.17) ont ainsi été 0 préparés (n = 1, 2, 6).

La préparation du macrocycle D,L-α-peptide débute par la synthèse du dérivé D- Ly sine IV.21 incorporant la fonction alcyne vrai et convenablement protégé en vue de son utilisation en synthèse peptidique sur support solide.

Le dérivé alcyne vrai (IV.18) servant à construire IV.21 et donnant lieu à la 5 fonctionnalité du macrocycle, provient de la réaction entre l'anhydride succinique et la mono-propargylamine comme suit :

IV.18

(a) DIEA, ACN, 71%

0 L'acide JV-Prop-2-ynyl-succmamique (IV.18) ainsi obtenu est alors couplé à l'acide aminé D-Lysine ïV-Fmoc protégé afin de former le dérivé IV.19. Une série de

déprotection et de protection permet d'obtenir le précurseur IV.21 en 5 étapes avec un rendement global de 23% :

Synthèse de l'intermédiaire couplé à un alcyne vrai.

IV.19 IV.20 IV.21

(a) BnBr (3 eq.), KHCO ₃ (1.6 eq.), Bu ₄ NI (0.1 eq.) ₅ DMSO, 100% ; (b) TFA, 100% ; (c) IV.17, BOP ₃ DIEA, ACN, 64% ; (d) LiOH IN (1 eq.), DMF, 54% ; (e) FmocOSu (1 eq.), K ₂ CO ₃ (2 eq.), Acetone/H ₂ O, 66%.

Ce précurseur fonctionnalisé ainsi préparé est alors incorporé lors de la synthèse de

Phexapeptide linéaire IV.22 en phase solide. Le peptide est ensuite cyclisé afin de former

I — IV.23 : R = Boc

^• IV.24 : R = NH ₃ ⁺ , TFA ^'

(a) Fmoc-Lys(Boc)-OH (2 eq.), DIEA (6 eq.), CH ₂ Cl ₂ ; (b) 25% pipéridine/DMF; (c) SPPS : Fmoc-Xaa-OH (5 eq.), BOP (5 eq.), HOBt (5 eq.), DIEA (15 eq.), DMF ; (d) HFIP/CH ₂ C1 ₂ (60/40 v/v) ; (e) BOP (1.2 eq.), DIEA (1.5 eq.) DMF, 83% ; (f) TFA, 87%.

A nouveau, la réaction de macrocyclisation a dû être optimisée. En effet, le profil HPLC de la réaction de cyclisation effectuée à l'aide du réactif de couplage EDCHCl montre un pic fin correspondant au macrocycle déprotégé IV.24, mais celui-ci est accompagné d'un massif important correspondant à des produits de polymérisation. Même si la dilution du milieu réactionnel a permis d'augmenter la pureté du macrocycle, le rendement de la réaction avec ce réactif de couplage reste très faible.

Il a alors été envisagé d'utiliser le réactif BOP. Celui-ci a permis d'augmenter largement le rendement (83%) et la pureté du macrocycle après déprotection (67%) des groupements Boc.

L'optimisation des conditions de cyclisation a permis d'envisager la réaction de couplage peptidique afin de former le ligand L40 correspondant, sans purification préalable du macrocycle IV.24 par HPLC préparative.

(a) Boc-Lys(Boc)-Gly-Tyr(O/Bu)-Tyr(Offlu)-Ahx-OH Pl (3.3 eq.), BOP (3.3 eq.), DIEA (15 eq.), DMF ; (b) TFA ; (c) RP-HPLC C ₁₈ .

c. Réaction de « click chemistry » i.Mise au point de la réaction de « click chemistry »

La réaction de « click chemistry » a tout d'abord été envisagée à partir du ligand déprotégé (L40) ou non (L40') de ces groupements protecteurs. Les essais de réactivité ont été réalisés avec le diazoture IV.15.

Le tableau 2 résume les conditions expérimentales utilisées. L'avancement de la réaction est suivie par HPLC analytique soit par injection directe du brut réactionnel dans le cas des expériences effectués sur le ligand déprotégé (L40), soit après traitement au

préalable à l'acide trifluoroacétique dans le cas des réactions effectuées à partir du ligand protégé (L40'). En effet, la faible solubilité du ligand L40' rend son analyse en HPLC en phase inverse et le suivi direct de la réaction de dimérisation par « click chemistry » difficile.

On a tout d'abord utilisé les conditions standards décrites par Sharpless à savoir une source de cuivre II, Cu(SO ₄ ).5H ₂ O, introduite en quantité catalytique et réduite in situ par un réducteur, l'ascorbate de sodium. Le ligand L40, qui est très hydrophile, a été solubilisé dans le mélange tBuOH/H ₂ O (1:1, v/v), utilisé classiquement par Sharpless. Les réactions effectuées avec le ligand protégé L40' ont été réalisées dans le N ₃ N'- diméthylformamide, seul solvant qui permet sa solubilisation.

Après quatre jours de réaction aucune évolution n'a été observée en HPLC, quelque soit le ligand de départ (L40 ou L40') et malgré l'ajout de quantités supplémentaires de Cuivre II et de réducteur. La réaction a également été effectuée à 80°C ainsi que sous micro-ondes. Cependant aucun résultat n'a été obtenu : au contraire, on observe une dégradation du produit de départ.

Tableau 2 : Conditions expérimentales utilisées pour la réaction 1,3-dipolaire à partir des ligands L40 ou L40'

On a donc envisagé l'utilisation directe d'une source de cuivre I, en s'appuyant sur les travaux réalisés par les groupes de Kirschenbaum (Jang, H.; Fafarman, A.; Holub, J.M.; Kirschenbaum, K. Or g Lett. 2005, 7, 1951-1954) et Ghadiri (Van Maarseveen, J.H.; Home, W.S., Ghadiri M.R. Org. Lett. 2005, 1, 4503-4506), qui effectuent des réactions 1,3-dipolaires à partir de peptides soit en solution soit en phase solide, à l'aide d'iodure de cuivre (CuI). L'utilisation d'une source de cviivre I nécessite de travailler sous atmosphère inerte et de dégazer le solvant à l'argon après solubilisation du produit.

Malgré ces précautions, aucune évolution n'a été observée lorsque la réaction est effectuée à partir des ligands L40 et L40'.

Une explication possible de ce manque de réactivité est la forte proportion d'aminés libres présentes sur le ligand L40. Il est en effet, possible que le cuivre se chélate autour de ces fonctionnalités, l'empêchant de chélater la fonction alcyne présente sur le macrocycle. Cette explication a déjà été évoquée par Nolte et al. dans le cas de réactions réalisées sur des peptides contenant des résidus arginines (Dirks, A.J.; Van Berkel, S. S.; Hatzakis, N.S.; Opsteen, J.A.; Van Delft, F.L.; Cornelissen, J.J.L.M.; Rowan, A.E.; Van Hest, J.C.M.; Rutjes, F.P.J.T. ; Nolte, RJ.M. Chem. Commun. 2005, 4172-4174). Alternativement, le fort encombrement lié à la présence du pentapeptide sur les bras du macrocycle peut empêcher ou du moins gêner la chélation du cuivre.

Suite à ces difficultés, il a été décidé de réaliser la réaction de « click chemistry » à partir du macrocycle protégé (IV.23) ou non protégé (IV.24). Le tableau 3 indique les conditions expérimentales utilisées lors de la réaction des macrocycles et du diazoture IV.15. Comme précédemment, l'avancement de la réaction est suivi par HPLC analytique soit par injection directe du mélange réactionnel dans le cas des expériences effectuées sur le macrocycle déprotégé (IV.24), soit après traitement au préalable à l'acide trifluroroacétique dans le cas des réactions effectuées à partir du macrocycle protégé (IV.23). Dans les conditions de Kirschenbaum, aucune évolution n'a été observée par

HPLC analytique (entrée 1). Par contre, dans les conditions de Ghadiri (entrées 2, 3 et 4), on a pu observer une diminution significative du produit de départ accompagnée de l'apparition d'un nouveau produit. Ce produit n'a cependant pas pu être caractérisé à ce stade. Ces réactions ont été réalisées dans l'acétonitrile (entrées 2 et 4) ou dans un mélange eau/acétonitrile (entrée 3). Ce solvant a été choisi car il est préconisé par

Sharpless lors de l'utilisation d'une source de Cuivre I (Rostovtsev, V.V.; Green, L. G.; Fokin, V.V.; Sharpless, K.B. Angew. Chem. Int. Ed. 2002, 41, 2596-2599).

Tableau 3 : Conditions expérimentales utilisés pour la réaction 1,3-dipolaire à partir du macrocycle protégé ou non.

A partir de ces résultats, il a été décidé d'effectuer la réaction à partir du macrocycle protégé IV.24 dans le λζiV'-diméthylformamide pour une meilleure solubilisation. En synthèse pseudopeptidique, Meldal utilise 2 équivalents de CuI et 50 équivalents de DDEA (Tomoe, C.W.; Christensen, C; Meldal, M. J. Org. Chem. 2002, 67, 3057-3064). Dans notre cas, la proportion de base a été augmentée à 25 équivalents de DIEA et 25 équivalents de 2,6-lutidine (entrée 6). Après trois jours d'agitation et traitement au TFA, l'analyse HPLC révèle la disparition quasi complète du cycle de départ (transformé en IV.24 après TFA, environ 2% restant) et l'apparition d'un produit majoritaire. La purification du brut réactionnel par HPLC préparative a permis d'identifier le produit majoritaire comme étant la molécule dimérique attendue IV.25 issue de la réaction par « click chemistry ». D'après l'analyse HPLC, le rapport IV.24:IV.25 est de 3:97 (Figure 2).

L'utilisation de CuBr (entrée 5) a également été explorée. La réaction a été arrêtée après trois jours d'agitation à 8O ⁰ C. Comme précédemment, l'analyse HPLC montre une conversion quasi complète du produit de départ (12% de IV.24 restant) mais cette fois ci deux produits sont formés majoritairement dans un rapport 41:59 (IV.25:IV45'). Il s'agit du composé dimérisé attendu IV.25 et du dérivé IV.25' résultant de la formation d'un seul motif triazole (Figure 3).

Même si ces conditions permettent d'accéder au produit de dimérisation, elles sont cependant moins efficaces que celles mettant enjeu l'iodure de cuivre car elles conduisent après 3 jours à un mélange de trois produits. Par conséquent, les conditions décrites dans l'entrée 6 du tableau 2 ont été conservées afin de généraliser la réaction de dimérisation 1,3-dipolaire aux autres bras espaceurs TV.16 et IV.17.

Réaction de dimérisation du macrocycle fonctionnalisé à partir de différents bras espaceurs.

1V.26 : n = 2 IV.27 : n = 6

(a) CuI (2 eq.), DIEA (25 eq.), 2,6-lutidine (25 eq.), DMF ; (b) TFA ; (c) Ci ₈ RP-HPLC.

Les composés IV.25 à IV.27 ont été isolés dans des rendements allant de 12 à 20% après purification par HPLC préparative.

Les ligands correspondants L41 à L43 ont alors été préparés par couplage des macrocycles dimérisés et du pentapeptide protégé Boc-Lys(Boc)-Gly-Tyr(OtBu)- Tyr(OtBu)-Ahx-OH (Pl), déprotection des groupements protecteurs et purification par HPLC préparative.

Habituellement, la réaction de couplage est effectuée en deux jours. Ici, la réaction nécessite une semaine d'agitation à température ambiante pour arriver à

complétion. L'arrêt de la réaction après seulement trois jours montre la présence de plusieurs produits intermédiaires résultant d'un couplage partiel du pentapeptide sur les aminés ^ε NH disponibles.

TFA-

IV.26 : n = 2 IV.27 : n = 6

L41 : n = 1 L42 : n = 2 L43 : n = 6

(a) Boc-Lys(Boc)-Gly-Tyr(Offiu)-Tyr(Offiu)-Ahx-OH Pl (6.6 eq.) ₅ BOP (6.6 eq.), DIEA (20 eq.), DMF, 1 semaine ; (b) TFA ₅ 5% H ₂ O ; (c) C ₁₈ RP-HPLC.

Chacun de ces ligands ont été caractérisés par HPLC, masse (MALDI-TOF) (Figures 4A, 4B et 4C).

Tableau 4 : Analyse par RMN du ligand L41. Expérience RMN réalisée dans H ₂ O/tert-Butanol-d ₉ à 300K sur un spectromètre 500MHz.

ii. Remarques sur la réaction de « click chemistry »

L'ordre d'addition des réactifs semble être important dans la réaction mise au point précédemment. En effet, les deux bases doivent être ajoutées avant l'addition de l'iodure de cuivre. Si le métal est ajouté en premier, on observe une diminution de la pureté du macrocyle dimérisé en fin de réaction.

De plus, il est intéressant de noter que l'utilisation de deux équivalents de cycle fonctionnalisé par rapport au diazoture n'est pas nécessaire à la formation du dimère. En effet en réalisant un mélange équimoléculaire, la réaction de dimérisation arrive également à complétion. Il semble donc, comme l'a déjà mentionné Sharless, que l'utilisation d'un diazoture facilite la formation du ditriazole, et que la formation du premier triazole favorise la formation du deuxième (Rodionov, V.O.; Fokin, V. V.; Finn, M.G. Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 2210-2215).

Enfin, l'utilisation d'un additif comme le tris~(benzyltriazolylmethyl)amine (TBTA) pourrait être la solution pour réaliser la réaction de « click chemistry » directement à partir du ligand L40 ou L40' ((a) Wang, Q.; Chan, T.R.; Hilgraf, R.; Fokin, V.V.; Sharpless, K.B.; Finn , M.G. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 3192-3193. (b) Chan, T.R.; Hilgraf R.; Sharpless K.B.; Fokin, V.V. Org. Lett. 2004, 6, 2853-2855). Identifié par Sharpless, le TBTA enveloppe le cuivre I et évite les interactions déstabilisantes provenant des sites de liaison libres comme les aminés. De plus, il permet d'accélérer la réaction de cycloaddition 1,3-dipolaire.

B) BIOLOGIE

1) Purification et culture des cellules B spléniques.

Les rates ont été prélevées sur des souris BALB/c âgées de 5-12 semaines. Les cellules B spléniques ont été préparées par sélection positive en utilisant des billes magnétiques recouvertes avec un anticorps monoclonal anti-CD19 (MACS, Milteny biotech, Allemagne). Cette fraction contient plus de 95% de cellules B220 ⁺ . Les cellules B (3 x 10 ⁶ /mL) ont été ensuite cultivées sur un milieu RPMI 1640 enrichi avec 10% de FBS décomplémenté, de la gentamicine (10 μg/mL), 25 mM d'Hepes et 10 μM de β- mercaptoéthanol en présence d'analogues de CD40L. Les cellules ont été puisées avec 1 μCi/puit de thymidine tritiée (ICN, Irvine, CA) durant les dernières 20 h de culture et la capture de [ H] -thymidine exprimée en cpm a été mesurée après 72 h en utilisant un compteur direct beta Matrix 9600 (Packard, Meriden, CT). Les résultats (Fig 5B) sont exprimés en index de stimulation correspondant aux cpm obtenus dans les cultures avec des analogues de CD40L/cpm obtenus dans les cultures sans analogues de CD40L. Les souris utilisées dans cette étude ont été élevées dans nos animaleries qui sont approuvées par les services vétérinaires français sous le numéro D-67-482-2.

2) Culture de cellules et induction de l'apoptose.

Le lymphome de Burkitt (RAJI) a été cultivé sur un milieu RPMI 1640 (Cambrex Bioscience, Verviers, Belgique) enrichi avec 10% de sérum bovin foetal décomplémenté (FBS) et de la gentamicine (10 μg/mL). Pour les dosages d'apoptose, les cellules (1 xlO /mL) ont été incubées à 37°C dans des plaques 96-puits, aux concentrations indiquées d'analogues de CD40L, dans un volume final de 200μL. Après 16h d'incubation, l'apoptose des cellules a été mesurée comme décrit ci-dessous.

3) Mesure de l'apoptose des cellules.

L'apoptose a été évaluée par mesure de la décroissance du potentiel transmembranaire mitocliondrial (δψ _m ) associé à la réduction de la capture du colorant cationique, l'iodure de 3,3'-dihéxyloxacarbocyanine (DiOC ₆ (3)), tel que démontré par cytométrie de flux (Zamzami et al., J. Exp. Med. 1995, 191 : 1661).

Pour cela, les cellules ont été puisées with DiOC6(3) (Interchim, Montluçon, France)) à une concentration finale de 4OnM pendant les dernières 45 minutes de culture.

Les cellules ont été ensuite lavées, resuspendues dans 300 μL de PBS et analysées par cytométrie de flux. Les résultats (Fig 5A) sont exprimés en pourcentage d'apoptose spécifique selon la formule suivante: % d'apoptose spécifique = [(% de cellules traitées mortes - % de cellules contrôle mortes) x 100]/(100 - % de cellules contrôle mortes).

Les cellules ont été analysées avec un FACSCalibur ^® . Au moins 25,000 événements ont été acquis pour chaque expérience en utilisant le logiciel CellQuest 3.3

(Becton Dickinson, Pont de Claix, France) et les données ont été analysées par le logiciel WinMDI 2.8 (Joseph Trotter, Scripps Research Institute, http ://facs. scripps . edu/software .html) .

4) Résultats

II a été observé que le ligand L41, ligand dimérique issu de la synthèse par « click chemistry », induit un pourcentage d'apoptose spécifique des lymphomes de Burkitt

(RAJI) à des doses où Ll n'est pas actif (Figure 5A).

De plus ce ligand induit seul la prolifération des cellules B spléniques murines alors que le ligand monomérique Ll ne le faisait pas sans potentialisation avec l'anticorps anti-CD40 3/23 (Figure 5B).

PARTIE EXPéRIMENTALE DéTAILLéE

Bismaléimidohexane (IV.l) On ajoute du iV-(rnéthoxy-carbonyl)maléimide (320 mg ; ² _> ⁰⁶ mmol) à 0°C à une solution agitée de N ₁ N'- diaminohexane (100 mg ; 0,86 mmol) dans NaHCO ₃ saturé

/ THF (tétrahydrofurane) (V, = 8 ml, 1 :1 v/v). Le mélange réactionnel est agité à 0°C pendant 10 min et est ensuite agité pendant 4 h à température ambiante. Le produit a ensuite été isolé par extraction avec de l'acétate d'éthyle. Les couches organiques combinées ont été lavées avec de l'eau et de la saumure, séchées sur Na ₂ SO ₄ , filtrées et concentrées sous vide pour obtenir le composé IV.l (230 mg ; rendement = 100%) : CLHP t _R 15,78 min (gradient linéaire, 30-100% B, 20 min) ; RMN ¹ H (300 MHz, CDCl ₃ , 298 K) δ 6,67 (s ; CH maléimide ; 4H) ; 3,48 (t ; NCH ₂ ; J = 7,2 Hz ; 4H) ; 1,62-1,54 (m, NCH ₂ CH ₂ , 4η) ; 1,31-1,26 (m, NCH ₂ CH ₂ CH ₂ , 4η) ; RMN ¹³ C (300

MHz, CDCl ₃ , 298 K) 170,84 (4 CO) ; 134,03 (4 CH) ; 37,67 (2 CH ₂ ) ; 28,32 (2 CH ₂ ) ; 26,15 (2 CH ₂ ) ; HRMS (ESI) : m/z : calculé pour C ₁₄ H _n N ₂ O ₄ : 277,11 ; trouvé : 277,1183 ; calculé pour C ₁₄ H ₁₆ N ₂ O ₄ Na : 299,1 1 ; trouvé : 299,1002.

Acide 3-((acétamidométhyI)sulfanyl)propanoïque (Acm) (IV.2) De l'acide 3-mercaptopropanoïque (1,64 mL ; 19 mmol) est dissous dans de l'acide trifluoroacétique (30 mL). On ajoute du

N-(hydroxyméthyl)acétamide (1,6 g ; 19 mmol). Après agitation pendant 30 minutes à température ambiante, le TFA (acide trifluoroacétique) est retiré par évaporation pour obtenir IV.2 : HPLC t _κ 7,1 min (gradient linéaire, 5-65% B, 20 min) ; RMN ¹ H (300

MHz, CDCl ₃ , 298 K) δ 12,4 (s, COOH, 1η) ; 7,74 (d, NH, J = 5,8 Hz, IH) ; 4,34 (d, SCH ₂ NH, J= 6 Hz ₅ 2H) ; 2,81 (t, CH ₂ SCH ₂ NH, J= 6,4 Hz, 2H) ; 2,67 (t, CH ₂ COOH, J = 6,4 Hz, 2H) ; 2,1 (s, NHCOCH ₃ , 3η) ; RMN ¹³ C (300 MHz, CDCl ₃ , 298 K) 177,45 (CO) ; 174,63 (CO) ; 41,60 (CH ₂ ) ; 34,37 (CH ₂ ) ; 25,67 (CH ₂ ) ; 21,46 (CH ₃ ).

Fmoc-D-Lys(Boc)-OBn (IV.3) Du Fmoc-D-Lys(Boc)-OH (5 g ; 10 mmol) est dissous dans du

DMSO (diméthylsulfoxyde) (22 mL). On ajoute séquentiellement KHCO ₃ (1,6 g ; 16 mmol) et Bu ₄ NI (390 mg ; 1 mmol). Après 30 min d'agitation, on ajoute du bromure de benzyle (3,8 mL ; 30 mmol). Le mélange est ensuite agité pendant une nuit. On ajoute ensuite de l'eau à la solution et la couche aqueuse est extraite avec de l'acétate d'éthyle. Les couches organiques combinées sont lavées avec du NaHCO ₃ saturé, une solution saturée de Na ₂ S ₂ O ₃ et de la saumure. L'évaporation du solvant et la précipitation dans du cyclohexane à -78 ⁰ C donne le composé IV.3 (5,80 g ; rendement = 98%) : HPLC / _R

16,94 min (gradient linéaire, 30-100% B, 20 min) ; RMN ¹ H (300 MHz, CDCl ₃ , 298 K) £7,76 (d, CHAiom Fmoc, J= 7,4 Hz, 2H) ; 7,60 (d, CHAiom Fmoc, J= 7,4 Hz, 2H) ; 7,42-7,25 (m, CHArom Fmoc et Ph, 9H) ; 5,18 (s, CJf ₂ Ph, 2H) ; 4,47-4,23 (m, CH ₂ Fmoc et CH Fmoc, 3H) ; 4,21 (t, FmocNHCH, J = 6,9 Hz, IH) ; 3,09-3,01 (m, CH ₂ Lysine, 2H) ; 1,95-1,64 (m, CH ₂ Lysine, 2H) ; 1,51-1,22 (m, CH ₂ Lysine et C(CH^) ₃ , 13H) ;

RMN ¹³ C (300 MHz, CDCl ₃ , 298 K) 172,33 (CO) ; 156,08 (CO) ; 156,00 (CO) ; 143,93 (2 C) ; 141,3 (C) ; 135,27 (2 C) ; 128,65 (2 CH) ; 128,54 (2 CH) ; 128,37 (CH) ; 127,71 (2 CH) ; 127,08 (2 CH) ; 125,12 (2 CH) ; 1 19,98 (2 CH) ; 79,20 (C) ; 67,19 (CH ₂ ) ; 67,03 (CH ₂ ) ; 53,80 (CH) ; 47,16 (CH) ; 40,04 (CH ₂ ) ; 32,11 (CH ₂ ) ; 29,58 (CH ₂ ) ; 28,43 (CH ₃ ) ; 22,30 (CH ₂ ).

Sel Fmoc-D-Lys-OBn, TFA (IV.4)

NH ₃ ⁺ TFA" Le composés IV.3 (5,80 g ; 10,34 mmol) est dissous dans du TFA (16 mL). Après agitation pendant 30 minutes à température ? f |] ambiante, le TFA est éliminé par évaporation avec de l'éther et o du cyclohexane. Le composé IV.4 a été obtenu : HPLC /R 10,91 min (gradient linéaire, 30-100% B, 20 min) ; RMN ¹ H (300 MHz, CDCl ₃ , 298 K) δ 7,71 (d, CH Arom Fmoc, J= 7,5 Hz, 2H) ; 7,53 (d, CHAiom Fmoc, J= 7,5 Hz, 2H) ; 7,37- 7,21 (m, CH Arom Fmoc et Ph, 9H) ; 5,6 (d, Ni/, J = 8,06 Hz, IH) ; 5,12 (s, CH ₂ Ph, 2H) ; 4,33 (m, CH Fmoc et CH ₂ Fmoc, 3η) ; 4,14 (t, FmocNHCH, J = 6,94 Hz, IH) ;

2,91-2,83 (m, CH ₂ Lysine, 2η) ; 1,65-1,52 (m, CH ₂ Lysine, 4η) ; 1,39-1,26 (m, CH ₂ Lysine, 2η) ; RMN ¹³ C (300 MHz, CDCl ₃ , 298 K) 172,12 (CO) ; 156,30 (CO) ; 143,66 2 (C) ; 141,26 (C) ; 135,08 (2 C) ; 128,63 (2 CH) ; 128,57 (2 CH) ; 128,33 (CH) ;

127,77 (CH) ; 127,10 (CH) ; 125,10 (CH) ; 120,01 (CH) ; 67,38 (CH ₂ ) ; 67,21 (CH ₂ ) ; 53,61 (CH) ; 47,01 (CH) ; 39,55 (CH ₂ ) ; 31,76 (CH ₂ ) ; 26,69 (CH ₂ ) ; 21,98 (CH ₂ ).

(9H-fluorén-9-yl)raéthyll-((benzyloxy)carbonyl)-5-(3-((ac� �tamidométhyl)sulfanyl) propanamido)pentylcarbamate (IV.5) Le composé IV.2 (2,2 g ; 12,41 mnαol) est dissous dans du DMF (diméthylformamide) (40 mL). On ajoute du DIEA (N,N- diisopropyléthylèneamine) (2 mL ; 12,41 mmol) au TFA neutralisé. Ensuite on ajoute séquentiellement le composé IV.4 (10,34 mmol) dans du DMF (2O mL) avec de la DIEA (2 mL ; 12,41 mmol), du BOP (benzotriazol-1-yloxy- tris(diméthylamino)phosphonium hexafluorophosphate) (2,2 g ; 12,41 mmol). Le mélange réactionnel est ajusté à pH = 8/9 avec de la DIEA. Après

6h d'agitation, le DMF est évaporé sous pression réduite et replacé dans du CH ₂ Cl ₂ qui a été lavée avec du NaHCO ₃ saturé, de l'eau et du KHSO ₄ IN plusieurs fois. Le séchage sur Na ₂ SO ₄ et l'évaporation du filtrat a permis d'obtenir une huile qui a été précipatée dans CH ₂ Cl ₂ / IPE (diisopropyléther) pour obtenir le composé IV.5 pur (5,74 g ; rendement = 90 %) : HPLC t _R 13,29 min (gradient linéaire, 30-100% B, 20 min) ; RMN ¹ H (300 MHz, OMSO-d ₆ , 298 K) £ 8,46 (t, Ni/, J = 6,11 Hz, IH) ; 7,9 (d, CH Arom Fmoc, J = 7,4 Hz, 2H) ; 7,87-7,81 (m, NH, 2H) ; 7,71 (d, CH Arom Fmoc, J = 7,2 Hz,

2H) ; 7,45-7,26 (m, CH Arom Fmoc et Ph, 9η) ; 5,12 (s, CH ₂ Ph, 2η) ; 4,31 (d, CHFmoc, J= 6,3 Hz, IH) ; 4,20 (d, CH ₂ Fmoc, J= 6,3 Hz, 2H) ; 4,06-4,01 (m, FmocNHCH, 1η) ; 3,0 (m, CH ₂ Lysine, 2η) ; 2,72 (t, CH ₂ CONH, J = 7,2 Hz, 2H) ; 2,53 (s, NHCOCH ₅ , 3η) ; 2,35 (t, CH ₂ SCH ₂ NHCOCH ₃ , J = 7,2 Hz, 2H) ; 1,83 (s, SCH ₂ NH, 2H) ; 1,71-1,60 (m, CH ₂ Lysine, 2η) ; 1,30-1,39 (m, CH ₂ Lysine, 4η) ; ¹³ C RMN (300 MHz, OMSO-d ₆ ,

298 K) 172,78 (CO) ; 170,70 (CO) ; 169,68 (CO) ; 156,63 (CO) ; 144,25 (2 C) ; 141,17 (C) ; 136,40 (2 C) ; 128,66 (2 CH) ; 128,54 (2 CH) ; 128,33 (CH) ; 127,76 (2 CH) ; 127,11 (2 CH) ; 125,12 (2 CH) ; 120,11 (2 CH) ; 66,31 (CH ₂ ) ; 66,12 (CH ₂ ) ; 54,41 (CH) ; 47,07 (CH) ; 40,18 (CH ₂ ) ; 38,66 (CH ₂ ) ; 36,07 (CH ₂ ) ; 30,72 (CH ₂ ) ; 29,06 (CH ₂ ) ; 26,62 (CH ₂ ) ; 23,35 (CH ₂ ) ; 23,01 (CH ₃ ).

Fmoc-D-Lys(Acm)-OH (IV.7) Le composé IV.6 (2,21 g ; 7,2 mmol) est dissous dans une solution de H ₂ O (50 mL) avec K ₂ CO ₃ (2 g ; 14,4 mmol). Ensuite on ajoute doucement du Fmoc-OSu (9- fluorénylméthyloxycarbonyl-N-hydroxysuccinimide) (2,4 g ; 7,2 mmol) dans de l'acétone (50 mL). Après 7 heures d'agitation, on ajoute de l'eau. La phase aqueuse est lavée rapidement avec de l'éther et est ajustée à pH = 3 avec du HCl IN et est ensuite extraite avec CH ₂ Cl ₂ . Le séchage sur Na ₂ SO ₄ et l'évaporation du filtrat permet d'obtenir une huile qui est précipitée dans CH ₂ CVlPE (diisopropyiéther) pour donner le composé pur IV.7 (2,24 g ; rendement == 60%) : HPLC / _R 8,9 min (gradient linéaire, 30-100% B, 20 min) ; ¹ H RMN (300 MHz, DMSO-4, 298 K) £ 8,47 (t, NH, J= 6,07 Hz, IH) ; 7,9 (d, CH Arom Fmoc, J= 7,46 Hz, 2H) ; 7,85 (t, NH, J= 5,92 Hz, IH) ; 7,73 (d, CHArom Fmoc, J= 7,4 Hz, 2H) ; 7,58 (d, NH, J= 8 Hz, IH) ; 7,44-7,30 (m, CH Arom Fmoc, 4η) ; 4,26 (t, CH Fmoc, J= 7,5 Hz, IH) ; 4,20 (d, CH ₂ Fmoc, J= 6,3 Hz, 2H) ; 3,90 (m, FmocNHCH, 1η) ; 3,05-2,99 (m, CH ₂ Lysine, 2η) ; 2,72 (t, CH ₂ CONH, J

= 7,3 Hz, 2H) ; 2,5 (s, NHCOCH ₅ , 3η) ; 2,36 (t, CH ₂ SCH ₂ NHCOCH ₃ , J= 7,23 Hz, 2H) ; 1,67- 1,57 (m, CH ₂ Lysine, 2η) ; 1,42-1,33 (m, CH ₂ Lysine, 4η) ; ¹³ C RMN (300 MHz, DMSO-ύfe, 298 K) 174,48 (CO) ; 170,70 (CO) ; 169,68 (CO) ; 156,58 (CO) ; 144,25 (2 C) ; 141,15 (2 C) ; 128,85 (CH) ; 128,08 (2 CH) ; 127,51 (2 CH) ; 125,73 (2 CH) ; 66,03 (CH ₂ ) ; 54,26 (CH) ; 47,10 (CH) ; 40,21 (CH ₂ ) ; 38,73 (CH ₂ ) ; 36,09(CH ₂ ) ; 30,91 (CH ₂ ) ;

29,12 (CH ₂ ) ; 26,64 (CH ₂ ) ; 23,50 (CH ₂ ) ; 23,24 (CH ₃ ) ; MS (MALDI-TOF) calculé pour C ₂₇ H ₃₃ N ₃ O ₆ S : 527,21. Trouvé [M+Na ⁴ ] ≈ 550,11; [M+K ⁺ ] = 566,20.

H-(D)AIa-LyS(BOC)-(D)LyS(ACm)-LyS(BoC)-(D)AIa-LyS(BoC)-OH (IV-S)

lavée avec du DMF, de Pisopropanol, du CH ₂ Cl ₂ , de Péther diéthylique, et séchée sous vide. La charge de la résine est déterminée par UV du dérivé fmoc après traitement avec 20% de pipéridine dans du DMF (charge = 0,3 mmol/g).

FmocXaaOH (5 eq.) est couplé deux fois à température ambiante pendant 30 min à la résine Fmoc-déprotégée en présence de BOP (5 eq.), HOBt (1- hydroxybenzotriazole) (5 eq.) et DIEA (15 eq.). Le composé IV.7 (2,5 eq.) est couplé une fois à température ambiante pendant 2 h en présence de BOP (2,5 eq.), HOBt (2,5 eq.) et DIEA (10 eq.). Après répétition de ces étapes de déprotection et couplage, le peptide est clivé de la résine avec un mélange de HFIP (hexafluoroisopropanol) et CH ₂ Cl ₂ (60/40). Après agitation pendant 2 h, la résine est filtrée et lavée plusieurs fois avec CH ₂ Cl ₂ . L'évaporation du solvant permet d'obtenir le composé IV.8 (rendement : 100%) : HPLC t _R 7.62 min (gradient linéaire, 30-100% B, 20 min) ; Pureté du produit brut déterminée par HPLC (gradient linéaire, 30-100 % B, 20 min) : 73% ; MS (MALDI-TOF) calculé pour C _5I H ₉₃ N _n O ₁₅ S : 1131,66. Trouvé : [M+Na ⁺ ] =1154,27, [M+K ⁺ ] = 1170.21 ; HRMS(ESI) : m/z : calculé pour C ₅₁ H ₉₄ N _n O ₁₅ S : 1132.66, trouvé : 1132.6646 ; calculé pour C ₅₁ H ₉₃ N _n O ₁₅ SNa : 1154,66, trouvé : 1154,6466.

Cyclo [(D)AIa-LyS(BoC)-(D)LyS(ACm)-LyS(BoC)-(D)AIa-LyS(BoC)] (IV.9)

NaHCO ₃ saturé. Le précipité est filtré et lavé avec du NaHCO ₃ saturé puis de l'eau, du KHSO ₄ IN, de la saumure, de l'acétate d'éthyle, de Facétonitrile et du cyclohexane. Le solide blanc IV.9 est séché sous vide (222 mg, rendement : 77%) ; HPLC t _κ 10,09 min (gradient linéaire, 30-100% B, 20 min) ; Pureté du produit brut déterminée par HPLC (gradient linéaire, 30-100 % B, 20 min) : 87 % ; MS (MALDI-TOF) calculé pour C ₅₁ H ₉₁ N _n O ₁₄ S : 1113,65. Trouvé : [M+Na ⁺ ] = 1136,44 ; [M+K ⁺ ] = 1152,42.

cyclo [D)Ala-Lys-(D)Lys(Acm)-Lys-(D)AIa-Lys] (IV.10) Le composé IV.9 (100 mg ; 0,089 mmol) ^es * dissous dans de l'acide trifluoroacétique

(5 mL) avec 5% d'eau. Après 20 min d'agitation à température ambiante, le mélange réactionnel est précipité avec de l'éther. Le sel de TFA attendu est filtré, lavé avec de l'éther. Le solide blanc IV.10 est séché sous vide (84 mg, rendement : 85%) : HPLC t _κ 6.56 min (gradient linéaire,

5-65% B, 20 min) ; Pureté du produit brut déterminée par HPLC (gradient linéaire, 5-65 % B, 20 min) : 86% ; MS (MALDI-TOF) calculé pour C ₃₆ H ₆₇ N ₁₁ O ₈ S : 813,05. Trouvé : [M+Na ⁺ ] = 836,44 ; [M+K ⁺ ] = 852,41 ; HRMS(ESI) : m/z : calculé pour C ₃₆ H ₆₈ N ₁₁ O ₈ S : 814,05 ; trouvé : 814,497.

Bismaléimidodiéthylèneglycol (IV.ll) O Onn aajjoouute à une solution agitée de N ₁ N'- diaminodiéthylèneglycol (100 mg ; 0,67 mmol) dans NaHCO ₃ saturé / THF (V, = 6mL, 1:1 v/v) à 0°C du JV- (méthoxy-carbonyl)maléimide (251 mg ; 1,62 mmol). Le mélange réactionnel est agité à

0°C pendant 10 minutes et est ensuite laissée agiter pendant 4 heures à température ambiante. Le produit est ensuite isolé par extraction avec de l'acétate d'éthyle. Les couches organiques combinées sont lavées avec de l'eau et de la saumure, séchées sur Na ₂ SO ₄ , filtrées et concentréess sous vide pour obtenir le composé IV.ll (150 mg, rendement = 72%) : HPLC fe 10.40 min (gradient linéaire, 30-100% B ₅ 20 min) ; ¹ H

RMN (300 MHz, CDCl ₃ , 298 K) δ 6,67 (s, CH maléimide, 4H) ; 3,68-3,63 (m, NCH ₂ CH ₂ O, 4H) ; 3,58-3,54 (m, NCH ₂ CH ₂ O, 4η) ; 3,51 (s, OCH ₂ CH ₂ O, 4H) ; ¹³ C RMN (300 MHz, CDCl ₃ , 298 K) 170,66 (4 CO) ; 134,13 (4 CH) ; 69,97 (2 CH ₂ ) ; 67,77 (2 CH ₂ ) ; 37,09 (2 CH ₂ ) ; HRMS (ESI) : m/z : calculé pour Ci ₄ H ₁₇ N ₂ O ₆ : 309,10 ; trouvé : 309,1081 ; calculé pour Ci ₄ Hi ₆ N ₂ O ₆ Na : 331,10 ; trouvé : 331,0901.

Dimésylate (IV.12)

Du triéthylène glycol (2 g ; 13,31 mmol) est dissous dans du

MsO ^^ ^^ O ^^

CH ₂ Cl ₂ (20 mL). On ajoute séquentiellement de la DIEA (5,6 mL ; 33,3 mmol) et du méthanesulfonylchlorure (2,6 mL ; 33,3 mmol). Le mélange est agité pendant 3 h et ensuite le CH ₂ Cl ₂ est évaporé. Le résidu est replacé dans de l'acétate d'éthyle. La phase organique est lavée avec du NaHCO ₃ saturé, de l'eau, du KHSO ₄ IN et de la saumure. Le séchage sur Na ₂ SO ₄ et l'évaporation du solvant permet d'obtenir IV.12 (3,93 g ; rendement = 96%) : ¹ H RMN (300 MHz, CDCl ₃ , 298 K) δ 4,25-4,22 (m, CH ₂ OMs, 4η) ; 3,64 (m, CH ₂ CH ₂ OMs, 4H) ; 3,55 (s, OCH ₂ CH ₂ O, 4H) ;

2,96 (s, SO ₂ CH ₃ , 6η) ; ¹³ C RMN (300 MHz ₅ CDCl ₃ , 298 K) 70,33 (CH ₂ ) ; 69,43 (CH ₂ ) ; 68,82 (CH ₂ ) ; 37,42 (CH ₃ ).

Dimésylate (IV.14) De Poctaéthylène glycol (540 mg ; 1,46 mmol) est dissous dans CH ₂ Cl ₂ (2 mL). A 0 ⁰ C, on ajoute successivement dans le mélange de la triéthylamine (606 μL ; 4,37 mmol) et du méthanesulfonylchlorure (288 μL ; 3,6 mmol). Après 4h d'agitation, le solvant est évaporé. Le résidu est replacé avec de l'acétate d'éthyle et la couche organique est lavée avec du NaHCO ₃ saturé et du

KHSO4 IN. Le séchage sur Na ₂ SO ₄ et l'évaporation du solvant permet d'obtenir IV.14 (560 mg ; rendement = 73%) : ¹ H RMN (300 MHz, CDCl ₃ , 298 K) 4,26-4,22 (m, CH ₂ OMs, 4H) ; 3,65-3,62 (m, CH ₂ CH ₂ OMs, 4H) ; 3,53-3,50 (m, OCH ₂ CH ₂ O, 24H) ; 2,96 (s, OSO ₂ CH ₃ , 6η) ; ¹³ C RMN (300 MHz, CDCl ₃ , 298 K) 70,43 (CH ₂ ) ; 69,47 (CH ₂ ) ; 68,88 (CH ₂ ) ; 37,57 (CH).

l,2-Bis(2-azidoéthoxy)éthane (IV.15)

On ajoute de l'azoture de sodium (1,33 g ; 20,57 mmol) à une solution de IV.12 (1,05 g ; 3,4 mmol) dans du DMF (10 mL). Le mélange réactionnel est chauffé pendant une nuit à 6O ⁰ C. Après refroidissement, on ajoute de l'eau et la phase aqueuse est extraire avec de l'éther. La phase organique est ensuite lavée avec de l'eau et séchée sur Na ₂ SO ₄ . L'évaporation du solvant donne IV.15 (670 mg, rendement = 96%) : HPLC t _R 8,29 min (gradient linéaire, 30-100% B, 20 min) ; ¹ H RMN (300 MHz, CDCl ₃ , 298 K) δ 2,98-2,94 (m, CH ₂ CH ₂ N ₃ , 4H) ; 2,94 (s, OCH ₂ CH ₂ O, 4H) ; 2,67-2,63 (m, CH ₂ N ₃ , 4η) ; ¹³ C RMN (300 MHz, CDCl ₃ , 298 K) 70,44 (CH ₂ ) ; 69,88

(CH ₂ ) ; 50,45 (CH ₂ ).

Diazide (IV.17)

On ajoute de l'azoture de sodium (170 mg ; 2,6 mmol) à une

N ₃ " ^ ^~ γ- "Oi ⁶ solution agitée de IV.14 (550 mg, 1.044 mmol) dans du DMF (8 mL). Le mélange réactionnel est chauffé pendant une nuit à 60 ⁰ C. Après refroidissement, on ajoute de l'eau et la phase aqueuse est extraite avec de l'éther. La phase organique est ensuite lavée avec de l'eau et séchée sur Na ₂ SO ₄ . L'évaporation du solvant permet d'obtenir IV.17 (300 mg, rendement = 70%) : HPLC t _R 6,59 min (gradient linéaire, 30-100% B, 20 min) ; ¹ H RMN (300 MHz, CDCl ₃ , 298 K) δ 3,66-

3,60 (m, OCH ₂ CH ₂ O and CH ₂ CH ₂ N ₃ , 28H) ; 3,38-3,33 (m, CH ₂ N ₃ , 4η) ; ¹³ C RMN (300 MHz, CDCl ₃ , 298 K) 70,68 (CH ₂ ) ; 70,66(CH ₂ ) ; 70,62 (CH ₂ ) ; 70,57 (CH ₂ ) ; 50,67 (CH ₂ ).

Acide iV-PropyI-2-ynyl-succinamique (Nps) (IV.18) On dissout de la dihydrofuran-2,5-dione (3,9 g ; 40 mmol) dans de l'acétonitrile (40 mL). On ajoute de la prop-2-yn-l -aminé (1,5 mL ; 51 mmol). Après 2 h d'agitation, la précipitation se produit. Le précipité est filtré et lavé avec de l'acétonitrile. Le composé IV.18 est obtenu (4,12 g ; rendement = 71%) : ¹ H

RMN (300 MHz, DMSO-J ₅ , 298 K) £3,83 (dd, WLCH ₂ CCU, J= 5,4 and 2,5 Hz, 2H) ; 3,33 (d, CCH, J = 2,5 Hz, IH) ; 2,42-2,36 (m, CH ₂ CO ₂ H, 2H) ; 2,33-2,27 (m, CH ₂ CONH, 2H) ; ¹³ C RMN (300 MHz, OMSO-(I ₆ , 298 K) 174,33 (CO) ; 172,29 (CO) ; 81,69 (CH) ; 73,45 (C) ; 30,35 (CH ₂ ) ; 29,66 (CH ₂ ) ; 28,24 (CH ₂ ).

(9H-Fluorén-9-yl)méthyl l-((benzyloxy)carbonyI)-5-(succinamido)pentyIcarbamate (Fmoc-Lys(Nps)-OBn) (IV.19) Le composé IV.4 (9,7 mmol) est dissous dans de Pacétonitrile (30 mL) avec de la DIEA (1,9 mL ; 11.6 mmol). On ajoute séquentiellement de l'acide 3-(prop-2- ynylcarbamoyl)propanoïque (1,8 g ; 11,6 mmol), de la BOP (5,13 g ; 11,6 mmol) et de la DIEA (1,9 mL ; 11.6 mmol). Après 3 heures d'agitation, la précipitation se produit. Le précipité est filtré et lavé avec du NaHCO ₃ saturé, de l'eau et du KHSO ₄ IN et ensuite de Pacétonitrile et du diisopropyléther. Le composé IV.19 est obtenu (3,7 g ; rendement = 64%) : ¹ H RMN (300 MHz, DMSO-<4, 298 K) δ 8,32 (t, NH, J= 5,27 Hz, IH) ; 7,90-7,85 (m, 2 NH et CH Arom Fmoc, 4η) ; 7,71 (d, CH Arom Fmoc, J = 7,33 Hz) ; 7,42 (t, CH Arom Fmoc, J = 7,32 Hz, 2H) ; 7,34-7,28 (m, CH Arom Fmoc et CH Arom Bn, 7η) ; 5,13 (s, CH ₂ Ph, 2η) ; 4,32-4,10 (m, CH ₂ Fmoc et CH Fmoc, 3η) ; 4,09-4,02 (dd, NHCHCH ₂ ,1H) ; 3,84 (dd, NHCH ₂ CCH, J = 5,25 et

2,32 Hz, 2H) ; 3,085 (t, CCH, J = 2,35 Hz, IH) ; 2,35-2,30 (m, COCH ₂ CH ₂ CO, 4η) ; 1,78-1,59 (m, CH ₂ Lysine, 2η) ; 1,41-1,22 (m, CH ₂ Lysine, 4η) ; ¹³ C RMN (300 MHz, DMSO-J ₆ , 298 K) 172,8 (CO) ; 171,62 (CO) ; 171,46 (CO) ; 155,66 (CO) ; 144,27 (2 C) ; 141,18 (C) ; 136,42 (2 C) ; 128,86 (2 CH) ; 128,47 (2 CH) ; 128,21 (2 CH) ; 128,11 (CH) ; 127,53 (2 CH) ; 125,7 (2 CH) ; 120,57 (2 CH) ; 81,73 (CH) ; 73,32 (C) ; 66,34

(CH ₂ ) ; 66,16 (CH ₂ ) ; 54,44 (CH) ; 47,10 (CH) ; 38,67 (CH ₂ ) ; 31,03 (CH ₂ ) ; 30,76 (CH ₂ ) ; 30,98 (CH ₂ ) ; 29,10 (CH ₂ ) ; 28,26 (CH ₂ ) ; 23,38 (CH ₂ ) ; MS (MALDI-TOF) calculé pour C ₃₅ H ₃₇ N ₃ O ₆ : 595,27. Trouvé [M+H ⁺ ] = 595,78 ; [M+Na ⁺ ] = 618,26 ; [M+K ⁺ ] = 634,35.

mL).

Fmoc-D-Lys(Nps)-OH (IV.21) Le composé IV.20 (972 mg ; 3,43 mmol) est dissous dans un mélange d'eau et d'acétone (50 mL, v/v : 1/1). On ajoute du K ₂ CO ₃ (948 mg ; 6,86 mmol) dans de l'eau (25 mL). Ensuite on ajoute doucement du Fmoc-OSu (9-fluorénylmethyloxycarbonyl- N-hydroxysuccinimide) (1,16 g ; 3,43 mmol) dans de l'acétone

(25 mL). Après une nuit d'agitation, on ajoute de l'eau. La phase aqueuse est lavée rapidement avec de l'éther et est ajustée à pH = 3 avec du HCl IN et est ensuite extraite avec CH ₂ Cl ₂ . Le séchage sur Na ₂ SO ₄ et l'évaporation du filtrat donne une huile qui est précipitée dans CH ₂ C1 ₂ /IPE pour donner le composé pur IV.21 (1,7 g ; rendement = 62%) : HPLC tu 8.61 min (gradient linéaire,

30-100% B ₃ 20 min) ; ¹ H RMN (300 MHz, DMSO-J ₅ , 298 K) δ 8,26 (t, NH, J= 5,36 Hz, IH) ; 7,89 (d, CHArom Fmoc, J= 7,42 Hz, 2H) ; 7,81 (t, NH, J= 5,25 Hz, IH) ; 7,73 (d, CHArom Fmoc, J- 7,38 Hz, 2H) ; 7,62 (d, FmocNH, J= 7,98 Hz, IH) ; 7,42 (t, CH Arom Fmoc, J = 7,41 et 1,06 Hz, 2H) ; 7,33 (dt, CH Arom Fmoc, J = 7,47 et 0,88 Hz, 2H) ; 4,29-4,19 (m, CH ₂ Fmoc et CH Fmoc, 3H) ; 3,94-3,87 (m, FmocNHCH,

1η) ; 3,83 (dd, NHCH ₂ CCH, J= 5,45 et 2,51 Hz, 2H) ; 3,07 (t, CCH, J= 2,51 Hz, IH) ; 3,04-2,96 (m, CH ₂ Lysine, 2η) ; 2,33-2,26 (m, CH ₂ CONH et CH ₂ CONH, 4H) ; 1,72- 1,54 (m, CH ₂ Lysine, 4η) ; 1,41-1,24 (m, CH ₂ Lysine, 4η) ; ¹³ C RMN (300 MHz, DMSO-J ₁₅ , 298 K) 173,89 (CO) ; 171,04 (CO) ; 170,88 (CO) ; 156,08 (CO) ; 143,72 (2 C) ; 140,62 (2 C) ; 127,56 (CH) ; 126,98 (CH) ; 125,19 (CH) ; 120,03 (CH) ; 81,54

(CH) ; 72,80 (CH) ; 65,52 (CH ₂ ) ; 53,68 (CH) ; 46,57 (CH) ; 38,73 (CH ₂ ) ; 30,46 (CH ₂ ) ; 30,41 (CH ₂ ) ; 30,34 (CH ₂ ) ; 28,60 (CH ₂ ) ; 27,71 (CH ₂ ) ; 22,99 (CH ₂ ) ; MS (MALDI-TOF) calculé pour C ₂₈ H ₃₁ N ₃ O ₆ : 505,22. Trouvé [M+Na ⁺ ] = 528,79 ; [M+K ⁺ ] = 545,57.

H-(D)Ala-Lys(Boc)-(D)Lys(Nps)-Lys(Boc)-(D)Ala-Lys(Boc)-OH (IV.22) Boc On lave 2 fois 1,3 g de résine 2- chlorotritylchloiτire (charge = 1,8 mmol/g) avec du CH ₂ Cl ₂ distillé. On ajoute à la résine un mélange de Fmoc-Lys(Boc)-OH (2 eq.) et de DIEA (6 eq.) dans du CH ₂ Cl ₂ . Après 3 h d'agitation, la résine est filtrée et lavée avec du CH ₂ Cl ₂ . La résine est regonflée dans du méthanol sous agitation pendant Ih et est ensuite lavée avec du DMF, de l'isopropanol, du CH ₂ Cl ₂ , de l'éther diéthylique et séchée sous vide. La charge de la résine est déterminée par analyse UV du dérivé fmoc après traitement avec 20% de pipéridine dans du DMF (charge = 0,5 mmol/g).

FmocXaaOH (5 eq.) est couplé deux fois à température ambiante pendant 30 min à la résinie Fmoc-déprotégée en présence de BOP (5 eq.), HOBt (5 eq.) et DIEA (15 eq.). Le composé IV.21 (2.5 eq.) est couplé une fois à température ambiante pendant 2 h à la résine Fmoc-déprotégée en présence de BOP (2.5 eq.), HOBt (2.5 eq.) et DIEA (10 eq.). Après répétition de ces étapes de déprotection et de couplage, le peptide est clivé de la résine avec un mélange de HFIP et de CH ₂ Cl ₂ (60/40). Après 2 h d'agitation, la résine est filtrée et lavée plusieurs fois avec CH ₂ Cl ₂ . L'évaporation du solvant donne le peptide IV.22 (rendement : 100 %) : HPLC t _R 8.54 min (gradient linéaire, 30-100% B, 20 min) ; Pureté du produit brut déterminée par HPLC (gradient linéaire, 30-100 % B, 20 min) : 60% ; MS (MALDI-TOF) calculé pour C ₅₂ H ₉₁ N ₁₁ O ₁₅ : 1109,67. Trouvé : [M+Na ⁺ ] 1132,45 ; [M+K ⁺ ] = 1148,43 ; HRMS(ESI) : m/z : calculé pour C ₅₂ H ₉₂ N ₁₁ O ₁₅ : 1110,67 ; trouvé : 1110,6769 ; calculé pour C ₅₂ H ₉₁ N ₁₁ Oi ₅ Na : 1132,67 ; trouvé : 1132,6588.

Cyclo [(D)AIa-LyS(BOC)-(D)LyS(NPS)-LyS(BoC)-(D)AIa-LyS(BoC)] (IV^S)

Le peptide IV.22 (60 mg ; 0,054 mmol) est dissous dans du DMF (12 mL) à température ambiante. On ajoute séquentiellement du BOP (28,6 mg ; 0,064 mmol) et de la DIEA (14 μL ; 0,081 mmol). Après agitation pendant 3 jours à température ambiante, le mélange réactionnel est précipité dans une grande quantité de NaHCO ₃ saturé. Le précipité est filtré et lavé avec du NaHCO ₃ saturé, puis par de l'eau, du KHSO ₄ IN, de la saumure, de l'acétate d'éthyle, de l'acétonitrile et du cyclohexane. Le solide blanc IV.23 est séché sous vide (49 mg, rendement : 83%) : HPLC fa 12.92 min (gradient linéaire, 30-100% B, 20 min) ; Pureté du produit brut déterminée par HPLC (gradient linéaire, 30-100% B, 20 min) : 60 % ; MS (MALDI-TOF) calculé pour C ₅₂ HS ₉ N ₁₁ O ₁₄ : 1091,66. Trouvé : [M+Na ⁺ ] ≈ 1114,58 ; [M+K ⁺ ] = 1130,56.

cyclo [(D)AIa-Lys-(D)Lys(Nps)-Lys-(D)AIa-Lys] (IV.24) Le composé IV.23 (38 mg ; 0,035 mmol) est dissous dans de l'acide trifluoroacétique (3,5 mL) avec de l'eau à 5%. Après 15 min d'agitation à température ambiante, le mélange réactionnel est précipité dans de l'éther. Le sel de TFA attendu est filtré, lavé avec de l'éther. Le solide blanc IV.23 est séché sous vide (34 mg, rendement : 87%) : HPLC fa 6.28 min (gradient linéaire, 5-65% B, 20 min) ; Pureté du produit brut déterminée par HPLC (gradient linéaire, 5-65 % B, 20 min) : 66 % ; MS (MALDI-TOF) calculé for C ₃₇ H ₆₅ N ₁₁ O ₈ : 791,5. Trouvé : [M+H ⁺ ] ≈ 792,57 ; [M+Na ⁺ ] = 814,54 ; [M+K ⁺ ] = 830,52.

Procédure générale pour Ia "click chemistry" (IV.25-IV.27)

Le composé IV.23 (1 eq) est dissous dans du DMF (c = 6.10 ^"3 M). On ajoute une solution de diazoture IN dans du DMF (1 eq). Ce mélange est dégazé d'oxygène avec de l'argon pendant 30 min. On ajoute successivement de la DIEA (25 eq), de la 2,6-lutidine (25 eq) et du CuI (2 eq). Après agitation pendant 3 jours à température ambiante, le mélange réactionnel est précipité dans une grande quantité de NaHCO ₃ saturé. Le précipité est filtré et lavé avec du NaHCO ₃ saturé, puis de l'eau, du KHSO ₄ IN et de la saumure. Le solide blanc est séché sous vide, ce composé est dissous dans de l'acide trifluoroacétique avec 5% d'eau. Après 30 min d'agitation à température ambiante, le mélange réactionnel est précipité dans de l'éther. Le sel de TFA attendu est filtré et lavé avec de l'éther et sécher sous vide. La purification par C ₁₈ RP-HPLC semi-preparative (5-65% B, 20 min) suivie d'une lyophilisation permet d'obtenir le composé attendu.

IV.25 : En utilisant la procédure générale, on obtient le composé IV.25. La pureté du produit brut est de 47% (déterminée par C ₁₈ RP-HPLC). La purification par Ci ₈ RP-

HPLC semi-préparative domie le composé pur IV.25 (rendement 40% et pureté >99%) : HPLC t _R 6,63 min (gradient linéaire, 5-65% B, 20 min) ; MS (MALDI-TOF) calculé pour C ₈₀ Hi ₄₂ N ₂₈ O ₁₈ : 1783,11. Trouvé : [M+Na ⁺ ] = 1806,48 ; [M+K ⁺ ] = 1823,39 ; HRMS(ESI) : m/z : calculé pour C ₈₀ Hi ₄₂ N ₂₈ Oi ₈ Na : 1806,11 ; trouvé : 1806,095.

IV.26 : En utilisant la procédure générale, on obtient le composé IV.26. La pureté du produit brut est de 30% (déterminée par Ci ₈ RP-HPLC). La purification par Ci ₈ RP- HPLC semi-préparative donne le composé pur IV.26 (rendement 13% et pureté >99 %) : HPLC t _κ 6,95 min (gradient linéaire, 5-65% B, 20 min) ; MS (MALDI-TOF) calculé pour C ₈₂ H ₁₄₆ N ₂₈ Oi ₉ : 1827,13. Trouvé : [M+H ⁺ ] = 1828,14 ; [M+Na ⁺ ] =

1850,14 ; [M+K ⁺ ] = 1866,14.

IV.27 : En utilisant la procédure générale, on obtient le composé IV.27. La pureté du produit brut est de 54% (déterminée par Ci ₈ RP-HPLC). La purification par C ₁₈ RP- HPLC semi-préparative donne le composé pur IV.27 (rendement 20% et pureté >99

%) : HPLC t _R 7,8 min (gradient linéaire, 5-65% B, 20 min) ; MS (MALDI-TOF) calculé pour C ₉₀ H ₁₆₂ N ₂₈ O ₂₃ : 2003,24. Trouvé : [MH-H ⁺ ] = 2004,34 ; [M+Na ⁺ ] = 2026,34 ; [M+K ⁺ ] = 2042,31.

Procédure générale pour le couplage

Le cœur IV.24, IV.25 ou IV.26 (1 eq.) est dissous dans du DMF. A température ambiante, on ajoute le peptide (6,6 eq.), du BOP (6,6 eq.) et de la DIEA (20 eq.). Le mélange réactionnel est agité pendant une semaine et précipité dans une grande quantité de NaHCO ₃ saturé. Le précipité est filtré et lavé avec du NaHCO ₃ saturé, puis de l'eau, du KHSO ₄ IN, de la saumure et du cyclohexane. Le solide est séché sous vide.

Le produit brut est dissous dans de l'acide trifluoroacétique avec 5% d'eau. Après

30 min d'agitation à température ambiante, le mélange réactionnel est précipité dans de l'éther. Le sel attendu de TFA est filtré, lavé avec de l'éther et séché sous vide. La purification par Ci ₈ RP-HPLC semi-préparative (5-65% B, 20 min) suivie d'une lyophilisation permet d'obtenir le ligand attendu.

L41 : En utilisant la procédure générale décrite ci-dessus, on obtient le ligand L41.

La pureté du ligand brut est de 51% (déterminée par Ci ₈ RP-HPLC). La purification par C ₁₈ RP-HPLC semi-préparative permet d'obtenir le ligand L41 pur (rendement 12% et pureté >99 %) : HPLC t _κ 10,65 min (gradient linéaire, 5-65% B, 20 min) ; MS (MALDI-

TOF) calculé pour C ₂₇₂ H ₄₀₆ N ₆₄ O ₆₀ : 5529,07. Trouvé : [MH-H ⁺ ] = 5529,78.

L42 : En utilisant la procédure générale décrite ci-dessus, on obtient le ligand L42. La pureté du ligand brut est de 58% (déterminée par Ci ₈ RP-HPLC). La purification par

C _1S RP-HPLC semi-préparative permet d'obtenir le ligand L42 pur (rendement 15% et pureté >99 %) : HPLC t _R 10,89 min (gradient linéaire, 5-65% B, 20 min) ; MS (MALDI-

TOF) calculé pour C ₂₇₅ H ₄₁₁ N ₆₅ O ₆₁ : 5600,11. Trouvé : [MHhH ⁺ ] = 5580.

L43 : En utilisant la procédure générale décrite ci-dessus, on obtient le ligand L43.

La pureté du ligand brut est de 54% (déterminée par Cj ₈ RP-HPLC). La purification par Ci ₈ RP-HPLC semi-préparative permet d'obtenir le ligand L43 pur (rendement 15% et pureté >99 %) : HPLC t _R 11,04 min (gradient linéaire, 5-65% B, 20 min) ; MS (MALDI- TOF) calculé pour C ₂₈₂ H ₄₂₆ N ₆₄ O ₆₅ : 5749,2. Trouvé : [M+H ⁺ ] = 5751.