以下、本発明の一実施形態について詳細に� ��明する。
(A)
 本発明において、増幅の対象となる核酸と� ��ては、標的核酸配列すなわち解析の対象と� ��る核酸配列を含む染色体又はその断片に相� ��的な配列を有する核酸、増幅した核酸また� ��その断片に相補的な配列を有する核酸、な� ��が挙げられる。

 上記染色体又はその断片に相補的な配列� ��有する核酸は、例えば、バクテリア、動物� ��たは植物組織、個体細胞由来の溶解物など� ��あらゆる材料から調製することができる。� ��染色体又はその断片に相補的な配列を有す� ��核酸の調製法は特に限定されないが、例え� ��、患者の血液、組織から、既知の方法によ� ��調製してもよい。代表的なものとして、フ� ��ノール/クロロホルム抽出法(Biochimica et Biop hysica Acta 第72巻、第619~629頁、1963年)、アル� �リSDS法(Nucleic Acids Research 第7巻、第1513~1523� ��、1979年)等の液相で行なう方法がある。ま� �、核酸の単離に核酸結合用担体を用いる系� �しては、ガラス粒子とヨウ化ナトリウム溶� �を使用する方法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 第76 -2巻、第615~619頁、1979年)、ハイドロキシアパ� ��イトを用いる方法(特開昭63-263093号公報)等� �ある。その他の方法としてはシリカ粒子と� �オトロピックイオンを用いた方法(Journal of  Clinical Microbiology 第28-3巻、第495~503頁、1990年 、特開平2-289596号公報)が挙げられる。なお、 例えば、バクテリア、動物、植物などに由来 する細胞を含む溶液を、当該細胞を破壊する ことなく試料として用いたり、あるいはバク テリア、動物、植物などに由来する細胞を直 接、核酸増幅反応を行なうための反応液に添 加して、上記のような方法による核酸の調製 を省略し、核酸増幅反応を行なうこともでき る。

 本発明において、核酸の増幅方法として� ��、上記PCRの他に、NASBA(Nucleic acid sequence-base damplification method;Nature 第350巻、第91頁(1991年) )、LCR(国際公開89/12696号公報、特開平2-2934号� �報)、SDA(Strand Displacement Amplification:Nucleic aci d research 第20巻、第1691頁(1992年))、RCA(国際公 開90/1069号公報)、TMA(Transcription mediated amplific ation method;J.Clin.Microbiol. 第31巻、第3270頁(1993� ��))、LAMP(loop-mediated isothermal amplification method :J Clin Microbiol. 第42巻:第1,956頁(2004年))、ICAN( isothermal and chimeric primer-initiated amplification  of nucleic acids:Kekkaku. 第78巻、第533頁(2003年))� ��ど既知の核酸増幅方法が挙げられる。本発� ��において、核酸増幅方法はPCRに限定される� ��のではないが、以下、説明の簡便化のため� ��核酸の増幅方法をPCRに代表させ、核酸増幅( 核酸増幅反応)を行なうための反応液を「PCR� �応液」と称することがある。

 本発明の核酸増幅容器は、材料として高� ��子材料を用いることにより、核酸増幅容器� ��破損する可能性を極めて低くすることがで� ��る。高分子材料としては、破損しにくい性� ��を有していれば特に限定されないが、成型� ��容易であるという観点から熱可塑性樹脂で� ��ることがより好ましい。例えば、ポリプロ� ��レン(PP)、ポリオレフィン(PO)、ポリメチル� �ンテン(TPX)、環状ポリオレフィン(COC)、ポリ� ��チレン(PE)、ポリスチレン(PS)、ポリカーボ� �ート(PC)、ポリアセタール(POM)、ポリアミド(P A)、ポリイミド(PI)、ポリアミドイミド(PAI)、� ��晶ポリマー(LCP)、ポリエーテルエーテルケ� �ン(PEEK)、ポリエーテルサルホン(PES)、ポリエ チレンテレフタレート(PET)、ポリフェニレン� ��ーテル(PPE)、ポリサルフォン(PSF)、ポリフェ ニレンサルファイド(PPS)、ポリブチレンテレ� ��タレート(PBT)、メタクリル樹脂(PMMA)、ABS樹� �(ABS)、ポリ塩化ビニル(PVC)などを使用するこ� ��ができる。またはこれら2種以上のポリマー アロイを使用することができる。好ましくは ポリプロピレン(PP)、環状ポリオレフィン(COC) 、ポリカーボネート(PC)、またはこれら2種以� ��のポリマーアロイ又は2種以上のポリマーブ レンドであり、より好ましくはポリプロピレ ン(PP)である。

 また、本発明の核酸増幅容器において、� ��酸の増幅反応を行なうための反応部の少な� ��とも一部が、光学的に透明であることによ� ��、核酸の増幅に応じて発する蛍光が変化す� ��PCR試料を用い、さらに核酸増幅装置がPCR反� ��液の蛍光を検出する手段を備えている場合� ��、短時間のうちにPCRを行ない、その結果を� ��認することができる。一般に、物体に入射� ��た光は、一部は物体表面で反射され、他の� ��部は物体内で吸収され、残りが透過光とな� ��ため、光学的な透明度は、入射光に対する� ��過光の比率として表すことができる。当該� ��応部の少なくとも一部の透明度としては、� ��酸の増幅に応じて発する蛍光が検出できれ� ��特に限定されない。1mm厚の成形板にしたと� ��の可視光線透過率が、50%以上であることが� ��ましく、より好ましくは80%以上、さらに好� ��しくは90%以上であればよい。

 高分子材料は、従来公知のキャピラリー� ��ンプルチューブの材質として知られるガラ� ��に比べて割れにくい、すなわち破損しにく� ��メリットを有する一方で、熱などの影響に� ��り変形しやすいデメリットを有する材料で� ��る。特に、PCR反応液の蛍光を検出すること� ��より短時間のうちにPCRの結果を確認する検� ��方法を用いる場合、核酸増幅容器が変形す� ��と、PCR反応液から発せられた蛍光が核酸増� ��装置の検出器に届かないことが大きな問題� ��なる。

 前述のように、PCRにおいては核酸増幅容� ��を介してPCR反応液の昇温または冷却を繰り� ��し、それぞれ変性反応、アニーリング反応� ��伸長反応に適した温度に調整することによ� ��、試料中の核酸が増幅する。一般に、PCRの� ��性反応に用いられる温度は95℃程度である� �め、当該温度において高分子材料からなる� �酸増幅容器が変形しないようにするために� �、該核酸増幅容器の肉厚を厚くする必要が� �る。しかしながら、肉厚を厚くすると核酸� �幅容器を介した熱エネルギーの伝達が遅く� �るため、PCR反応液の昇温または冷却に時間� �かかり、核酸増幅を迅速に行なうことがで� �ない。したがって、従来公知のキャピラリ� �サンプルチューブの材質を単純に高分子材� �と置き換えるだけでは、迅速性を犠牲にす� �ことなく、破損しにくい核酸増幅容器を提� �することはできない。すなわち、本発明で� �、様々な材質および形状を検討し、破損し� �くい性質と変形しにくい性質を両立できる� �酸増幅容器を確立したものである。

 本発明の核酸増幅容器は、底面と、該底� ��を構成する直線または曲線をそれぞれ一辺� ��する平面状または曲面状の側面とを有する� ��該底面の形状としては、核酸増幅容器の強� ��を確保するために、少なくとも2つの角を有 していれば特に限定されないが、例えば、図 1の(A)~(O)に示すような形状が挙げられる。(A)~ (E)に示すような正多角形、(F)のような長方形 、(G)のような平行四辺形、(H)のような十字型 、(I)または(J)のような星型など、直線のみで 構成される形状の他に、(K)~(N)のように直線� �曲線とを組み合わせた形状、(O)のように曲� �のみで構成される形状など、適宜選択する� �とができる。

 核酸増幅容器の強度を確保し、かつPCR反� ��液から発せられる蛍光を容易に検出すると� ��う観点からは、該底面の形状は(A)のような� ��角形、または(B)、(F)、(G)のような四角形が� ��ましい。一般に、蛍光検出においては、光� ��すなわちPCR反応液と検出器とを結ぶ直線に� ��行な軸線上にある蛍光分子の量が、測定さ� ��るシグナルの強度に反映されるため、該底� ��の形状は(F)のような長方形であることがよ� ��好ましく、該長方形を構成する辺において� ��長辺の長さが短辺の長さの2倍以上であるこ とがさらに好ましい。

 核酸増幅容器の成型方法としては、従来� ��知の方法を使用することができるが、短い� ��間で同じ品質の成型品を大量に生産できる� ��原料の投入から成型品の取り出しまでを全� ��動で行うことができる、高い寸法精度と複� ��な構造の成型品を作ることができる、など� ��観点から、射出成型法がより好適に使用し� ��る。

 蛍光検出において、当該PCR反応液へ入射� ��た励起光が核酸増幅容器により反射される� ��象が蛍光測定の障害となる場合は、例えば� ��(K)~(N)のように直線と曲線を組み合わせた形 状、または(O)のように曲線のみで構成される 形状を選択することで、反射光の影響を低減 させることができる。この場合、上述したよ うに、光源すなわちPCR反応液と検出器とを結 ぶ直線に平行な軸線上にある蛍光分子の量が 、測定されるシグナルの強度に反映されるこ とから、(K)のような形状であることがより好 ましい。

 本発明の核酸増幅容器は、上記のような� ��状の底面を構成する直線または曲線をそれ� ��れ一辺とする平面状または曲面状の側面と� ��有する。すなわち核酸増幅容器において、� ��酸の増幅反応を行なうための反応部は、上� ��のような形状の底面を、該底面に垂直な軸� ��方向に掃引したような外観を有する。当該� ��酸増幅容器を側面から見た場合の形状は特� ��限定されず、該反応部を、該底面に平行な� ��面で切断した場合の切り口の大きさは、該� ��面からの距離によらず一定の形状(すなわち 、柱状)でも良いし、該底面からの距離が離� �るほど大きくなる形状(すなわち、底面に向� ��って細くなる形状)でも良い。本発明の実施 形態の一例として、図2に、底面の形状を正� �形、側面の形状を柱状(すなわち、該底面に� ��行な平面で切断した場合の切り口の大きさ� ��該底面からの距離によらず一定)とした場合 の核酸増幅容器の外観を示す。

 一般に、柱状または底面に向かって細く� ��る形状の構造物の変形に対する抵抗性、す� ��わち強度は、該構造物の断面形状が三角形� ��四角形などの多角形の方が、円形より強い� ��とが知られている。したがって、本発明の� ��酸増幅容器の外観は、三角形や四角形など� ��角形の断面形状を有する柱状または底面に� ��かって細くなる形状が好ましく、三角形ま� ��は四角形の断面形状を有することがより好� ��しい。

 本発明では、核酸増幅容器の反応部、す� ��わちPCR反応液の貯留部位を極めて細く形成� ��ることにより、該PCR反応液の容積に対する� ��面積が大きくなる、すなわち該PCR溶液と核� ��増幅装置の間での熱エネルギーの伝達速度� ��向上し、PCRにおいて繰り返される変性反応� ��アニーリング反応、伸長反応の各工程間で� ��温度調整の時間を短縮することができる。� ��反応部において、容積に対する表面積の比� ��4mm-1以上であることが好ましく、6mm-1以上で あることがより好ましく、8mm-1以上であるこ� ��がさらに好ましい。

 また、PCRにおいて繰り返される変性反応� ��アニーリング反応、伸長反応の各工程間で� ��温度調整の時間を短縮するためには、PCR反� ��液の容積を小さくすることも効果的である� ��迅速にPCRを行なうためには、該PCR反応液の� ��積は0.1ml以下であることが好ましく、0.02ml� �下であることがより好ましい。しかしなが� �、PCR反応液の容積が小さすぎると、該PCR反� �液の蛍光を検出することにより短時間のう� �にPCRの結果を確認する検出方法を用いる場� �に、検出可能な蛍光分子の量が不足し、シ� �ナルとして測定できない可能性があるため� �該PCR反応液の容積は0.005ml以上であることが� ��ましく、0.01ml以上であることがより好まし� ��。

 さらに、上述のように、核酸増幅容器の� ��厚を厚くすると、該核酸増幅容器を介した� ��エネルギーの伝達が遅くなるため、PCR反応� ��の昇温または冷却に時間がかかり、核酸増� ��を迅速に行なうことができない。核酸増幅� ��器の反応部の側面における平面状または曲� ��状の部分の肉厚は0.5mm以下であることが好� �しく、0.4mm以下であることがより好ましく、 0.3mm以下であることがさらに好ましい。しか� ��ながら、当該反応部の側面における平面状� ��たは曲面状の部分の肉厚が薄すぎると、例� ��、核酸増幅容器の形状について前述のよう� ��工夫を施していたとしても、強度不足によ� ��PCR中に該核酸増幅容器の反応部が変形する� ��能性があるため、該肉厚は0.1mm以上である� �とが好ましく、0.2mm以上であることがより好 ましい。

 上述のように、本発明の核酸増幅容器に� ��いて、反応部、すなわちPCR反応液の貯留部� ��を極めて細く形成することが好ましい。し� ��しながら、極めて細い反応部に試料またはP CR反応液などを充填するためには、導入部、� ��なわち試料などを受け入れるための注入口� ��注いだ上で遠心機にかける工程が必要にな� ��。核酸増幅容器の導入部へ試料またはPCR反� ��液などを注入する際には、例えば、マイク� ��ピペットなど手動式の分注器または自動式� ��分注装置を使用するため、該導入部は当該� ��注器または分注装置により容易に試料また� ��PCR反応液などを注入し得る形状であること� ��好ましい。具体的には、該導入部の容積に� ��する表面積の比が4mm-1未満であり、該容積� �前記反応部の容積より大きいことが好まし� �。さらには、該導入部の容積に対する表面� �の比が2mm-1未満であり、該容積は前記反応部 の容積より大きいことがより好ましい。

 また、試料またはPCR反応液などを核酸増� ��容器の導入部に注入し、遠心により該核酸� ��幅容器の反応部に充填するためには、該反� ��部と該導入部は流動性連通を有しているこ� ��が好ましい。「流動性連通」とは、該導入� ��に注入した溶液が遠心力、圧力、重力など� ��外力により該反応部へ移動できることを指� ��、該溶液が約1000xg以上の遠心力により該反� ��部へ移動できることが好ましい。さらに、� ��反応部と該導入部とが同一の材料からなり� ��一体的に形成されていれば、従来公知の高� ��子材料の成型技術を用いて、当該核酸増幅� ��器を安価に大量生産することが可能となる� ��め、より好ましい。

 多数の反応を同時に行なう場合などにお� ��ては、複数の核酸増幅容器を連結すること� ��取り扱いを簡便にすることができる。核酸� ��幅容器の連結方法としては、生産する際に� ��複数の核酸増幅容器をあらかじめ連結した� ��造で成型しても良いし、使用する際に、単� ��の核酸増幅容器を当業者により用意に想到� ��得る冶具などを用いて連結しても良い。前� ��のように、PCRにおいて繰り返される変性反� ��、アニーリング反応、伸長反応の各工程間� ��の温度調整の時間を短縮するためには、核� ��増幅容器の反応部を介した熱エネルギーの� ��達を速くすることが効果的であるから、上� ��複数の核酸増幅容器の連結は、該核酸増幅� ��器の導入部を連結することによってなるこ� ��が好ましい。本発明の実施形態の一例とし� ��、図3に、底面の形状を正方形、側面の形状 を柱状とした核酸増幅容器を、8個連結した� �合の外観を示す。

 本発明の核酸増幅容器は、核酸を増幅お� ��び/または検出するための容器として、例え ば、核酸の増幅のみの場合、核酸の増幅と同 時に検出する場合、核酸の増幅後に検出する 場合、核酸の検出のみの場合などの用途で適 宜使用することができる。

(B)
 本発明の反応容器を、バイオテクノロジー� ��おける様々な分野で応用されている化学反� ��である核酸増幅反応に適用する場合、増幅� ��対象となる核酸としては、標的核酸配列す� ��わち解析の対象となる核酸配列を含む染色� ��又はその断片に相補的な配列を有する核酸� ��増幅した核酸またはその断片に相補的な配� ��を有する核酸、などが挙げられる。

 本発明は、簡易な操作で確実に反応液の飛� ��を防ぐことができ、コンタミネーションを� ��防することが可能な反応容器を提供するこ� ��を目的の一つとする。
 したがって、本発明において、核酸増幅方� ��とは、前述のような、核酸の増幅に応じて� ��する蛍光が変化するPCR試料を用い、さらに� ��酸増幅装置がキャピラリチューブなどに含� ��れるPCR反応液の蛍光を検出する手段を備え� ��いることによって、核酸の増幅と同時に、� ��るいは核酸の増幅後に連続して、増幅した� ��酸を検出する方法をも包含する。

 本発明の反応容器は、化学反応のための溶� ��を保持させたピペットチップの少なくとも� ��入吐出口部位を収納することにより、例え� ��、遺伝子検査においては、従来のピペット� ��作など核酸増幅反応のための溶液を核酸増� ��容器に充填する際に、検体中に含まれる核
酸が飛散し、他の患者などに由来する検体の コンタミネーションが起こる可能性を極めて 低くすることができる。

 ピペットチップとしては、化学反応のた� ��の溶液を保持させることが可能な性質を有� ��ていれば特に限定されないが、入手が容易� ��あるという観点から、ピペットチップを介� ��て溶液を吸引および吐出することが可能な� ��注機構を有する手動分注器または自動分注� ��置に使用するために、市販されているピペ� ��トチップであることが好ましい。例えば、� ��イニン・インスツルメント社、ギルソン社� ��エッペンドルフ社、イナ・オプティカ社な� ��から市販されているマイクロピペット用の� ��ップを使用することができる。また、従来� ��知の成型技術を用いれば、任意の形状のピ� ��ットチップを設計および作製することがで� ��、上記ピペットチップとして使用すること� ��できる。

 ピペットチップが吸引することができる� ��液の量は、ピペットチップに化学反応のた� ��の溶液を保持させることができれば特に限� ��されないが、例えば、核酸増幅反応では、0 .5マイクロリットル以上100マイクロリットル� ��下であることが好ましく、1マイクロリット ル以上50マイクロリットル以下であることが� ��り好ましく、5マイクロリットル以上20マイ� ��ロリットル以下であることがさらに好まし� ��。また、溶液の量は、ピペットチップが反� ��容器に収納された際に、当該ピペットチッ� ��の先端、すなわち吸入吐出口部位に溶液が� ��触しない量であることが好ましい。

 ピペットチップに、化学反応のための溶� ��を保持させるための手段も特に制限されな� ��が、ピペットチップを介して溶液を吸引お� ��び吐出することが可能な分注機構を用いて� ��ピペットチップに化学反応のための溶液を� ��引することにより、行なうことができる。� ��えば、ピペットチップを手動式または電動� ��のマイクロピペット装着して、化学反応の� ��めの溶液を吸引し、プランジャーを停止す� ��ことにより、ピペットチップに溶液を保持� ��せることができる。このとき、マイクロピ� ��ットの吸引量を、化学反応のための溶液よ� ��多く設定しておけば、チップの先端、すな� ��ち吸引吐出口部位より奥の位置で溶液を保� ��させることもできる。例えば、自動分注装� ��の使用は、これら一連の操作をより簡便に� ��なうことができるため好ましい。また、例� ��ば、核酸増幅機構と分注機構とを有する装� ��の使用は、さらに好ましい。

 ピペットチップを反応容器に収納する手� ��は、収納後にピペットチップと反応容器を� ��体的に取り扱うことができる形態であれば� ��に制限されないが、ピペットチップと反応� ��器が嵌合する形態であることが好ましく、� ��ペットチップが反応容器に嵌入する形態で� ��ることがより好ましい。このような形態で� ��ペットチップを反応容器に収納することに� ��り、反応後、ピペットチップおよび反応容� ��を廃棄する際においても、ピペットチップ� ��反応容器が分離することなく一体的に廃棄� ��ることができる。一例として、核酸増幅反� ��において、ピペットチップと核酸増幅容器� ��分離することなく一体的に廃棄することが� ��きることにより、廃棄の際に、ピペットチ� ��プに付着した核酸が飛散する可能性を極め� ��低くし、さらに、核酸増幅容器から増幅核� ��断片が漏出する可能性を極めて低くするこ� ��で、コンタミネーションの可能性をさらに� ��減させることができる。

 ピペットチップの反応容器への収納は、� ��ペットチップを上記分注機構から取り外す� ��となく行なわれても良いし、ピペットチッ� ��を上記分注機構から取り外した後に行なわ� ��ても良い。手動で装着する場合の操作、あ� ��いは自動で装着する場合の動作を、ともに� ��易にするためには、チップを上記分注機構� ��ら取り外すことなく、反応容器へ収納する� ��とがより好ましい。

 本発明の反応容器は、反応液の飛散を厳密� ��防ぐため、ピペットチップがフィルターを� ��蔵してなる、フィルター付きピペットチッ� ��であることが好ましい。化学反応中および
化学反応後の反応液の飛散を防ぐ観点から、 フィルターは、ピペットチップにおいて溶液 を保持する部分と、上記分注機構に装着され る際に分注機構に接する部分との間に位置す ることが好ましい。また、フィルターは疎水 性フィルターであることが好ましく、飛沫だ けでなく、エアゾールの通過をも阻止し得る 疎水性フィルターであることがより好ましい 。このようなフィルターはとしては、従来公 知の方法にて作製することが可能であるが、 例えば、ポリエチレン製の基材からなる、フ ィルター孔の大きさが平均約20ミクロンのフ� ��ルターを用いれば、エアゾールの通過によ� ��コンタミネーションを好適に防止し得る。

 フィルター付きピペットチップとしては� ��例えば、レイニン・インスツルメント社、� ��ルソン社、エッペンドルフ社、イナ・オプ� ��ィカ社などから市販されているマイクロピ� ��ット用のフィルターチップあるいはエアゾ� ��ル耐性チップを使用することができる。こ� ��ような市販品の使用は、入手が容易である� ��いう観点から好ましい。

 チップを反応容器に装着する際には、反� ��液の飛散を厳密に防ぐため、ピペットチッ� ��と反応容器が密着していることが好ましい� ��このような形状のピペットチップおよび反� ��容器の組み合わせを市販品より選抜して用� ��ることが好ましいが、ピペットチップと反� ��容器の形状が合わず、反応容器にピペット� ��ップを装着した際に隙間が生じる場合には� ��例えば、ピペットチップとして市販のフィ� ��ターチップあるいはエアゾール耐性チップ� ��使用し、当該ピペットチップの形状に合わ� ��て反応容器を作製すればよい。また、反応� ��器にピペットチップを装着した際に生じた� ��間をシール材などを充填することにより塞� ��、あるいは、反応容器とピペットチップの� ��に装着するアダプターなどを作製する、な� ��によりピペットチップと反応容器を密着さ� ��ればよい。

 本発明の重要な開示について、核酸増幅� ��応をその一例として、ピペットチップにフ� ��ルター付きピペットチップを用い、反応容� ��に核酸増幅容器であるキャピラリチューブ� ��用いる場合について、図7を用いて、より詳 しく説明する。図7において、まず、(A)に示� �ような、フィルター付きピペットチップに� �手動分注器または自動分注装置を用いて、(B )に示すように、核酸増幅反応のための溶液� �吸引し、溶液を保持する。当該ピペットチ� �プを、手動または自動にて、(C)に示すよう� �、核酸増幅容器まで移動させ、(D)に示すよ� �に、ピペットチップを核酸増幅容器に収納� �る。次に、ピペットチップを手動分注器ま� �は自動分注装置から取り外す。このとき、� �動分注器または自動分注装置の分注機構か� �空気を吐出しながら、当該ピペットチップ� �取り外す動作を行なうことにより、当該動� �の際に生じる圧力によってピペットチップ� �保持された溶液の位置が変化する現象を回� �することもできる。

 続いて、ピペットチップを装着した核酸� ��幅容器を遠心することにより、(E)に示すよ� ��に、核酸増幅反応のための溶液を核酸増幅� ��器の底部に移動させる。このとき、遠心の� ��わりに空気圧を用いることにより、当該溶� ��を移動させることもできる。空気圧を用い� ��場合には、例えば、手動分注器または自動� ��注装置の分注機構を再度ピペットチップに� ��着し、空気を吐出することにより、ピペッ� ��チップに保持された溶液を押し出すことが� ��きる。

 次に、(E)の状態のままで核酸増幅反応お� ��び増幅核酸断片の検出を行い、(E)の状態の� ��までピペットチップおよび核酸増幅容器を� ��棄する。

 また、本発明の別の重要な開示について、� ��酸増幅反応をその一例として、ピペットチ� ��プにフィルター付きピペットチップを用い� ��反応容器に核酸増幅容器であるキャピラリ� ��ューブを用いる場合について、図7を用いて 説明する。図7において、まず、(A)に示すよ� �な、フィルター付きピペットチップに、手� �分注器または自動分注装置を用いて
、(B)に示すように、核酸増幅反応のための溶 液を吸引し、溶液を保持する。当該ピペット チップを、手動または自動にて、(C)に示すよ うに、核酸増幅容器まで移動させ、(D)に示す ように、ピペットチップを核酸増幅容器に収 納する。

 次に、手動分注器または自動分注装置の� ��注機構から空気を吐出することにより、ピ� ��ットチップに保持された溶液に空気圧を与� ��、(E)に示すように、当該溶液を核酸増幅容� ��の底部に移動させる。

 続いて、(E)の状態のままで核酸増幅反応� ��よび増幅核酸断片の検出を行い、(E)の状態� ��ままでピペットチップおよび核酸増幅容器� ��廃棄する。

 本発明の反応容器は、材料として熱可塑� ��樹脂を用いることにより、成型が容易であ� ��とともに、核酸増幅容器が破損する可能性� ��極めて低くすることができる。熱可塑性樹� ��としては、破損しにくい性質を有していれ� ��特に限定されないが、例えば、ポリプロピ� ��ン(PP)、ポリオレフィン(PO)、ポリメチルペ� �テン(TPX)、環状ポリオレフィン(COC)、ポリエ� ��レン(PE)、ポリスチレン(PS)、ポリカーボネ� �ト(PC)、ポリアセタール(POM)、ポリアミド(PA)� ��ポリイミド(PI)、ポリアミドイミド(PAI)、液� ��ポリマー(LCP)、ポリエーテルエーテルケト� �(PEEK)、ポリエーテルサルホン(PES)、ポリエチ レンテレフタレート(PET)、ポリフェニレンエ� ��テル(PPE)、ポリサルフォン(PSF)、ポリフェニ レンサルファイド(PPS)、ポリブチレンテレフ� ��レート(PBT)、メタクリル樹脂(PMMA)、ABS樹脂(A BS)、ポリ塩化ビニル(PVC)などを使用すること� ��できる。またはこれら2種以上のポリマーア ロイを使用することができる。好ましくはポ リプロピレン(PP)、環状ポリオレフィン(COC)、 ポリカーボネート(PC)、またはこれら2種以上� ��ポリマーアロイ又は2種以上のポリマーブレ ンドであり、より好ましくはポリプロピレン (PP)である。

 また、本発明の反応容器において、化学� ��応を行なうための反応部の少なくとも一部� ��、光学的に透明であることにより、化学反� ��中あるいは化学反応後に、当該反応の結果� ��確認することができる。一例として、核酸� ��幅反応においては、核酸の増幅に応じて発� ��る蛍光が変化するPCR試料を用い、さらに核� ��増幅装置がPCR反応液の蛍光を検出する手段� ��備えている場合に、短時間のうちにPCRを行� ��い、その結果を確認することができる。一� ��に、物体に入射した光は、一部は物体表面� ��反射され、他の一部は物体内で吸収され、� ��りが透過光となるため、光学的な透明度は� ��入射光に対する透過光の比率として表すこ� ��ができる。当該反応部の少なくとも一部の� ��明度としては、核酸の増幅に応じて発する� ��光が検出できれば特に限定されない。1mm厚� ��成形板にしたときの可視光線透過率が、50%� ��上であることが好ましく、より好ましくは8 0%以上、さらに好ましくは90%以上であればよ� ��。

 熱可塑性樹脂は、従来公知のキャピラリ� ��サンプルチューブの材質として知られるガ� ��スに比べて割れにくい、すなわち破損しに� ��いメリットを有する一方で、熱などの影響� ��より変形しやすいデメリットを有する材料� ��ある。例えば、核酸増幅反応において、PCR� ��応液の蛍光を検出することにより短時間の� ��ちにPCRの結果を確認する検出方法を用いる� ��合、核酸増幅容器が変形すると、PCR反応液� ��ら発せられた蛍光が核酸増幅装置の検出器� ��届かないことが大きな問題となる。

 前述のように、PCRにおいては核酸増幅容器� ��介してPCR反応液の昇温または冷却を繰り返� ��、それぞれ変性反応、アニーリング反応、� ��長反応に適した温度に調整することにより� ��試料中の核酸が増幅する。一般に、PCRの変� ��反応に用いられる温度は95℃程度であるた� �、当該温度において高分子材料からなる核� �増幅容器が変形しないよう
にするためには、該核酸増幅容器の肉厚を厚 くする必要がある。しかしながら、肉厚を厚 くすると核酸増幅容器を介した熱エネルギー の伝達が遅くなるため、PCR反応液の昇温また は冷却に時間がかかり、核酸増幅を迅速に行 なうことができない。したがって、従来公知 のキャピラリーサンプルチューブの材質を単 純に高分子材料と置き換えるだけでは、迅速 性を犠牲にすることなく、破損しにくい核酸 増幅容器を提供することはできない。すなわ ち、本発明では、様々な材質および形状を検 討し、破損しにくい性質と変形しにくい性質 を両立できる反応容器を確立したものである 。

 本発明の反応容器は、底面と、該底面を� ��成する直線または曲線をそれぞれ一辺とす� ��平面状または曲面状の側面とを有する。該� ��面の形状としては、反応容器の強度を確保� ��るために、少なくとも2つの角を有していれ ば特に限定されないが、例えば、図8の(A)~(O)� ��示すような形状が挙げられる。(A)~(E)に示す ような正多角形、(F)のような長方形、(G)のよ うな平行四辺形、(H)のような十字型、(I)また は(J)のような星型など、直線のみで構成され る形状の他に、(K)~(N)のように直線と曲線と� �組み合わせた形状、(O)のように曲線のみで� �成される形状など、適宜選択することがで� �る。

 反応容器の強度を確保し、かつ反応液か� ��発せられる蛍光などの光学的な信号を容易� ��検出するという観点からは、該底面の形状� ��(A)のような三角形、または(B)、(F)、(G)のよ� ��な四角形が好ましい。一般に、蛍光検出に� ��いては、光源すなわちPCR反応液と検出器と� ��結ぶ直線に平行な軸線上にある蛍光分子の� ��が、測定されるシグナルの強度に反映され� ��ため、該底面の形状は(F)のような長方形で� ��ることがより好ましく、該長方形を構成す� ��辺において、長辺の長さが短辺の長さの2倍 以上であることがさらに好ましい。

 本発明において、ピペットチップの少な� ��とも吸入吐出口部位を収納できる収納部と� ��化学反応を行なう反応部とが、同一の材料� ��らなり、一体的に形成されていれば、従来� ��知の高分子材料の成型技術を用いて、当該� ��酸増幅容器を安価に大量生産することが可� ��となるため、より好ましい。

 反応容器の成型方法としては、従来公知� ��方法を使用することができるが、短い時間� ��同じ品質の成型品を大量に生産できる、原� ��の投入から成型品の取り出しまでを全自動� ��行うことができる、高い寸法精度と複雑な� ��造の成型品を作ることができる、などの観� ��から、射出成型法がより好適に使用し得る� ��

 蛍光検出において、当該反応液へ入射し� ��励起光が反応容器により反射される現象が� ��光測定の障害となる場合は、例えば、(K)~(N) のように直線と曲線を組み合わせた形状、ま たは(O)のように曲線のみで構成される形状を 選択することで、反射光の影響を低減させる ことができる。この場合、上述したように、 光源すなわちPCR反応液と検出器とを結ぶ直線 に平行な軸線上にある蛍光分子の量が、測定 されるシグナルの強度に反映されることから 、(K)のような形状であることがより好ましい 。

 本発明の反応容器は、上記のような形状の� ��面を構成する直線または曲線をそれぞれ一� ��とする平面状または曲面状の側面とを有す� ��。すなわち反応容器において、化学反応を� ��なうための反応部は、上記のような形状の� ��面を、該底面に垂直な軸線方向に掃引した� ��うな外観を有する。当該反応容器を側面か� ��見た場合の形状は特に限定されず、該反応� ��を、該底面に平行な平面で切断した場合の� ��り口の大きさは、該底面からの距離によら� ��一定の形状(すなわち、柱状)でも良いし、� �底面からの距離が離れるほど大きくなる形� �(すなわち、底面に向かって細くなる形状)で も良い。本発明の実施形態の一例として、図 9に、底面の形状を正方形、側面の形状を柱� �(すなわち、該底面に平行な平面で
切断した場合の切り口の大きさが該底面から の距離によらず一定)とした場合の反応容器� �外観を示す。

 一般に、柱状または底面に向かって細く� ��る形状の構造物の変形に対する抵抗性、す� ��わち強度は、該構造物の断面形状が三角形� ��四角形などの多角形の方が、円形より強い� ��とが知られている。したがって、本発明の� ��応容器の外観は、三角形や四角形など多角� ��の断面形状を有する柱状または底面に向か� ��て細くなる形状が好ましく、三角形または� ��角形の断面形状を有することがより好まし� ��。

 本発明では、反応容器の反応部、すなわ� ��反応液の貯留部位を極めて細く形成するこ� ��により、該反応液の容積に対する表面積が� ��きくなる、すなわち、反応液と反応装置の� ��での熱エネルギーの伝達速度が向上し、特� ��温度変化を伴う化学反応において、反応時� ��を短縮することができる。一例として、PCR� ��用いた核酸増幅反応においては、PCR溶液と� ��酸増幅装置の間での熱エネルギーの伝達速� ��が向上し、PCRにおいて繰り返される変性反� ��、アニーリング反応、伸長反応の各工程間� ��の温度調整の時間を短縮することができる� ��該反応部において、容積に対する表面積の� ��は4mm-1以上であることが好ましく、6mm-1以上 であることがより好ましく、8mm-1以上である� ��とがさらに好ましい。

 また、特に温度変化を伴う化学反応にお� ��て、反応時間を短縮するためには、反応液� ��容積を小さくすることも効果的である。一� ��として、PCRにおいて繰り返される変性反応� ��アニーリング反応、伸長反応の各工程間で� ��温度調整の時間を短縮するためには、PCR反� ��液の容積を小さくすることも効果的である� ��迅速にPCRを行なうためには、該PCR反応液の� ��積は0.1ml以下であることが好ましく、0.02ml� �下であることがより好ましい。しかしなが� �、PCR反応液の容積が小さすぎると、該PCR反� �液の蛍光を検出することにより短時間のう� �にPCRの結果を確認する検出方法を用いる場� �に、検出可能な蛍光分子の量が不足し、シ� �ナルとして測定できない可能性があるため� �該PCR反応液の容積は0.005ml以上であることが� ��ましく、0.01ml以上であることがより好まし� ��。

 さらに、上述のように、反応容器の肉厚� ��厚くすると、該反応容器を介した熱エネル� ��ーの伝達が遅くなるため、反応液の昇温ま� ��は冷却に時間がかかり、温度変化を伴う化� ��反応を迅速に行なうことができない。例え� ��、核酸増幅反応において、核酸増幅容器の� ��応部の側面における平面状または曲面状の� ��分の肉厚は0.5mm以下であることが好ましく� �0.4mm以下であることがより好ましく、0.3mm以� ��であることがさらに好ましい。しかしなが� ��、当該反応部の側面における平面状または� ��面状の部分の肉厚が薄すぎると、例え、核� ��増幅容器の形状について前述のような工夫� ��施していたとしても、強度不足によりPCR中� ��該核酸増幅容器の反応部が変形する可能性� ��あるため、該肉厚は0.1mm以上であることが� �ましく、0.2mm以上であることがより好ましい 。

 多数の反応を同時に行なう場合などにお� ��ては、複数の反応容器を連結することで取� ��扱いを簡便にすることができる。反応容器� ��連結方法としては、生産する際に、複数の� ��応容器をあらかじめ連結した構造で成型し� ��も良いし、使用する際に、単体の反応容器� ��当業者により用意に想到し得る冶具などを� ��いて連結しても良い。例えば、核酸増幅反� ��においては、前述のように、PCRにおいて繰� ��返される変性反応、アニーリング反応、伸� ��反応の各工程間での温度調整の時間を短縮� ��るためには、核酸増幅容器の反応部を介し� ��熱エネルギーの伝達を速くすることが効果� ��であるから、上記複数の核酸増幅容器の連� ��は、該核酸増幅容器の収納部を連結するこ� ��によってなることが好ましい。本発明の実� ��形態の一例として、図10に、底面の形状を� �方形、側面の形状を柱状とした反応容器を� �8個連結した場合の外観を示す。

 本発明の反応容器を核酸増幅反応に用い� ��場合は、核酸を増幅および/または検出する ための容器として、例えば、核酸の増幅のみ の場合、核酸の増幅と同時に検出する場合、 核酸の増幅後に検出する場合、核酸の検出の みの場合などの用途で適宜使用することがで きる。

 本発明において、化学反応としては、加水� ��解、脱水反応、付加重合、縮合重合、酸化� ��応、還元反応、中和反応など、原子間の結� ��または切断によって異なる物質を生成する� ��応の他に、抗原-抗体反応、リガンド結合反 応、蛍光エネルギー転移反応など、分子間の 相互作用に由来する反応をも包含する。
 本発明の反応容器はこれらの化学反応に用� ��ることもできる。

(c)
 本発明は、簡易な操作で確実に核酸増幅反� ��液の飛散を防ぐことができ、自動化が容易� ��あり、簡易な構造の核酸増幅装置でコンタ� ��ネーションを予防することが可能な核酸増� ��方法を提供することを目的の一つとする。� ��たがって、本発明において、核酸増幅方法� ��は、前述のような、核酸の増幅に応じて発� ��る蛍光が変化するPCR試料を用い、さらに核� ��増幅装置がキャピラリチューブなどに含ま� ��るPCR反応液の蛍光を検出する手段を備えて� ��ることによって、核酸の増幅と同時に、あ� ��いは核酸の増幅後に連続して、増幅した核� ��を検出する方法をも包含する。

 本発明の核酸増幅方法は、核酸増幅反応� ��ための溶液を保持させた着脱可能なチップ� ��核酸増幅容器に装着することにより、例え� ��、従来のピペット操作など核酸増幅反応の� ��めの溶液を核酸増幅容器に充填する際に、� ��体中に含まれる核酸が飛散し、他の患者な� ��に由来する検体のコンタミネーションが起� ��る可能性を極めて低くすることができる。

 着脱可能なチップとしては、核酸増幅反� ��のための溶液を保持させることが可能な性� ��を有していれば特に限定されないが、入手� ��容易であるという観点から、チップを介し� ��溶液を吸引および吐出することが可能な分� ��機構を有する手動分注器または自動分注装� ��に使用するために、市販されているチップ� ��あることが好ましい。例えば、レイニン・� ��ンスツルメント社、ギルソン社、エッペン� ��ルフ社、イナ・オプティカ社などから市販� ��れているマイクロピペット用のチップを使� ��することができる。また、従来公知の成型� ��術を用いれば、任意の形状のチップを設計� ��よび作製することができ、上記着脱可能な� ��ップとして使用することができる。

 着脱可能なチップが吸引することができ� ��溶液の量は、チップに核酸増幅反応のため� ��溶液を保持させることができれば特に限定� ��れないが、0.5マイクロリットル以上100マイ� ��ロリットル以下であることが好ましく、1マ イクロリットル以上50マイクロリットル以下� ��あることがより好ましく、5マイクロリット ル以上20マイクロリットル以下であることが� ��らに好ましい。

 着脱可能なチップに、核酸増幅反応のた� ��の溶液を保持させるための手段も特に制限� ��れないが、チップを介して溶液を吸引およ� ��吐出することが可能な分注機構を用いて、� ��ップに核酸増幅反応のための溶液を吸引す� ��ことにより、行なうことができる。例えば� ��チップを手動式または電動式のマイクロピ� ��ット装着して、核酸増幅反応のための溶液� ��吸引し、プランジャーを停止することによ� ��、チップに溶液を保持させることができる� ��このとき、マイクロピペットの吸引量を、� ��酸増幅反応のための溶液より多く設定して� ��けば、チップの先端開口部より奥の位置で� ��液を保持させることもできる。例えば、自� ��分注装置の使用は、これら一連の操作をよ� ��簡便に行なうことができるため好ましい。� ��た、例えば、核酸増幅機構と分注機構とを� ��する装置の使用は、さらに好ましい。

 チップを核酸増幅容器に装着する手段は� ��装着後にチップと核酸増幅容器を一体的に� ��り扱うことができる形態であれば特に制限� ��れないが、チップと核酸増幅容器が嵌合す� ��形態であることが好ましく、チップが核酸� ��幅容器に嵌入する形態であることがより好� ��しい。このような形態でチップを核酸増幅� ��器に装着することにより、核酸増幅反応後� ��チップおよび核酸増幅容器を廃棄する際に� ��いても、チップと核酸増幅容器が分離する� ��となく一体的に廃棄することができる。つ� ��り、廃棄の際に、チップに付着した核酸が� ��散する可能性を極めて低くし、さらに、核� ��増幅容器から増幅核酸断片が漏出する可能� ��を極めて低くすることで、コンタミネーシ� ��ンの可能性をさらに低減させることができ� ��。

 溶液を保持したチップの核酸増幅容器へ� ��装着は、チップを上記分注機構から取り外� ��ことなく行なわれても良いし、チップを上� ��分注機構から取り外した後に行なわれても� ��い。手動で装着する場合の操作、あるいは� ��動で装着する場合の動作を、ともに簡易に� ��るためには、チップを上記分注機構から取� ��外すことなく、核酸増幅容器へ装着するこ� ��がより好ましい。

 本発明の核酸増幅方法は、検体中に含ま� ��る核酸または増幅核酸断片の飛散を厳密に� ��ぐため、チップがフィルターを内蔵してな� ��ことが好ましい。核酸増幅反応中および核� ��増幅反応後の当該核酸断片の飛散を防ぐ観� ��から、フィルターは、フィルターは、チッ� ��において溶液を保持する部分と、上記分注� ��構に装着される際に分注機構に接する部分� ��の間に位置することが好ましい。また、フ� ��ルターは疎水性フィルターであることが好� ��しく、飛沫だけでなく、エアゾールの通過� ��も阻止し得る疎水性フィルターであること� ��より好ましい。このようなフィルターはと� ��ては、従来公知の方法にて作製することが� ��能であるが、例えば、ポリエチレン製の基� ��からなる、フィルター孔の大きさが平均約2 0ミクロンのフィルターを用いれば、エアゾ� �ルの通過によるコンタミネーションを好適� �防止し得る。

 フィルターを内臓したチップとしては、� ��えば、レイニン・インスツルメント社、ギ� ��ソン社、エッペンドルフ社、イナ・オプテ� ��カ社などから市販されているマイクロピペ� ��ト用のフィルターチップあるいはエアゾー� ��耐性チップを使用することができる。この� ��うな市販品の使用は、入手が容易であると� ��う観点から好ましい。

 チップを核酸増幅容器に装着する際には� ��検体中に含まれる核酸または増幅核酸断片� ��飛散を厳密に防ぐため、チップと核酸増幅� ��器が密着していることが好ましい。このよ� ��な形状のチップおよび核酸増幅容器の組み� ��わせを市販品より選抜して用いることが好� ��しいが、チップと核酸増幅容器の形状が合� ��ず、核酸増幅容器にチップを装着した際に� ��間が生じる場合には、例えば、チップとし� ��市販のフィルターチップあるいはエアゾー� ��耐性チップを使用し、当該チップの形状に� ��わせて核酸増幅容器を作製することも、当� ��者により容易に想到し得る。また、核酸増� ��容器にチップを装着した際に生じた隙間を� ��ール材などを充填することにより塞ぐ、あ� ��いは、核酸増幅容器とチップの間に装着す� ��アダプターなどを作製する、などによりチ� ��プと核酸増幅容器を密着させることも、当� ��者により容易に想到し得る。

 本発明の重要な開示について、チップに� ��ィルター内臓チップを用い、核酸増幅容器� ��キャピラリチューブを用いる場合を例とし� ��、図15を用いて、より詳しく説明する。図15 において、まず、(A)に示すような、フィルタ ーを内蔵したチップに、手動分注器または自 動分注装置を用いて、(B)に示すように、核酸 増幅反応のための溶液を吸引し、溶液を保持 する。当該チップを、手動または自動にて、 (C)に示すように、核酸増幅容器まで移動させ 、(D)に示すように、チップを核酸増幅容器に 装着する。次に、チップを手動分注器または 自動分注装置から取り外す。このとき、手動 分注器または自動分注装置の分注機構から空 気を吐出しながら、当該チップを取り外す動 作を行なうことにより、当該動作の際に生じ る圧力によってチップに保持された溶液の位 置が変化する現象を回避することもできる。

 続いて、チップを装着した核酸増幅容器� ��遠心することにより、(E)に示すように、核� ��増幅反応のための溶液を核酸増幅容器の底� ��に移動させる。このとき、遠心の代わりに� ��気圧を用いることにより、当該溶液を移動� ��せることもできる。空気圧を用いる場合に� ��、例えば、手動分注器または自動分注装置� ��分注機構を再度チップに装着し、空気を吐� ��することにより、チップに保持された溶液� ��押し出すことができる。

 次に、(E)の状態のままで核酸増幅反応お� ��び増幅核酸断片の検出を行い、(E)の状態の� ��までチップおよび核酸増幅容器を廃棄する� ��

 また、本発明の別の重要な開示について� ��チップにフィルター内臓チップを用い、核� ��増幅容器にキャピラリチューブを用いる場� ��を例として、図15を用いて説明する。図15に おいて、まず、(A)に示すような、フィルター を内蔵したチップに、手動分注器または自動 分注装置を用いて、(B)に示すように、核酸増 幅反応のための溶液を吸引し、溶液を保持す る。当該チップを、手動または自動にて、(C) に示すように、核酸増幅容器まで移動させ、 (D)に示すように、チップを核酸増幅容器に装 着する。

 次に、手動分注器または自動分注装置の� ��注機構から空気を吐出することにより、チ� ��プに保持された溶液に空気圧を与え、(E)に� ��すように、当該溶液を核酸増幅容器の底部� ��移動させる。

 続いて、(E)の状態のままで核酸増幅反応お� ��び増幅核酸断片の検出を行い、(E)の状態の� ��までチップおよび核酸増幅容器を廃棄する� ��