SDF-1a (stromal cell derived factor 1a) und seine durch alternatives Spleißen entste- hende Isoform SDF-1ß wurden ursprünglich aus einer Zellinie von Stromazellen des Knochenmarks der Maus kloniert (Tashiro et al, 1993). Auf der Grundlage der festgestell- ten Homologie der abgeleiteten Aminosäuresequenz zu den Sequenzen des Interleu- kins 8 (32%) und des Makrophagen-Entzündungsproteins 1a (32%) und der Anwesenheit von vier charakteristischen Cystein-Resten wurden SDF-1a und SDF-1ß der Gruppe der CXC (a)-Chemokine zugeordnet. Die CXC (a)-Chemokine sind eine Untergruppe der Fa- milie der interkrinen Cytokine, die aus verschiedenen entfernt verwandten entzündungs- fördernden Cytokinen besteht. Die cDNA-Sequenzen für SDF-1a und SDF-1ß der Maus und des Menschen weisen eine starke Homologie zueinander auf und entstehen durch alternatives Spleißen eines einzigen Gens.

Die biologische Funktion von SDF-1 wurde anhand des menschlichen SDF-1a untersucht.

SDF-1a ist für die Reifung von B-Zellen erforderlich, wirkt T-lymphotrop und induziert den Zelltod bei der neuronalen Zellinie hNT. SDF-1 a ist ein natürlicher Ligand des CXCR4 (LESTR/Fusin)-Chemokin-Rezeptors von T-Zellen, der ein bindender Kofaktor von T-lymphotropen HlV-1-Stämmen ist. SDF-1a und-1ß zeigen sowohl in vitro als auch in vivo ein"growth arrest"-spezifisches Expressionsmuster in Fibroblasten und Hepatozyten.

Mäuse, bei denen das SDF-1-Gen inaktiviert wurde, zeigen eine verminderte Bildung von B-Zellen, einen Defekt des ventrikulären Septums und Defekte bei der Zellmigration im Kleinhirn, und sterben kurz nach der Geburt. SDF-1 könnte bei der Nervenregeneration eine wichtige Rolle spielen.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Mittel zur Verfügung zu stellen, die gezielt zur Diagnose und/oder Behandlung von Erkrankungen, die in Zusam- menhang mit einem Defekt des SDF-1-Faktors oder seines Rezeptors (CXCR4) stehen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Nukleinsäure-Molekül, umfassend : (1) eine für ein Chemokin, einen Neuropeptid-Präkursor oder mindestens ein Neuropep- tid kodierende Nukleinsäuresequenz, die aus folgenden Sequenzen ausgewählt ist : (a) einer Nukleinsäuresequenz nach SEQ ID NO : 1 ; (b) einer Nukleinsäuresequenz, die ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz nach SEQ ID NO : 2 kodiert ; (c) einer Nukleinsäuresequenz, die mit der in (a) angegebenen Sequenz zu minde- stens 60% identisch ist ; (d) einer Sequenz, die mit dem Gegenstrang der in (a) angegebenen Sequenz hybri- disiert oder unter Berücksichtigung der Degeneration des genetischen Codes hy- bridisieren würde ; (e) einem durch Substitution, Addition, Inversion und/oder Deletion einer oder mehre- rer Nukleotide erhaltenen Derivat einer der in (a) oder (b) angegebenen Sequen- zen, das für ein Chemokin, einen Neuropeptid-Präkursor oder mindestens ein Neuropeptid kodiert ; oder (2) eine komplementäre Sequenz zu einer der in (a) bis (e) angegebenen Nukleinsäure- sequenzen.

Der Begriff"Polypeptid", wie nachfolgend in der Beschreibung verwendet, umfaßt aus 7 oder mehr Aminosäuren zusammengesetzte Peptide oder Proteine.

Der Begriff"Chemokin"steht für ein Mitglied einer Familie relativ kleiner Proteine, die auf der Basis der charakteristischen Anordnung von Cystein-Gruppen in vier Untergruppen unterteilt werden : C, CC, CXC und CX3C. Die Chemokine binden an spezifische Rezepto- ren (Rollins, B. J., 1997). In Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff"Chemokin"insbesondere auf Mitglied der CXC-Chemokinfamilie. Vorzugs- weise handelt es sich bei dem Chemokin um ein Polypeptid-Molekül, das in einem Ca- Imaging-Experiment unter den in Köller et al (2001) beschriebenen Bedingungen einen 1,5-10-fachen Anstieg der intrazellulären Calcium-Konzentration in primären Astrozyten und/oder Neuronen aus dem Zentralnervensystem von Ratten oder Menschen hervorruft.

Als"Neuropeptide"werden biologisch aktive und physiologisch wichtige Signalmolekule mit regulatorischen und modulatorischen Funktionen im Nervensystem bezeichnet. Die Funktionsbereiche umfassen unter anderem Neurotransmission, Rezeptormodulation, Veränderung elektrophysiologischer Eigenschaften von Zellmembranen und metaboli- scher Prozesse. Neuropeptide werden von Neuronen synthetisiert und meist an der Sy- napse freigesetzt (Siegel et al., 1989).

Unter"Neuropeptid-Präkursor"wird ein Vorläuferprotein verstanden, das durch proteolyti- sche Spaltung in ein aktives Neuropeptid überführt wird.

Die im erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Molekül enthaltene Nukleinsäuresequenz kann eine genomische DNA, cDNA oder synthetische DNA sein, wobei unter synthetischen DNA-Sequenzen auch solche verstanden werden, die modifizierte Internukleosid-Bindun- gen enthalten.

In Zusammenhang mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Molekülen bezieht sich der Ausdruck"mindestens 60% identisch"auf Identität auf DNA-Ebene, die gemäß bekannter Verfahren, z. B. der computergestützten Sequenzvergleiche (Altschul et al., 1990) be- stimmt werden kann.

Der dem Fachmann bekannte Ausdruck"Identitat"bezeichnet den Grad der Verwandt- schaft zwischen zwei oder mehr Nukleinsäuremolekülen, der durch die Übereinstimmung zwischen den Sequenzen bestimmt wird. Der Prozentsatz der"Identitat"ergibt sich aus dem Prozentsatz identischer Bereiche in zwei oder mehr Sequenzen unter Berücksichti- gung von Lücken oder anderen Sequenzbesonderheiten.

Die Identität miteinander verwandter Nukleinsäuremoleküle kann mit Hilfe bekannter Ver- fahren bestimmt werden. In der Regel werden spezielle Computerprogramme mit den be- sonderen Anforderungen Rechnung tragenden Algorithmen eingesetzt. Bevorzugte Ver- fahren zur Bestimmung der Identität erzeugen zunächst die größte Übereinstimmung zwi- schen den untersuchten Sequenzen. Computerprogramme zur Bestimmung der Identität zwischen zwei Sequenzen umfassen das GCG Programmpaket, einschließlich GAP (De- vereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12 (12) : 387,1984) ; Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison, (Wi)) ; BLASTP, BLASTN und FASTA (Altschul et al., 1990), sind jedoch nicht auf diese eingeschränkt. Das BLASTX Programm kann vom Na- tional Centre for Biotechnology Information (NCBI) und aus weiteren Quellen bezogen werden (BLAST Handbuch, Altschul S., et al., NCB NLM NIH Bethesda MD 20894 ; Alt- schul (et a (., 1990). Auch der bekannte Smith Waterman-Algorithmus kann zur Bestim- mung von Identität verwendet werden.

Bevorzugte Parameter für den Nukleinsauresequenz-Vergleich umfassen die nachste- henden : Algorithmus : Needleman und Wunsch (1970) Vergleichsmatrix : Übereinstimmung (matches) =+10 Nichtübereinstimmung (mismatch) = 0 Lücken-Wert (Gap Penalty) : 50 Lückenlängen-Wert : (Gap Length Penalty) : 3 Das GAP-Programm ist auch zur Verwendung mit den vorstehenden Parametern geeig- net. Die vorstehenden Parameter sind die Standardparameter (default parameters) für Nukleinsäuresequenz-Vergleiche.

Weitere beispielhafte Algorithmen, Lücken-Offnungs-Werte (gap opening penalties), Lückenausdehnungs-Werte (gap extension penalties), Vergleichsmatrizen einschließlich der im Programm-Handbuch, Wisconsin-Paket, Version 9, September 1997, genannten können verwendet werden. Die Auswahl wird von dem durchzuführenden Vergleich ab- hängen und weiterhin davon, ob der Vergleich zwischen Sequenzpaaren, wobei GAP oder Best Fit bevorzugt sind, oder zwischen einer Sequenz und einer umfangreichen Sequenz- Datenbank, wobei FASTA oder BLAST bevorzugt sind, durchgeführt wird. Eine mit dem oben genannten Algorithmus ermittelte Übereinstimmung von 60% wird im Rahmen dieser Anmeldung als 60% ige Identität bezeichnet. Entsprechendes gilt für höhere Identitäts- grade.

Das Merkmal"Sequenz, die mit dem Gegenstrang der in (a) angegebenen Sequenz hy- bridisiert"weist auf eine Sequenz hin, die unter stringenten Bedingungen mit dem Ge- genstrang der unter (a) angegebenen Sequenz hybridisiert. Beispielsweise können die Hybridisierungen bei 42°C mit einer Hybridisierungslösung bestehend aus 5 x SSPE, 5 x Denhardt's, 0,1 % SDS, 100 g/ml Lachssperma-DNA, 30-50% Formamid (Sambrook et al., 1989) durchgeführt werden. Als Waschschritt eignet sich eine zweimal wiederholte 10-15minütige Waschung in 2 x SSPE, 0,1% SDS bei 42°C, gefolgt von einer zweimal wiederholten 20minütigen Waschung in 0,2 x SSPE, 0,1 % SDS bei 50°C. Alternativ kann bei den Waschlösungen SSC anstelle von SSPE verwendet werden.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass das erfindungsgemäße Nukleinsäure- Molekül ein neues Mitglied der SDF-Familie von Chemokinen darstellt, das im folgenden als SDF-1y bezeichnet wird. Die Klonierung und Charakterisierung der SDF-ly-cDNA sowie die Nukleinsäuresequenz und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz für das humane SDF-1y und das SDF-1 von Ratte werden in den Beispielen beschrieben.

Die SDF-1y-Nukleinsauresequenz besteht aus der vollständigen Nukleinsäuresequenz von SDF-1 D und einer zusätzlichen Sequenz von 2572 Nukleotiden, die im gleichen Lese- raster stromabwärts an das Codon 89 von SDF-1ß anschließt. Durch dieses Insert ergibt sich für das neue SDF-ly-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit 119 Aminosäuren und einem theoretischen Molekulargewicht von 13,6 Kd, wobei die Sequenz am Carboxy- terminus im Vergleich zu der bekannten SDF-la-Sequenz um 30 Aminosäuren verlängert ist. Es wird vermutet, dass SDF-1y durch Insertion eines neuen alternativen Exons Illa zwischen den bekannten Exons III und IV (vgl. Shirozu et al., 1995) erzeugt wird.

Im Carboxy-terminalen Bereich der Aminosäuresequenz von SDF-1y können 5 Gruppen aus zwei basischen Aminosäuren (Lys-Lys, Arg-Arg und Lys-Arg) Erkennungsmuster für eine Membran-gebundenen Protease des Golgi-Systems und der Sekretionsvesikel bil- den. Durch proteolytische Spaltung an diesen Stellen entstehen fünf kurze Peptide (SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10) und ein verkürztes Protein (SEQ ID NO : 7), von denen zwei Peptide und ein Polypeptid (SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6 und SEQ ID NO : 7) einen Carboxy-terminalen Glycin-Rest aufweisen. Peptide mit einem Glycin-Rest am Carboxyterminus sind potentielle Substrate für die Peptidyl-a-ami- dierende Monooxigenase (PAM), die die Carboxy-terminale Spaltung von Carboxylat ka- talysiert und dadurch a-amidierte Carboxytermini (CONH2) erzeugt, die für Neuropeptide charakteristisch sind (siehe Übersicht von Eipper et al., 1992).

Das SDF-1, B-Transkript von Ratte (siehe SEQ 1D NO : 16) kodiert ein Protein mit 93 Ami- nosäuren (siehe SEQ ID NO : 17) und einem theoretischen Molekulargewicht von 10,5 Kd, wobei die ersten 19 Aminosäuren eine Signalsequenz für sezernierte Proteine darstellen.

Die ersten 17 Aminosäuren des reifen Proteins, die in allen Isoformen vorkommen, wer- den für die Bindung an den CXCR4-Rezeptor benötigt (vgl. Loetscher et al. 1998 ; Doranz et al., 1999). Zwei basische Aminosäuren (Lys 89 und Arg 90) im Carboxy-terminalen Bereich liefern ein Erkennungsmuster für die proteolytische Spaltung, aus der sich ein Pentapeptid (Lys 89-Met 93, SEQ ID NO : 18) und ein verkürztes Protein ergeben.

In einer Ausführungsform der Erfindung umfasst das erfindungsgemäße Nukleinsäure- Molekül eine Nukleinsäuresequenz, die mit der Nukleinsauresequenz nach SEQ ID NO : 1 zu mindestens 80%, vorzugsweise zu mindestens 90%, besonders bevorzugt zu minde- stens 95% identisch ist.

Nukleinsäure-Moleküle, die eine Nukleinsäuresequenz nach SEQ ID NO : 3 oder eine für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz nach SEQ ID NO : 4 kodierende Nukleinsäu- resequenz umfassen, sind besonders bevorzugt.

Das erfindungsgemäße Nukleinsäure-Molekül kann weiterhin einen zur Expression ge- eigneten Promotor umfassen, wobei die kodierende Nukleinsäuresequenz unter der Kon- trolle des Promotors steht. Ein, zur Expression geeigneter Promotor", wie hier verwendet, bezeichnet ein DNA-Fragment, durch das der Initiationspunkt und die lnitiationshaufigkeit der Transkription (RNA-Synthese) einer unter der Kontrolle des Promotorelements ste- henden Nukleinsäuresequenz, die ein Chemokin, einen Neuropeptid-Präkursor oder min- destens ein Neuropeptid kodiert, im Wirtsorganismus festgelegt werden. Die Wahl des Promotors hängt vom zur Expression verwendeten Expressionssystem ab. Generell sind konstitutive Promotoren bevorzugt, jedoch sind auch induzierbare Promotoren, wie z. B. der Metallothionein-Promotor, möglich. Zur Ausführung der Erfindung in Betracht kom- mende Promotoren schließen unter anderem die FMD-, MOX-, TPS1-, PMA1-und DAS-Promotoren aus Hansenula polymorpha, die AOX1-und GAP1-Promotoren aus Pichia pastoris, die ADH1-, PDC1-, GAP1-und CUP1-Promotoren aus S. cerevisiae, die AXDH-und AHSB4-Promotoren von Arxula adeninovorans und die NDK1-und CPC2-Promotoren von Sordaria macrospora ein.

Das erfindungsgemäße Nukleinsäure-Molekül kann darüber hinaus Sequenzen eines Vektors umfassen, die die Replikation des Nukleinsäure-Moleküls in einer Wirtszelle und/oder die Integration des Nukleinsäure-Moleküls in das Genom einer Wirtszelle er- möglichen. Im Stand der Technik sind zahlreiche Klonierungs-und Expressions-Vektoren bekannt, vgl. Recombinant Gene Expression Protocols, Meth. Mol. Biol. Vol. 62, Humana Press, New Jersey, USA. Zur Replikation. in einer Wirtszelle muß der verwendete Vektor einen Replikationsursprung und gegebenenfalls weitere regulatorische Regionen enthal- ten. Der Vektor kann aus Bakteriophagen wie A-Derivaten, Adenoviren, Vacciniaviren, Baculoviren, SV40-Virus, Retroviren ; Plasmiden, wie Ti-Plasmiden von Agrobacterium tumefaciens, YAC-Vektoren und BAC-Vektoren ausgewählt sein.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner eine Wirtszelle, die mindestens ein er- findungsgemäßes Nukleinsäure-Molekül enthält, wobei die Wirtszelle eine zur Expression des Nukleinsäure-Moleküls und gegebenenfalls zur Prozessierung des entstandenen Po- lypeptid-Moleküls geeignete prokaryontische oder eukaryontische Zelle ist. Im Stand der Technik sind zahlreiche prokaryontische und eukaryontische Expressionssysteme be- kannt. Wirtszellen können beispielsweise aus prokaryontischen Zellen, wie E. coli oder B. subtilis, oder aus eukaryontischen Zellen, wie Pilzzellen, Pflanzenzellen, Insektenzellen und Säugerzellen, z. B. CHO-Zellen, COS-Zellen oder HeLa-Zellen, sowie Derivaten da- von ausgewählt sein. Im Stand der Technik sind beispielsweise bestimmte CHO-Produk- tionslinien bekannt, deren Glykosylierungsmuster im Vergleich zu CHO-Zellen verändert sind. Vorzugsweise ist die eukaryontische Wirtszelle die Hefe Saccharomyces cerevisiae, die methylotrophe Hefe Hansenula polymorpha, die dimorphe Hefe Arxula adeninivorans oder der filamentöse Pilz Sordaria macrospora.

Die Erfindung stellt ferner ein Polypeptid-Molekül bereit, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus folgenden Sequenzen ausgewählt ist : (i) einer Aminosäuresequenz, die eine der Aminosäuresequenzen nach SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9 und/oder SEQ ID NO : 10 und/oder Kombination aus zwei oder mehreren dieser Sequenzen umfaßt ; (ii) einer Aminosäuresequenz nach SEQ ID NO : 4 ; (iii) einer Aminosäuresequenz, die der Sequenz von Aminosäure 20 bis Aminosäure 119 in SEQ ID NO : 4 entspricht ; (iv) einer Aminosäuresequenz nach SEQ ID NO : 22 ; (v) einer Aminosäuresequenz, die mit der in (i), (ii), (iii) oder (iv) angegebenen Se- quenz zu mindestens 85% identisch ist.

In diesem Zusammenhang bezieht sich der Ausdruck"mindestens 85% identisch"auf Übereinstimmung auf der Ebene der Aminosäuresequenz, die gemäß bekannter Verfah- ren, z. B. der computergestützten Sequenzvergleiche (Altschul et al., 1990) bestimmt wer- den kann.

Der Ausdruck"Identität"bezeichnet hier den Grad der Verwandtschaft zwischen zwei oder mehreren Polypeptid-Molekülen, der durch die Übereinstimmung zwischen den Sequen- zen bestimmt wird, wobei unter Übereinstimmung sowohl identische Übereinstimmung als auch konservativer Aminosäure-Austausch zu verstehen ist. Der Prozentsatz der"Iden- tität"ergibt sich aus dem Prozentsatz übereinstimmender Bereiche in zwei oder mehr Se- quenzen unter Berücksichtigung von Lücken oder anderen Sequenzbesonderheiten.

Der Begriff"konservativer Aminosäure-Austausch"bezieht sich auf einen Austausch eines Aminosäurerestes durch einen anderen Aminosäurerest, wobei der Austausch einen möglichst geringen Einfluß auf die (räumliche) Struktur des Polypeptid-Moleküls ausüben soll. Grundsätzlich werden vier physiko-chemische Gruppen unterschieden, in die die natürlicherweise vorkommenden Aminosäuren eingeteilt werden. Zur Gruppe der basischen Aminosäuren gehören Arginin, Lysin und Histidin. Zur Gruppe der sauren Ami- nosäuren gehören Glutaminsäure und Asparaginsäure. Die ungeladenen/polaren Ami- nosäuren umfassen Glutamin, Asparagin, Serin, Threonin und Tyrosin. Die nichtpolaren Aminosäuren umfassen Phenylalanin, Tryptophan, Cystein, Glycin, Alanin, Valin, Methio- nin, Isoleucin, Leucin und Prolin. Ein konservativer Aminosäure-Austausch bedeutet in diesem Zusammenhang den Austausch einer gegebenen Aminosäure durch eine Ami- nosäure, die zur gleichen physiko-chemischen Gruppe gehört.

Die Identität miteinander verwandter Polypeptid-Moleküle kann mit Hilfe bekannter Verfah- ren bestimmt werden. Bevorzugte Verfahren zur Bestimmung der Identität erzeugen zu- nächst die größte Übereinstimmung zwischen den untersuchten Sequenzen. Computer- programme zur Bestimmung der Identität zwischen zwei Aminosäuresequenzen umfas- sen das GCG-Programmpaket, einschließlich GAP (Devereux et al., 1984 ; Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison, (Wl)) ; BLASTP, BLASTN und FASTA (Altschul et al., 1990), sind jedoch nicht auf diese eingeschränkt. Das BLAST X Programm kann vom National Centre for Biotechnology Information (NCBI) und aus weiteren Quellen bezogen werden (BLAST Handbuch, Altschul, S. et al., NCB NLM NIH Bethesda MD 20894 ; Altschul et al., 1990). Auch der bekannte Smith Waterman-Algorithmus kann zur Bestimmung von Sequenzidentität verwendet werden.

Bevorzugte Parameter für den Sequenz-Vergleich umfassen die nachstehenden : Algorithmus : Needleman und Wunsch (1970) Vergleichsmatrix : BLOSUM 62 von Henikoff und Henikoff (1992) Lücken-Wert (Gap Penalty) : 12 Lückenlängen-Wert (Gap Length Penalty) : 4 Schwellenwert der Ähnlichkeit : 0 Das GAP-Programm ist auch zur Verwendung mit den vorstehenden Parametern geeig- net. Die vorstehenden Parameter sind die Standardparameter (default parameters) für Aminosäuresequenz-Vergleiche, wobei Lücken an den Enden den Identität-Wert nicht verringern. Bei sehr kurzen Sequenzen im Vergleich zur Referenzsequenz kann es wei- terhin notwendig sein, den Erwartungswert (expected value) auf bis zu 100.000 zu erhö- hen und gegebenenfalls die Wortlänge (word size) auf bis zu 2 zu verkleinern.

Weitere beispielhafte Algorithmen, Lücken-Öffnungs-Werte (gap opening penalties), Lückenausdehnungs-Werte (gap extension penalties), Vergleichsmatrizen einschließlich der im Programm-Handbuch, Wisconsin-Paket, Version 9, September 1997, genannten können verwendet werden. Die Auswahl wird von dem durchzuführenden Vergleich ab- hängen und weiterhin davon, ob der Vergleich zwischen Sequenzpaaren, wobei GAP oder Best Fit bevorzugt sind, oder zwischen einer Sequenz und einer umfangreichen Se- quenz-Datenbank, wobei FASTA oder BLAST bevorzugt sind, durchgeführt wird.

Eine mit dem oben genannten Algorithmus ermittelte Übereinstimmung von 85% wird im Rahmen dieser Anmeldung als 85% ige Identität bezeichnet. Entsprechendes gilt für hö- here Identitätsgrade.

In einer Ausführungsform der Erfindung umfasst das erfindungsgemäße Polypeptid-Mole- kül eine Sequenz, die mit der vorstehend unter (i), (ii), (iii) oder (iv) angegebenen Amino- säuresequenz zu mindestens 90%, vorzugsweise zu mindestens 95% identisch ist. Be- sonders bevorzugt sind Polypeptid-Moleküle, die eine Aminosäuresequenz nach SEQ ID NO : 12 oder SEQ ID N0 : 13 umfassen.

In einer Ausführungsform der Erfindung umfaßt das erfindungsgemäße Polypeptid-Mole- kül die Aminosäuresequenzen nach SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6 und/oder SEQ ID NO : 7.

Bevorzugt sind Polypeptid-Moleküle gemäß der Erfindung, die die Aminosäuresequenzen nach SEQ ID NO : 5 und SEQ ID NO : 6 umfassen.

In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Fusionsprotein bereit, das min- destens ein erfindungsgemäßes Polypeptid umfasst.

Fragmente der erfindungsgemäßen Polypeptid-Moleküle, die mindestens ein Neuropeptid umfassen, werden von der Erfindung ebenfalls umfasst. Bevorzugt sind Fragmente, die mindestens eine der Aminosäuresequenzen nach SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9 und/oder SEQ ID NO : 10 umfassen. Besonders bevor- zugt sind Fragmente mit der Aminosäuresequenz nach SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6 oder SEQ ID NO : 7. Die Fragmente der erfindungsgemäßen Polypeptid-Moleküle können auch modifiziert sein, beispielsweise durch Glykosilierung, Phosphorylierung, Acetylierung oder Amidierung.

Vorzugsweise handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen Polypeptid-Molekül, Fusions- protein oder Fragment um ein Polypeptid-Molekül, das in einem Ca-imaging-Experiment unter den in Killer et al (2001) beschriebenen Bedingungen einen 1,5-10-fachen Anstieg der intrazellularen Calcium-Konzentration in primären Astrozyten und/oder Neuronen aus dem Zentralnervensystem von Ratten oder Menschen hervorruft.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zum Herstellen eines erfindungs- gemäßen Polypeptid-Moleküls und/oder eines Fragments davon, das das Kultivieren einer erfindungsgemäßen Wirtszelle unter zur Expression und eventuellen Prozessierung geeigneten Bedingungen und gegebenenfalls das Aufreinigen des exprimierten Polype- tid-Moleküls oder Fragments umfasst. Alternativ können die erfindungsgemäßen Polypep- tid-Moleküle und Fragmente davon auch durch chemische und enzymatische Synthese, wie beispielsweise Merrifield-Synthese, und/oder Fragmentkondensation erhalten werden.

Kombinationen von chemischen, enzymatischen und rekombinanten Herstellungsverfah- ren kommen ebenfalls in Betracht.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Antikörper, der für ein erfindungsgemäßes Polypeptid-Molekül und/oder ein Fragment davon spezifisch ist. Allgemein sind spezifi- sche Antikörper durch Immunisieren von Versuchstieren, wie z. B. Mäusen oder Kanin- chen, mit den erfindungsgemäßen Polypeptid-Molekülen und/oder Fragmenten, die vor- zugsweise an geeignete hochmolekulare Trägermolekule (haufig Proteine) gekoppelt sind, erhältlich. Das Immunisieren kann hierbei durch den Zusatz geeigneter im Stand der Technik bekannter Adjuvanzien erleichtert werden. Monoklonale Antikörper sind üblicher- weise durch Fusionieren von Milzzellen, die aus einer immunisierten Maus entnommen wurden, mit Tumorzellen und Selektionieren der dabei entstehenden Hybridome erhält- fich. Diejenigen Hybridome, die effizient spezifische Antikörper sezernieren, können hier- bei durch Absuchen des Überstandes bestimmt werden. Alternativ können Antikörper re- kombinant hergestellt werden ; bei der Herstellung rekombinanter Antikörper wird die mRNA aus Hybridomazellen oder B-Lymphozyten isoliert, die als Grundlage für die Syn- these der entsprechenden cDNA fungiert und über PCR amplifiziert wird. Nach der Liga- tion in einen geeigneten Vektor und der Einführung in eine geeignete Wirtszeiikuftur täßt sich der Antikörper aus den Zelikulturüberständen oder den Zelilysaten gewinnen. Re- kombinante Antikörper erlauben eine"Humanisierung"des Antikörpers und sind dadurch weniger immunogen. Die diesbezüglichen Verfahren sind im Stand der Technik bekannt.

Zum Nachweisen eines erfindungsgemäßen Polypeptid-Moleküls und/oder Fragments davon in einer biologischen Probe stellt die Erfindung ein in vitro-Verfahren bereit, das das Inkontaktbringen der Probe mit einem für das Polypeptid-Molekül und/oder für ein Fragment davon spezifischen Reagenz und das Nachweisen der Bindung umfasst.

Die Erfindung stellt ferner einen Test-Kit zum Nachweisen eines Polypeptids und/oder eines Fragments davon bereit, der mindestens ein für das erfindungsgemäße Polypeptid und/oder Fragment spezifisches Reagenz umfasst. Ein Beispiel solcher spezifischen Reagenzien sind Antikörper, Antikörperfragmente, z. B. Fab oder F (ab) 2-Fragmente oder Antikörperderivate, wobei Antikörper besonders bevorzugt sind. Die Antikörper, Antikör- perfragmente, z. B. Fab oder F (ab) 2-Fragmente oder Antikörperderivate können mono- klonalen oder polyklonalen Ursprungs sein.

Ferner stellt die Erfindung ein in vitro-Verfahren zum Nachweisen einer ein erfindungsge- mäßes Polypeptid-Molekül kodierenden Nukleinsäure in einer biologischen Probe bereit, das : -das Inkontaktbringen der Probe mit einem erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Mole- kül und/oder Fragment davon, wobei das Nukleinsäure-Molekül und/oder das Frag- ment eine nachweisbare Markierung tragen, und -das Nachweisen der Markierung umfasst.

Gegenstand der Erfindung sind ferner pharmazeutische Zusammensetzungen, die min- destens ein erfindungsgemäßes Polypeptid-Molekül und/oder ein Fragment davon und/oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz eines solchen Polypeptid-Moleküls oder Fragments enthalten. Diese pharmazeutischen Zusammensetzungen können einen pharmakologisch verträglichen Träger und/oder Verdünnungsmittel enthalten. Geeignete Träger und/oder Verdünnungsmittel sind im Stand der Technik bekannt. Bevorzugt sind pharmazeutische Zusammensetzungen, die sich zur intravenösen, subkutanen oder intra- muskulären Verabreichung eignen. In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen enthält die Zusammensetzung neben einem oder mehreren erfindungsgemäßen Polypeptid-Molekülen oder Fragmenten derselben auch mindestens einen Antikörper.

Erfindungsgemäß können diese pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Therapie von demyelinisierenden oder neurodegenerativen Erkrankungen oder von Entwicklungs- störungen des Nervensystems eingesetzt werden. Eine weitere Anwendung der erfin- dungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen ist auf die Vorbeugung oder Behandlung einer HIV-Infektion und insbesondere einer HIV-Enzephalopathie in Men- schen gerichtet. Von der Erfindung wird ebenfalls die Anwendung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Therapie von Erkrankungen des hämato- poietischen Systems, des Immunsystems und des Herz/Kreislaufsystems umfaßt.

Pharmazeutische Zusammensetzungen, die mindestens ein für ein erfindungsgemäßes Polypeptid-Molekül und/oder ein Fragment davon spezifisches Reagenz enthalten, wer- den von der Erfindung ebenfalls umfasst. Vorzugsweise ist das Reagenz ein Antikörper.

Solche pharmazeutische Zusammensetzungen können zur Diagnose oder Therapie von demyelinisierenden oder neurodegenerativen Erkrankungen oder von Entwicklungssto- rungen des Nervensystems eingesetzt werden. Eine weitere Anwendung betrifft die Diag- nose oder Behandlung einer HIV-Infektion und insbesondere einer HIV-Enzephalopathie in Menschen.

Die folgenden Figuren und Beispiele erläutern die Erfindung : Figur 1 zeigt die auf RT-PCR beruhende Strategie zur Klonierung von SDF-1ß-und SDF-ly-cDNA aus Ratte. 5'-und 3'-UTR-Bereiche werden durch Linien, kodierende Bereiche durch Kästchen dargestellt. Kleine Pfeile zeigen die Position und Orientierung der Primer. Identische oder homologe Sequenzen werden durch identische graphische Elemente dargestellt. Die letzten vier Codons der kodierenden Region von SDF-1ß wer- den als schwarzes Kästchen dargestellt. Die Strichlinien markieren ein Insert von 2572 Nukleotiden in SDF-1Y. Die 30 carboxyterminalen Codons von SDF-1y werden als schraf- fiertes Kästchen dargestellt.

Figur 2 zeigt das Ergebnis eines Northern-Blot-Versuchs zum Nachweis von SDF-1 ß-und SDF-ly-Transkripten im Ischiasnerv von erwachsenen Ratten. Die Filter wurden (A) mit einem radioaktiven markierten, 626 Nukleotiden langen PCR-Fragment der NT-1-15- cDNA, das den Nukleotiden 743-1368 von SDF-1ß entspricht und Teil der SDF-1ß und SDF-1y gemeinsamen 3'-UTR-Sequenz ist, (B) mit einem 190 Nukleotide langen PCR- Fragment der allen SDF-1-isoformen gemeinsamen kodierenden Region, das den Nu- kleotiden 49-239 in der SEQ ID NO : 16 entspricht, (C) mit einem 1702 Nukleotide langen Fragment, das den Nukleotiden 625-2327 der SDF-1y-cDNA entspricht und von dem SDF-ly-spezifischen Insert durch Verdau des mit den Primern GAS2 und MMSE2 erhal- tenen PCR-Produktes mit Pvull entstand, hybridisiert.

Figur 3 zeigt die Nukleinsäuresequenzen sowie die davon abgeleitete Aminosäure- sequenzen der SDF-1, 8-und SDF-1r-cDNA aus Ratte. Das SDF-ly-spezifische Insert ist durch einen Rahmen hervorgehoben. Die Nukleinsäuresequenz des gemeinsamen Sig- nalpeptids ist unterstrichen. Die Numerierung der Nukleotide (links) und der Aminosäuren (rechts) entspricht der Sequenz von SDF-1y. (93) kennzeichnet die letzte Aminosäure von SDF-1ß.

Figur 4 zeigt einen Vergleich der Aminosäuresequenzen der SDF-1 Proteine von Maus und Ratte. Die Punkte stehen für identische Aminosäuren. Das 19 Aminosäuren lange Signalpeptid ist umrahmt.

Figur 5 zeigt das Ergebnis verschiedener Northern-Blot-Versuche zum Nachweis von SDF-1, 8-und SDF-1r-Transkripten in verschiedenen Geweben (A) und Entwicklungssta- dien (B). (A) Northern-Blot-Filter mit Gesamt-RNA aus Ischiasnerv (SN), Hirn (Br), Lunge (Lu), Herzen (HE), Muskel (Mu), Hoden (Te), Leber (Li), Niere (Ki), Milz (Sp) und Thymus (Th) von Ratten wurden mit einer radioaktiv markierten cDNA-Sonde aus dem SDF-1ß und SDF-1r gemeinsamen 3'-UTR-Bereich hybridisiert. (B) Nachweis von SDF-1, 8-und SDF-1r-mRNA im Hirn von Ratten während der Entwicklung. Northern-Blot-Filter mit Ge- samt-RNA aus dem Hirn von 17 Tage alten Rattenembryonen (E 17) sowie von Ratten 1, 4,7,13 und 20 Tage nach der Geburt (P1-20) und von erwachsenen Tieren (Ad) wurden wie bei (A) hybridisiert. (C) Nachweis von SDF-ß-und SDF-ly-mRNA im Ischiasnerv von Ratten im Laufe der Entwicklung. Northern-Blot-Filter mit Gesamt-RNA, die aus Nerven von 1,4,7,14 und 21 Tage alten Ratten (P1-21) und von erwachsenen Ratten (Ad) ge- wonnen wurde, wurden mit einer SDF-1ß/r-Sonde wie bei (A) hybridisiert. Die Pfeilspitze in dem oberen Teil zeigt die Position der ribosomalen 28S-RNA ; die unteren Teile zeigen mit Methylenblau gefärbte Northern-Blot-Filter.

Figur 6 zeigt das Ergebnis von in situ-Hybridisierungsversuchen zur zellulären Lokalisie- rung von SDF-ly-mRNA im Hirn von erwachsenen Ratten. Die Schnitte wurden mit einem Digoxigenin-UTP-markierten, 596 Nukleotide langen Antisense-Transkript, das aus einem Subklon der allen SDF-1-mRNA-Isoformen gemeinsamen 5'-UTR-und kodierenden Sequenz (A, D, E) bzw. von einem Subklon des SDF-1y-spezifischen Inserts (B, E, H) abgeleitet ist, inkubiert. Als negative Kontrolle diente die Hybridisierung mit Sense-Tran- skripten (C, F, I). (A, B, C) Corpus callosum mit"Perlenkette"-ähnlicher Anreihung von markierten Oligodendrozyten und stark markierten Neuronen in den bilateralen Schichten des Indusium griseum dorsale des Corpus callosum. (D, E, F) Starke Hybridisierungs- signale werden in Purkinje-und Granulärzellen des Kleinhirns und schwache Signale in der äußeren Schicht beobachtet. (G, H, I) Sehr starke Hybridisierungssignale werden in pyramidalen und granularen Neuronen des Hippokampus nachgewiesen. Strich : 10 um.

Figur 7 zeigt das Ergebnis von in situ-Hybridisierungsversuchen zur zellularen Lokalisie- rung von SDF-1y-mRNA im Neocortex von Ratten unter Verwendung der gleichen Son- den wie in Figur 6. Bei Schnitten aus den frontolateralen (A) und mediolateralen (B) Berei- chen des Neocortex sind die Neuronen in sämtlichen Neocortex-Schichten (I-VI) sowohl mit der allen SDF-1-mRNA-Isoformen gemeinsamen Antisense-Sonde (A) als auch der SDF-ly-spezifischen Sonde (B) stark markiert.

Figur 8 zeigt das Ergebnis von in situ-Hybridisierungsversuchen zur zellulären Lokalisie- rung von SDF-ly-mRNA im Ischiasnerv von erwachsenen Ratten. Die Schnitte wurden mit Digoxigenin-UTP-markierten RNA-Sonden in Sense-und Antisense-Orientierung hybridi- siert, die (a) von dem SDF-1ß und SDF-1y gemeinsamen 3'-UTR-Bereich (A-C, E, F), (b) von den allen SDF-1-Isoformen gemeinsamen 5'-UTR-und kodierenden Bereichen (G) und von dem SDF-1y-spezifischen Insert (H, I) abgeleitet wurden. (A, B, C) Der Längs- schnitt zeigt mehrere spindelförmige Schwann-Zellen in der Nähe der Axone. (D) Mit einem Antikörper gegen das S100-Protein (einen Marker für Schwann-Zellen) immun- gefärbter Querschnitt. (E) Die Hybridisierungssignale bei einem dem Querschnitt in (D) benachbarten Querschnitt zeigen halbkreisförmige, die Axone umgebende markierte Schwann-Zellen, die an den gleichen Stellen wie die S100-immunpositiven Zellen auftre- ten (Pfeilspitzen in D, E). (G, H) Mit je einem der beiden Antisense-Transkripten markierte benachbarte Querschnitte, die zahlreiche halbkreisförmige Schwann-Zellen (siehe Pfeil- spitzen) und die Wand eines BlutgefäRes in der oberen rechte Ecke zeigen. (C, F, I) Als negative Kontrolle diente die Hybridisierung mit Transkripten in Sense-Orientierung. Stri- che in A, C, G-I : 100 pm, in D-F : 10 um.

Figur 9 zeigt den kodierenden Bereich der Nukleinsäuresequenz von SDF-1y aus Ratte und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz.

Figur 10 zeigt den kodierenden Bereich der Nukleinsäuresequenz von humanem SDF-1y und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz.

Figur 11 zeigt einen Vergleich der kodierenden Bereiche der Nukleinsäuresequenz von humanem und Ratten-SDF-ly."hum" : Humansequenz ;"rat" : Ratte.

Figur 12 zeigt einen Vergleich der von den Nukleinsäuresequenzen in Figur 11 abgelei- teten Aminosäuresequenzen von humanem und Ratten-SDF-ly."hum" : Humansequenz ; "rat" : Ratte.

Figur 13 zeigt schematisch die in dem Plasmid PCRII-TOPO (Invitrogen, Groningen, NL) eingebauten hSDF-1y-und hSDF-1y-H6-Konstrukte sowie die Konstrukte M-mhSDF-1y- H6, hSDF-1y-H6 und MFa-mhSDF-1y-H6 in dem Plasmid pFPMT121.

Figur 14 zeigt die Restriktionskarte des 439 bps langen DNA-Fragments mit dem kodie- renden Bereich des hSDF-ly-Gens.

Figur 15 zeigt die Restriktionskarte des 457 bps langen DNA-Fragments mit dem kodie- renden Bereich des hSDF-ly-Gens und dem His-Tag.

Figur 16 zeigt die Restriktionskarte des Expressionsplasmids pFPMT-M-mhSDF-1r-H6.

Figur 17 zeigt die Restriktionskarte des Expressionsplasmids pFPMT-hSDF-1y-H6.

Figur 18 zeigt schematisch die Strategie zur Generierung des Expressionsplasmids pFPMT-MFa-mhSDF-1y-H6. Die mit"P"gekennzeichneten Pfeile stellen PCR-Primer dar.

Figur 19 zeigt die Restriktionskarte des Expressionsplasmids pFPMT-MFa-mhSDF-1y-H6.

Figur 20 zeigt das Ergebnis eines Western-Blot-Versuchs zum Nachweis der Expres- sionsprodukte in Zellextrakten von H. polymorpha (A) mit dem SDF-1-spezifischen Anti- körper SDF-1 (C19) (Santa Cruz Biotechnology, USA) und (B) mit einem His-Tag-spezifi- schen Antikörper (RGS-His Antibody, Mouse IgG1, Qiagen, Hilden, BRD). Die Spuren in (A) enthalten : (1) Sea Blue Prestained Standard, (2) M-mhSDF-1y-H6, (3) M-mhSDF-1y- H6 behandelt mit PNGaseF, (4) hSDF-1y-H6, (5) hSDF-1y-H6 behandelt mit PNGaseF, (6) MFa-mhSDF-1y-H6, (7) MFa-mhSDF-1y-H6 behandelt mit PNGaseF und (8) Zellextrakt ohne SDF-1r. Die Spuren in (B) enthalten : (1) Zellextrakt ohne SDF-1y, (2) Sea Blue Prestained Standard, (3) M-mhSDF-1y-H6, (4) M-mhSDF-1y-H6 behandelt mit PNGaseF, (5) hSDF-1y-H6, (6) hSDF-1r-H6 behandelt mit PNGaseF, (7) MFa-mhSDF-1y-H6 und (8) MFa-mhSDF-1y-H6 behandelt mit PNGaseF.

Figur 21 zeigt einen Vergleich der Wirkung von SDF-1a und SDF-1r auf die Ca-Konzen- tration in Astrozyten. (A) 50 nM SDF-1a ; (B) 35 pLg Hefezellextrakt mit rekombinantem SDF-1y (M-mhSDF-1y-H6) ; (C) 22,4 wg Kontroll-Extrakt ; (D) quantitative Auswertung des intrazellulären Calciumanstiegs bei SDF- und dem Kontroll-Extrakt bezogen auf den von SDF-1a hervorgerufenen Calciumanstieg.

Figur 22 zeigt das Ergebnis eines Ca-Imaging-Experiments in Astrozyten für SDF-1a ohne (A) und mit (B) Vorinkubation mit Antikörper gegen CXCR4.

Figur 23 zeigt das Ergebnis eines Ca-imaging-Experiments in Astrozyten für SDF-1y ohne (A) und mit (B) Vorinkubation mit Antikörper gegen CXCR4.

Figur 24 zeigt das Ergebnis eines Ca-imaging-Experiments in Cortexneuronen für SDF-1y ohne (A) und mit (B) Vorinkubation mit Antikörper gegen CXCR4.

Figur 25 zeigt das Ergebnis eines Ca-Imaging-Experiments in Astrozyten für das C-terminale basische Peptid von SDF-1y (30 Aminosäuren) ohne (A) und mit (B) Vorinku- bation mit Antikörper gegen CXCR4.

Figur 26 zeigt das Ergebnis eines Ca-Imaging-Experiments in Astrozyten für : (A) das Peptid 2 (KKEKIG ; SEQ ID NO : 6) und (B) das Peptid 3 (KKKRQ ; SEQ ID NO : 8).

Beispiele Beispiel 1 Klonierung und Sequenzanalvse von SDF-1v A. Materialien und Methoden Tierversuche Erwachsene Wistar-Ratten (Körpergewicht 200-250 g) wurden durch intraperitoneale Verabreichung von Chloralhydrat (350ml/kg Körpergewicht) betäubt. Der Ischiasnerv wurde im oberen Oberschenkelbereich mit Pinzette kurzzeitig gequetscht (Müller et al., 1986). Vor der Gewinnung von RNA aus den Nervenbahnen wurde das Gewebe 2-3 mm um die Wunde herum entfernt und entsorgt. Alle Tierversuche wurden gemäß den Richtli- nien des deutschen Tierschutzgesetzes durchgeführt.

RNA-Isolieruna Gesamt-RNA aus Rattengewebe wurde durch das Phenol-Guanidiniumthiocyanat-Verfah- ren (Chomczynski und Sacchi, 1987) isoliert. Die gefrorenen Gewebeproben wurden zweimal 45 Sekunden lang bei 2500 Upm mit einem Poltron (Brinkmann, Westbury, NY) homogenisiert. Poly (A) +-RNA wurde durch Oligo (dT)-Cellulose-Chromatographie isoliert (Sambrook et al., 1998).

Herstellung einer cDNA-Genbank Zur Herstellung einer cDNA-Genbank wurden 4,5 Ug aus Ischiasnerv von erwachsenen Ratten isolierte Poly (A) +-RNA. als Matrize und Oligo (dT) 12 18 als Primer verwendet. cDNA wurde mit dem TimeSaver-cDNA-Synthese-Kit (Pharmacia-LKB, Piscataway, NJ) gene- riert. Die cDNA wurde unter Verwendung des Gigapack II-Verpackungsextraktes (Strata- gene) mit EcoRI vorgeschnittenen B-ZAP ll-Phagenpartikeln durch Ligation verknüpft. Die Titration der erhaltenen cDNA-Genbank ergab eine Komplexität von etwa 0,5 x 106. Das Screening der cDNA-Genbank wurde durch Standardverfahren (Sambrook et al., 1989) mit einem radioaktiv markiertem cDNA-Fragment aus dem nicht translatierten 3'-Bereich von rSDF-1, 8 (Nukleotide 743-1368) durchgeführt.

Oligonukleotide Folgende Oligonukleotide wurden mit einem GeneAssembler Plus-Synthesator (Phar- macia, Piscataway, NJ) synthetisiert.

MMSE2 : 5'-ACGCCATGGACGCCAAGGTCG-3' (SEQ ID NO : 19) entspricht den Nu- kleotiden 49-69 der rSDF-1, 8-cDNA.

GAS2 : 5'-ACTGTAAGGAAGACCCTCTCTCACC-3' (SEQ ID NO : 20) entspricht den Nukleotiden 2327-2303 von SDF-1y.

GAS3 : 5'-GTTGAGACTATGCATCGACTCCAAC-3' (SEQ ID NO : 21) entspricht den Nukleotiden 2576-2552 von SDF-1y.

DNA-Sequenzieruna und-analvse Beide cDNA-Stränge von SDF-1ß und von dem 2,5 Kb langen Insert in SDF-1y ein- schließlich der flankierenden Bereiche wurden mit der Didesoxy-DNA-Sequenzierungs- methode (Sanger et. al., 1977) mit Hilfe des T7-Sequenzierungskits (Pharmacia-LKB) sequenziert. Die Sequenzen wurden durch Sequenzierung mehrerer unabhängiger Klone aus RT-PCR-Reaktionen bestätigt. Die Daten wurden mit Hilfe der Programme FASTA (Pearson, 1990) und BLAST (Altschul et al., 1990) mit der EMBL-Datenbank verglichen.

Eine weitergehende Analyse der Sequenzen wurde mit Hilfe des PCGENE-Software-Pa- kets (Intelligenetics, Mountain View, CA) durchgeführt.

RT-PCR Die Umkehrtranskription wurde mit 1-5 ug Gesamt-RNA und Reverse-Transkriptase Su- perscript (Gibco, Gaithersburg) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.

Der erste cDNA-Strang wurde mit RNase H (Boehringer Mannheim) verdaut und an- schließend wurde 1/10 des Volumens als Matrize für die PCR-Amplifizierung mit Amplitaq- Polymerase (Perkin Elmer) oder Pfu-Polymerase (Stratagene, La Jolla) (für SDF-1y) ver- wendet.

B. Klonierung und Sequenzierung von SDF-1v Bei der Identifizierung von Genen, die nach einer Nervenlasion differentiell exprimiert werden, wurde aus einer cDNA-Genbank, die aus Ischiasnerv von Ratten erzeugt wurde, der cDNA-Klon NT-1-15 mit 2174 Nukleotiden isoliert. Die Analyse der Sequenz NT-1-15- Klons zeigte, dass dieser Klon eine 86% ige Homologie zu dem nicht translatierten 3'-Bereich (UTR) der SDF-1p-cDNA von Maus (vgl. Tashiro et al., 1993) aufweist. Bei Northern Blot-Versuchen unter stringenten Waschbedingungen hybridisierte NT-1-15 mit zwei Transkripten aus dem Ischiasnerv von erwachsenen Ratten (Figur 2). Während das kleinere Transkript mit etwa 3 Kb der Größe der SDF-1p-mRNA entsprach, war das län- gere Transkript mit 5,5 Kb unbekannt. Dieses Transkript wurde SDF- genannt.

Die Isolierung von vollständigen Klonen für beide Transkripte wurde sowohl durch Scree- nen einer cDNA-Genbank als auch durch Umkehrtranskription-PCR (RT-PCR) angegan- gen. Durch Screenen einer cDNA-Genbank aus Ischiasnerv von Ratten mit einem 626 Nukleotide langen cDNA-Fragment des NT-1-15-Klons, das den Nukleotiden 734-1368 des 3'-UTR-Bereiches von SDF-1, 8 der Ratte entspricht, erhielt man einen vollstandigen cDNA-Klon mit einer Länge von 2819 Nukleotiden, der den vollständigen kodierenden Bereich von SDF-1ß enthalt.

Durch erneutes Screenen der cDNA-Genbank mit dem 626 Nukleotide langen cDNA- Fragment von NT-1-15 erhielt man einen unvollständigen SDF-ly-Klon von etwa 3400 Nukleotiden (SDF-I-G6), der nicht nur den vollständigen 3'-UTR-Bereich und die letzten 4 Codons (90-93) von SDF-1ß, sondern auch eine neue (nicht-kodierende) Sequenz mit einer Länge von etwa 1 Kb stromaufwärts des Codons 90 enthielt. Es wurde dann ange- nommen, dass das im Northern Blot identifizierte Transkript mit einer Länge von 5,5 Kb eine alternativ gespleißte Isoform darstellt, die durch ein 2,5 Kb langes Insert zwischen den Codons 89 und 90 von SDF-1ß erzeugt wird. Zur Bestätigung dieser Hypothese wurde durch RT-PCR mit Antisense-Primern, die für die neue Sequenz am 5'-Ende des SDF-G6-Klons spezifisch sind (Primer GAS2 und GAS3), und einem Sense-Primer, der der Translationsinitationsstelle von SDF-1ß entspricht (Primer MNSE2), ein neues Frag- ment erzeugt. Die Sequenzierung des amplifizierten PCR-Fragments zeigte ein Tran- skript, das ab Codon 89 stromabwärts eine andere Sequenz als SDF-1D aufwies. Dieses Transkript kodierte für ein Peptid von 119 Aminosäuren, von denen die ersten 89 Ami- nosäuren mit den ersten 89 Aminosäuren von SDF-1a und-ß identisch waren. Anschlie- ßende Northern Blot-Analysen bestätigten, dass die erhaltene Sequenz das 5,5 Kb lange Transkript darstellte. cDNA-Sonden aus dem SDF-1ß und-y gemeinsamen 3'-UTR-Be- reich (Fig. 2A) oder aus dem allen SDF-Isoformen gemeinsamen 5'-Bereich der kodieren- den Region (Fig. 2B) hybridisierten sowohl mit dem 3 Kb langem (SDF-1, B) als auch mit dem 5,5 Kb langem (SDF-1y) Transkript, während eine cDNA-Sonde, die für das 2,5 Kb lange Insert spezifisch war, nur mit dem 5,5 Kb SDF-ly-Transkript hybridisierte (Fig. 2C).

Im Ischiasnerv von Ratten konnte keine SDF-1a-mRNA mit einer Länge von 1,5 Kb nach- gewiesen werden.

Beide Stränge der SDF-1ß-cDNA von Ratte wurden sequenziert. Bei SDF-1y wurde das neue Insert mit einer Länge von 2572 Nukleotiden und die flankierenden Bereiche mit den bekannten sDF-1ß-sequenzen ebenfalls doppelt sequenziert. Die abgeleitete Aminosäu- resequenz für SDF-1ß ergibt ein Peptid von 93 Aminosäuren mit einem theoretischem Molekulargewicht von 10,5 Kd. Die ersten 19 Aminosäuren stellen ein Signalpeptid für sezernierte Proteine dar. Die abgeleitete Aminosäuresequenz für SDF-10 beinhaltet die ersten 89 Aminosäurereste von SDF-1ß und 30 zusätzliche Aminosäuren im Carboxy- terminalen Bereich, die keine Homologie zu SDF-1ß zeigen (vgl. Fig. 3). Das theoretische Molekulargewicht des 119 Aminosäuren langen SDF-1y Peptids ist 13,5 Kd. Die Ami- nosäuresequenz des SDF- von Ratte zeigt eine starke Homologie (96,8%) zu dem ent- sprechendem Maus-Protein (98,9% unter Berücksichtigung konservativer Aminosäu- reausstausche). Ein Vergleich der Aminosäuresequenzen der neuen SDF-1-Isoformen SDF-1-y und SDF-1, 8 mit den bekannten SDF-1-Sequenzen wird in Figur 4 gezeigt.

Beispiel 2 Nachweis von SDF-1ß-und SDF-lv-mRNA in verschiedenen Geweben und Entwicklunqsstadien A. Northern Blot-Analvse Je 10 pg Gesamt-RNA wurden in 1,2% igen Agarosegelen, die 15% Formaldehyd ent- hielten, fraktioniert und dann durch Standardverfahren auf Nytran NY 13 N-Membranen (Schleicher und Schüll, Keene, NH) übertragen. Die Filter wurden mit UV-Licht bestrahlt und mit Methylenblau gefärbt (Sambrook et at., 1989), in einer 0,5 M Natriumphosphat- Lösung (pH 7,0) mit 7% SDS vorhybridisiert und mit 1-5 x 106 cpm/mi einer 32P-markierten cDNA-Sonde in derselben Lösung hybridisiert. cDNA-Fragmente entsprechend (i) dem gemeinsamen 3'-UTR-Bereich von SDF-1 /y (Nukleotide 743-1368 in SDF-1ß), (ii) dem allen SDF-1-Isoformen gemeinsamen kodierenden Bereich (Nukleotide 49-239) und (iii) einem 1702 Nukleotide langen Abschnitt des SDF-ly-spezifischen Inserts (Nukleotide 625-2327 in der SDF-ly-cDNA) wurden durch einseitig gerichtete PCR (Stürzl et al., 1991) radioaktiv markiert. Nach dem Hybridisieren wurden die Filter mindestens 15 Minuten lang bei 60°C in 2 x SSC/1 % SDS und 15 Minuten lang bei 60°C in 0,1 x SSC/1 % SDS gewaschen. Die Filter wurden entweder zusammen mit einem Rönt- genfilm (X-OmatAR, Kodak) exponiert oder mit einem BAS-1050-Bioimager (Fuji) direkt quantifiziert.

B. Nachweis von SDF-1 ß-und SDF-1v-mRNA in verschiedenen Geweben Die in Figur 5 A gezeigten Northern Blot-Hybridisierungsversuche wurden mit Gesamt- RNA aus verschiedenen Geweben von erwachsenen Ratten und einem 602 Nukleotide langen Fragment aus dem gemeinsamen 3'-UTR-Bereich von SDF-1ß/, das mit 32p_ dCTP radioaktiv markiert worden war, durchgeführt. Die Verteilung der SDF-1ß-und SDF-1y-mRNA über verschiedene Gewebe von erwachsenen Ratten zeigte ein komple- mentäres Muster. Während die ß-lsoform vor allem in der Leber, der Niere, der Milz und dem Thymus nachgewiesen wurde, trat SDF-1y vorwiegend im Herz-und Lungengewebe sowie im reifen Gewebe des Nervensystems auf (Fig. 5). Die Tatsache, dass das SDF-1, ß- Transkript vor allem im embryonalen und neonatalen Hirngewebe und im Ischiasnerv be- vorzugt auftritt, deutet auf eine differentielle Regulation der SDF-1-Expression während der Entwicklung des Nervensystems hin. In Muskel-und Hodengewebe konnten weder SDF-1, 8-noch SDF-1Y-mRNA nachgewiesen werden (Fig. 5A).

C. Nachweis von SDF-1 ß-und SDF-1v-mRNA im Gehirn und im Ischiasnerv im Laufe der Entwicklung Gehirn : Zur Untersuchung der entwicklungsspezifischen Verteilung von SDF-1ß und SDF-1y wurde RNA aus Hirngewebe zu verschiedenen Stadien der Entwicklung in Ratten (von 17 Tage alten Embryonen (E17) bis zu erwachsenen Ratten) mit einem 602 Nukleotide langen Fragment des gemeinsamen 3'-UTR-Bereichs von SDF-1p/y geprobt. Im Hirn- gewebe von E17-Embryonen wurde vorwiegend SDF-1ß-mRNA nachgewiesen, die Transkriptmenge sank jedoch mit zunehmendem Alter und das Transkript konnte im Hirn- gewebe von erwachsenen Ratten nicht mehr nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu war die Menge an SDF-1y-Transkript bei E17-Embryonen sehr niedrig, sie nahm jedoch stetig zu und erreichte ein Maximum bei erwachsenen Ratten (Fig. 5B).

Ischiasnerv : Aus Ischiasnerv von Ratten in verschiedenen Entwicklungsstadien (von einem Tag nach der Geburt (P1) bis zum Erreichen des Erwachsenenalters) wurde Gesamt-RNA isoliert.

Im P1-Stadium wurde SDF-1, 8-mRNA in kleinen Mengen nachgewiesen ; die Transkript- menge stieg im P4-P7-Stadium und sank im Nervengewebe von erwachsenen Ratten unter der Nachweisgrenze (Fig. 5C). SDF-1Y-mRNA wurde erstmals im P4-Stadium beo- bachtet ; die Transkriptmenge erreichte im P-14-Stadium ein Maximum und sank dann im Gewebe von erwachsenen Ratten auf ein mittleres Niveau (Fig. 5C).

SDF-1, 8-und SDF-1Y-mRNAs scheinen also während der Entwicklung und im Nerven- system der erwachsenen Ratte ein unterschiedliches Expressionsmuster zu zeigen. Wäh- rend die SDF-1, 8-lsoform überwiegend im embryonalen oder perinatalem ZNS und PNS auftritt, ist SDF-1y die wichtigste Variante im Nervensystem von erwachsenen Ratten (Fig. 5B, C). In dem Zeitraum zwischen dem 4. und dem 7. Tag nach der Geburt, in dem die Differenzierung der Gliazellen und die Neuronenreifung einsetzt, treten die SDF-1, 8- und SDF-ly-Transkripte in nahezu gleichen Mengen auf.

D. Nachweis von SDF-1ß-und SDF-lv-mRNA nach einer Läsion des Ischiasnervs Nach Verletzung des Ischiasnerv durch Quetschung wurden am distalen Ende des Nervs kleine Änderungen des SDF-1ß-und SDF-ly-mRNA-Musters beobachtet. Mittels"multiple quantitative bioimaging"von radioaktiven Northern Blot-Filtern wurde nach der Läsion eine vorübergehende Erhöhung der SDF-1ß-mRNA-Menge festgestellt, die zwei Tage nach der Nervenquetschung ein Maximum bei 175% erreichte ; danach sanken die Werte, bis sie am 7. Tag nach der Verletzung das gleiche Niveau wie die Kontrolle erreichten. Für die SDF-1y-mRNA wurden nach der Nervenläsion keine signifikanten Änderungen fest- gestellt.

Beispiel 3 Zelluläre Lokalisierung des SDF-1X-TranskriPts durch in situ-Hvbridisieruna A. In situ-Hvbridisierung Die Gewebeproben wurden in Tissue Tec II (Miles, Napperville, IL) eingebettet, in Methyl- butan bei-70°C eingefroren und in 20 Um starke Schnitte geschnitten. Die Schnitte wur- den fixiert und anschließend acetyliert und 4 Stunden lang bei 55°C gemäß Angerer et al.

(1987) vorhybridisiert. In vitro-Transkripte (i) eines Subklons des gemeinsamen 3'-UTR- Bereiches von SDF-1, 8/ (Nukleotide 1758-2199 in SDF-1 P), (ii) eines Subklons, der allen SDF-1-mRNA-Isoformen gemeinsamen 5'-UTR-und kodierenden Bereiche (Nukleotide 1-596 in der SDF-1, 8-cDNA) und (iii) eines Subklons des SDF-1y-spezifischen Inserts (Nukleotide 661-1313 in der SDF-ly-cDNA) wurden mit Hilfe des DIG-RNA-Markierungs- kits von Boehringer Mannheim unter Verwendung von Digoxigenin-UTP erzeugt. Nach der Hybridisierung bei 55°C über Nacht wurde eine RNase A-Behandlung (20 lug/ml in 0,6 M NaCI, 20 mM Tris-HCI, 2 mM EDTA, pH 8) 20 Minuten lang bei 37°C durchgeführt.

Die Schnitte wurden dann dreimal je 20 Minuten lang bei 50°C mit 2 x SSC und dreimal je 20 Minuten lang bei 50°C mit 0,2 x SSC gewaschen. Der Digoxigenin-Nachweis wurde nach den Anweisungen des Herstellers (Boehringer Mannheim) durchgeführt.

B. Zelluläre Lokalisierung des SDF-1v-TranskriPts Für die in situ-Hybridisierung wurden Antisense-Transkripte aus (a) dem gemeinsamen 3'-UTR-Bereich von SDF-1 p/y, (b) dem allen SDF 1-isoformen gemeinsamen 5'-UTR-und kodierenden Bereich und (c) dem SDF-1Y-spezifischen Insert mit Digoxigenin-UTP mar- kiert. Die Sense-Transkripte dienten als negative Kontrollen.

In ZNS von erwachsenen Ratten wurden sowohl mit der allen SDF-1-Isoformen gemein- samen als auch mit der SDF-1r-spezifischen Sonde starke und ausgedehnte Hybridisie- rungssignale in Bereichen mit grauer Hirnsubstanz sowie in"Perlenketten"-ähnlichen An- reihungen von Oligodendrozyten in myelinisierten Nervenfasern wie etwa dem Corpus callosum beobachtet (Fig. 6A, B). Weitere Hybridisierungssignale traten vor allem in Ver- bindung mit Purkinje-und granulären Neuronen im Kleinhirn (Fig. 6D, E), in pyramidalen und granulären Neuronen im Hippocampus (Fig. 6G, H) sowie in Neuronen sämtlicher Hauptschichten des Neocortex (Fig. 7A, B), auf. Mit den entsprechenden Sense-Tran- skripten erhielt man keine Hybridisierungssignale (siehe Fig. 6C, F, 1 für die Sense-Sonden für SDF-1y).

Die mit dem SDF-ly-spezifischen Antisense-Transkript erhaltenen Signale waren nahezu identisch mit dem Hybridisierungsmuster, das mit der gemeinsamen SDF-1-Antisense- Sonde erhalten wurde, was darauf hindeutet, dass die SDF-ly-Isoform in Neuronen und Oligodendrozyten des Gehirns von erwachsenen Ratten exprimiert wird. SDF-1ß-Tran- skripte, soweit sie im Gehirn von erwachsenen Ratten auftreten, scheinen in den gleichen Bereichen und Zellpopulationen wie SDF-1y vorhanden zu sein.

In Längsschnitten des Ischiasnervs von erwachsenen Ratten erzeugt eine Antisense- Sonde aus dem gemeinsamen 3'-UTR-Bereich von SDF-1, 8/r spindelförmige Hybridisie- rungssignale, die der typischen Form von Schwann-Zellen in der Nähe der Axonfasern ähnelten (Fig. 8A, B). Die identische Lokalisierung der S-100-lmmunreaktivität sowie der Hybridisierungssignale in Querschnitten des Ischiasnervs (siehe Pfeilspitzen) bestätigten die Expression von SDF-1, 8/r-mRNA in Schwann-Zellen (Fig. 8 D, E). Bei Verwendung einer SDF-ly-spezifischen Antisense-Sonde erhält man im Ischiasnerv von erwachsenen Ratten ein Markierungsmuster (Fig. 8H), das dem Hybridisierungsmuster des mit dem allen SDF-isoformen gemeinsamen Antisense-Transkripts (Fig. 8G) stark ähnelte.

SDF-ly-mRNA (und vermutlich auch die SDF-1p-lsoform) treten sowohl in Schwann- Zellen (siehe Pfeilspitzen) als auch in vaskulären Zellen (obere rechte Ecke in Fig. 8G, H) des Ischiasnervs auf. Die Ergebnisse der in situ-Hybridisierungsversuche stimmen mit den Ergebnissen der Northern Blot-Versuche der Figuren2 und 5 überein. SDF-1-a- mRNA wurde mit Antisense-/Sense-Transkripten aus dem SDF-1-a-spezifischen 3'-UTR- Bereich weder im Gehirn noch im Ischiasnerv von erwachsenen Ratten nachgewiesen.

Beispiel 4 Expression von SDF-1v-Produkten in Hansenula polvmorpha A. hSDF-1v-Konstrukte Zur Expression von SDF 1y in Hansenula polymorpha wurden drei verschiedene Kon- strukte erzeugt, die zwecks besserer analytischer Zugänglichkeit mit einem His-Tag aus- gestattet wurden. Die Konstrukte werden in Figur 13 gezeigt.

1. M-mhSDF-1y-H6 (Methionin/matures humanes SDF ly/His-Tag). Bei diesem Fusions- protein befindet sich die Sequenz des reifen humanen SDF-9 (Aminosäuren 20-119 in SEQ ID NO : 12) hinter einem N-terminalen Methionin-Rest. Da keine Leader-Sequenz vorhanden ist, wurde eine cytosolische Lokalisierung erwartet. Am C-Terminus befinden sich sechs Histidin-Reste (His-Tag).

2. hSDF-1r-H6 (unreifes humanes SDF-1y/His-Tag). Dieses Konstrukt umfaßt Aminosäu- ren 1-119 von SDF-1y (SEQ ID NO : 12), gefolgt von einem C-terminalen His-Tag. Es enthält somit die natürliche, in menschlichen Zellen erkannte Leader-Sequenz. Da mitun- ter Leader-Sequenzen auch in heterologen Wirtszellen erkannt werden, sollte mit diesem Konstrukt untersucht werden, ob H. polymorpha das authentische SDF-ly-Leader-Peptid erkennt.

3. MFa-mhSDF-1y-H6 (Prepro-Sequenz des Mating-Faktor a aus Saccharomyces cerevi- siae/matures humanes SDF-1y/His-Tag). Hier befindet sich die Sequenz des reifen SDF-1y (Aminosäuren 20-119 in SEQ ID NO : 12) hinter der in H. polymorpha häufig ge- nutzten Prepro-Sequenz des Mating-Faktor a aus der verwandten Bierhefe Saccharomy- ces cerevisae. Dieses Konstrukt sollte von H. polymorpha sezerniert werden.

B. Konstruktion von Expressionsplasmiden Als Ausgangskonstrukt diente das Plasmid SDF-ly-PCRII-TOPO, das das 439 bps lange SDF-1y-Insert enthielt (Fig. 14). In einem ersten Schritt wurden der hSDF-ly-Sequenz durch PCR-Mutagenese sechs Kodons für einen C-terminalen His-Tag hinzugefügt (hSDF-1y-H6, Fig. 15).

Als Basisvektor für die spätere Expression von SDF-ly-Konstrukten in H. polymorpha wurde das integrative Plasmid pFPMT121 (Gellissen, 2000) eingesetzt, in dem das zu exprimierende fremde Gen unter der Kontrolle des FMD-Promotors steht. Auf der Grund- lage dieses Plasmids wurden folgende Expressionsvektoren konstruiert : 1. pFPMT-M-mhSDF-1y-H6. Von dem M-mhSDF-1y-H6-ORF wurde mittels PCR ein DNA- Fragment generiert, bei dem die kodierende Sequenz von SDF-1y von einer EcoRl- (vor dem Startkodon) und einer BamHI-Restriktionsschnittstelle flankiert ist. Als Template-DNA diente hSDF-1y-H6 in PCRII-TOPO (Invitrogen, Groningen, NL). Das PCR-Produkt wurde mit EcoRI/BamHI verdaut und zwischen die entsprechenden Stellen des pFPMT121- Plasmids kloniert. Die Karte des resultierenden Plasmids pFPMT-M-mhSDF-1y-H6 wird in Fig. 16 gezeigt.

2. pFPMT-hSDF-1y-H6. Auch bei diesem Konstrukt wurde zunächst ein von einer EcoRl- und einer BamHI-Schnittstelle flankiertes PCR-Produkt erzeugt, wobei wiederum hSDF-1r-H6 in PCRII-TOPO als Template-DNA diente. Das mit EcoRl und BamHl ver- daute PCR-Produkt wurde zwischen die entsprechenden Stellen des pFPMT121-Plas- mids kloniert. Die Karte des resultierenden Plasmids pFPMT-hSDF-1y-H6 wird in Fig. 17 gezeigt.

3. pFPMT-MFa-mhSDF-1r-H6. Zur Generierung dieses Plasmids wurden zwei separate PCR-Produkte erzeugt (siehe Fig. 18). Das erste PCR-Produkt (PCR IA) umfaßte die Kodons der Prepro-Sequenz des Mating-Faktors a, flankiert von einer EcoRI-Schnittstelle (vor dem Startkodon) sowie am anderen Ende von Basen mit Homologie zu den ersten Kodons der reifen hSDF-1y-Sequenz. Das zweite PCR-Produkt (PCR IB) enthielt die Se- quenz des reifen hSDF-1y, am vorderen Teil flankiert von Basen mit Homologie zum hin- teren Teil der Prepro-Sequenz des Mating-Faktors a, am hinteren Teil flankiert von einer BamHI-Schnittstelle (hinter dem Stopkodon). Dann wurde eine weitere PCR-Reaktion (PCR II) durchgeführt, bei der die Produkte der beiden oben beschriebenen PCR IA und IB gemischt wurden. Als Primer wurden der Hin-Primer aus PCR IA (der mit der EcoRl- Schnittstelle) und der Rück-Primer aus PCR IB (der mit der BamHl-Schnittstelle) einge- setzt. Das entstandene PCR-Produkt umfaßte die Prepro-Sequenz des Mating-Faktors a fusioniert mit der Sequenz des mhSDF-1y-H6, flankiert von EcoRl- (vor dem Startkodon) und BamHI-Schnittstellen (hinter dem Stopkodon). Nach Verdauung mit EcoRl/BamHl wurde das Fragment zwischen die entsprechenden Schnittstellen des pFPMT121-Plas- mids kloniert. Die Karte des resultierenden Plasmids pFPMT-MFa-mhSDF-1y-H6 wird in Fig. 19 gezeigt.

C. Transformation von H. Polvmorsha mit den erzeugten Expressionsvektoren, Stammgenerierung und-identifizierung Zur Herstellung kompetenter H. polymorpha-Zellen für die Elektroporation wurden 5 ml YPD-Medium wurden mit einer Einzelkolonie von H. polymorpha RB11 (odc, Orotidin- 5-phosphat-decarboxylase-defizienter (Uracil-auxotropher) H. polymorpha-Stamm (Weydemann et al., 1995)) beimpft und 16 Std lang bei 37°C geschüttelt. Anschließend wurden 100 ml YPD-Medium in einem 2 I-Erlen-Meyer-Kolben mit 3 ml dieser Vorkultur beimpft und bis zu einer OD600 von 0,8-1 bei 37°C inkubiert (Schüttelfrequenz 140 rpm).

Die Zellernte erfolgte durch Zentrifugation der Kultur in 50 ml-Falcon-Röhrchen (4000 rpm ; 6') in einer Beckmann-Zentrifuge. Nach Entfernung der Überstände wurden die Zellen in 20 mi 50 mM Kaliumphosphat-Puffer (pH 7,5 ; vorgewärmt auf 37°C) resus- pendiert, mit 0,5 ml 1 M DTT versetzt und 15'lang bei 37°C inkubiert (Wasserbad). An- schließend wurden die Zellen erneut abzentrifugiert (3000 rpm ; 10', Beckmannzentrifuge) und mit 100 ml, anschließend mit 50 ml STM-Puffer (270 mM Saccharose ; 10 mM Tris-HCI pH 7,5 ; 1 mM MgCI2) gewaschen. Nach erneutem Abzentrifugieren wurden die Zellen in 0,5 ml STM-Puffer resuspendiert und als 60 ul-Aliquots entweder direkt für Transformationen eingesetzt oder für spätere Verwendung bei-70°C eingefroren.

Kompetente Zellen von H. polymorpha RB11 wurden mit den drei erzeugten Expres- sionsplasmiden (siehe oben) wie folgt transformiert : 60 pi kompetente H. polymorpha- Zellen wurden mit 1-2 ug der einzuführenden zirkuläre Plasmid-DNA versetzt und in Elektroporationsküvetten mit 2 mm Spaltbreite überführt. Die Elektroporation erfolgte bei 2 kV, 25 F und 200 Ohm. Anschließend wurden die Zellen in Reagenzgläser mit 1 mi YPD-Medium überführt und 1 Std. lang bei 37°C geschüttelt (Winkel 45° ; 160 rpm). Nach dieser Erholung wurden je 330 ut der Zellen auf YNB-Agar-Platten (1 % Glukose ; ohne Uracil) ausplattiert. Die Platten wurden bei 37°C inkubiert, bis makroskopische Uracil- prototrophe Kolonien sichtbar wurden (ca. 1 Woche).

Anschließend wurden jeweils 36 Uracil-prototrophe Kolonien durch viermaliges Passagie- ren und zweimaliges Stabilisieren in stabile Stämme überführt. Zur Passagierung wurden je 2 ml YNB-Medium (1% Glukose) mit einzelnen Uracil-prototrophen Kolonien von den Transformanten-Platten angeimft und 2 Tage lang bei 37°C inkubiert (Winkel 45° ; Schüt- telfrequenz 160 rpm). Je 150 ul der resultierenden Kulturen wurden in je 2 ml frisches YNB-Medium überführt und erneut 2 Tage lang inkubiert (s. o.). Dieser Vorgang wurde insgesamt viermal durchgeführt (= vier Passagen). Zur Stabilisierung wurden je 150 ut der Kulturen aus der letzten Passage in 2 ml YPD-Medium überführt und für 2 Tage bei 37°C inkubiert (s. o.). Anschließend wurden Aliquots dieser Kulturen auf YNB-Agar-Platten (1 % Glukose ; ohne Uracil) ausplattiert. Pro Ausstrich wurde eine einzelne Kolonie isoliert und als Stamm definiert.

D. Induktion der Expression und Nachweis von SDF-ly-Produkten Nach Vereinzelung wurden alle Stämme einer MeOH-Induktion unterzogen und die intra- zellularen löslichen Fraktionen wurden mittels Western-Blot bezüglich ihres Gehalts an hSDF-ly-Produkten analysiert. Zunächst wurden je 2 mi YPD-Medium in 10ml-Rea- genzgläsern mit Einzelkolonien der zu testenden Stämme beimpft und anschließend wurden die Kulturen zur Induktion der Fremdgenexpression 16 Std. lang bei 37°C inku- biert (Winkel 45° ; Schüttelfrequenz 160 rpm). Anschließend wurden 150 pI der resultie- renden dichtgewachsenen Kulturen zum Beimpfen von je 3 ml YNB-Medium (1 % Glycerin) eingesetzt. Nach 24 Std. Schütteln bei 37°C wurden die Zellen abzentrifu- giert und in je 3 ml YNB-Medium (1% MeOH) resuspendiert. Die Fremdgenexpression wurde dann durch erneutes Schütteln 24 Stunden lang bei 37°C induziert.

Nach Abzentrifugation der Zellen aus den Induktionskulturen wurden zur Präparation von Kulturüberständen Aliquots der Überstände mit 4 x SAB (8% w/v SDS ; 40% w/v Glycerin ; 8 mM EDTA pH 6,8 ; 250 mM Tris pH 6,8 ; 0,04% w/v Bromphenolblau ; 40% v/v a-Mercaptoethanol) versetzt und für 5'bei 95°C denaturiert.

Zur Präparation intrazellulärer löslicher Fraktionen wurden folgende Schritte auf Eis oder bei 4°C ausgeführt : Die Zellpellets aus den Induktionskulturen wurden in je 500 ul Extrak- tionspuffer (50 mM Tris pH 7,5,150 mM NaCI, 0,1 % v/v Triton X-100 oder PBS-Puffer) resuspendiert und mit je 12,5gul PMSF versetzt. Anschließend wurden die Proben in 1,5ml-Eppendorf-Gefäße überführt. Nach Zugabe von 500 ul Glasperlen erfolgte der Zellaufschluß in einem Vibrax bei 2500 rpm. Die Überstände wurden in frische Eppendorf- Gefäße überführt und 10'lang bei 10.000 rpm (Eppendorf-Zentrifuge mit Kühifunktion) zentrifugiert. Die Überstände dieser Zentrifugation stellten die sogenannte intrazelluläre lösliche Fraktion dar. Diese wurden für direkte Proteingelelektrophorese mit'/4 Vol.

4 x SAB versetzt und 5'lang bei 95°C denaturiert, oder für weitere Verwendungen ohne SAB-Zusatz bei-20°C eingefroren.

Für die PNGaseF-Verdauung wurden je 8 pI der nativen intrazellulären löslichen Fraktion mit 1 ul 1% SDS versetzt und 5'lang bei 95°C inkubiert. Anschließend erfolgte Zugabe von 1 pi PNGaseF (2 u ; Roche) oder H20. Nach Inkubation bei 37°C 16 Std. lang wurden 4 pi 4 x SAB hinzugefügt, die Proben 5'lang bei 95°C denaturiert und auf Proteingelen aufgetrennt.

Die Auftrennung der denaturierten Proben durch Proteingelelektrophorese erfolgte auf 4-20% igen Tricine-SDS-Gelen (Novex) nach Herstellerangaben. Anschließend wurden die Proteinbanden in einer Semy-Dry-Blot-Apparatur (Trans-Blot SD ; Biorad) nach Her- stellerangaben auf Nitrocellulose-Membranen übertragen. Für die Western-Blots wurde als primäre Antikörper (-seren) ein His-Tag-spezifischer monoklonaler Antikörper aus Maus (RGS-His-Antikörper, Qiagen, Hilden, BRD) oder ein SDF-1-spezifisches polyklo- nales Serum aus Ziege (SDF-1 (C19) ; #sc6193 ; Santa Cruz Biotechnology, USA) einge- setzt. Die Western-Blots wurden mit den Western Breeze-Kits Maus oder Ziege (Novex) nach Herstellerangaben durchgeführt.

Auf diese Weise konnten für jedes der drei Konstrukte Stämme identifiziert werden, die signifikante Mengen des jeweiligen hSDF-1y-H6-Derivats produzierten. Für weitere Pro- duktanalysen wurde der jeweils produktivste Stamm ausgewähit. Für pFPMT- M-mhSDF-1y-H6 war dies der Stamm g7-5/36 ; für pFPMT-hSDF-1y-H6 und pFPMT-MFa- mhSDF-1y-H6 wurden entsprechend die Stämme g8-28/7 und g9c-20/6 ausgewähit.

E. Produktanalvsen In den Kulturüberständen der Stämme g7-5/36, g8-28/7 und g9c-20/6 konnten mittels Western-Blot keine sezernierten SDF-ly-Produkte nachgewiesen werden. In der intra- zellularen löslichen Fraktion dieser Stämme konnten SDF-ly-Produkte sowohl mit einem His-Tag-spezifischen Antikörper aus Maus als auch mit einem SDF-1-spezifischen Serum aus Ziege (SDF-1 (C19) ; #sc6193 ; Santa Cruz Biotechnology, USA) identifiziert werden (siehe Fig. 20 A, B). Die intrazelluläre lösliche Fraktion eines Kontrollstamms (ohne SDF-1y) zeigt nicht die als SDF-1y-Produkte identifizierten Produkte (Fig. 20, Spur 8 (A), Spur 1 (B)).

Die im Western-Blot beobachteten Molekulargewichte der SDF-ly-Hauptprodukte liegen generell etwas oberhalb der berechneten Molekulargewichten. M-mhSDF-1y-H6 : 12,692 kDa berechnet, etwa 16 kDa beobachtet (Fig. 20, Spuren 2 und 3 (A), Spuren 3 und 4 (B)) ; hSDF-1y-H6 : 14,529 kDa berechnet, etwa 17 kDa beobachtet (Fig. 20, Spu- ren 4 und 5 (A), Spuren 5 und 6 (B)) ; MFa-mhSDF-1y-H6 : 21,468 kDa berechnet, etwa 30 kDa beobachtet (Fig. 20, Spuren 6 und 7 (A), Spuren 7 und 8 (B)). Da alle Haupt- banden sowohl mit dem His-Tag-spezifischen Antikörper als auch mit dem SDF-1-spezifi- schen Serum detektierbar sind, müssen die den Banden zugehörigen Proteine C-terminal intakt sein. Darüber hinaus zeigen die apparenten Molekulargewichte der verschiedenen Produkte die erwarteten relativen Abstufungen (M-mhSDF-1y-H6 < hSDF-1y-H6 < MFa-mhSDF-1y-H6 ; Fig. 20).

Die Aminosäure-Sequenzen von M-mhSDF-1y-H6 und hSDF-1y-H6 enthalten keine potentiellen N-Glycosylierungsstellen. Dementsprechend hat eine PNGaseF-Verdauung keinen Einfluß auf das apparente Molekulargewicht der jeweiligen Produkt-Hauptbande (Fig. 20, Spuren 2/3 und 4/5 (A), Spuren 3/4 und 5/6 (B)). MFa-mhSDF-1y-H6 hat drei N-Glycosylierungsstellen im Bereich der MFa-Prepro-Sequenz, die typischerweise im ER N-glycosyliert werden. Die fehlende Reduktion des apparenten Molekulargewichts des 30 kDa-Produkts nach PNGaseF-Verdauung deutet an, daß es sich bei diesem Produkt um die Prepro-Form handelt, die nicht in das ER eingeschleust wurde (Fig. 20, Spu- ren 6/7 (A), Spuren 7/8 (B)). Oberhalb von 30 kDa befinden sich drei schwache PNGaseF-sensitive Banden (Spur 7 (B)), die nach N-Deglycosylierung nach unterhalb von 30 kDa verschoben werden (Spur 8 (B)). Diese Banden können als an der Pro- Sequenz N-glycosylierte Pro-Formen von MFa-mhSDF-1y-H6 interpretiert werden, bei denen die Pre-Sequenz während des Eintritts in das ER abgespalten wurde.

Beispiel 5 Wirkung von rekombinantem humanen SDF-1r auf die Calcium-Konzentration in Nervenzellen und Gliazellen In diesem Beispiel wurde die Wirkung von rekombinantem humanem SDF-1y (M-mhSDF-1y-H6) in Zellextrakten von Hansenula polymorpha auf die Calcium-Konzen- tration in Nervenzellen und Gliazellen untersucht. Zur Bestimmung der Calcium-Konzen- tration wurde die Calcium-Imaging-Methode benutzt (siehe Koller et al., 2001).

Für die Ca-Imaging-Experimente wurden primäre Astrozyten und primäre Cortexneurone der Ratte (Stamm Wistar) aus neugeborenen Ratten (Postnataltag 0-1 ; Astrocyten) bzw. aus Rattenembryonen (Embryonaltag 15 ; Cortexneurone) wie von Koller et al. (2001) be- schrieben präpariert und kultiviert. Nach 5-15 Tagen in Kultur wurden die Zellen in vitro 1 Std. lang mit dem Calcium-Indikator Fura-2 beladen. Das intrazelluläre Fura-2 reagiert mit freigesetztem Calcium zu Fura-Calcium, das bei einer anderen Wellenlänge (340 nm) absorbiert als Fura-2 (380 nm). Mit Hilfe des Extinktionskoeffizienten (F340/F380) kann somit die relative intrazelluläre Calcium-Konzentration ermittelt und graphisch aufgetragen werden. Dieses Verfahren ermöglicht die Detektion intrazellularer Calcium-Konzentra- tionsänderungen, die durch extrazellulare Stimuli (z. B. Ligand/Rezeptor-Interaktionen) hervorgerufen werden.

Figur 21 zeigt das Ergebnis von Ca-Imaging-Experimenten, bei denen die Wirkung von SDF-1a und SDF-1y auf die Ca-Konzentration in Astrozyten verglichen wurde. Nach Applikation von SDF-1a (50 nM, R&D Systems, Wiesbaden, BRD) steigt die intrazelluläre Calciumkonzentration in kultivierten Astrozyten (Figur21 A). Nach Applikation von Hefe- zellextrakt mit rekombinantem SDF-1y (M-mhSDF-1y-H6) (35 pg Gesamtprotein) kommt es zu einem intrazellulären Calciumanstieg in kultivierten Astrozyten (Figur21 B). Die Antwort ist jedoch etwas geringer als die Antwort auf SDF-1 a.

Nach Applikation von Kontroll-Extrakt (22,4 Fg Protein von einem Zellextrakt von H. polymorpha RB11-Zellen, die mit dem pFPMT121-Plasmid ohne Insert transformiert wurden) bleibt der intrazelluläre Calciumanstieg in kultivierten Astrozyten aus (Figur 21 C).

Figur 21 D zeigt die quantitative Auswertung der intrazellulären Calciumanstiege bei SDF-1y und dem Kontroll-Extrakt bezogen auf den von SDF-1 a hervorgerufenen Cal- ciumanstieg.

Ferner wurde getestet, ob die Vorinkubation der Zellen mit einem CXCR4-spezifischen Antikörper (monoklonaler Antikörper 12G5 ; R&D Systems, Wiesbaden, BRD) eine solche Calcium-Antwort reduzieren kann, wie es zuvor für die von SDF-1 a induzierte Calcium- Reaktion beobachtet wurde (für die methodischen Details zu den Ca-Imaging-Experi- menten siehe Killer et al., 2001).

Figur22 zeigt das Ergebnis eines Ca-Imaging-Experiments in Astrozyten für SDF-la (A) ohne und (B) mit Antikörper gegen CXCR4, Figur 23 zeigt das Ergebnis der entspre- chenden Experimente für SDF-1r. Nach Applikation von SDF-1a (50 nM ; R&D Systems, Wiesbaden, BRD) steigt die intrazelluläre Calciumkonzentration in kultivierten Astrozyten stark an (Figur 22 A). Gibt man jedoch SDF-1 a nach 5 Min. Vorinkubation mit dem mono- klonalen Antikörper 12G5, so zeigen kultivierte Astrozyten eine um ca. 50% verminderte intrazellulare Calciumausschüttung (Figur22 B). Diese Ergebnisse bestätigen Literatur- befunde, die zeigen, dass der Einfluß von SDF-1a bzw.-1ß auf die intrazelluläre Calcium- Konzentration in Astrozyten aus dem Zentralnervensystem durch den CXCR4-Rezeptor vermittelt wird.

Nach Applikation von 35 p. Hefezellextrakt mit rekombinantem SDF-1y (M-mhSDF-1y-H6 ; Zellaufschluss in PBS-Puffer) kommt es zu einem messbaren intrazellularen Calcium- anstieg in kultivierten Astrozyten (Figur 23 A). Anders als bei SDF-la führt die SDF- 1y-Applikation bei kultivierten Astrozyten, die mit dem monoklonalen Antikörper12G5 gegen den CXCR4-Rezeptor 5 Min. lang vorinkubiert wurden, zu einer stark erhöhten signifikanten intrazellulären Calciumausschüttung (Figur 23 B).

Auch Zellkulturen von Cortexneuronen aus dem Rattenhirn zeigen nach Vorinkubation mit dem CXCR4-Antikörper eine weitere Erhöhung der Calcium-Konzentration als Reaktion auf SDF-1y. Figur 24 zeigt das Ergebnis eines entsprechenden Ca-Imaging-Experiments in Cortexneuronen. Die Applikation sowohl von 35 Fg als auch von 124 g (Gesamtpro- tein) eines Hefezellextrakts mit rekombinantem SDF-1y (M-mhSDF-1y-H6) führt zu einem signifikanten Anstieg der intrazellularen Calciumkonzentration in kultivierten primären Cortexneuronen (Figur 24 A). Nach 5-minütiger Vorinkubation mit dem monoklonalen Antikörper 12G5 (Antikörper gegen CXCR4) bewirkt die Zugabe von SDF-1y eine stark erhöhte intrazelluläre Calciumausschüttung bei kultivierten primären Cortexneuronen (Fi- gur 24 B).

Diese vorstehenden Ergebnisse belegen, dass sich die zellphysiologische Reaktion von Neuronen und Astrozyten aus dem Zentralnervensystem auf SDF-1a bzw.-1ß von den Reaktionen auf das neue SDF-ly-Chemokin deutlich unterscheidet.

Beispiel 6 Wirkung des C-terminalen basischen Peptids aus SDF-1v und der davon abaeleiteten, synthetisch heraestellten Peptidspaltprodukte auf die intrazellulare Ca-Konzentration in Astrozvten Es wurde zunächst untersucht, wie sich die Zugabe eines basischen Peptids mit einer Aminosäuresequenz, die der Sequenz der letzten 30 Aminosäuren im C-terminalen Be- reich von SDF-1 entspricht, auf die intrazellulären Ca-Konzentration in Astrozyten aus- wirkt.

Figur 25 zeigt das Ergebnis eines Ca-Imaging-Experiments mit dem C-terminalen basi- schen Peptid von SDF-1y in Astrozyten. Die Applikation von 1 lig/ml des synthetischen Peptids, das die C-terminalen 30 Aminosäuren von SDF-1y repräsentiert, führte zu einer nur schwachen Beeinflussung der intrazellularen Ca-Konzentration der kultivierten Astrocyten (Figur 25 A). Wurden die Astrozyten zuvor 5 Minuten lang mit dem monoklo- nalen Antikörper 12G5 (Antikörper gegen CXCR4) inkubiert, so kommt es in den primären Astrocyten zu einer stark erhöhten intrazellulären Calciumausschüttung bei Applikation des gleichen C-terminalen Peptides (Figur 25 B).

Wurde ein Ca-Imaging-Experiment mit den von dem C-terminalen Bereich von SDF-1y abgeleiteten Peptiden RREEKVG (Peptid 1, SEQ ID NO : 5), KKEKIG (Peptid 2, SEQ ID NO : 6), KKKRQ (Peptid 3, SEQ ID NO : 8), KKRKAAQ (Peptid 4, SEQ ID NO : 9) und KKKN (Peptid 5, SEQ ID NO : 10) sowie mit den wie in Eipper et al (1992) beschrieben amidierten Peptiden 1' (RREEKV (NH2)) und 2' (KKEKI (NH2)), so wurde festgestellt, dass die Zu- gabe der nicht-amidierten Peptide 1,2 und 3 sowie der amidierten Peptide 1'und 2'zu einer Erhöhung der intrazellularen Ca-Konzentration in Astrozyten führten. In Figur 26 wird gezeigt, dass die Applikation von 1 mg/ml des Peptids 2 (KKEKIG ; SEQ ID NO : 6) (Fi- gur 26 A) oder des Peptids 3 (KKKRQ ; SEQ ID NO : 8) (Figur 26 B) zu einem signifikanten Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration in kultivierten primären Astrocyten führt.

Dagegen bewirkten die Peptide 4 und 5 keinen Anstieg der Ca-Konzentration in Astro- zyten.

Diese Ergebnisse zeigen, dass die putativen Neuropeptide in unterschiedlicher Weise die intrazelluläre Calcium-Konzentration modulieren können. Sie legen ebenfalls nahe, dass für die von SDF-1y hervorgerufene drastische Heraufregulation der intrazellularen Cal- cium-Konzentration nach Vorinkubation der Zellen mit dem Anti-CXCR4-Antikõrper aus- schließlich der C-terminale Bereich von SDF-1y verantwortlich ist, nicht aber der mit den Chemokinen SDF-1a bzw.-1ß übereinstimmende Molekülabschnitt. Dieser Befund belegt die besondere und spezifische Funktion des C-Terminus von SDF-1y und bestätigt die Ergebnisse, die mit dem vollständigen SDF-ly-Molekül erhalten wurden.

Literatur Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W. und Lipman, D. J. (1990) Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215,403-410.

Angerer, L. M., Stoler, M. H. und Angerer, R. C. (1987) In situ hybridization with RNA probes : An annotated recipe. In K. L. Valentino, R. H. Eberwine, J. D. Barchas (Hrsg.) In Situ Hybridization. Application to neurobiology, Oxford University Press, New York, 42-70.

Chomczynski, P. und Sacchi, N. (1987) Single step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chlorofrom extraction. Anal. Biochem. 162,156-159.

Devereux, J., et al. (1984) Nucleic Acids Research 12 (12) : 387.

Doranz, B. J., Orsini, M. J., Turner, J. D., Hoffman, T. L., Berson, J. F., Hoxie, J. A., Peiper, S. C., Brass, L. F. und Doms, R. W. (1999) Identification of CXCR4 domains that support coreceptor and chemokine receptor functions J. Virol. 73,2752-2761.

Eipper, B., Stoffers, D. und Xu, R. (1992) The biosynthesis of neuropeptides : peptide alpha amidation. Annu. Rev. Neurosci. 15,57-85.

Gellissen, G. (2000) Heterologous protein production in methylotrophic yeasts. Appl.

Microbiol. Biotechnol. 54 : 741-750.

Henikoff und Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 : 10915-10919.

Koller, H., Trimborn, M., von Giesen, H.-J., Schroeter, M. und Arendt, G. (2001) TNFa reduces glutamate induced intracellular Ca2+ increase in cultured cortical astrocytes. Brain Research 893 : 237-243.

Loetscher, P., Gong, J. H., Dewald, B., Baggiolini, M. und Clark-Lewis, l. (1998) N-terminal peptides of stromal cell-derived factor-1 with CXC chemokine receptor 4 agonist and antagonist activities. J. Biochem. 273 (35) : 22279-83.

Müller, H. W., Ignatius, M. J., Hangen, D. H. und Shooter, E. M. (1986) Expression of specific sheath cell proteins during peripheral nerve regeneration in mammals, J. Ce// Biol. 102,393-402.

Needleman und Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48 : 443-453.

Pearson, W. R. (1990) Rapid and sensitive sequence comparison with FASTP and FASTA. Methods Enzymol. 183,63-98.

Rollins, B. J. (1997) Chemokines. Blood 90, 909-928.

Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989) Molecular cloning : A laboratory Manual 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

Sanger, N., Nicken, S. und Coulson, A. R., (1977) DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Nafl. Acad. Sci. USA, 74,144-148.

Shirozu, M., Nakano, T., Inazawa, J., Tashiro, K., Tada, H., Shinohara, T. und Honjo, T.

(1995) Structure and chromosomal localization of the human stromal cell-derived factor 1 (SDF1) gene. Genomics 28, 495-500.

Siegel, G., Agranoff, B. Albers, R. W., Molinoff, P. (1989) Basic Neurochimstry, Raven Press, New York.

Stürzl, M., Roth, W. K., Viehweger, P. und Hoffschneider, H. Ü. (1991) Taq DNA- polymerase synthesized single stranded DNA hybridization probes and their application in Northern blotting and in-situ hybridization. In Rolfs, A., Schumacher, A. C., Marx, P.

(Hrsg.) PCR-Topics. Usage of Polymerase Chain Reaction in Genetic and Infectious Diseases. Berlin, Springer-Verlag, 41-45.

Tashiro, K. Tada, H., Heilker, R., Sherozou, M., Nakano, T. und Honjo, T. (1993) Signal sequence trap : a cloning strategy for secreted proteins and type I membrane proteins.

Science 261,600-602.

Weydemann, U., Keup, P., Piontek, M., Strasser, A. W. M., Schweden, J., Gellissen, G., Janowicz, Z. A. (1995) High level secretion of hirudin by Hansenula polymorpha- authentic processing of three different preprohirudins. Appl. Microbiol. Biotechnol. 44 : 844-849.