CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con ácidos nucleicos que codifican péptidos que comprenden, al menos, un epítopo del alérgeno Ole e 1 o del alérgeno Ole e 2 de polen de olivo de una variedad definida de olivo {Olea europaea L.). La invención también se relaciona con los péptidos resultantes de la expresión de dichos ácidos nucleicos y con las aplicaciones de dichos ácidos nucleicos y péptidos con fines de diagnóstico y tratamiento de la alergia al polen de olivo, entre otras aplicaciones.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El olivo {Olea europaea L.) es uno de los cultivos de mayor importancia en el área Mediterránea, donde ha sido cultivado durante milenios. El cultivo extensivo de esta planta ha conducido a la aparición de un germoplasma extremadamente amplio y variado, con al menos 262 cultivares identificados solamente en España. Hasta muy recientemente, la caracterización de los cultivares de olivo se ha realizado primariamente de acuerdo a parámetros morfológicos y agronómicos. Sin embargo, está emergiendo la utilización de técnicas moleculares con la finalidad de hacer esta caracterización varietal mucho más fiable, rápida y sencilla.

El polen del olivo es uno de los más importantes agentes causales de fenómenos de alergia estacional en humanos, más concretamente de las alergias de tipo I, en aquellos países en los que esta planta está ampliamente distribuida.

Están siendo caracterizadas muchas de las proteínas del polen del olivo (Ole e 1, Ole e 2, Ole e 3, ... y sucesivamente hasta Ole e 10) capaces de unirse a anticuerpos IgE humanos, y, por tanto, catalogadas como alérgenos:

Ole e 1: El alérgeno mayoritario del polen de olivo (denominado Ole e 1) es una proteína de 20 kDa que ha sido aislada, secuenciada, clonada y expresada en Escherichia coli [Lauzurica et al. Olive {Olea europaea) pollen allergens I. Immunochemical characterization by immunoblotting, CRIE and immunodetection by a monoclonal antibody. Mol. Immunol. 1988; 25: 329-335; Lauzurica et al. Olive {Olea europaea) pollen allergens II. Isolation and characterization of two major antigens. Mol Immunol. 1988; 25:

337-344; Villalba et al. Isolation of three allergenic fractions of the major allergen from Olea europaea pollen and N-teπninal amino acid sequence. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1990; 172:523-528; Villalba et al. The amino acid sequence of Ole e 1, the major allergen from olive tree {Olea europaea) pollen. Eur J Biochem 1993; 216: 863-869; Villalba et al. Cloning and expression of Ole e 1, the major allergen from olive tree pollen. J Biol Chem 1994; 269:15217-15222; Martín-Orozco et al. Ole e 1 : epitope mapping, cross-reactivity with other Oleaceae pollens and ultrastructural localization. Int. Arch. Allergy Immunol. 1994; 104: 160-170; Lombardero et al. cDNA sequence analysis of the main olive allergen, Ole e I. Clin Exp Allergy 1994; 24:765-770; Batanero et al. Glycosylation site of the major allergen from olive tree. Allergenic implications of the carbohydrate moiety. Mol. Immunol. 1994; 31 : 31-37; Batanero et al. IgE binding and histamine-release capabilities of the main carbohydrate component isolated from the major allergen of olive tree pollen. J. Allergy Clin. Immunol. 1999; 103: 147-153].

Ole e 1 consiste en una sola cadena polipeptídica de 145 aminoácidos que presenta diversas formas de glicosüación que incluyen fundamentalmente una forma no-glicosilada de 18,4 kDa, una forma glicosilada de 20 kDa, una forma hiperglicosilada de 22 IcDa y otra variante de 40 kDa compuesta de dímeros de la forma glicosilada [Villalba et al. The amino acid sequence of Ole e 1, the major allergen from olive tree (Olea europaea) pollen. Eur J Biochem 1993; 216: 863-869; Villalba et al. Cloning and expression of Ole e 1, the major allergen from olive tree pollen. J Biol Chem 1994; 269:15217-15222]. La secuencia de Ole e 1 presenta una homología relevante (24-34%) con otras proteínas del polen de maíz, tomate, centeno, abedul, arroz, Arabidopsis etc. Esta identidad aumenta a un 85% cuando se compara con proteínas análogas a Ole e 1 de otros miembros de la familia Oleaceae (Fraxinus excelsior, Ligustrum vulgaris, Syringa vulgare, Forsithya suspensa). El propio Ole e 1 muestra también microheterogeneidades en diversas posiciones de su secuencia aminoacídica.

Ole e 2: Las profílinas son proteínas ubicuas que se encuentran en mamíferos, células animales, vegetales e incluso en virus. Su carácter alergénico en humanos fue descrito por Valenta et al. quien acuñó para estas proteínas el término de panalergenos (Valenta et al. Identification of profilin as a novel pollen allergern;IgE autoreactivity in sensitized individuáis. Science 1991; 253: 557-560; Valenta et al. Profilins contitute a novel family of functional plant pan-allergens. J. Exp. Med. 1992; 175: 377-385). Las

profilinas son alérgenos importantes en el polen de árboles, gramíneas, etc., siendo reconocidas por el 20% de los pacientes alérgicos al polen (Martínez et al. The panallergenic character of profilin. Allergy Clin Immunol. News 1995; 7/3: 85-93). El papel que juegan las profilinas en la organización del citoesqueleto de las células eucariotas es muy relevante, ya que pueden modular la polimerización de los filamentos de actina (Ayscough et al. In vivo functions of actin-binding proteins. Curr Opin CeIl Biol. 1998; 10: 102-1 11; Haarer et al. Structure and fimction of profilin. CeIl motility Cytoskel. 1990; 17: 71-74). Además de esta función, se ha descrito que las profilinas pueden actuar como reguladores de las rutas de transmisión de señales en la célula por su afinidad tanto por fosfatidilinositol 4, 5 fosfato como por secuencias de L-prolina (Goldschmidt- Clermont et al. The actin-binding profilin binds to PIP2 and inhibits its hydrolysis by phospolipase C. Scien 1990; 247: 1575-1577; Laffer et al. IgE-binding capacity of recombinant timothy grass (PhI eum pratense) pollen allergens. J Allergy Clin Immunol 1994; 94: 88-94; Lindberg et al. The use of poly(l-ρroline)-8epharose in the isolation of profiling and profilactin complexes. Biochim Biophys 1988; 967: 391-400; van Ree et al. Profilin is a cross-reactive allergen in pollen and vegetable food. Int Arch Allergy Immunol 1992; 98: 97-104; Valenta et al. Profüins contitute a novel family of functional plant pan-allergens. J. Exp. Med. 1992; 175: 377-385). En el polen del olivo, las profilinas se denominan alérgeno Ole e 2 y representan otro de los alérgenos mayoritarios junto con Ole e 1 en el polen del olivo, responsable del 74,6% de los casos de polinosis al olivo. Poseen entre 15-18 kDa (Martínez et al. The allergenic relevance of profilin (Ole e 2) from Olea europaea pollen. Allergy 2002; 57:Suppl. 71: 17-23), que ha sido aislada, secuenciada, clonada y expresada en E. coli, mostrando un alto grado de polimorfismo en su secuencia nucleotídica (Asturias et al. Cloning and expresión of the panallergen profilin and the major allergen (Ole e l) from olive tree pollen. J Allergy Clin Immunol 1997; 100(3):365-72). Se ha descrito la presencia de, al menos, tres isoformas de profilina en este material sobre la base de las secuencias aminoacídicas resultantes de predicciones teóricas (Rodríguez et al. Allergenic diversity of the olive pollen. Allergy 2002; 57: 6-16). La secuencia de Ole e 2 presenta una alta identidad (73-86%) con otras profilinas de B.verrucosa, Phoenix dactylifera, Parietaria judaica, Brassica napus, Pyrus communis, Malus domestica, N.tabacum, Arabidopsis etc. Esta identidad es menor (32%) cuando se compara con profilinas análogas a Ole e 2 de otras especies tal como las humanas.

Ole e 3: Batanero et al. Isolation, cDNA cloning and expression of Lig v 1, the major allergen from privet pollen. Clin Exp Allergy. 1996; 26(12):1401-10; Ledesma et al.

Molecular cloning and expression of active Ole e 3, a major allergen from olive-tree pollen and member of a novel family of Ca ²⁺ -binding proteins (polcalcins) involved in allergy. Eur J Biochem. 1998; 258(2):454-459;

Ole e 4 y Ole e 5: Boluda et al. Purifϊcation, characterization, and partial sequencing of two new allergens of Olea europaea. J Allergy Clin Immunol. 1998 Feb; 101(2 Pt l):210-6; Carnes & Fernandez-Caldas. Ole e 4 and Ole e 5, important allergens of Olea europaea. Allergy. 2002; 57 Suppl 71 :24-28; Ole e 5: Alché et al. Superoxide dismutase isoenzymes of olive pollen. Physiol.

Plantarum 104, 772-776. 1998;

Ole e 6: Batanero et al. Purification, amino acid sequence and immunological characterization of Ole e 6, a cysteine-enriched allergen from olive tree pollen. FEBS Lett. 1997 Jun 30;410 (2-3):293-6; Ole e 7: Florido López et al. An allergen from Olea europaea pollen (Ole e 7) is associated with plant-derived food anaphylaxis. Allergy. 2002; 57 Suppl 71 :53-9; Tejera et al. Identification, isolation, and characterization of Ole e 7, a new allergen of olive tree pollen. J Allergy Clin Immunol. 1999; 104:797-802;

Ole e 8: Ledesma A, Villalba M, Vivanco F, Rodríguez R. Olive pollen allergen Ole e 8: identification in mature pollen and presence of Ole e 8-like proteins in different pollens. Allergy. 2002 Jan; 57(l):40-3;

Ole e 9: Palomares et al. The C-terminal segment of the 1,3-beta-glucanase Ole e 9 from olive (Olea europaea) pollen is an independent domain with allergenic activity: expression in Pichia pastoris and characterization. Biochem J. 2003; 369:593-601; Huecas et al. Ole e 9, a major olive pollen allergen is a 1,3 -beta- glucanase. Isolation, characterization, amino acid sequence, and tissue specificity. J Biol Chem. 2001 ; 276(30):27959-66. Epub 2001 May 23; y

Ole e 10: Barral et al. A major allergen from pollen defines a novel family of plant proteins and shows intra- and interspecie cross-reactivity. J Immunol. 2004; 172(6):3644- 3651.

Tanto la diagnosis como el tratamiento de la alergia al polen del olivo se basan actualmente en la utilización de extractos proteicos obtenidos a partir de dicho polen,

mediante diversos procedimientos. Los extractos obtenidos tienen que ser estandarizados según recomendaciones de la OMS a través de la Unión Internacional de Sociedades de Inmunología, Subcomité de Estandarización de Alérgenos (WHO Expert Committee on Biológica! Standardisation. Guidelines for the preparation and establishment of reference materials and reference reagents for biological substances. WHO Technical Report Series No. 626, 1978). Dicha organización mantiene diversos patrones, aunque los fabricantes de extractos poseen patrones internos para su propia referencia.

Diversos trabajos científicos están caracterizando la presencia de elevada variabilidad en el contenido alergénico del polen del olivo (y en consecuencia en los extractos producidos a partir de dicho polen) proveniente de diversas distribuciones geográficas, y concretamente de distintas variedades de esta planta. Debido a que la alergenicidad depende del material usado en inmunoterapia, el cual varía según la variedad de la que proceda el polen, se ha prestado gran atención a la tecnología del ADN recombinante como una alternativa viable a la producción de alérgenos recombinantes, facilitando así su caracterización a nivel molecular, y su uso en diagnóstico y terapia.

Los alérgenos recombinantes serían capaces de eliminar en parte la variabilidad natural propia de las fuentes alergénicas, dando lugar a preparaciones homogéneas, controladas y reproducibles, con gran uso diagnóstico, terapéutico y preventivo. Igualmente permitirían el diseño de derivados hipoalergénicos para su empleo en vacunas de desensibilización, así como el diseño de nuevos métodos de vehiculización y administración de estos compuestos, obtenidos a través de diferentes metodologías que están siendo desarrolladas actualmente y nuevas herramientas terapéuticas [Vítala et al. Strategies for converting allergens into hypoallergenic vaccine candidates. Methods. 2004 Mar; 32(3):313-20; Bohle & Vieths. Improving diagnostic tests for food allergy with recombinant allergens. Methods. 2004; 32(3):292-9; Cromwell et al. Transition of recombinant allergens from bench to clinical application. Methods. 2004; 32(3):300-12; van Hage-Hamsten & Pauli. Provocation testing with recombinant allergens. Methods. 2004; 32(3):281-91; Herz et al. Animal models of type I allergy using recombinant allergens. Methods. 2004; 32(3):271-80; Valent et al. Assays for measuring in vitro basophil activation induced by recombinant allergens. Methods. 2004; 32(3):265-70; Thomas et al. Recombinant allergens for analysing T-cell responses. Methods. 2004; 32(3):255-64; Deinhofer et al. Microarrayed allergens for IgE profiling. Methods. 2004;

32(3):249-54; Obermeyer et al. Over-expression and production of plañí allergens by molecular farming strategies. Methods. 2004; 32(3):235-40; Wallner et al. Lab scale and médium scale production of recombinant allergens in Escherichia coli. Methods. 2004; 32(3):219-26; Slater JE. Recombinant allergens in the US. Methods. 2004; 32(3):209-l l; Valenta & Kraft. Recombinant allergens: from production and characterization to diagnosis, treatment, and prevention of allergy. Methods. 2004; 32(3):207-208; Rhyner et al. Cloning allergens via phage display. Methods. 2004; 32(3):212-218; Verdino & Keller. Circular dichroism analysis of allergens. Methods. 2004; 32(3):241-248; Wagner et al. Plant virus expression systems for transient production of recombinant allergens in Nicotiana benthamiana, Methods. 2004; 32(3):227-234; Riemer et al. Allergen mimotopes. Methods. 2004; 32(3):321-327; Hartl et al. DNA vaccines for allergy treatment. Methods. 2004; 32(3):328-339; Bhalla & Singh. Knocking out expression of plant allergen genes. Methods. 2004; 32(3):340-345].

Algunos alérgenos del polen del olivo y otras oleáceas han sido ya expresados de forma recombinante [Villalba et al. Cloning and expression of Ole e 1, the major allergen from olive tree pollen. J Biol Chem 1994; 269: 15217-15222; Batanero et al. Isolation, cDNA cloning and expression of Lig v 1, the major allergen from privet pollen. Clin Exp Allergy. 1996; 26(12):1401-10; Asturias et al. Cloning and expression of the panallergen profilin and the major allergen (Ole e 1) from olive tree pollen. J Allergy Clin Immunol. 1997 Sep; 100(3):365-72; Ledesma et al. Molecular cloning and expression of active Ole e 3, a major allergen from olive-tree pollen and member of a novel family of Ca ²⁺ -binding proteins (polcalcins) involved in allergy. Eur J Biochem. 1998; 258(2):454-459; Ledesma et al. Cloning, expression and characterization of a novel four EF-hand Ca(2+)-binding protein from olive pollen with allergenic activity. FEBS Lett. 2000; 466(1): 192-6; Huecas et al. Production and detailed characterization of biologically active olive pollen allergen Ole e 1 secreted by the yeast Pichia pastoris. Eur. J. Biochem. 1999; 261 : 539-545; González et al. Immunological and molecular characterization of the major allergens from lilac and privet pollens overproduced in Pichia pastoris. Clin Exp Allergy. 2001; 31(2):313-21 ; Palomares et al. The C-terminal segment of the 1 ,3 -beta- glucanase Ole e 9 from olive (Olea europaea) pollen is an independent domain with allergenic activity: expression in Pichia pastoris and characterization. Biochem J. 2003; 369:593-601].

En el caso particular del alérgeno Ole e 1, la producción de varias isoformas recombinantes ha sido utilizada para determinar el papel del plegamiento de la proteína, del componente glicosídico y de varios cambios puntuales en la secuencia aminoacídica en la capacidad de unión de anticuerpos monoclonales y de inmunoglobulinas IgE humanas al alérgeno [González et al. Influence of the 3D-conformation, glycan component and microheterogeneity on the epitope structure of Ole e 1, the major olive allergen. Use of recombinant isoforms and specific monoclonal antibodies as immunological tools. Mol Immunol. 2002; 39(l-2):93-101]. Sin embargo, en ninguno de los casos citados se menciona la composición varietal del polen de partida o el origen varietal de la secuencia de alérgeno usada en la forma recombinante.

La alergia al polen del olivo sigue representando actualmente un tópico de salud pública. Los reactivos actualmente existentes para diagnóstico e ínmunoterapia de la atopia al polen del olivo no especifican la composición varietal de partida del polen utilizado para la preparación de dichos reactivos. Por ello, no es posible, entre otras cosas, identificar la variedad concreta de olivo frente a la cual el paciente de alergia está sensibilizado ni ' diseñar una inmunoterapia personalizada administrando el alérgeno apropiado en la pauta terapéutica adecuada.

Existe, por tanto, la necesidad de identificar los alérgenos de polen de olivo específicos de variedades definidas de olivo con el fin de optimizar el diagnóstico y tratamiento de la alergia al polen de olivo.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona una solución a la necesidad existente. Para ello, se han aislado, caracterizado e identificado los ácidos nucleicos que codifican péptidos, o fragmentos de los mismos, que comprenden, al menos, un epítopo del alérgeno Ole e 1 o del alérgeno Ole e 2 de polen de olivo de variedades definidas de olivo {Olea enropaea L.). Dichos péptidos, que poseen uno o más epítopos alergénicos de los alérgenos mayoritarios del polen de olivo (Ole e 1 u Ole e 2) tienen actividad alergénica y pueden ser utilizados, entre otras aplicaciones, en el diagnóstico y tratamiento de la alergia al polen de olivo. Dicha actividad alergénica de dichos péptidos o fragmentos de los mismos puede ser modulada mediante la introducción de modificaciones apropiadas con el fin de obtener variantes hipoalergénicas o hiperalergénicas.

La invención, por tanto, proporciona una mejora del diagnóstico y tratamiento de la alergia al polen del olivo basada en el empleo de alérgenos recombinantes específicos de variedades definidas de olivo. El uso de dichos alérgenos permite, entre otras aplicaciones, determinar perfiles individualizados de reactividad para cada paciente y el diseño de inmunoterapias igualmente personalizadas.

Por tanto, en un aspecto, la invención se relaciona con un ácido nucleico que codifica un péptido que comprende, al menos, un epítopo del alérgeno Ole e 1 o del alérgeno Ole e 2 de polen de olivo de una variedad definida de olivo (Olea europaea L.). Las construcciones génicas, vectores recombinantes y sistemas de expresión que comprenden dicho ácido nucleico constituyen un aspecto adicional de esta invención.

Otro aspecto de esta invención lo constituye un péptido que comprende, al menos, un epítopo del alérgeno Ole e 1 o del alérgeno Ole e 2 de polen de olivo de una variedad definida de olivo (Olea europaea). El procedimiento para la obtención de dicho péptido y sus aplicaciones constituyen aspectos adicionales de esta invención. En una realización particular, dicho péptido es una variante hipoalergénica o hiperalergénica del mismo.

Otro aspecto de esta invención lo constituye un anticuerpo capaz de unirse a un péptido que comprende, al menos, un epítopo del alérgeno Ole e 1 o del alérgeno Ole e|2 de polen de olivo de una variedad definida de olivo. El procedimiento para la obtención de dicho anticuerpo y sus aplicaciones constituyen aspectos adicionales de esta invención. Otro aspecto de esta invención lo constituye un soporte sólido que comprende bien una pluralidad de ácidos nucleicos, en donde cada uno de dichos ácidos nucleicos está separado del resto de ácidos nucleicos y su secuencia nucleotídica codifica, al menos, un epítopo de un alérgeno de polen de olivo específico de una variedad definida de olivo; o bien una pluralidad de péptidos, en donde cada uno de dichos péptidos está separado del resto de péptidos y comprende, al menos, un epítopo de un alérgeno de polen de olivo específico de una variedad definida de olivo, o bien una pluralidad de anticuerpos, en donde cada uno de dichos anticuerpos está separado del resto de anticuerpos y es capaz de unirse a un péptido que comprende, al menos, un epítopo del alérgeno Ole e 1 o del alérgeno Ole e 2 de polen de olivo de una variedad definida de olivo. Otro aspecto de esta invención lo constituye una composición farmacéutica que comprende, como sustancia activa, al menos, uno de dichos péptidos o anticuerpos. El empleo de dichos péptidos y anticuerpos en la elaboración de una composición

farmacéutica para la prevención o el tratamiento de la alergia al polen de olivo de una variedad definida de olivo constituye un aspecto adicional de la invención.

Otro aspecto de esta invención lo constituye un método in vivo para el diagnóstico de alergia a polen de olivo de una variedad definida de olivo en un sujeto. Otro aspecto de esta invención lo constituye un método in vitro para (i) el diagnóstico de alergia al polen de olivo de una variedad definida de olivo en un sujeto, o para (ii) determinar la evolución del curso de la alergia al polen de olivo de una variedad definida de olivo en un sujeto, o para (iii) evaluar la eficacia de un tratamiento contra alergia al polen de olivo de una variedad definida de olivo en un sujeto. Los kits para la puesta en práctica de dichos métodos constituyen un aspecto adicional de esta invención.

Otro aspecto de esta invención lo constituye el empleo de dichos ácidos nucleicos y péptidos para obtener productos derivados de dichos ácidos nucleicos o péptidos, potencialmente útiles en investigación, diagnóstico, terapia y/o prevención de alergia al polen de olivo y/o en la caracterización de cultivares de olivo. Los productos derivados de dichos ácidos nucleicos y péptidos constituyen un aspecto adicional de esta invención.

Otro aspecto de esta invención lo constituye un método in vitro para identificar el alérgeno del polen de la variedad de olivo causante de alergia en un sujeto o para identificar la variedad de olivo causante de alergia en un sujeto. Otro aspecto de esta invención lo constituye un método para diseñar una terapia personalizada para un sujeto que padece alergia al polen de olivo de una variedad definida de olivo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra los alineamientos aminoacídicos de los péptidos (SEQ ID NO:

27-50) entre sí y con respecto a las secuencias depositadas en GenBank con número de acceso X76395 y X76396, e incluye las posiciones de los epítopos inmunodominantes de Ole e 1 responsables de la unión a células T y B. Se han incluido unas barras (identificadas con las letras a, b y c) que representan los epítopos T determinados experimentalmente [Cardaba et al. "Olive pollen allergy: searching for inmmunodominant T-cell epitopes on the Ole e 1 molecule" Clin. Exper. Allergy 28:413-422. 1998], así como unas barras rectangulares oscuras que muestran las secuencias antigénicamente relevantes para la

unión a IgG determinadas experimentalmente [González et al. "Análisis og IgE and IgG B- cell immunodominant regions of Ole e 1 , the main allergen from olive pollen" Mol. Immunol. 43:570-578. 2006] y unas barras rectangulares claras que muestran los aminoácidos implicados en el reconocimiento por IgEs experimentalmente determinados mediante varios métodos [González et al., 2006, citado supra}.

La Figura 2 muestra los alineamientos aminoacídicos de los péptidos (SEQ ID NO: 133-212) entre sí y con respecto a la secuencia depositada en GenBank con número de acceso Yl 2425, e incluye las posiciones de los epítopos inmunodominantes de Ole e 2 responsables de la unión a células T y células B. Se han señalado los epítopos T predichos mediante el programa TEPITOPE [Burastero et al., "T-cell receptor mediated cross- allergenicity" Int. Arch. Allergy Immunol. 2004, 135: 296-305] (posiciones 29, 45, 53, 68, 85 y 95) y se han incluido unas barras rectangulares oscuras que muestran las secuencias antigénicamente relevantes para la unión a IgG y a IgE determinadas experimentalmente [Asturias et al, "Molecular and structural analysis of the panallergen profilin B cell epitopes defined by monoclonal antibodies" ínter. Immunol. 2002, 14: 993-1001].

La Figura 3 es una representación esquemática y genérica de una aproximación para la obtención de las secuencias de los alérgenos de polen de Olivo individuales específicos de variedades definidas de olivo.

La Figura 4 es una gráfica que muestra las relaciones correspondientes entre las variedades de olivo en las que se determinó la secuencia de Ole e 1, obtenida a partir del análisis de dichas secuencias con un software específico (programas Clustal X y Treeview).

La Figura 5 es una gráfica que muestra las relaciones correspondientes entre las variedades de olivo en las que se determinó la secuencia de Ole e 2, obtenida a partir del análisis de dichas secuencias con un software específico (programas Clustal X y Treeview).

La Figura 6 es una representación esquemática de un procedimiento para la construcción de variantes hipoalergénicas recombinantes de Ole e 1 [Ejemplo 3]

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

A. Acido nucleico, construcciones génicas y vectores recombinantes

En un aspecto, la invención se relaciona con un ácido nucleico que codifica un péptido que comprende, al menos, un epítopo del alérgeno Ole e 1 o del alérgeno Ole e 2 de polen de olivo de una variedad definida de olivo (Olea enropaea L.), en adelante ácido nucleico de la invención, en donde

(i) el ácido nucleico que comprende, al menos, un epítopo del alérgeno Ole e 1 , se selecciona entre: a) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada entre las secuencias de nucleótidos identificadas como SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID

NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 1 1, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24; o un fragmento de dichas secuencias de nucleótidos; b) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido cuya secuencia de aminoácidos se selecciona entre las secuencias identificadas como SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO:

38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49 y SEQ ID NO: 50, o un fragmento del mismo; c) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia definida en a) o b); d) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que híbrida con las secuencias de nucleótidos definidas en a), b) o c); e) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos derivable por degeneración de las secuencias de nucleótidos definidas en a), b), c), o d); o

f) un ácido nucleico que comprende una secuencia complementaria a cualquiera de las secuencias definidas en a)-e), y

(ii) el ácido nucleico que comprende, al menos, un epítopo del alérgeno Ole e 2, se selecciona entre: g) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada entre las secuencias de nucleótidos identificadas como SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID

NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94,

SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 1 10, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID

NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, o un fragmento de dichas secuencias de nucleótidos; h) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido cuya secuencia de aminoácidos se selecciona entre las secuencias identificadas como SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143,

SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150; SEQ ID NO: 151, SEQ ID

NO: 152, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157, SEQ- ID NO: 158, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO:

173, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 194,

SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 211 y SEQ ID NO: 212, o un fragmento del mismo; i) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia definida en g) o h); j) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que híbrida con las secuencias de nucleótidos definidas en g), h) o i); k) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos derivable por degeneración de las secuencias de nucleótidos definidas en g), h), i), o j); y

1) un ácido nucleico que comprende una secuencia complementaria a cualquiera de las secuencias definidas en g)-k).

El péptido codificado por el ácido nucleico de la invención (denominado más adelante, péptido de la invención) tiene, en general, actividad alergénica y comprende, al menos, un epítopo alergénico del alérgeno Ole e 1 o del alérgeno Ole e 2 de polen de olivo de una variedad definida de olivo.

Adicionalmente, si el péptido de la invención comprende, al menos, un epítopo alergénico del alérgeno Ole e 1, dicho péptido puede contener una región responsable de la unión a células T y/o B, una región responsable de la unión a IgG, IgE o una región responsable de la modulación de la unión a las IgG y/o IgE. Se han definido algunos

epítopos inmunodominantes de Ole e 1 responsables de la unión a células T [Cardaba et al. "Olive pollen allergy: searching for inmmunodominant T-cell epitopes on the Ole e 1 molecule" Clin. Exper. Allergy 28:413-422. 1998]. Estas regiones corresponden a las posiciones 91-102, 109-120 y 119-130 de la secuencia aminoacídica de Ole e 1 definida por Villaba et al. [Villalba M, Batanero E, López-Otín et al. "The amino acid sequence of Ole e 1, the major allergen from olive tree {Olea europaea) pollen". Eur. J. Biochem. 216:863-869. 1993]. Dichos epítopos no son reconocidos por anticuerpos IgE. El componente glucídico de Ole e 1 muestra una moderada capacidad de unir anticuerpos (IgGs) monoclonales murinos. Se han identificado regiones de Ole e 1 que contienen epítopos IgE de reconocimiento por células B, así como regiones inmunodominantes IgG [González et al. "Análisis og IgE and IgG B-cell immunodominant regions of Ole e 1, the main allergen from olive pollen" Mol. Immunol. 43:570-578. 2006]. Estas regiones corresponden a las posiciones: 8-11, 29, 32, 33, 55-59, 70, 107-110, 112, 120, 123, 141 (unión a IgG), y: K137, L138, G139, Y141, P142 y T1 14-M145 (unión a IgE) de la secuencia aminoacídica de Ole e 1 definida por Villaba et al. [Villalba M, Batanero E, López-Otín et al. "The amino acid sequence of Ole e 1, the major allergen from olive tree {Olea europaea) pollen". Eur. J. Biochem. 216:863-869. 1993]. En la Figura 1 se muestran los alineamientos aminoacídicos de los péptidos (SEQ ID NO: 27-50) entre sí y con respecto a las secuencias depositadas en GenBank con número de acceso X76395 y X76396, así como las posiciones de los epítopos inmunodominantes de Ole e 1 responsables de la unión a células T (epítopos a, b y c), IgG e IgE.

Por otro lado, en el caso de que el péptido de la invención comprenda, al menos, un epítopo alergénico del alérgeno Ole e 2 de polen de olivo, dicho péptido puede contener no sólo una región responsable de la unión a células T y/o B, una región responsable de la unión a IgE, IgG, o una región responsable de la modulación de la unión a la IgE o IgG. Se han definido experimentalmente, o predicho mediante herramientas bioinformáticas algunos epítopos inmunodominantes de profilinas responsables de la unión a células T y B [Asturias et al., "Molecular and structural analysis of the panallergen profilin b cell epitopes defined by monoclonal antibodies" ínter. Immunol. 2002, 14: 993-1001 ; Burastero et al., "T-cell receptor mediated cross-allergenicity" Int. Arch. Allergy Immunol. 2004, 135: 296-305]. Estas regiones corresponden a las posiciones 29, 45, 53, 68, 85 y 95 [epítopos T predichos por Burastero et al, "T-cell receptor mediated cross-allergenicity"

Int. Arch. Allergy Immunol. 2004, 135: 296-305 sobre las secuencias de diferentes profílinas, incluyendo Ole e 2 (número de acceso GenBank Yl 2425)], y a las regiones 1-7 (10A4), 36-49 (5F2), 100-109 (9A7), 108-1 15 (9G4) y 122-128 (3H7) [epítopos B analizados por Asturias et al., "Molecular and structural analysis of the panallergen profilin b cell epitopes defíned by monoclonal antibodies" ínter. Immunol. 2002, 14: 993-1001 en profílinas heterólogas de girasol]. En la Figura 2 se muestran los alineamientos aminoacídicos de los péptidos (SEQ ID NO: 133-212) entre sí y con respecto a la secuencia depositada en GenBank con número de acceso Y12425, así como las posiciones de los epítopos inmunodominantes de Ole e 2 responsables de la unión a células T y B. En una realización particular, el ácido nucleico de la invención comprende, o está constituido por, una secuencia de nucleótidos seleccionada entre las secuencias de nucleótidos identificadas como SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24. Dichas secuencias nucleotídicas son secuencias de ADNc que codifican para el alérgeno Ole e 1 de las variedades Picholine (SEQ ID NO: 1-3), Menara (SEQ ID NO: 4-6), Lucio (SEQ ID NO: 7-9), Picual (SEQ ID NO: 10-12), Loaime (SEQ ID NO: 13-15), Hojiblanca (SEQ ID NO: 16-18), Arbequina (SEQ ID NO: 19-21) y Bella de España (SEQ ID NO: 22-24), clones 1, 2 y 3 en todos los casos.

Las diferencias observadas en la longitud de las secuencias nucleotídicas (SEQ ID NO: 1-24) se deben al empleo, para su generación, de un método de amplificación mediante RT-PCR a partir de ARNm total de polen de olivo. En dicho método se utilizan un adaptador oligo-dT (SEQ ID NO: 51) y el oligonucleótido Ole e 1 (SEQ ID NO: 52), de forma que las secuencias obtenidas presentan las dos características diferenciales siguientes: debido al diseño del oligonucleótido Ole e 1 (SEQ ID NO: 52), las secuencias obtenidas no incluyen el codón de iniciación ATG ni los nucleótidos 1-38 de las secuencias descritas para Ole e 1 por Villaba et al. [Villalba M, Batanero E,

Monsalve RI, González de la Peña MA, Lahoz C and Rodríguez R. "Cloning

and expression of Ole e 1, the major allergen from olive tree pollen. Polymorphism analysis and tissue specificity" J. Biol. Chem. 269 (21), 15217- 15222 (1994); Número de acceso GenBank: X76395]; y al utilizarse un adaptador oligo-dT son amplificadas tanto la región codificante como la región no codificante 3' de los mensajeros correspondientes; las diferencias existentes en longitud entre los distintos clones se deben fundamentalmente a la diferente longitud de esas regiones no codificantes 3'.

Merece la pena mencionar la ausencia de un fragmento de 39 nucleótidos de dicha región que no aparece en ninguno de los tres clones secuenciados de la variedad Bella de España (SEQ ID NO: 22-24).

En otra realización particular, el ácido nucleico de la invención comprende, o está constituido por, una secuencia de nucleótidos seleccionada entre las secuencias de nucleótidos identificadas como SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 1 14, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132. Dichas secuencias nucleotídicas son secuencias de ADNc que codifican el alérgeno Ole e 2 de las variedades Lechín de Sevilla (SEQ ID NO: 53-56), Verdial de Vélez-Málaga (SEQ ID NO: 57-60), Hojiblanca (SEQ ID NO: 61-64), Verdial de Huevar (SEQ ID NO: 65-69), Picudo (SEQ ID NO: 70-73), Manzanilla de Sevilla (SEQ

ID NO: 74-77), Arbequina (SEQ ID NO: 78-81), Cornicabra (SEQ ID NO: 82-85), Blanqueta (SEQ ID NO: 86-89), Loaime (SEQ ID NO: 90-92), Lucio (SEQ ID NO: 93- 96), Bella de España (SEQ ID NO: 97-98), Empeltre (SEQ ID NO: 99-101), Farga (SEQ ID NO: 102-104), Frantoio (SEQ ID NO: 105-106), Galega (SEQ ID NO: 107), Leccino (SEQ ID NO: 108-1 10), Lechín de Granada (SEQ ID NO: 1 1 1-1 12), Morrut (SEQ ID NO: 1 13-116), Sevillenca (SEQ ID NO: 117-119), Sourani (SEQ ID NO:120-122), Villalonga (SEQ ID NO: 123-126), Acebuche (SEQ ID NO: 127-129) y Picual (SEQ ID NO: 130- 132), dependiendo de la variedad con 1, 2, 3 ó 4 clones en cada caso.

Las secuencias nucleotídicas descritas (SEQ ID NO: 53-132) constituyen las "open reading frame" (ORF) completas de los genes correspondientes. Para la generación de estas secuencias se empleó un método de amplificación mediante RT-PCR a partir de ARNm total de polen de olivo. En dicho método se utilizan el oligonucleótido OL-I (SEQ ID NO: 213) y el oligonucleótido OL-2 (SEQ ID NO: 214), de forma que las secuencias obtenidas presentan las dos características diferenciales siguientes: - con el diseño del oligonucleótido OL-I (SEQ ID NO: 213), las secuencias obtenidas incluyen el codón de iniciación ATG descritas por Asturias et al. [Asturias, et al. "Cloning and expression of the panallergen profilin and the major allergen (Ole e 1) from olive tree polen. L. Allergy Clin Immunol, 1997, 100: 365-372; Números de acceso GenBank: Y12430, Y12429 e Yl 2425]; y - con el diseño del oligonucleótido OL-2 (SEQ ID NO: 214) se amplifica la región codificante 3' de los mensajeros correspondientes. Utilizando ambos oligonucleótidos OL-I y OL-2 (SEQ ID NO: 213 y 214) se genera por tanto la secuencia completa de los genes de profilinas correspondientes.

En otra realización particular, el ácido nucleico de la invención comprende, o está constituido por, un fragmento de dichas secuencias SEQ ID NO: 1-24 o SEQ ID NO: 53-

132 que codifica un péptido que comprende, al menos, un epítopo del alérgeno Ole e 1 o del alérgeno Ole e 2 de polen de olivo de una variedad definida de olivo. El péptido codificado por dicho fragmento nucleotídico tiene actividad alergénica y comprende, al menos, un epítopo alergénico del alérgeno Ole e 1 o del alérgeno Ole e 2 de polen de olivo de una variedad definida de olivo. Adicionalmente, dicho péptido puede contener una región responsable de la unión a células T y/o B, o una región responsable de la unión a

IgE o IgG, o una región responsable de la modulación de la unión a la IgE o IgG, tal como se ha mencionado previamente.

En otra realización particular, el ácido nucleico de la invención comprende, o está constituido por, una secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido cuya secuencia de aminoácidos se selecciona entre las secuencias identificadas como SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49 y SEQ ID NO: 50, o un fragmento del mismo. Dichas secuencias aminoacídicas corresponden a las secuencias de aminoácidos del alérgeno Ole e 1 de las variedades Picholine (SEQ ID NO: 27-29), Menara (SEQ ID ÑO: 30-32), Lucio (SEQ ID NO: 33-35), Picual (SEQ ID NO: 36-38), Loaime (SEQ ID NO: 39-41), Hojiblanca (SEQ ID NO: 42-44), Arbequina (SEQ ID NO: 45-47) y Bella de España (SEQ ID NO: 48-50), clones 1, 2 y 3 en todos los casos.

Las diferencias observadas en la longitud de las secuencias aminoacídicas (SEQ ID NO: 27-50) se explican de la misma manera que las diferencias observadas en la longitud de las secuencias nucleotídicas mencionadas más arriba ya que se ha utilizado una estrategia de RT-PCR que genera clones parciales de Ole e 1, puesto que el oligomαcleótido Ole e 1 (SEQ ID NO: 52) hibrida desde el nucleótido 38 a partir de la secuencia descrita para Ole e 1 por Villaba et al. [Villalba M, Batanero E, Monsalve RI, González de la Peña MA, Lahoz C and Rodríguez R: "Cloning and expression of Ole e 1, the major allergen from olive tree pollen. Polymorphism analysis and tissue specifϊcity" J. Biol. Chem. 269 (21), 15217-15222 (1994); Número de acceso GenBank: X76395]. En otra realización particular, el ácido nucleico de la invención comprende, o está constituido por, una secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido cuya secuencia de aminoácidos se selecciona entre las secuencias identificadas como SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150; SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152,

SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 171, 5 SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 181 , SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 211 y SEQ ID NO: 212. Dichas secuencias aminoacídicas corresponden a las secuencias de aminoácidos del alérgeno Ole e 2 de las variedades Lechín de Sevilla (SEQ ID NO: 133-136), Verdial de Vélez-Málaga (SEQ ID NO: 137-

140), Hojiblanca (SEQ ID NO: 141-144), Verdial de Huevar (SEQ ID NO: 145-149),

Picudo (SEQ ID NO: 150-153), Manzanilla de Sevilla (SEQ ID NO: 154-157), Arbequina

(SEQ ID NO: 158-161), Cornicabra (SEQ ID NO: 162-165), Blanqueta (SEQ ID NO: 166-

^' 169), Loaime (SEQ ID NO: 170-172), Lucio (SEQ ID NO: 173-176), Bella de España (SEQ ID NO: 177-178), Empeltre (SEQ ID NO: 179-181), Farga (SEQ ID NO: 182-184), Frantoio (SEQ ID NO: 185-186), Galega (SEQ ID NO: 187), Leccino (SEQ ID NO: 188- 190), Lechín de Granada (SEQ ID NO: 191-192), Morrut (SEQ ID NO: 193-196), Sevillenca (SEQ ID NO: 197-199), Sourani (SEQ ID NO: 200-202), Villalonga (SEQ ID NO: 203-206), Acebuche (SEQ ID NO: 207-209) y Picual (SEQ ID NO: 210-212), dependiendo de la variedad con 1, 2, 3 ó 4 clones en cada caso.

En otra realización particular, el ácido nucleico de la invención comprende, o está constituido por, una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia definida en (i) [a) o b)] o en (ii) [g) o h)]. En el sentido utilizado en esta descripción, el término "análoga" pretende incluir a cualquier secuencia de nucleótidos que codifica un péptido con actividad alergénica que comprende, al menos, un epítopo alergénico del alérgeno Ole e 1 o del alérgeno Ole e 2 de polen de olivo de una variedad definida de olivo. Dicha secuencia análoga es sustancialmente homologa a la secuencia de nucleótidos definida en a); y/o

codifica un péptido que es sustancialmente homólogo al péptido codificado por la secuencia de nucleótidos definida en (i) [a) o b)] o en (ii) [g) o h)]. Típicamente, una secuencia análoga de nucleótidos:

- se puede aislar de cualquier organismo que produce un péptido con actividad alergénica que comprende, al menos, un epítopo alergénico del alérgeno Ole e 1 o del alérgeno Ole e 2 de polen de olivo de una variedad definida de olivo en base a la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1-24 ó SEQ ID NO 53-132; o

- se construye en base a la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1-24 ó SEQ ID NO 53-132, por ejemplo, mediante la introducción de sustituciones de nucleótidos conservativas o bien mediante la inserción de uno o más nucleótidos en la secuencia, la adición de uno o más nucleótidos en cualquiera de los extremos de la secuencia, o la deleción de uno o más nucleótidos en cualquier extremo o en el interior de la secuencia.

En general, una secuencia de nucleótidos análoga a una segunda secuencia de nucleótidos es una secuencia sustancialmente homologa a dicha segunda secuencia nucleotídica, es decir, presenta una homología a nivel de nucleótidos de, al menos, un 60%, típicamente, al menos, un 70%, ventajosamente, al menos, un 80%, preferentemente, al menos un 90%, o más preferentemente, al menos, un 95% respecto a dicha segunda secuencia de nucleótidos. En otra realización particular, el ácido nucleico de la invención comprende, o está constituido por, una secuencia de nucleótidos que híbrida con las secuencias de nucleótidos definidas en (i) [a), b) o c)] o en (ii) [g) , h) o i)]. Las condiciones bajo las cuales hibridan cadenas de ácidos nucleicos totalmente complementarias se denominan "condiciones muy severas de hibridación" o "condiciones de hibridación específicas de secuencia". No obstante, se pueden obtener cadenas dobles estables de ácidos nucleicos sustancialmente complementarias bajo condiciones de hibridación menos severas, denominadas genéricamente "condiciones severas de hibridación", en cuyo caso, el grado de desapareamiento tolerado puede ajustarse mediante ajuste apropiado de las condiciones de hibridación. El experto en la materia puede determinar empíricamente la estabilidad de un dúplex teniendo en cuenta diversas variables, tales como, la longitud y concentración de pares de bases de las sondas, la fuerza iónica y la incidencia de los pares de bases desapareados, siguiendo las directrices del estado de la técnica (véase, por ejemplo,

Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, N. Y. (1989); y Wetmur, Critical Reviews in Biochem. and Mol. Biol. 26 (3/4):227-259 (1991)). A modo ilustrativo, en una realización particular, las condiciones severas de hibridación comprenden, por ejemplo, una concentración comprendida entre 0,15 M y 0,9 M de NaCl y una temperatura comprendida entre 20 ⁰ C y 65 ⁰ C. En otra realización particular, las condiciones muy severas de hibridación comprenden, por ejemplo, una concentración comprendida entre 0,02 M y 0,15 M de NaCl y una temperatura comprendida entre 5O ⁰ C y 70 ⁰ C.

En otra realización particular, el ácido nucleico de la invención comprende, o está constituido por, una secuencia de nucleótidos derivable por degeneración de las secuencias de nucleótidos definidas en (i) [a), b), c) o d)] o en (ii) [g), h), i) o j)]. Un ejemplo ilustrativo de este tipo incluye ácidos nucleicos cuyas secuencias contienen modificaciones conservativas, es decir, cambios de nucleótidos que no afectan a la secuencia de aminoácidos. En otra realización particular, el ácido nucleico de la invención comprende, o está constituido por, una secuencia de nucleótidos complementaria a cualquiera de las secuencias definidas en (i) [a)-e)] o en (ii) [g)-k)].

El ácido nucleico de la invención puede obtenerse por métodos convencionales. Con el fin de identificar correctamente el alérgeno de cada variedad de olivo es imprescindible controlar el material a tratar, en particular, es imprescindible identificar, recolectar y almacenar apropiadamente el material a tratar dado que una de las características determinantes de esta invención consiste en el empleo de polen de olivo procedente de variedades o cultivares definidos, de forma individual para cada variedad. Para ello se utilizan árboles perfectamente caracterizados agronómicamente, en base a los criterios disponibles bien establecidos en la bibliografía (pomológicos, isoenzimáticos, moleculares, etc.). El polen es recolectado de forma individualizada en cada cultivar, con la utilización de procedimientos convencionales, tales como embolsado de las inflorescencias en el momento previo a la antesis, aspiración etc. Una vez recolectado, el polen es (i) purificado mediante procedimientos de tamizado, filtración, etc., para eliminar componentes contaminantes, (ii) caracterizado mediante diversos tipos de procedimientos analíticos (e.g., mediante diversos tipos de microscopías) y (iii) convenientemente almacenado.

La obtención de las secuencias de alérgenos individualmente para el polen de cada variedad puede realizarse a partir de muy diversas aproximaciones moleculares (e.g., por amplificación de la región codificante mediante PCR a partir de ADNc, exploración de bibliotecas de expresión con sueros de pacientes, etc.). A continuación, se describe brevemente una de las aproximaciones más simples, mostrada esquemáticamente en la Figura 3, realizada mediante amplificación de la región codificante a partir de ADNc, mediante PCR. Para ello, se procede a la extracción de ARN total y/o ARN mensajero (ARNm) a partir de las muestras de polen de olivo, de forma individual para cada variedad. La extracción del ARN (total o mensajero) puede realizarse mediante el empleo de técnicas convencionales, tales como las estandarizadas en diferentes publicaciones especializadas o a través de kits comerciales de extracción. Una vez aislado dicho ARN, se determina su calidad y concentración mediante métodos convencionales, tales como espectrofotometría o electroforesis, y se procede a su conversión en ANDc mediante transcripción inversa según procedimientos convencionales conocidos por los expertos en la materia o bien utilizando kits comerciales específicos, mediante el empleo de una transcriptasa inversa y un oligonucleótido adecuado. A partir de los ADNc correspondientes pueden amplificarse las secuencias de los alérgenos mediante reacciones de PCR utilizando oligonucleótidos diseñados a partir de las secuencias descritas para los alérgenos ya conocidos del polen del olivo (e.g., Ole e 1 u Ole e 2). Los productos de PCR obtenidos son clonados en vectores adecuados para el análisis de su secuencia, su expresión, transformación, etc. Como paso previo, se procede a la determinación de las secuencias clonadas.

A continuación, con el fin de obtener los alérgenos recombinantes de las distintas variedades de olivo se procede por métodos convencionales. Brevemente, las secuencias de los alérgenos obtenidos tal como se ha mencionado previamente o mediante métodos análogos o similares al descrito previamente, en cada una de las variedades de olivo elegidas, pueden ser expresadas in vitro en un sistema de expresión de proteínas recombinantes apropiado, por ejemplo, en sistemas bacterianos, levaduras, virus (e.g., baculovirus, etc.), células de anímales, células vegetales, etc., siendo especialmente importante este diseño experimental en el caso de alérgenos glicosilados. La expresión in vitro puede realizarse en la forma de una proteína de fusión del alérgeno de interés, conjugado a una cola de fusión para facilitar la purificación (poli-His, tioredoxina, glutatión S-transferasa, proteína de unión a maltosa, biotina, etc.), o bien directamente sin

la expresión de dicha cola de fusión. Otra alternativa consiste en la aplicación de procedimientos de traducción in vitro. En general, para cada alérgeno, debe ser optimizado tanto el tipo de vector de expresión utilizado como las condiciones de la inducción del cultivo, la producción a gran escala y las condiciones de purificación. Una vez purificado, el alérgeno recombinante es investigado ampliamente en sus propiedades bioquímicas, biofísicas, biológicas e inmunológicas tanto in vivo como in vitro. En el caso de proteínas de fusión debe valorarse la escisión previa de la cola de fusión, generalmente mediante digestiones con endoproteinasas, y, en el caso de productos insolubles, debe valorarse la renaturalización de la proteína de forma previa a su caracterización. Los Ejemplos 1 y 2 ilustran, respectivamente, un procedimiento para la obtención de secuencias de alérgenos Ole e 1 y Ole e 2 recombinantes de distintas variedades definidas de olivo.

Para obtener los alérgenos Ole e 1 y Ole e 2 recombinantes específicos de variedades definidas de olivo proporcionados por esta invención mediante la clonación de los ácidos nucleicos de la invención en un sistema de expresión de proteínas recombinantes es preciso disponer previamente de construcciones geni cas y vectores que comprenden dichos ácidos nucleicos de la invención. Por ello, la invención también se relaciona con una construcción génica que comprende un ácido nucleico de la invención, así como con un vector recombinante que comprende dicha construcción génica o dicho ácido nucleico de la invención, y con un sistema de expresión que comprende un ácido nucleico de la invención, una construcción génica o un vector recombinante proporcionaos por esta invención.

En otro aspecto, la invención se relaciona con una construcción génica, en adelante construcción génica de la invención, que comprende un ácido nucleico de la invención operativamente unido a una secuencia de control de la expresión que controla la expresión de dicho ácido nucleico. Las secuencias de control de expresión son secuencias nucleotídicas que controlan y regulan la transcripción, y en su caso, la traducción del producto de interés. Prácticamente cualquier secuencia de control de expresión puede estar presente en la construcción génica de la invención. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichas secuencias de control incluyen secuencias promotoras (e.g., /? 77, plac, pBAD, ptet, etc.), secuencias codificantes para reguladores transcripcionales (e.g., lacl, tetR, araC, etc.), secuencias de unión a ribosomas (RBS), y/o secuencias terminadoras de

transcripción (ÜΩ, etc.). La construcción génica de la invención puede obtenerse por métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia descritos, por ejemplo, por Sambrook et al. [Molecular Cloning. A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor, NY, 1989]. El ácido nucleico de la invención, o la construcción génica que lo contiene, puede ser insertado en un vector apropiado. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un vector recombinante, en adelante vector recombinante de la invención, que comprende un ácido nucleico de la invención o una construcción génica de la invención que comprende dicho ácido nucleico de la invención. En una realización particular, el vector recombinante de la invención es un vector de expresión. En este caso, el ácido nucleico de la invención se encuentra conectado operativamente a una secuencia reguladora de la expresión que, en general, comprende un promotor y una secuencia terminadora de la transcripción y/o de la traducción. Tal como se ha mencionado más arriba, prácticamente cualquier secuencia reguladora de la expresión del ácido nucleico de la invención (incluyendo promotores y secuencias terminadoras apropiadas) puede ser utilizada para la puesta en práctica de esta invención.

El vector recombinante de la invención puede ser un vector viral o un vector no viral. La elección del vector dependerá del sistema de expresión en el que se va a introducir posteriormente. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de vectores virales que pueden incluir el ácido nucleico de la invención incluyen, por ejemplo, todos los que permiten hacer "phage display" [Rhyner et al. "Cloning allergens via phage display". Methods. 2004, 32(3):212- 218.]. Otros ejemplos de vectores virales incluyen vectores basados en el virus del mosaico del tabaco (TMV) y en el virus X de patata (PVX) [Wagner et al. "Plant virus expression systems for transient production of recombinant allergens in Nicotiana benthamiana", Methods. 2004, 32(3):227-234]. Asimismo, quedan incluidos entre los vectores virales los vectores apropiados para la expresión en sistemas eucariotas, por ejemplo, los vectores adenovirales, etc., y los vectores de expresión basados en baculovirus.

Entre los vectores no virales se pueden citar los vectores bacterianos, de los que existen numerosos ejemplos, incluyendo cualquier plásmido (de expresión o no) descrito para bacterias (E. coli, Bacillus sp., etc.) o sus modificaciones, etc. Ejemplos adicionales de vectores no virales incluyen plásmidos para levaduras (Pichia sp., Saccharomyces sp.,

etc.), vectores para expresión en plantas, vectores para expresión en animales, por ejemplo, en mamíferos, tales como ratones, ratas, vacas, ovejas, cabras, etc.

En una realización particular, dichos vectores pueden derivar de vectores de expresión comerciales comercializados por Promega (e.g., plásmidos PinPoint Xa, etc.), Invitrogen (e.g., plásmidos del sistema Gateway, etc.), Amersham (e.g., plásmidos pGEX, etc.), Ingenius (e.g., pINK vector, etc.), Sigma (e.g., BICEP vectors, etc.), etc.

El vector recombinante proporcionado por esta invención puede obtenerse por métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia descritos, por ejemplo, por Sambrook et al. [Molecular Cloning. A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor, NY, 1989].

En otro aspecto, la invención se relaciona con un sistema de expresión, en adelante sistema de expresión de la invención, que comprende un ácido nucleico de la invención, o una construcción génica de la invención, o bien un vector recombinante de la invención. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de sistemas de expresión de la invención incluyen tanto sistemas procarióticos como eucarióticos, tales como bacterias, levaduras, cultivos de células de animales (e.g., mamíferos, insectos, etc.), cultivos de células vegetales, animales transgénicos, plantas transgénicas, etc. tanto comerciales como no comerciales [Fernandez & Hoeffler JP: "Gene expression systems" Academic Press. ISBN:0~12-253840-4-1999; 480 pp]. En una realización particular, el sistema de expresión de la invención es un sistema recombinante de expresión. Existen sistemas completos de expresión de productos recombinantes que comprende un vector o un juego de vectores con distintas pautas de lectura junto con un sistema cromatográfico de purificación del producto recombinante, un sistema de eliminación del "tag", un sistema de detección y unos accesorios, tales como células para transformar, oligos específicos para secuenciar, etc., que pueden ser comerciales o no comerciales. Entre los sistemas comerciales se pueden citar los comercializados por Promega (e.g., sistema PinPoint, etc.), Invitrogen (e.g., sistema Gateway, etc.), QIAGEN (e.g., sistema QIAexpress, etc.), Amersham (e.g., plásmidos pGEX, etc.), Ingenius (e.g., pINK system, etc.), Sigma (e.g., FLAG, etc.), etc. Información sobre sistemas no comerciales puede encontrarse en la revista "Protein Expression and Purification".

En otra realización particular, el sistema de expresión de la invención es un sistema de expresión in vitro de ARN mensajeros, es decir, sistemas de traducción in vitro tanto en sistemas procariotas como eucariotas. Aunque, en general, se tiende a usar sistemas eucariotas para traducir proteínas eucariotas, no se descarta el uso de sistemas procariotas. Existen sistemas de expresión in vitro de ARN mensajeros comerciales y no comerciales. Entre los sistemas comerciales se pueden citar los sistemas comercializados por Promega (e.g., sistemas basados en extractos de germen de trigo con o sin sistemas acoplados de transcripción o Usados de reticulocitos de conejo, igualmente acoplados o no a sistemas de transcripción -TNT systems en el caso de Promega-). A esos sistemas habría que unirle la posibilidad de realizar modificaciones post-traduccionales, tales como glicosidación (Ole e 1 es una proteína glicosilada), mediante el empleo de sistemas convencionales, por ejemplo, mediante la utilización de sistemas de membranas microsomales pancreáticas caninas, etc.

En una realización concreta, el sistema de expresión de la invención es una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico de la invención o una construcción génica de la invención o un vector recombinante de la invención. La introducción en dicha célula hospedadora de dicho ácido nucleico, construcción génica o vector recombinante de la invención puede llevarse a cabo por cualquier medio apropiado, conocido por los expertos en la materia, de transferencia de material genético. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichas células hospedadoras incluyen tanto células procariotas como eucariotas, tales como bacterias y levaduras, por ejemplo, E. coli, Bacillus sp., por ejemplo, B. subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. brevis, B. megaterium, etc.), Caulobacter sp., Pichia pastoris, Pichia methanolica, Saccharomyces cerevisiae, S. pombe, etc., líneas celulares de animales, tales como líneas celulares de mamíferos, por ejemplo, líneas celulares epiteliales (porcinas, etc.), líneas celulares de osteosarcoma (humanas, etc.), líneas celulares de neuroblastoma (humanas, etc.), carcinomas epiteliales (humanos, etc.), células gliales (murinas, etc.), líneas celulares hepáticas (de mono, etc.), líneas celulares de insectos, por ejemplo, las líneas celulares S2 y S3 de Drosophüa melanogaster, D. immigrans, D. hydei, D. virilis, etc., células de animales transgénicos (e.g., ratón, cabra, cerdo, oveja, vaca, etc.), células vegetales, células de plantas transgénicas (e.g., tabaco, A. thaliana, algodón, Brassica, patata, arroz, etc.), etc.

El sistema de expresión de la invención puede obtenerse por métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia descritos, por ejemplo, por Sambrook et al. [Molecular Cloning. A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor, NY, 1989].

B. Papudos, variantes y procedimientos para su obtención

En otro aspecto, la invención se relaciona con un péptido, en adelante péptido de la invención, que comprende, al menos, un epítopo del alérgeno Ole e 1 o del alérgeno Ole e 2 de polen de olivo de una variedad definida de olivo {Olea europaea L.), en donde dicho péptido tiene la secuencia de aminoácidos correspondiente a la expresión de la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico de la invención. Dicho término "péptido de la invención" también incluye variantes de los mismos, es decir, péptidos con actividad alergénica que comprenden, al menos, un epítopo alergénico del alérgeno Ole e 1 o del alérgeno Ole e 2 de polen de olivo de una variedad definida de olivo pero que presentan ^* una afinidad de unión a IgE igual, superior, inferior o nula respecto al alérgeno Ole e 1 o al alérgeno Ole e 2 natural específico de la variedad definida de olivo en cuestión. Dichas variantes se definirán más adelante.

El péptido de la invención es un péptido con actividad alergénica que comprende, al menos, un epítopo alergénico del alérgeno Ole e 1 o del alérgeno Ole e 2 de polen de olivo de una variedad definida de olivo. Adicionalmente, el péptido de la invención puede contener una región responsable de la unión a células T y/o B, o una región responsable de la unión a IgE, IgG, o una región responsable de la modulación de la unión a la IgE o IgG, tal como se ha mencionado previamente.

En una realización particular, dicha variedad definida de olivo se selecciona entre las variedades denominadas Picholine, Menara, Lucio, Picual, Loaime, Hojiblanca,

Arbequina, Bella de España, Lechín de Sevilla, Verdial de Vélez-Málaga, Verdial de

Huevar, Picudo, Manzanilla de Sevilla, Cornicabra, Blanqueta, Empeltre, Farga, Frantoio,

Galega, Leccino, Lechín de Granada, Morrut, Sevillenca, Sourani, Villalonga y Acebuche.

En otra realización particular, el péptido de la invención comprende, o está constituido por, una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las secuencias identificadas como SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30,

SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 y un fragmento de las mismas. Dichas secuencias aminoacídicas corresponden a las secuencias de aminoácidos del alérgeno Ole e 1 de las variedades Picholine (SEQ ID NO: 27-29), Menara (SEQ ID NO: 30-32), Lucio (SEQ ID NO: 33-35), Picual (SEQ ID NO: 36-38), Loaime (SEQ ID NO: 39-41), Hojiblanca (SEQ ID NO: 42-44), Arbequina (SEQ ID NO: 45-47) y Bella de España (SEQ ID NO: 48-50), clones 1, 2 y 3 en todos los casos. En otra realización particular, el péptido de la invención comprende, o está constituido por, una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las secuencias identificadas como SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150; SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 212 y un fragmento de las mismas. Dichas secuencias aminoacídicas corresponden a las secuencias de aminoácidos del alérgeno Ole e 2 de las variedades Lechín de Sevilla (SEQ ID NO: 133-136), Verdial de Vélez-Málaga (SEQ ID NO: 137-140), Hojiblanca (SEQ ID NO: 141-144), Verdial de Huevar (SEQ ID NO: 145-149), Picudo (SEQ ID NO: 150-153),

Manzanilla de Sevilla (SEQ ID NO: 154-157), Arbequina (SEQ ID NO: 158-161), Cornicabra (SEQ ID NO: 162-165), Blanqueta (SEQ ID NO: 166-169), Loaime (SEQ ID NO: 170-172), Lucio (SEQ ID NO: 173-176), Bella de España (SEQ ID NO: 177-178), Empeltre (SEQ ID NO: 179-181), Farga (SEQ ID NO: 182-184), Frantoio (SEQ ID NO: 185-186), Galega (SEQ ID NO: 187), Leccino (SEQ ID NO: 188-190), Lechín de Granada (SEQ ID NO: 191-192), Morrut (SEQ ID NO: 193-196), Sevillenca (SEQ ID NO: 197- 199), Sourani (SEQ ID NO: 200-202), Villalonga (SEQ ID NO: 203-206), Acebuche (SEQ ID NO: 207-209) y Picual (SEQ ID NO: 210-212), dependiendo de la variedad con 1, 2, 3 ó 4 clones en cada caso. El fragmento peptídico al que se ha hecho referencia previamente tiene actividad alergénica y comprende, al menos, un epítopo alergénico del alérgeno Ole e 1 o del alérgeno Ole e 2 de polen de olivo de una variedad definida de olivo. Adicionalmente, dicho fragmento peptídico puede contener una región responsable de la unión a células T y/o B o una región responsable de la unión a IgE, IgG, o una región responsable de la modulación de la unión a la IgE o IgG, tal como se ha mencionado previamente.

Los péptidos de la invención pueden obtenerse por métodos convencionales, preferentemente, por métodos recombinantes, salvo en el caso de fragmentos peptídicos de corta longitud, en cuyo caso, dichos fragmentos pueden obtenerse por síntesis química.

Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para la producción de un péptido de la invención que comprende la expresión de la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico de la invención, contenido en un sistema de expresión de la invención, bajo condiciones que permiten la expresión de dicha secuencia de nucleótidos y la producción de dicho péptido de la invención, y, si se desea, aislar y, opcionalmente, purificar dicho péptido de la invención. En una realización particular, dicho péptido de la invención comprende, o está constituido por, una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las secuencias identificadas como SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 ^' y un fragmento de

las mismas. Dichos péptidos constituyen el producto de expresión de SEQ ID NO: 1-24, respectivamente, o de un fragmento de las mismas.

En otra realización particular, dicho péptido de la invención comprende, o está constituido por, una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las secuencias identificadas como SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150; SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 161 , SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 212 y un fragmento de las mismas. Dichos péptidos constituyen el producto de expresión de SEQ ID NO: 53-132 respectivamente o de un fragmento de las mismas.

En otra realización particular, el péptido de la invención es una variante de un péptido de la invención. Dicha variante tiene actividad alergénica y comprende, al menos, un epítopo alergénico del alérgeno Ole e 1 o del alérgeno Ole e 2 de polen de olivo de una variedad definida de olivo, al igual que los péptidos de la invención, pero presentan una afinidad de unión a IgE igual, superior, inferior o nula respecto al alérgeno Ole e 1 o al alérgeno Ole e 2 natural específico de la variedad definida de olivo en cuestión. En una realización concreta, dicha variante comprende, respecto a la secuencia aminoacídica del péptido natural, una modificación que afecta a:

(i) al menos, una de las regiones de inmunogenicidad elevada del alérgeno Ole e 1 o del alérgeno Ole e 2; dichas regiones de inmunogenicidad elevada pueden ser establecidas en base a predicciones realizadas por los programas del tipo de Epiplot [Menéndez- Arias & Rodríguez R. 1990. "A BASIC microcomputer program for prediction of B and T cell epitopes in proteins". Comput. Appl.

Biosci. 6(2): 101 -5] o PeptideSelect Design Tool [Invitrogen: https://peptideselect.invi troRen.com/peptide/] las cuales han puesto de manifiesto la existencia de cuatro regiones de immunogenicidad elevada en el alérgeno Ole e I ₅ [en los péptidos de la invención que comprenden, o están constituidos por, cualquiera de las SEQ ID NO: 27-50, se ha observado la existencia de 4 picos de antigenicidad teórica (identificados como picos Al, A2, A3 y A4 en la Tabla IA)], y de 8 regiones en el alérgeno Ole e 2 [en los péptidos de la región que comprenden, o están constituidos por, cualquiera de las SEQ ID NO: 133-212, se ha observado la existencia de 8 picos de antigenicidad teórica (identificados como picos Al, A2, A3, A4, A5, A6, A7 y

A8 en la Tabla 2A]. Aparte de las predicciones teóricas mencionadas, existe un estudio que ha definido experimentalmente regiones inmunodominantes IgE e IgG en una secuencia concreta de Ole e 1 de polen de olivo [González et al. "Análisis og IgE and IgG B-cell immunodominant regions of Ole e 1, the main allergen from olive pollen" Mol. Immunol. 43:570-578. 2006]. La Tabla IB muestra la distribución de dichas regiones inmunodominantes en las secuencias SEQ ID NO: 27-50. Igualmente, existe un estudio que ha definido experimentalmente regiones inmunodominantes IgG e IgE en una secuencia concreta de profilina de girasol [Asturias et al., "Molecular and structural analysis of the panallergen profilin B cell epitopes defined by monoclonal antibodies" ínter. Immunol. 2002, 14: 993-1001]. La Tabla 2B muestra la distribución de dichas regiones inmunodominantes en las secuencias SEQ ID NO: 133-212; o a

(ii) al menos, una de las regiones definidas como epítopos inmunodominantes de Ole e 1 responsables de la unión a células T [Cardaba et al. "Olive pollen allergy: searching for inmmunodominant T-cell epitopes on the Ole e 1 molecule". Clin. Exper. Allergy 28:413-422. 1998]; estas regiones

corresponden a las posiciones 91-102, 109-120 y 119-130 de la secuencia aminoacídica de Ole e 1 definida por Villalba et al. [Villalba M, Batanero E, López-Otín et al. 'The amino acid sequence of Ole e 1 , the major allergen from olive tree (Olea europaea) pollen". Eur. J. Biochem. 216:863-869 (1993)] (véase la Figura 1); en los péptidos de la invención que comprenden, o están constituidos por, cualquiera de las SEQ ID NO: 27-50, se ha observado la existencia de 3 epítopos inmunodominantes de unión a células T (identificados como epítopos a, b y c en la Tabla 3); o a

(iii) al menos, una de las regiones predi chas como residuos de anclaje para los alelos MHC de clase II más comunes mediante algoritmos de predicción del tipo de

TEPITOPE [Burastero et al. (2004) "T-cell receptor mediated cross- allergenicity" Int Arch Allergy Immunol 135: 296-305]. Estas regiones corresponden a las posiciones 29V, 45F, 531, 68L, 85V y 951 de la secuencia aminoacídica de Ole e 2 con número dé acceso GenBank Yl 2425 (véase Figura 2); en los péptidos de la invención que comprenden, o están constituidos por, cualquiera de las SEQ ID NO: 133-212, se ha observado la existencia de 6 residuos de anclaje, identificados con las denominaciones mencionadas (29V,

45F, 531, 68L, 85V y 951) en la Tabla 4; o a

(iv) al menos, una secuencia que afecta a la integridad de los puentes disulfuro presentes en el péptido de la invención, es decir, una modificación que afecta a, al menos, una región codificante de una cisteína implicada en la formación de un puente disulfuro presente en los péptidos de la invención, ya que, como es conocido, la capacidad de unión de IgEs e IgGs humanos a Ole e 1 es fuertemente dependiente de la integridad de dichos puentes disulfuro [González et al. "Influence of the 3D-conformation, glycan component and microheterogeneity on the epitope structure of Ole e 1, the major olive allergen.

Use of recombinant isoforms and specific monoclonal antibodies as immunological tools". Mol Immunol. 2002; 39(l-2):93-101]; las regiones codificantes de cisteína implicadas en la formación de puentes disulfuro presentes en los péptidos de la invención que comprenden, o están constituidos por, cualquiera de las SEQ ID NO: 27-50, se recogen en la Tabla 5; o a

(v) al menos, una secuencia que afecta a la integridad de los puentes disulfuro presentes en el péptido de la invención, es decir, una modificación que afecta a, al menos, una región codificante de una cisteína implicada potencialmente en la formación de un puente disulfuro presente en los péptidos de la invención, ya que, como es conocido, la capacidad de unión de IgEs e IgGs humanos a una proteína puede ser fuertemente dependiente de la integridad de dichos puentes disulfuro, y por tanto de la estructura tridimensional de dicha proteína; las regiones codificantes de cisteína implicadas potencialmente en la formación de puentes disulfuro presentes en los péptidos de la invención que comprenden, o están constituidos por, cualquiera de las SEQ ID NO: 133-212, se recogen en la

Tabla 6; o a

(vi) la adición o eliminación de lugares o secuencias de glicosilación potencial, ya que se ha demostrado que el componente glicosídico de Ole e 1 es reconocido por diversos anticuerpos monoclonales, así como por IgGs e IgEs humanos, modulando, por tanto, su carácter alergénico [Batanero et al. "Glycosylation site of the major allergen from olive tree. Allergenic implications of the carbohydrate moiety". Mol. Immunol. 1994; 31 : 31-37; Batanero et al. "IgE binding and histamine-release capabilities of the main carbohydrate component isolated from the major allergen of olive tree pollen". J. Allergy Clin. Immunol. 1999; 103:147-153; González et al. "Infmence of the 3D-conformation, glycan component and microheterogeneity on the epitope structure of Ole e 1, the major olive allergen. Use of recombinant isoforms and specific monoclonal antibodies as immunological tools". Mol Immunol. 2002; 39(l-2):93-101]; las regiones implicadas en la N-glicosilación potencial presentes en los péptidos de la invención que comprenden, o están constituidos por, cualquiera de las SEQ

ID NO: 27-50, se recogen en la Tabla 7; asimismo, entre dichos péptidos, los correspondientes a la variedad Bella de España (SEQ ID NO: 48-50) poseen en su posición 37/38 una secuencia extra de glicosilación. Los extractos crudos de polen de esta variedad presentan una banda adicional, de aproximadamente 19,2 kDa correspondiente a una forma de Ole e 1, que es reconocida por

Concanavalina A; o a

(vii) la adición de lugares o secuencias de glicosilación potencial, ya que se ha demostrado que el componente glicosídico de algunos alérgenos como Ole e 1 es reconocido por diversos anticuerpos monoclonales, así como por IgGs e IgEs humanos, modulando, por tanto, su carácter alergénico [Batanero et al. "Glycosylation site of the major allergen from olive tree. Allergenic implications of the carbohydrate moiety". Mol. Immunol. 1994; 31 : 31-37; Batanero et al. "IgE binding and histamine-release capabilities of the main carbohydrate component isolated from the major allergen of olive tree pollen". J. AUergy Clin. Immunol. 1999; 103:147-153; González et al. "Influence of the 3D-conformation, glycan component and microheterogeneity on the epitope structure of Ole e 1, the major olive allergen. Use of recombinant isoforms and specific monoclonal antibodies as immunological tools". Mol Immunol. 2002; 39(l-2):93-101]; como se recoge en la Tabla 8, no aparecen regiones implicadas en la N-glicosilación potencial en ninguna de los péptidos de SEQ ID NO: 133-212.

A modo ilustrativo, no limitativo, en una realización particular: las regiones de inmunogenicidad elevada de Ole e 1 se seleccionan entre (las posiciones se citan entre paréntesis) VRLQCK (26-31), LVERDH (55-60), LIERDH (55-60), WAKPSL (85-90), WVKPSL (85-90) y KKEALP (111- 116); I (70), MLNT (107-110) y

TRTINPLGFFKKEALPKCPQVFNKLGMYPPDM (114-145), las regiones definidas como epítopos inmunodominantes de Ole e 1 responsables de la unión a células T y B se seleccionan entre (las posiciones se citan entre paréntesis) NEIPTEGWAKPS (78-89), DEIPTEGWAKPS (78- 89), DEIPTEGWVKPS (78-89), TVNGTTRTVNPL (96-107),

TVNGTTRTINPL (96-107) y PLGFFKKEALPK (106-1 17); las regiones de inmunogenicidad elevada de Ole e 2 se seleccionan entre (las posiciones se citan entre paréntesis) MLWQAYV(I -7), MSWQGYV(I -7), MSWQTYV(l-7), MSWQSYVO-7), MSWHAYV(l-7), AYVDDH(5-10), GYVDDH(5-10), TYVDDH(5-10), SYVDDH(5-10), DIEGHEDHRLTA

(14-25), DIEGHEGHRLTA(14-25), DIEDHEGHRLTA(14-25),

ELEGNPGHHLSA(14-25), DIEGPEDHRLTA(14-25),

DIEGHEGHRLIA(14,25), AQSATFPQFKPEEM(36-49),

AQS ATFPQFKPVEM(36-49), AQSSAFPQFKPEEI(36-49),

AQSATSPQFKPEEM(36-49), FKPEE(45-59), VKPEE(45-49), DFNEPGHLAPTGLHLG(56-71), DFNAPGHLAPTGLHLG(56-71),

DFSEPGHLAPTGLHLG(56-71 ), DSNEPGHLAPTGLHLG(56-71 ),

QGE(79-81), AGE(79-81), IRGKKGS(86-92), IRGKKGA(86-92), TRGKKGS(86-92), VRGKKGS(86-92), TKKTG(79-101), IKKTG(79-101), SKKTG(79-101), IKETG(79-101), GQALVFGIyE(100- 109) GQALVCGIYE(100-109), GQALVFGIYK(100-109),

GQALVCGIYK(100- 109), EPVTPG(111-116), ESVAPG(111-116) EPVAPG(111-116), YEESVTPG(108-115), YKEPVTPG(108-115), YEEPVAPG(108- 115), ERLGDY(122- 127), GRLGDY(122-127),

KRLGDY(122- 127), ERLEDY(122- 127) y EGLGDY(122- 127); - las regiones definidas como epítopos inmunodominantes de Ole e 2 responsables de la unión a células T y B se seleccionan entre aquellas que se anclan en las posiciones V (29), 45F (45), I (53), T (53), L (68), V(85) y I (95); la modificación que afecta a dicha secuencia que afecta a la integridad de los puentes disulfuro es una modificación que afecta a una región codificante de una cisterna implicada en la formación de un puente disulfuro presente en dicho péptido; y las secuencias de N-glicosilación potencial se seleccionan entre NGT y NVT.

Las variantes de los péptidos de la invención pueden obtenerse mediante métodos convencionales, por ejemplo, mediante mutagénesis, e.g., mutación puntual, inserción o deleción de secuencias o truncamiento de un péptido de la invención. Por tanto, la invención también se relaciona con un método para producir una variante de un péptido de la invención que comprende alterar la secuencia de dicho péptido de la invención, por ejemplo, mediante adición, sustitución o deleción de uno o más residuos de cualquiera de las regiones previamente mencionadas [e.g., regiones de inmunogenicidad elevada del alérgeno Ole e 1 o del alérgeno Ole e 2, regiones definidas como epítopos

inmunodominantes de Ole e 1 responsables de la unión a células T y B, o de Ole e 2 responsables de la unión a células T y B, regiones que afectan a la integridad de los puentes disulfuro presentes en el péptido de la invención, modificación de los lugares o secuencias de glicosilación potencial, etc.] y ensayar el péptido alterado (variante) para analizar su actividad.

Aunque resulta difícil conocer de antemano si una modificación determinada en un péptido de la invención va a dar lugar a una variante del mismo con una afinidad de unión a IgE mayor o menor que la del péptido de la invención natural, o si dicha modificación anularía la unión a IgE, se puede realizar una aproximación teórica consistente en determinar los perfiles de antigenicidad de los péptidos de la invención. Esta aproximación ha sido realizada por los inventores en relación con los péptidos de la invención que comprenden, o están constituidos por, cualquiera de las SEQ ID NO: 27-50 observándose que, en todos ellos, aparecen 4 picos de antigenicidad teórica (Tabla 1) que supondrían sitios probables de unión a anticuerpos (aunque no es detenninable si serían IgGs o IgEs). Asimismo, se ha observado que dichos péptidos (SEQ ID NO: 27-50) presentan polimorfismos en dos de esas regiones de antigenicidad (picos A2 y A3). Se ha descrito el mapeo epitópico de la proteína Ole e 1 de polen de olivo con anticuerpos monoclonales [Martín-Orozco et al. "Ole e I: epitope mapping, cross-reactivity with other Oleaceae pollens and ultrastructural localization". Int. Arch. Allergy ímmunol. 1994; 104:160-170; González et al. "Influence of the 3D-conformation, glycan component and microheterogeneity on the epitope structure of Ole e 1, the major olive allergen. Use of recombinant isoforms and specific monoclonal antibodies as immunological tools". Mol ímmunol. 2002; 39(l-2):93-101 y González et al. "Análisis og IgE and IgG B-cell immunodominant regions of Ole e 1, the main allergen from olive pollen" Mol. ímmunol. 43:570-578. 2006]. Dichos trabajos muestran que hay unos 11 residuos o regiones epitópicas relevantes en la unión a IgG, y 6 relevantes en la unión a IgE. En algunos de ellos podría haber una coincidencia parcial entre algunos de esos epítopos IgG con epítopos IgE.

Una aproximación similar ha sido realizada por los inventores en relación con los péptidos de la invención que comprenden, o están constituidos por, cualquiera de las SEQ

ID NO: 133-212 observándose que, en todos ellos, aparecen 8 picos de antigenicidad teórica (Tabla 2A) que supondrían sitios probables de unión a anticuerpos. Asimismo, se

ha observado que dichos péptidos (SEQ ID NO: 133-212) presentan polimorfismos en todas esas regiones de antigenicidad (picos A1-A8). Se ha realizado un análisis estructural y molecular de los epítopos de células B en profilinas mediante anticuerpos monoclonales [Asturias et al. (2002) "Molecular and structural analysis of the parallergen profilin b cell epitopes defined by monoclonal antibodies" ínter Immunol 14: 993-1001], así como un análisis predi ctivo de epítopos para células T en profilinas [Burastero et al. (2004) "T-cell receptor mediated cross-allergenicity" Int Arch Allergy Immunol 135: 296-305]. Dichos trabajos muestran que hay 5 regiones de unión a anticuerpos IgG e IgE en la secuencias de diversas profilinas, denominadas 10A4 (1-7), 3H8(122-127), 5F2(36-49), 9G4(108-115) y 9A7(100-109), así como 6 residuos de probable anclaje para los alelos más comunes de clase MHC (predicción realizada mediante el software TEPITOPE), que coinciden con las posiciones 29V, 45F, 531, 68L, 85V y 951 de las secuencias de profilinas. Los péptidos (SEQ ID NO: 133-212) presentan polimorfismos en todas las regiones de antigenicidad descritas 10A4 (1-7), 3H8(122-127), 5F2(36-49), 9G4(108-115) y 9A7(100-109). Estudios realizados por los inventores para el alérgeno Ole e 1 y el alérgeno Ole e 2 han permitido establecer para las secuencias SEQ ID NO: 27-50 y SEQ ID NO: 133-212, respectivamente:

(i) las regiones que representan picos de alergenicidad predictiva elevada (Tablas IA y 2A), (ii) las regiones que representan residuos inmunodominantes de unión a IgG e

IgE determinadas experimentalmente (Tablas IB y 2B),

(iii) las regiones que definen epítopos inmunodominantes de unión a células T para Ole e 1 determinadas experimentalmente (Tabla 3) o a células T para Ole e 2 de forma predictiva (Tabla 4), (iv) las regiones codificantes de cisteínas implicadas potencialmente en la formación de puentes disulfuro (Tablas 5 y 6 para Ole e 1 y Ole e 2, respectivamente), y

(v) las regiones implicadas en la N-glicosilación potencial (Tablas 7 y 8 para

Ole e 1 y Ole e 2, respectivamente).

Tabla IA Regiones de Ole e 1 que representan picos de alergenicidad predictiva elevada

SEQlD NO: Pico A1 Pico A2 PicoA3 Pico A4

27 VRLQCK (26-31) LVERDH (55-60) WAKPSL (85-90) KKEALP (111-116) 28 VRLQCK (26-31) LVERDH (55-60) WAKPSL (85-90) KKEALP (111-116) 29 VRLQCK (26-31) LVERDH (55-60) WAKPSL (85-90) KKEALP (111-116) 30 VRLQCK (26-31) LVERDH (55-60) WAKPSL (85-90) KKEALP (111-116) 31 VRLQCK (26-31) LVERDH (55-60) WAKPSL (85-90) KKEALP (111-116) 32 VRLQCK (26-31) LVERDH (55-60) WAKPSL (85-90) KKEALP (111-116) 33 VRLQCK (26-31) LVERDH (55-60) WAKPSL (85-90) KKEALP (111-116) 34 VRLQCK (26-31) LVERDH (55-60) WAKPSL (85-90) KKEALP (111-116) 35 VRLQCK (26-31) LVERDH (55-60) WAKPSL (85-90) KKEALP (111-116) 36 VRLQCK (25-30) LVERDH (54-59) WAKPSL (84-89) KKEALP (110-115) 37 VRLQCK (26-31) LVERDH (55-60) WAKPSL (85-90) KKEALP (111-116) 38 VRLQCK (26-31) LVERDH (55-60) WAKPSL (85-90) KKEALP (111-116) 39 VRLQCK (26-31) LVERDH (54-59) WAKPSL (84-89) KKEALP (111-116) 40 VRLQCK (26-31) LVERDH (55-60) WAKPSL (85-90) KKEALP (111-116) 41 VRLQCK (26-31) LVERDH (55-60) WAKPSL (85-90) KKEALP (111-116) 42 VRLQCK (23-28) LVERDH (52-57) WVKPSL (82-87) KKEALP (108-113) 43 VRLQCK (23-28) LVERDH (52-57) WVKPSL (82-87) KKEALP (108-113) 44 VRLQCK (23-28) LVERDH (52-57) WVKPSL (82-87) KKEALP (108-113) 45 VRLQCK (25-30) LVERDH (54-59) WVKPSL (84-89) KKEALP (110-115) 46 VRLQCK (25-30) LVERDH (54-59) WVKPSL (84-89) KKEALP (110-115) 47 VRLQCK (25-30) LVERDH (54-59) WVKPSL (84-89) KKEALP (110-115) 48 VRLQCK (26-31) LIERDH (55-60) WVKPSL (85-90) KKEALP (111-116) 49 VRLQCK (26-31) LIERDH (55-60) WVKPSL (85-90) KKEALP (111-116) 50 VRLQCK (25-30) LIERDH (54-59) WVKPSL (84-89) KKEALP (110-115)

Las modificaciones observadas en las SEQ ID NO: 27-50 sobre la secuencia aminoacídica de Ole e 1 (GenBank X76295) definida por Villalba et al. [Villalba M, Batanero E, López-Otín et al. "The amino acid sequence of Ole e 1, the major allergen from olive tree (Olea europaea) poli en". Eur. J. Biochem. 216:863-869 (1993)] se muestran resaltadas en negrita.

Tabla IB

Regiones de Ole e 1 antigénicamente relevantes [González et al. "Análisis og IgE and IgG B-cell immunodominant regions of Ole e

1, the main allergen from olive pollen" Mol. Immunol. 43:570-578. 2006]

SEQ 8- 29 32 33 55-59 70 107-110 112 120 T114-M145 L138 G139 Y141 P142

ID 11 NO:

27 - E E F TEVGY V ILNT N F Y TRTVNPLGFFKKEALPKCA K G

QVYNKLGMYPPNM

28 - E E F TEVGY V ILNT N F Y TRTVNPLGFFKKEALPKCA K G

QVYNKLGMYPPNM

29 - E E F TEVGY V ILNT N F Y TRTVNPLGFFKKEALPKCA K G

QVYNKLGMYPPNM

30 - E E F TEVGY V ILNT N F Y TRTVNPLGFFKKEALPKCA K Y

QVYNKLGMYPPNM

31 - E E F TEVGY V ILNT N F Y TRTVNPLGFFKKEALPKCA K Y

QVYNKLGMYPPNM

32 - E E F TEVGY V ILNT N F Y TRTVNPLGFFKKEALPKCA K

QVYNKLGMYPPNM

33 - E E F TEVGY V ILNT N P F Y TRTVNPLGFFKKEALPKCA K

QVYNKLGMYPPNM

34 - E E F TEVGY V ILNT N P F Y TRTVNPLGFFKKEALPKCA K

QVYNKLGMYPPNM

35 - E E F TEVGY V ILNT N F Y TRTVNPLGFFKKEALPKCA K G

QVYNKLGMYPPNM

36 - E E F TEVGY V ILNT N F Y TRTVNPLGFFKKEALPKCA K G

QVYNKLGMYPPNM

37 - E E F TEVGY V ILNT N F Y TRTVNPLGFFKKEALPKCA K

QVYNKLGMYPPNM

38 - E E F TEVGY V ILNT N F Y TRTVNPLGFFKKEALPKCA K

QVYNKLGMYPPNM

39 - E E F TEVGY V ILNT F Y TRTINPLGFFKKEALPKCAQ K

VYNKLGMYPPNM

₄ 0 - E E F TEVGY V ILNT F Y TRTINPLGFFKKEALPKCAQ K

VYNKLGMYPPNM

41 - E E F TEVGY V ILNT F Y TRTINPLGFFKKEALPKCAQ K

VYNKLGMYPPNM

42 - E E F TEVGY V ILNT F Y TRTVNPLGFFKKEALPKCA K

QVYNKLGMYPPNM

43 - E E F TEVGY V ILNT F Y TRTVNPLGFFKKEALPKCA K

QVYNKLGMYPPNM

44 - E E F TEVGY V ILNT F Y TRTVNPLGFFKKEALPKCA K

QVYNKLGMYPPNM

45 - E E F TEVGY V ILNT F Y TRTVNPLGFFKKEALPKCA K

QVYNKLGMYPPNM

46 - E E F TEVGY V ILNT F Y TRTVNPLGFFKKEALPKCA K o

QVYNKLGMYPPNM

47 - E E F TEVGY V ILNT F Y TRTVNPLGFFKKEALPKCA K

QVYNKLGMYPPNM

48 - E E F TEVGY I WILNT N F Y TRTINPLGFFKKEALPKCPQ K

VFNKLGMYPPDM

49 - E E F TEVGY I WILNT F Y TRTVNPLGFFKKEALPKCP K

QVFNKLGMYPPDM

50 - E E F TEVGY I WlLNT F Y TRTVNPLGFFKKEALPKCP K G

QVFNKLGMYPPDM

Las modificaciones observadas en las SEQ ID NO: 27-50 sobre la secuencia aminoacídica de Ole e 1 (GenBank X76295) definida por Villalba et al. [Villalba M, Batanero E, López-Otín et al. "The amino acid sequence of Ole e 1, the major allergen from olive tree (Olea europaea) pollen". Eur. J. Biochem. 216:863-869 (1993)] se muestran resaltadas en negrita.

Tabla 2A

Regiones de Ole e 2 que representan picos de alergenicidad predictiva elevada

SEC lD Pico Al Pico A2 (14-25) Pico Pico A4(56-71) Pico A5 Pico A6 Pico A7 Pico

N ⁰ : (5-10) A3(45-49) (79-81) (86-92) (79-101) A8(111-116)

133 AYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

134 AYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

135 GYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

136 AYVDDH DIEGHEDHRLTA VKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

137 TYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE TRGKKGS IKKTG EPVTPG

138 AYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

139 TYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

140 SYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNAPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

141 AYVDDH DIEDHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

142 AYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

143 AYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

144 AYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

145 AYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

146 AYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

147 TYVDDH DIEGHEDHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

148 AYVDDH DIEGHEDHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

149 TYVDDH DIEGHEDHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

150 AYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

151 AYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

152 AYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

153 AYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

154 TYVDDH DIEGHEDHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

155 TYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

156 AYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

157 AYVDDH DIEGHEDHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

158 TYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

159 AYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

160 AYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

161 AYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

162 AYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

163 TYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

164 AYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

165 AYVDDH DIEGHEDHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

166 AYVDDH DIEGHEDHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

167 TYVDDH ELEGNPGHHLSA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG AGE IRGKKGA IKKTG EPVTPG

168 AYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

169 TYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

170 AYVDDH DIEGHEDHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

171 AYVDDH DIEGHEDHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

172 AYVDDH DIEGHEDHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

173 AYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

174 TYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

175 AYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

176 AYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

177 AYVDDH DIEGPEDHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE VRGKKGS IKKTG EPVTPG

178 AYVDDH DIEGHEDHRLTA FKPEE DFSEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

179 AYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

180 AYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

181 AYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

182 AYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

183 AYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

184 AYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

185 TYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

186 AYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

187 AYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS TKKTG EPVTPG

188 AYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

189 TYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

190 TYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

191 AYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

192 TYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

193 AYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

194 AYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS SKKTG EPVTPG

195 TYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

196 AYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

197 AYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

198 TYVDDH DIEGHEDHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

199 AYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

200 AYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

201 AYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

202 TYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DSNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

203 AYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG ESVTPG

204 AYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKETG EPVTPG

205 AYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVAPG

206 AYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKETG EPVTPG

207 AYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

208 AYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

209 AYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

210 TYVDDH DIEGHEGHRUA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

211 TYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

212 TYVDDH DIEGHEGHRLTA FKPEE DFNEPGHLAPTGLHLG QGE IRGKKGS IKKTG EPVTPG

Se incluyen en negrita las modificaciones observadas en las SEQ ID NO: 133-212 sobre la secuencia aminoacídica de Ole e 2 (Yl 2425) definida por Asturias et al. [Asturias, et al. "Cloning and expression of the panallergen profilin and the major allergen (Ole e l) from olive tree polen. L. Allergy Clin Immunol, 1997, 100: 365-372]

Tabla 2B

Regiones de Ole e 2 que representan regiones de reconocimiento por IgG e IgE

(Asturias et al., "Molecular and structural analysis of the panallergen profílín B cell epitopes defined by monoclonal antibodies" ínter. Immunol. 2002, 14:993-01)

SEQ lD 10A4 5F2 9A7 9G4 3H8

NO:

133 MSWQAYV(I -7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVFGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

134 MLWQA YV(1-7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVFGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

135 MSWQGYV(1-7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVFGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

136 MSWQA YV(1-7) AQSATFPQFKPVEM(36-49) GQALVFGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

137 MSWQTYV(I -7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVFGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-1 15) GRLGDY(122-127)

138 MSWQA YV(1-7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVFGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

139 MSWQTYV(I -7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVFGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

140 MSWQSYV(I -7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVFGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

141 MSWQA YV(1-7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVFGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) KRLGDY(122-127)

142 MSWQAYV(I -7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVFGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

143 MSWQA YV(1-7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVFGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

144 MSWQAYV(1-7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVFGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

145 MLWQAYV(I -7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVFGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

146 MSWQA YV(1-7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVFGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-1 15) ERLGDY(122-127)

147 MSWQTYV(I -7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVFGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

148 MSWQAYV(I -7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVFGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

149 MSWQTYV(1-7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVFGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

150 MSWQA YV(1-7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVCGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLEDY(122-127)

151 MSWQA YV(1-7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVFGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

152 MSWQA YV(1-7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVCGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

153 MSWQAYV(I -7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVFGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

154 MSWQTYV(I -7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVFGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

155 MSWQTYV(I -7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVFGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

156 MSWQA YV(1-7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVFGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

157 MSWQA YV(1-7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVFGIYK(100-109) YKEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

158 MSWQTYV(I -7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVCGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

159 MSWQAYV(I -7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVCGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

160 MSWHAYV(I -7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVFGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

161 MSWQA YV(1-7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVFGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

162 MSWQAYV(I -7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVFGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

163 MSWQTYV(1-7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVFGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

164 MSWQAYV(I -7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVCGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

165 MSWQAYV(I -7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVFGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) EGLGDY(122-127)

166 MSWQAYV(I -7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVFGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

167 MSWQTYV(I -7) AQSSAFPQFKPEEI(36-49) GQALVFG!YE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDYf 122-127)

168 MSWQA YV(1-7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVFGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

169 MSWQTYV(1-7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVFGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

170 MSWQAYV(I -7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVFGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

171 MSWQA YV(1-7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVFGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

172 MSWQA YV(1-7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVFGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

173 MSWQAYV(I -7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVFGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

174 MSWQTYV(1-7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVFGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

175 MSWQA YV(1-7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVFGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

176 MSWQAYV(I -7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVFGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

177 MSWQAYV(I -7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVFGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

178 MSWQA YV(1-7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVFGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

179 MSWQA YV(1-7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVFGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

180 MSWQA YV(1-7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVFGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

181 MSWQAYV(1-7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVCGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

182 MSWQA YV(1-7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVFGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

183 MSWQA W(1-7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVCGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

184 MSWQA YV(1-7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVFGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

185 MSWQTYV(I -7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVCGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

186 MSWQAYV(I -7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVFGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

187 MSWQA YV(1-7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVFGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

188 MSWQA YV(1-7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVCGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

189 MSWQTYV(I -7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVCGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

190 MSWQTYV(1-7) AQSATSPQFKPEEM(36-49) GQALVCGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

191 MSWQAYV(I -7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVFGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

192 MSWQTYV(I -7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVFGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) EGLGDY(122-127)

193 MSWQA YV(1-7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVLGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

194 MSWQAYV(I -7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVCGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

195 MSWQTYV(1-7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVCGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

196 MSWQA YV(1-7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVFGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

197 MSWQAYV(1-7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVCGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

198 MSWQTYV(I -7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVCGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

199 MSWQA YV(1-7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVCGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

200 MSWQAYV(I -7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVCGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

201 MSWQA YV(1-7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVCGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

202 MSWQTYV(I -7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVCGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

203 MSWQA YV(1-7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVFGIYE(100-109) YEESVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

204 MLWQAYV(I -7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVCGIYK(100-109) YKEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

205 MSWQAYV(I -7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVFGIYE(100-109) YEEPVAPG(108-115) ERLGDY(122-127)

206 MLWQA YV(1-7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVCGIYK(100-109) YKEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

207 MSWQAYV(I -7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVCGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

208 MSWQAYV(I -7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVCGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

209 MSWQA YV(1-7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVCGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

210 MSWQTYV(1-7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVCGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDYf 122-127)

211 MSWQTYV(I -7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVCGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

212 MSWQTYV(I -7) AQSATFPQFKPEEM(36-49) GQALVCGIYE(100-109) YEEPVTPG(108-115) ERLGDY(122-127)

Se incluyen en negrita las modificaciones observadas en las SEQ ID NO: 133-212 sobre la secuencia aminoacídica de Ole e 2 (Yl 2425) definida por Asturias et al. [Asturias, et al. "Cloning and expression of the panallergen profilin and the major allergen (Ole e 1) from olive tree polen. L. Allergy Clin Immunol, 1997, 100: 365-372]

Tabla 3 Regiones de Ole e 1 que definen epítopos inmunodominantes de unión a células T

SEQ lD NO: Epitopo a Epítopo b Epitopo c

27 NEIPTEGWAKPS (78-89) TVNGTTRTVNPL (96-107) PLGFFKKEALPK (106-117)

28 NEIPTEGWAKPS (78-89) TVNGTTRTVNPL (96-107) PLGFFKKEALPK (106-117)

29 NEIPTEGWAKPS (78-89) TVNGTTRTVNPL (96-107) PLGFFKKEALPK (106-117)

30 NEIPTEGWAKPS (78-89) TVNGTTRTVNPL (96-107) PLGFFKKEALPK (106-117)

31 NEIPTEGWAKPS (78-89) TVNGTTRTVNPL (96-107) PLGFFKKEALPK (106-117)

32 NEIPTEGWAKPS (78-89) TVNGTTRTVNPL (96-107) PLGFFKKEALPK (106-117)

33 NEIPTEGWAKPS (78-89) TVNGTTRTVNPL (96-107) PLGFFKKEALPK (106-117)

34 NEIPTEGWAKPS (78-89) TVNGTTRTVNPL (96-107) PLGFFKKEALPK (106-117)

35 NEIPTEGWAKPS (78-89) TVNGTTRTVNPL (96-107) PLGFFKKEALPK (106-117)

36 DEIPTEGWAKPS (77-88) TVNGTTRTVNPL (95-106) PLGFFKKEALPK (105-116)

37 DEIPTEGWAKPS (78-89) TVNGTTRTVNPL (96-107) PLGFFKKEALPK (106-117)

38 DEIPTEGWAKPS (78-89) TVNGTTRTVNPL (96-107) PLGFFKKEALPK (106-117)

39 DEIPTEGWVKPS (78-89) TVNGTTRTINPL (96-107) PLGFFKKEALPK (106-117)

40 DEIPTEGWVKPS (78-89) TVNGTTRTINPL (96-107) PLGFFKKEALPK (106-117)

41 DEIPTEGWVKPS (78-89) TVNGTTRTINPL (96-107) PLGFFKKEALPK (106-117)

42 DEIPTEGWAKPS (75-86) TVNGTTRTVNPL (93-104) PLGFFKKEALPK (103-114)

43 DEIPTEGWAKPS (75-86) TVNGTTRTVNPL (93-104) PLGFFKKEALPK (103-114)

44 DEIPTEGWAKPS (75-86) TVNGTTRTVNPL (93-104) PLGFFKKEALPK (103-114)

45 DEIPTEGWVKPS (77-88) TVNGTTRTVNPL (95-106) PLGFFKKEALPK (105-116)

46 DEIPTEGWVKPS (77-88) TVNGTTRTVNPL (95-106) PLGFFKKEALPK (105-116)

47 DEIPTEGWVKPS (77-88) TVNGTTRTVNPL (95-106) PLGFFKKEALPK (105-116)

48 DEIPVEGWVKPS (78-89) TVNGTTRTINPL (96-107) PLGFFKKEALPK (106-117)

49 DEIPVEGWVKPS (78-89) TVNGTTRTINPL (96-107) PLGFFKKEALPK (106-117)

50 DEIPVEGWVKPS (77-88 TVNGTTRTINPL (95-106) PLGFFKKEALPK (105-116)

Las modificaciones observadas en las SEQ ID NO: 27-50 sobre la secuencia aminoacídica de Ole e 1 (GenBank X76295) definida por Villalba et al. [Villalba M, Batanero E, López-Otín et a!. "The amino acid sequence of Ole e 1, the major allergen from olive tree (Olea europaea) pollen". Eur. J. Biochem. 216:863-869 (1993)] se muestran resaltadas en negrita.

Tabla 4 Residuos de anclaje para los alelos más comunes de MCH clase II predichos por el algoritmo TEPITOPE para Ole e 2 -Y12425- (Burastero et al. "T-cell receptor mediated cross-allergenicity" Int Arch Allergy Immunol 135:296-305. 2004)

SEQ ID NO: 29V 45F 53I 68L 85V 95I

133 V F I L V I

134 V F L V

135 V F L V

136 V F L V

137 V F L V

138 V F L V

139 V F L V

140 V F L V

141 V F L V

142 V F L V

143 V F L V

144 V F L V

145 V F L V

146 V F I L V

147 V F I L V

148 V F I L V

149 V F I L V

150 V F I L V

151 V F I L V

152 V F I L V

153 V F I L V

154 V F I L V

155 V F I L V

156 V F I L V

157 V F I L V

158 V F I L V

159 V F I L V

160 V F I L V

161 V F I L V

162 V F I L V

163 V F I L V

164 V F I L V

165 V F I L V

166 V F I L V

167 V F I L V

168 V F T L V

169 V F I L V

170 V F I L V

171 V F I L V

172 V F I L V

173 V F I L V

174 V F I L V

175 V F I L V

176 V F I L V

177 V F I L V

178 V F I L V

179 V F I L V

180 V F I L V

181 V F I L V

182 V F I L V

183 V F I L V

184 V F I L V

185 V F I L V

186 V F I L V

187 V F I L V

188 V F I L V

189 V F I L V

190 V F I L V

191 V F I L V

192 V F I L V

193 V F I L V I

194 V F I L V I

195 V F I L V I

196 V F I L V I

197 V F I L V I

198 V F I L V I

199 V F I L V I

200 V F I L V I

201 V F I L V I

202 V F I L V I

203 V F I L V I

204 V F I L V I

205 V F I L V I

206 V F I L V I

207 V F I L V I

208 V F I L V I

209 V F I L V I

210 V F I L V I

211 V F I L V I

212 V F I L V I

Se incluyen las modificaciones observadas en las SEQ ID NO: 133-212 sobre la secuencia aminoacídica de Ole e 2 (Yl 2425) definida por Asturias et al. [Asturias, et al. "Cloning and expression of the panallergen profilin and the major allergen (Ole el) from olive tree polen. L. Allergy Clin Immunol, 1997, 100: 365-372]

Tabla 5 Regiones de Ole e 1 codificantes de Cys implicadas en puentes disulfuro

SEQ ID NO: Cisternas

27 6,9,30,65,77, 118

28 6, 9,30,65,77, 118

29 6,9,30,65,77, 118

30 6,9,30,65,77, 118

31 6,9,30,65,77, 118

32 6,9,30,65,77, 118

33 6,9,30,65,77, 118

34 6,9,30,65,77, 118

35 6, 9,30, 65,77, 118

36 5,8,29,64,76, 117

37 6,9,30,65,77, 118

38 6,9,30,65,77, 118

39 6,9,30,65,77, 118

40 6,9,30,65,77, 118

41 6,9,30,65,77, 118

42 3,6,27,62,74, 115

43 3,6,27,62,74, 115

44 3,6,27,62,74, 115

45 8,29,64,76, 117

46 5,8,29,64,76, 117

47 8,29,64,76, 117

48 9,30,65,77,118

49 9,30,65,77,118

50 8,29,64,76, 117

Se incluyen las modificaciones significativas observadas en las SEQ ID NO: 27-50 sobre la secuencia aminoacídica de Ole e 1 (GenBank X76295) definida por Villalba et al. [Villalba M,

Batanero E, López-Otín et a!. "The amino acid sequence of Ole e 1, the major allergen from olive tree (Olea europaea) pollen". Eur. J. Biochem. 216:863-869 (1993)]

Tabla 6 Regiones de Ole e 2 codificantes de Cys potencialmente implicadas en puentes disulfuro

SEQ ID NO: Cisteínas

133 13,118

134 13,118

135 13,118

136 13,118

137 13,118

138 13,118

139 13,118

140 13, 118

141 13,118

142 13,118

143 13,118

144 13,118

145 13,118

146 13,118

147 13, 118

148 13,118

149 13,118

150 12,106,118

151 13, 118

152 12,106,118

153 13, 118

154 13,118

155 13,118

156 13, 118

157 13,118

158 12,106,118

159 12,106,118

160 13,118

161 13,118

162 13, 118

163 13,118

164 12,106,118

165 13, 118

166 13, 118

167 13,118

168 13,118

169 118

170 13,118

171 13,118

172 13, 118

173 13, 118

174 13, 118

175 13, 118

176 13, 118

177 13, 118

178 13, 118

179 13, 118

180 13, 118

181 12, 1Q6, 118

182 13, 118

183 12, 106, 118

184 13, 118

185 12,106,118

186 13, 118

187 13,118

188 12,106,118

189 12,106,118

190 12,106,118

191 13, 118

192 13,118

193 13,118

194 12,106,118

195 12,106,118

196 13,118

197 12,106,118

198 12,106,118

199 12,106,118

200 12,106,118

201 12,106,118

202 12,106,118

203 13,118

204 12,106,118

205 13,118

206 12,106,118

207 12,106,118

208 12,106,118

209 12,106,118

210 12,106,118

211 12,106,118

212 12,106,118

Se incluyen las modificaciones observadas en las SEQ ID NO: 133-212 sobre la secuencia aminoacídica de Ole e 2 (Yl 2425) definida por Asturias et al. [Asturias, et al. "Cloning and expression of the panallergen profilin and the major allergen (Ole e 1) from olive tree polen. L. Allergy Clin Immunol, 1997, 100: 365-372]

Tabla 7 Regiones de Ole e 1 implicadas en N-glicosilación potencial

SEQ lD NO: N-glucosιlac¡on

27 NGT (98-100)

28 NGT (98-100)

29 NGT (98-100)

30 NGT (98-100)

31 NGT (98-100)

32 NGT (98-100)

33 NGT (98-100)

34 NGT (98-100)

35 NGT (98-100)

36 NGT (97-99)

37 NGT (98-100)

38 NGT (98-100)

39 NGT (98-100)

40 NGT (98-100)

41 NGT (98-100)

42 NGT (95-97)

43 NGT (95-97)

44 NGT (95-97)

45 NGT (97-99)

46 NGT (97-99)

47 NGT (97-99)

48 NVT (37-39); NGT (98-100)

49 NVT (37-39); NGT (98-100)

50 NVT (36-38 ; NGT 97-99) ^* Se incluyen las modificaciones observadas en las SEQ ID NO: 27-50 sobre la secuencia aminoacídica de Ole e 1 (GenBank X76295) definida por Villalba et al. [Villalba M, Batanero E, López-Otín et al. "The amino acid sequence of Ole e 1, the major allergen from olive tree (Olea europaea) pollen". Eur. J. Biochem. 216:863-869 (1993)]

Tabla 8 Regiones de Ole e 2 implicadas en N-glicosilación potencial

SEQ ID NO: N-glicosilación

133

134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148

149

150

151

152

153

154

155

156

157

158

159

160

161

162

163

164

165

166

167

168

169

170

171

172

173

174

175

176

177

178

179

180

181

182

183

184

185

186

187

188

189

190

191

192

193

194

195

196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212

No se han observado modificaciones en las SEQ ID 133-212 sobre la secuencia aminoacídica de Ole e 2 (Y12425) definida por Asturias et al. [Asturias, et al. "Cloning and expression of the panallergen profilin and the major allergen (Ole e 1) from olive tree polen. L. Allergy Clin Immunol, 1997, 100: 365-372].

Entre las variantes de los péptidos de la invención se encuentran variantes hipoalergénicas o hiperalergénicas. Las variantes hipoalergénicas tienen disminuida (o anulada) su unión a IgE (es decir, son unos alérgenos mutantes con capacidad reducida de producir efectos adversos) y, por ello, son particularmente útiles en el tratamiento de la alergia al polen de olivo. De hecho, la aplicación fundamental de dichas variantes hipoalergénicas consiste en el aumento de la seguridad clínica tanto en el diagnóstico de la alergia como en los tratamientos de desensibilización (vacunación), disminuyendo o eliminando totalmente la aparición de fenómenos de anafüaxia. Con la utilización de dichas variantes hipoalergénicas se pueden utilizar dosis mucho mayores del alérgeno en los tratamientos de desensibilización, con lo que se aumenta la eficacia de dichos tratamientos, y se puede reducir también el tiempo de administración de dichos tratamientos, que son usualmente muy largos (varios años). Otras ventajas añadidas son las siguientes: a) contribuyen a la personalización de las vacunas, adecuándose al perfil de sensibilidad individualizado de cada paciente, b) evitan la posible sensibilización de novo a alérgenos originalmente no reconocidos causada en algunos casos por la propia terapia desensibilizante, y c), son moléculas candidatas a su utilización en vacunación

profiláctica frente a alergia [Valenta R: "Recombinant allergen-based concepts for diagnosis and therapy of Type I allergy" Allergy 2002; 57: Suppl. 71 : 66-67; Vrtala et al. Strategies for converting allergens into hypoallergenic vaccine candidates. Methods. 2004 Mar; 32(3):313-20]. Las formas hiperalergénicas se utilizarían casi exclusivamente en investigación básica de la alergia y sus mecanismos, no en terapia.

C. Anticuerpos

En otro aspecto, la invención se relaciona con un anticuerpo, en adelante anticuerpo de la invención, capaz de unirse a un péptido de la invención, es decir, a un péptido que comprende, al menos, un epítopo del alérgeno Ole e 1 o del alérgeno Ole e 2 de polen de olivo de una variedad definida de olivo {Olea europaea). En una realización particular, dicho anticuerpo de la invención es un anticuerpo capaz de unirse a un péptido cuya secuencia aminoacídica comprende, o está constituida por, una secuencia de aminoácidos seleccionada entre cualquiera de las SEQ ID NO: 27-50 o SEQ ID NO: 133-212, o un fragmento de las mismas que comprende, al menos, un epítopo del alérgeno Ole e 1 o del alérgeno Ole e 2 de polen de olivo.

El término "anticuerpo" tal como aquí se utiliza se refiere a una inmunoglobulina (Ig) o a un fragmento inmunológicamente activo de la misma, es decir, a un fragmento que comprende la región de unión al antígeno. Ejemplos ilustrativos de fragmentos inmunológicamente activos de Ig incluyen fragmentos scFv y dcFv, fragmentos Fab y F(ab') ₂ que pueden ser obtenidos tratando el anticuerpo con una enzima tal como papaína o pepsina, respectivamente.

El anticuerpo puede ser monoclonal, policlonal, recombinante, e.g., quimérico o humanizado, totalmente humano, no humano, por ejemplo, taurino, o un fragmento Fv de anticuerpo de cadena única (scFv). El anticuerpo puede acoplarse a un marcador.

Un péptido de la invención, o un fragmento antigénico del mismo, puede ser utilizado como antígeno para generar anticuerpos. En general, dicho péptido antigénico debe incluir, al menos, 8 restos de aminoácidos e incluir un epítopo de dicho péptido de la invención. Preferentemente, dicho péptido antigénico incluye contiene debe incluir, al menos, 10 restos de aminoácidos, más preferentemente, al menos, 15 restos de

aminoácidos, aún más preferentemente, al menos, 20 restos de aminoácidos, y todavía más preferentemente, al menos, 30 restos de aminoácidos.

El anticuerpo de la invención reacciona con, o es específico o selectivo para, cualquiera de las regiones o dominios de los péptidos de la invención. En una realización particular, dicho anticuerpo se une a un epítopo presente en un dominio o en una región de un péptido de la invención.

Adicionalmente, los anticuerpos quiméricos, humanizados y completamente humanos caen dentro del ámbito de la presente invención. Los anticuerpos quiméricos, humanizados y, más preferentemente, completamente humanos, son particularmente deseables con fines terapéuticos y de diagnóstico, en humanos.

Los anticuerpos quiméricos y humanizados monoclonales, incluyendo fragmentos humanos y no humanos, pueden obtenerse por métodos convencionales basados en técnicas de ADN recombinante, por ejemplo, utilizando los métodos descritos en EP 184187, EP 171496, EP 173494, WO 86/01533, US 4.816.567, EP 125023, Better et al. (1988) Science 240:1041-1043; Liu et al. (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al. (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura et al. (1987) Cana Res. 47:999- 1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449; Shaw et al. (1988) J. Natl.Cancer Inst. 80:1553-1559); Morrison (1985) Science 229: 1202-1207; Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214; US 5.225.539; Jones et al. (1986) Nature 321 :552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; y Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141 :4053-4060.

Los anticuerpos completamente humanos son particularmente útiles para el tratamiento terapéutico de pacientes humanos así como para aplicaciones de diagnóstico. Dichos anticuerpos puede obtenerse fácilmente utilizando ratones transgénicos incapaces de expresar los genes de las cadenas ligera y pesada de Igs endógenas pero capaces de expresar los genes de las cadenas ligera y pesada de Igs humanas (véase, por ejemplo, Lonberg & Huszar (1995) Int. Rev. Immunol. 13:65-93, US 5.625.126, US 5.633.425, US 5.569.825; US 5.661.016; y US 5.545.806. El anticuerpo de la invención puede ser un fragmento de anticueipo de cadena única (scFv) tal como describen, por ejemplo, Colcher et al. (1999) Ann. NY Acad. Sci. 880:263-80; y Reiter (1996) Clin. Cáncer Res. 2:245-52. Dicho scFv puede ser

oligomerizado (di- o multimerizado) para generar anticuerpos multivalentes con distintas especificidades para distintos epítopos del mismo péptido de la invención diana.

Los anticuerpos de la invención (e.g., anticuerpos monoclonales) pueden ser utilizados con fines terapéuticos o para realizar métodos inversos de análisis, por ejemplo, inmovilizando los anticuerpos sobre un soporte sólido y ensayando su unión a péptidos. La detección de los complejos formados puede facilitarse mediante el acoplamiento al anticuerpo de una sustancia detectable o marcador, por ejemplo, enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, luminiscentes, bioluminiscentes, radiactivos, etc. (WO 03/003977).

D. Soporte

En otro aspecto, la invención se relaciona con un soporte sólido, en adelante soporte sólido de la invención, que comprende: a) una pluralidad de ácidos nucleicos, en donde cada uno de dichos ácidos nucleicos está separado del resto de ácidos nucleicos y su secuencia nucleotídica codifica, al menos, un epítopo de un alérgeno de polen de olivo específico de una variedad definida de olivo; o bien b) una pluralidad de péptidos, en donde cada uno de dichos péptidos está separado del resto de péptidos y comprende, al menos, un epítopo de un alérgeno de polen de olivo específico de una variedad definida de olivo; o bien c) una pluralidad de anticuerpos, en donde cada uno de dichos anticuerpos está separado del resto de anticuerpos y es capaz de unirse a un péptido que comprende, al menos, un epítopo del alérgeno Ole e 1 o del alérgeno

Ole e 2 de polen de olivo de una variedad definida de olivo {Olea enropaea).

El término "pluralidad" tal como aquí se utiliza se refiere a, al menos, 2 ácidos nucleicos, péptidos o anticuerpos. El número de ácidos nucleicos, péptidos o anticuerpos que pueden estar presentes en el soporte sólido de la invención puede variar dentro de un amplio intervalo. A modo ilustrativo, el soporte sólido de la invención puede contener, al menos, 10 ácidos nucleicos, péptidos o anticuerpos, generalmente, al

menos, 100 ácidos nucleicos, péptidos o anticuerpos, típicamente, al menos, 1.000 ácidos nucleicos, péptidos o anticuerpos, ventajosamente, al menos, 10.000 ácidos nucleicos, péptidos o anticuerpos.

En una realización particular, dicha pluralidad de ácidos nucleicos contenida en el soporte sólido de la invención comprende, al menos, un ácido nucleico de la invención, por ejemplo, al menos, un ácido nucleico cuya secuencia de nucleótidos comprende, o está constituida por, una secuencia de nucleótidos seleccionada entre cualquiera de las SEQ ID NO: 1-24 o SEQ ID NO: 53-132, o un fragmento de las mismas que codifica un péptido que comprende, al menos, un epítopo del alérgeno Ole e 1 o del alérgeno Ole e 2 de polen de olivo.

En otra realización particular, dicha pluralidad de péptidos contenida en el soporte sólido de la invención comprende, al menos, un péptido de la invención, por ejemplo, al menos, un péptido cuya secuencia aminoacídica comprende, o está constituida por, una secuencia de aminoácidos seleccionada entre cualquiera de las SEQ ID NO: 27-50 o SEQ ID NO: 133-212, o un fragmento de las mismas que comprende, al menos, un epítopo del alérgeno Ole e 1 o del alérgeno Ole e 2 de polen de olivo.

En otra realización particular, dicha pluralidad de anticuerpos contenida en el soporte sólido de la invención comprende, al menos, un anticuerpo de la invención, por ejemplo, al menos, un anticuerpo capaz de unirse a un péptido cuya secuencia aminoacídica comprende, o está constituida por, una secuencia de aminoácidos seleccionada entre cualquiera de las SEQ ID NO: 27-50 o SEQ ID NO: 133-212, o un fragmento de las mismas que comprende, al menos, un epítopo del alérgeno Ole e 1 o del alérgeno Ole e 2 de polen de olivo. En una realización particular, dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o un fragmento inmunológicamente activo del mismo, por ejemplo, un fragmento scFv o un dímero o multímero del mismo. Mediante el empleo de anticuerpos es posible el desarrollo de métodos inversos de análisis en soportes sólidos, es decir, de inmovilización de los anticueipos (e.g., anticuerpos monoclonales) a los soportes sólidos, que luego son testados utilizando los péptidos [Ko IK, Kato K, Iwata H. Antibody microarray for correlating cell phenotype with surface marker. Biomaterials. 2005 Feb;26(6):687-96].

Los ácidos nucleicos, los péptidos y los anticueipos pueden estar dispuestos sobre el soporte sólido en una disposición orientada (conocida) o no orientada. Tal

como aquí se utiliza, el término "disposición orientada" significa que el ácido nucleico, el péptido o el anticuerpo está inmovilizado sobre el soporte sólido en una localización definida (posición conocida). Por tanto, en una realización particular, el soporte sólido de la invención comprende dos o más ácidos nucleicos o, alternativamente, dos o más péptidos, o bien dos o más anticuerpos, inmovilizados sobre dicho soporte sólido en una disposición no orientada. Alternativamente, en otra realización particular, el soporte sólido de la invención comprende dos o más ácidos nucleicos o bien dos o más péptidos o bien dos o más anticuerpos inmovilizados sobre dicho soporte sólido en una disposición orientada. Ventajosamente, los ácidos nucleicos, péptidos o anticuerpos están inmovilizados sobre el soporte sólido en una disposición orientada, constituyendo un "array". Dicho array puede realizarse sobre un chip o biochip [(bio)chip].

Los (bio)chips o arrays de ácidos nucleicos, péptidos o anticuerpos implican la disposición en zonas puntuales de un soporte sólido de una pluralidad de ácidos nucleicos, péptidos o anticuerpos. Puesto que la deposición de dichos ácidos nucleicos, péptidos o anticuerpos se realiza en puntos microscópicos, se puede aplicar en un solo (bio)chip una cantidad muy elevada de ácidos nucleicos, péptidos o anticuerpos. A modo ilustrativo, no limitativo, en un chip de alta densidad se pueden analizar hasta 10.000 genes distintos por chip (unas 150 mieras de diámetro por gota y unas 200 mieras de espaciado) [Park CH, Jeong HJ, Jung JJ, Lee GY, Kim SC, Kim TS, Yang SH, Chung HC, Rha SY. Fabrication of high quality cDNA microarray using a small amount of cDNA. Int J Mol Med. 2004 May;13(5):675-9], mientras que en el caso de péptidos y anticuerpos el número de sustancias a analizar es, aparentemente, algo menor (e.g., las gotas pueden ser de 180-250 mieras) [Deinhofer, K., Sevcik, H., Balic, N., Harwanegg, Ch., Hiller, R., Rumpold, H., Mueller, M.W. and Spitzauer, S.: "Microarrayed allergens for IgE profiling". Methods 32:249.254 (2004)]. Los valores indicados previamente corresponden a unos valores medios, aceptables en general. No obstante, según la compañía Affymetrix se pueden hacer chips de más de 61.000 secuencias por array, con gotas de 1 1 mieras, que solo se pueden leer con sus equipos más sofisticados (http://www.affymetrix.com/products/arrays/specific/cexpress .affx). En general, para analizar un chip de proteínas es suficiente con unos 20 microlitros de suero [Deinhofer, K., Sevcik, H., Balic, N., Harwanegg, Ch., Hiller, R., Rumpold, H., Mueller, M.W. and Spitzauer, S.: "Microarrayed allergens for IgE

profiling". Methods 32:249.254 (2004)]. Para testar cada chip de genes con ARN humano, se puede usar tan poco como 5 microgramos de ARN humano de un tejido concreto ya que se pueden utilizar procedimientos de amplificación [Dumur CI, Garrett CT, Archer KJ, Nasim S, Wilkinson DS, Ferreira-Gonzalez A. Evaluation of a linear amplification method for small samples used on high-density oligonucleotide microarray analysis. Anal Biochem. 2004 Aug 15;331(2):314-21).

El empleo de dicho soporte sólido de la invención permite, por tanto, detectar simultáneamente el alérgeno o alérgenos de polen de olivo, específico(s) de variedad de olivo, frente a los cuales puede estar sensibilizado un sujeto, a partir de una única muestra biológica procedente de dicho sujeto, lo que garantizaría el diagnóstico y facilitaría el tratamiento del sujeto.

El soporte sólido de la invención puede ser obtenido por métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia. Prácticamente cualquier método conocido por los expertos en la materia puede ser utilizado para inmovilizar ácidos nucleicos, péptidos y anticuerpos al soporte sólido. A modo ilustrativo, véase, por ejemplo, Deinhofer, K., Sevcik, H., Balic, N., Harwanegg, Ch., Hiller, R., Rumpold, H., Mueller, M. W. and Spitzauer, S.: "Microarrayed allergens for IgE profiling". Methods 32:249.254 (2004); Alcocer MJ, Murtagh GJ, Wilson PB, Progias P, Lin J, Archer DB. The major human structural IgE epitope of the Brazil nut allergen Ber e 1 : a chimaeric and protein microarray approach. J Mol Biol. 2004 Oct 22;343(3):759-69; Jahn-Schmid B, Harwanegg C, Hiller R, Bohle B, Ebner C, Scheiner O, Mueller MW. Allergen microarray: comparison of microarray using recombinant allergens with conventional diagnostic methods to detect allergen-specific serum immunoglobulin E. Clin Exp Allergy. 2003 Oct;33(10): 1443-9; Beyer K. Characterization of allergenic food proteins for improved diagnostic methods. Curr Opin Allergy Clin Immunol. 2003 Jun;3(3): 189-97; FaIl BI, Eberlein-Konig B, Behrendt H, Niessner R, Ring J, Weller MG. Microarrays for the screening of allergen-specific IgE in human serum. Anal Chem. 2003 Feb l ;75(3):556-62; y Kim TE, Park SW, Cho NY, Choi SY, Yong TS, Nahm BH, Lee S, Noh G. Quantitative measurement of serum allergen-specific IgE on protein chip. Exp Mol Med. 2002 May 31 ;34(2): 152-8.

Un método habitualmente utilizado para inmovilizar ácidos nucleicos sobre un soporte sólido consiste en el recubrimiento no covalente del soporte sólido con un

miembro de un par de unión específica, por ejemplo, avidina o estreptavidina, y la inmovilización de ácidos nucleicos biotiniladas. Allemativamenle, los ácidos nucleicos se pueden unir directamente al soporte sólido mediante reacciones de acoplamiento de tipo epóxido/amina. El soporte sólido puede ser de naturaleza y composición diversa, por ejemplo, vidrio (portaobjetos), sílice (chips), plástico (diversos tipos) (placas microtiter), nitrocelulosa, PVDF (polivinilideno difluoruro), partículas magnéticas, metálicas, de vidrio, etc. [Kim TE, Park SW, Cho NY, Choi SY, Yong TS, Nahm BH, Lee S, Noh G. Quantitative measurement of serum allergen-specifíc IgE on protein chip. Exp Mol Med. 2002 May 31 ;34(2):152-8 (membranas de nitrocelulosa); The Major Human Structural IgE Epitope of the Brazil Nut Allergen Ber e 1 : A Chimaeric and Protein Microaπ'ay Approach Marcos J. C. Alcocer, Gareth J. Murtagh, Philip B. Wilson, Pavlos Progias, Jing Lin and David B. Archer. J. Mol. Biol. (2004) 343, 759-769 (PVDF y placas microtiter). En una realización particular, el soporte sólido es una membrana que posee una superficie de carga negativa, tal como una membrana de nylon. En este caso, antes de la unión de las sondas, la membrana se trata con un activador de los grupos carboxilo presentes en la superficie de la membrana, tal como, por ejemplo, l-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida (EDAC). En este caso, los ácidos nucleicos se diseñarían de manera que contuvieran, por ejemplo, un grupo amino en el extremo 5' con el fin de orientar espacialmente el ácido nucleico sobre la membrana.

En otra realización particular, el soporte sólido es un portaobjetos de cristal (vidrio), o espejo tal como un portaobjetos, opcionalmente sometido a un tratamiento con poli-L-lisina con el fin de disponer sobre la superficie de cristal grupos amino que se van a unir por interacciones electro estáticas a los grupos fosfato de los ácidos nucleicos, que no quedan orientados espacialmente sobre la superficie del soporte sólido. Además de los grupos amino, existen una serie de tratamientos opcionales que producen un recubrimiento sobre la superficie del cristal con otra serie de grupos químicos reactivos tales como grupos aldehido, epóxido, O ₂ , CF ₄ , metales, dieléctricos, avidina, estreptavidina, sustratos hidrofóbicos, etc.

Los péptidos y anticuerpos se pueden unir a los soportes sólidos utilizando prácticamente los mismos sistemas de los ácidos nucleicos: en ambos casos se basan

fundamentalmente en una reacción de Schiff aldehido/amina (residuos de lisina en las proteínas, aminas primarias de las bases de ADN, o generación sintética de derivados amínicos de las bases del ADN). Un ejemplo de cómo se unen péptidos alergénicos recombinantes se describe en Deinhofer, K., Sevcik, H., Balic, N., Harwanegg, Ch., Hiller, R., Rumpold, H., Mueller, M. W. and Spitzauer, S.: "Microarrayed allergens for IgE profíling". Methods 32:249.254 (2004). En dicho trabajo se usan portaobjetos de vidrio cuya superficie se hace reactiva a los grupos aminos mediante tratamiento con silano y un polímero reactivo. En el caso de péptidos es muy frecuente la utilización de soportes de vidrio (portaobjetos) recubiertos con silano-epóxido, que constituyen una superficie reactiva frente a los grupos amino de las proteínas. Se están desarrollando nuevos sustratos, ej Cretich M, Pirri G, Damin F, Solinas I, Chiari M. A new polymeric coating for protein microarrays. Anal Biochem. 2004 Sep l;332(l):67-74. Otro ejemplo más: Cha T, Guo A, Jun Y, Pei D, Zhu XY. Immobilization of oriented protein molecules on poly(ethylene glycol)-coated Si(I I l). Proteomics. 2004 Jul;4(7): 1965-76. En general los métodos de unión son de 4 tipos: los que se basan en reacciones de tipo covalente (recubrimientos de tipo silano, amina, etc.), los que se basan en fenómenos de difusión (gel de poliacrilamida -hidrogel- , agarosa, etc.), los que se basan en fenómenos de adsorción a superficies (PVDF, nitrocelulosa, poli-L-lisina, etc.) y los que se basan en fenómenos de afinidad: biotina/estreptavidina, His/Ni-NTA, etc.). La concentración de los ácidos nucleicos, péptidos y anticuerpos en el soporte sólido de la invención puede variar dentro de un amplio intervalo dependiendo de numerosos factores, entre los que se encuentran la naturaleza y tipo de soporte sólido, la naturaleza del ácido nucleico, el péptido, o el anticuerpo, etc. A modo ilustrativo, no limitativo, se pueden usar concentraciones de proteína (péptido o anticuerpo) de 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, ó 1 mg/ml, o bien de entre 0,01 y 2 ng de proteina por spot [Deinhofer, K., Sevcik, H., Balic, N., Harwanegg, Ch., Hiller, R., Rumpold, H., Mueller, M.W. and Spitzauer, S.: "Microarrayed allergens for IgE profíling". Methods 32:249.254 (2004); The Major Human Structural IgE Epitope of the Brazil Nut Allergen Ber e 1 : A Chimaeric and Protein Microarray Approach Marcos J. C. Alcocer, Gareth J. Murtagh, Philip B. Wilson, Pavlos Progias, Jing Lin and David B. Archer. J. Mol. Biol. (2004) 343, 759-769].

E. Composición farmacéutica

Los péptidos y anticuerpos de la invención pueden ser utilizados en la elaboración de una composición farmacéutica útil para prevenir y/o tratar la alergia al polen de olivo. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende, como sustancia activa, al menos, un péptido de la invención o un anticuerpo de la invención. En general, dicha composición farmacéutica comprende, además, un vehículo, un excipiente, un diluyente, un adyuvante, un retardante y/o un estabilizante, farmacéuticamente aceptables.

El término "composición farmacéutica" incluye composiciones para su uso en sanidad humana o animal (composiciones veterinarias).

En una realización particular, la composición farmacéutica de la invención comprende, al menos, un péptido de la invención. En una realización concreta, la secuencia aminoacídica de dicho péptido de la invención comprende, o está constituida por, una secuencia de aminoácidos seleccionada entre cualquiera de las SEQ ID NO: 27-50 o SEQ ID NO: 133-212, o un fragmento de las mismas que comprende, al menos, un epítopo del alérgeno Ole e 1 o del alérgeno Ole e 2 de polen de olivo.

En otra realización particular, la composición farmacéutica de la invención comprende, al menos, un anticuerpo de la invención. Dicho anticuerpo tendrá que ser compatible con la especie (humana o animal) a la que se le va a administrar para evitar reacciones indeseables. Por tanto, en una realización concreta, cuando la composición farmacéutica va destinada al tratamiento de un ser humano, dicho anticuerpo de la invención será un anticuerpo quimérico, humanizado o, preferentemente, completamente humano, monoclonal, o un fragmento del mismo, tal como, por ejemplo, un scFv, opcionalmente, oligomerizado (di- o multimerizado). En una realización específica, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo capaz de unirse a un péptido cuya secuencia aminoacídica comprende, o está constituida por, una secuencia de aminoácidos seleccionada entre cualquiera de las SEQ ID NO: 27-50 o SEQ ID NO: 133-212, o un fragmento de las mismas que comprende, al menos, un epítopo del alérgeno Ole e 1 o del alérgeno Ole e 2 de polen de olivo. En otra realización particular, la composición farmacéutica de la invención comprende, además, una sustancia activa adicional. Prácticamente cualquier sustancia potencialmente útil para el tratamiento sintomático de la alergia puede ser incorporada

como sustancia activa adicional. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dicha sustancia activa adicional incluyen agentes antihistamínicos, hormonas esteroideas, cromoglicato disódico, fluticasona, rupatadina, ebastina, loratadina, desloratadina y otros antagonistas de receptores de histamina, leucotrienos, etc., alergoides (alérgenos modificados con glutaraldehido), y sus mezclas.

En una realización particular, la composición farmacéutica de la invención es una vacuna destinada a inmunoterapia frente a la alergia del polen de olivo. Ventajosamente, el antígeno (alérgeno o inmunógeno) presente en dicha vacuna será una variante hipo al er geni ca de un péptido de la invención. En otra realización particular, el antígeno (alérgeno o inmunógeno) presente en dicha vacuna será un anticuerpo de la invención, tal como un anticuerpo quimérico, humanizado o, preferentemente, completamente humano, monoclonal, o un fragmento del mismo, tal como, por ejemplo, un scFv, opcionalmente, oligomerizado, cuando la vacuna va destinada a su administración a seres humanos. La composición farmacéutica de la invención puede administrarse por cualquier vía apropiada (e.g., oral, parenteral, tópica, etc.), para lo cual se utilizarán los excipientes y vehículos farmacéuticamente aceptables necesarios para la formulación de la forma farmacéutica de administración elegida. Una revisión de las distintas formas farmacéuticas de administración de fármacos y de su preparación puede encontrarse en el libro "Tratado de Farmacia Galénica", de C. Faulí i Trillo, I ^a Edición, 1993, Luzán 5, S. A. de Ediciones. A modo ilustrativo, no limitativo, la composición farmacéutica de la invención puede encontrarse formando parte de una formulación en macropartículas, nanop articulas o liposomas, y puede administrarse en una forma farmacéutica de administración sólida, en una forma farmacéutica de administración líquida, o en una forma farmacéutica de administración que comprende un sistema disperso. Más concretamente, la composición farmacéutica de la invención puede encontrarse en forma de soluciones inyectables, formas farmacéuticas adecuadas para su administración sublingual, polvos, granulos, perlas, comprimidos, cápsulas, jarabes, emulsiones, supositorios, colirios, nebulizaciones, aerosoles, cremas, geles, etc. Consecuentemente, en otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de un péptido o de un anticuerpo de la invención en la elaboración de una composición farmacéutica para la prevención o el tratamiento de la alergia al polen de olivo de una

variedad definida de olivo. En una realización particular, dicha composición farmacéutica es una vacuna destinada a inmunoterapia. En otra realización particular, dicho péptido de la invención comprende un péptido cuya secuencia aminoacídica comprende, o está constituida por, una secuencia de aminoácidos seleccionada entre cualquiera de las SEQ ID NO: 27-50 o SEQ ID NO: 133-212, o un fragmento de las mismas que comprende, al menos, un epítopo del alérgeno Ole e 1 o del alérgeno Ole e 2 de polen de olivo. En otra realización particular, dicho anticuerpo es un anticuerpo quimérico, humanizado o, preferentemente, completamente humano, monoclonal, o un fragmento del mismo, tal como, por ejemplo, un scFv, opcionalmente, oligomerizado, capaz de unirse a un péptido cuya secuencia aminoacídica comprende, o está constituida por, una secuencia de aminoácidos seleccionada entre cualquiera de las SEQ ID NO: 27-50 o SEQ ID NO: 133-212, o un fragmento de las mismas que comprende, al menos, un epítopo del alérgeno Ole e 1 o del alérgeno Ole e 2 de polen de olivo.

F. Diagnóstico (reactivos, métodos y kits)

Los péptidos y anticuerpos de la invención pueden ser utilizados en el diagnóstico de la alergia al polen del olivo, por lo que pueden actuar como reactivos en métodos para el diagnóstico de alergia al polen de olivo de una variedad definida de olivo. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un reactivo para su empleo en un método in vitro o in vivo para el diagnóstico de alergia a polen de olivo de una variedad definida de olivo en un sujeto, en donde dicho reactivo comprende un péptido de la invención o un anticuerpo de la invención. En una realización particular, dicho péptido de la invención comprende un péptido cuya secuencia aminoacídica comprende, o está constituida por, una secuencia de aminoácidos seleccionada entre cualquiera de las SEQ ID NO: 27-50 o SEQ ID NO: 133-212, o un fragmento de las mismas que comprende, al menos, un epítopo del alérgeno Ole e 1 o del alérgeno Ole e 2 de polen de olivo. En otra realización particular, dicho anticuerpo es un anticuerpo quimérico, humanizado o, preferentemente, completamente humano, monoclonal, o un fragmento del mismo, tal como, por ejemplo, un scFv, opcionalmente, oligomerizado, capaz de unirse a un péptido cuya secuencia aminoacídica comprende, o está constituida por, una secuencia de aminoácidos seleccionada entre cualquiera de las SEQ ID NO:

27-50 o SEQ ID NO: 133-212, o un fragmento de las mismas que comprende, al menos, un epítopo del alérgeno Ole e 1 o del alérgeno Ole e 2 de polen de olivo.

Los métodos in vitro o in vivo para el diagnóstico de alergia a polen de olivo de una variedad definida de olivo se basan en técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia que serán mencionadas más adelante.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método in vivo para el diagnóstico de alergia a polen de olivo de una variedad definida de olivo en un sujeto que comprende administrar a un sujeto un péptido de la invención o un anticuerpo de la invención y evaluar la reacción en el sujeto. Tal como aquí se utiliza, el término "sujeto" incluye a cualquier animal susceptible de inducir una respuesta inmune en respuesta a un antígeno, por ejemplo, un mamífero, incluido el ser humano.

Para la puesta en práctica de este método de diagnóstico in vivo puede realizarse cualquiera de las pruebas in vivo convencionales tales como, por ejemplo, Skin Prick Test (SPT), pruebas intradérmicas, pruebas de provocación nasal, bronquial y/o conjuntival (humanos), etc. [van Hage-Hamsten M, Pauli G. Provocation testing with recombinant allergens. Methods. 2004; 32(3):281-91].

En una realización particular, dicho péptido de la invención es un péptido cuya secuencia aminoacídica comprende, o está constituida por, una secuencia de aminoácidos seleccionada entre cualquiera de las SEQ ID NO: 27-50 o SEQ ID NO:

133-212, o un fragmento de las mismas que comprende, al menos, un epítopo del alérgeno Ole e 1 o del alérgeno Ole e 2 de polen de olivo.

Cuando se utilizan anticuerpos, estos tendrán que ser, ventajosamente, compatibles con la especie (humana o animal) a la que se le va a administrar para evitar reacciones indeseables. Por tanto, en una realización particular, cuando el sujeto es un ser humano, el anticuerpo de la invención será un anticuerpo quimérico, humanizado o, preferentemente, completamente humano, monoclonal, o un fragmento del mismo, tal como, por ejemplo, un scFv, opcionalmente, oligomerizado (di- o multimerizado). En una realización específica, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo capaz de unirse a un péptido cuya secuencia aminoacídica comprende, o está constituida por, una secuencia de aminoácidos seleccionada entre cualquiera de las SEQ ID NO: 27-50 o

SEQ ID NO: 133-212, o un fragmento de las mismas que comprende, al menos, un epítopo del alérgeno Ole e 1 o del alérgeno Ole e 2 de polen de olivo.

Consecuentemente, en otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de un péptido de la invención o de un anticuerpo de la invención en la elaboración de una composición para el diagnóstico in vivo de la alergia al polen de olivo de una variedad definida de olivo en un sujeto. En una realización particular, dicho péptido de la invención comprende un péptido cuya secuencia aminoacídica comprende, o está constituida por, una secuencia de aminoácidos seleccionada entre cualquiera de las SEQ ID NO: 27-50 o SEQ ID NO: 133-212, o un fragmento de las mismas que comprende, al menos, un epítopo del alérgeno Ole e 1 0 del alérgeno Ole e 2 de polen de olivo. Cuando se utilizan anticuerpos, estos tendrán que ser, ventajosamente, compatibles con la especie (humana o animal) a la que se le va a administrar. Por tanto, en una realización particular, cuando el sujeto es un ser humano, el anticuerpo de la invención será un anticuerpo quimérico, humanizado o, preferentemente, completamente humano, monoclonal, o un fragmento del mismo, tal como, por ejemplo, un scFv, opcionalmente, oligomerizado (di- o multimerizado). En una realización específica, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo capaz de unirse a un péptido cuya secuencia aminoacídica comprende, o está constituida por, una secuencia de aminoácidos seleccionada entre cualquiera de las SEQ ID NO: 27-50 o SEQ ID NO: 133-212, o un fragmento de las mismas que comprende, al menos, un epítopo del alérgeno Ole e 1 o del alérgeno Ole e 2 de polen de olivo.

El diagnóstico in vivo de alergia al polen de olivo de una variedad definida de olivo en un sujeto comprende la realización de pruebas in vivo convencionales tales como las mencionadas previamente. La invención también se relaciona, en otro aspecto, con un método in vitro para

(i) el diagnóstico de alergia al polen de olivo de una variedad definida de olivo en un sujeto, o para (ii) determinar la evolución del curso de la alergia al polen de olivo de una variedad definida de olivo en un sujeto, o para (iii) evaluar la eficacia de un tratamiento contra alergia al polen de olivo de una variedad definida de olivo en un sujeto, que comprende determinar el título de IgE y, opcionalmente, IgG, frente a un péptido de la invención en una muestra biológica de dicho sujeto.

Tal como aquí se utiliza, el término "muestra biológica de un sujeto" incluye a cualquier muestra del sujeto susceptible de contener inmunoglobulinas, por ejemplo, sangre completa, suero o plasma, secreciones nasales y bronquiales, lágrimas, leche materna, cordón umbilical, etc. En una realización particular, dicho péptido de la invención comprende un péptido cuya secuencia aminoacídica comprende, o está constituida por, una secuencia de aminoácidos seleccionada entre cualquiera de las SEQ ID NO: 27-50 o SEQ ID NO: 133-212, o un fragmento de las mismas que comprende, al menos, un epítopo del alérgeno Ole e 1 o del alérgeno Ole e 2 de polen de olivo. En una realización particular, la puesta en práctica de este método comprende la realización de pruebas in vitro basadas en el empleo de técnicas de RIST [radioimmunosorbent test (ensayo de radioinmunoabsorción)], PRIST [paper radioimmuno-sorbent test (ensayo de radioinmunoabsorción en papel)], RAST [radioallergosorbent test (ensayo de radioalergoabsorción)], ELISA (ensayo de inmunoabsorción con enzima ligada), RIA (radioinmunoensayo), etc., incluyendo el empleo de sistemas de diagnóstico comerciales disponibles (e.g., Phadebas RAST, CAP, ImmunoCAP, UniCAP, CAP FEIA, AIaSTAT, FAST, IgEquick, CMG Immunodot, etc., producidos o suministrados por diversas compañías comerciales, tales como Pharmacia Diagnostics, CMG Laboratorios etc., o bien, el empleo de (bio)chips, arrays o microarrays de alérgenos y/o la determinación de la activación de células T, la activación de basófilos, la liberación de histamina, etc.

En una realización particular, dicho método comprende poner en contacto una muestra biológica de dicho sujeto, por ejemplo, una muestra de suero, con un péptido de la invención y determinar el título de anticuerpos IgE y, si se desea, de IgG, frente a dicho péptido. La determinación de la IgG puede ser interesante para el seguimiento de las terapias aplicadas al sujeto en tratamiento. De este modo, este método puede ser utilizado con fines de diagnóstico o, alternativamente, para determinar la evolución del curso de la alergia en el sujeto (opcionalmente sometido a un tratamiento), así como para evaluar la eficacia de un tratamiento anti-alérgico administrado a un sujeto que padece alergia al polen de olivo.

La determinación del título de inmunoglobulinas (IgE y, en su caso, IgG) frente a los péptidos de la invención puede realizarse por métodos convencionales conocidos

por el experto en la materia. En una realización particular, la determinación del título de IgE y, en su caso, de IgG, comprende analizar la reacción péptido de la invención- inmunoglobulina (IgE y, en su caso, IgG) presente en la muestra biológica del sujeto, visualizar la formación de dicho complejo y determinar la variedad de olivo responsable de la alergia en el sujeto. La visualización del complejo puede llevarse a cabo por métodos convencionales, por ejemplo, mediante métodos colorimétricos, fluorimétricos, quimioluminiscentes, radioisotópicos, de medidas de densidad óptica (absorbancia), otras técnicas asociadas: planimetría, recuento celular, citometría de flujo, etc. Una referencia general sobre estas técnicas puede encontrarse en "Enfermedades Respiratorias. Utilidad del Laboratorio". Segunda Edición. Editores: P. Ancic Cortez, T. Clark, R. Rodriguez-Roisin, R. Paredes Martínez. Facultad de Medicina, Universidad de Chile y The British Council (http://www.med.uchile.cl/otros/dra_ancic/libro.html).

Para establecer si un sujeto padece alergia al polen de olivo de una variedad definida se aplicarán, en general, los límites normales ya establecidos. Como es conocido, la IgE sérica está presente normalmente en cantidades del orden de ng/ml, encontrándose aumentada en diferentes condiciones alérgicas, en enfermedades virales y parasitarias, y en ciertas inmunodefíciencias. El valor de IgE sérica se expresa normalmente en unidades internacionales (UI) por mi (1 UI = 2,4 ng de proteína). El nivel de IgE varía con la edad; en la sangre de cordón de recién nacidos normales es interior a 0,5 Ul/ml, y en el adulto normal es alrededor de 20 Ul/ml (normalmente inferior a 80 Ul/ml). A partir de los 14 años se considera anormalmente elevada una IgE mayor de 333 Ul/ml (800 ng/ml). En personas atópicas el nivel de IgE es usualmente 3 a 5 veces más elevado.

El empleo de un péptido de la invención en un método in vitro para (i) el diagnóstico de la alergia al polen de olivo de una variedad definida de olivo en un sujeto, o para (ii) determinar la evolución del curso de la alergia al polen de olivo de una variedad definida de olivo en un sujeto, o para (iií) evaluar la eficacia de un tratamiento contra alergia al polen de olivo de una variedad definida de olivo en un sujeto, constituye un aspecto adicional de esta invención. En una realización particular, dicho péptido de la invención comprende un péptido cuya secuencia aminoacídica comprende, o está constituida por, una secuencia de aminoácidos seleccionada entre cualquiera de las SEQ ID NO: 27-50 o SEQ ID NO: 133-212, o un fragmento de las

mismas que comprende, al menos, un epítopo del alérgeno Ole e 1 o del alérgeno Ole e 2 de polen de olivo.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un kit, en adelante kit de la invención, para la puesta en práctica de los métodos in vivo e in vitro previamente definidos que comprende un péptido de la invención, o un anticuerpo de la invención o un soporte sólido de la invención.

El kit de la invención comprende, además, si se desea, controles positivos (i.e. histamina hidroclórica), negativos (el mismo tampón en que se realizan las diluciones de los extractos, proteínas alergénicas recombinantes de variedades con baja/nula reactividad, etc.).

En una realización particular, el kit de la invención es un kit para el diagnóstico in vivo de alergia a polen de olivo de una variedad definida de olivo en un sujeto que comprende un péptido de la invención. En otra realización particular, el kit de la invención es un kit para la puesta en práctica de un método in vitro para (i) el diagnóstico de alergia al polen de olivo de una variedad definida de olivo en un sujeto, o para (ii) determinar la evolución del curso de la alergia al polen de olivo de una variedad definida de olivo en un sujeto, o para (iii) evaluar la eficacia de un tratamiento contra alergia al polen de olivo de una variedad definida de olivo en un sujeto que comprende un péptido de la invención o un soporte sólido de la invención. En ambos casos, en una realización particular, dicho péptido de la invención es un péptido cuya secuencia aminoacídica comprende, o está constituida por, una secuencia de aminoácidos seleccionada entre cualquiera de las SEQ ID NO: 27-50 o SEQ ID NO: 133-212, o un fragmento de las mismas que comprende, al menos, un epítopo del alérgeno Ole e 1 o del alérgeno Ole e 2 de polen de olivo. En otra realización particular, el kit de la invención es un kit para el diagnóstico in vivo de alergia a polen de olivo de una variedad definida de olivo en un sujeto que comprende un anticuerpo de la invención. En una realización concreta, cuando el kit está destinado para su empleo en seres humanos, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo quimérico, humanizado o, preferentemente, completamente humano, monoclonal, o un fragmento del mismo, tal como, por ejemplo, un scFv, opcionalmente, oligomerizado (di- o multimerizado). En una realización específica, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo capaz de unirse a un péptido cuya secuencia aminoacídica

comprende, o está constituida por, una secuencia de aminoácidos seleccionada entre cualquiera de las SEQ ID NO: 27-50 o SEQ ID NO: 133-212, o un fragmento de las mismas que comprende, al menos, un epítopo del alérgeno Ole e 1 o del alérgeno Ole e 2 de polen de olivo,

G. Aplicaciones adicionales

Los péptidos de la invención también pueden ser utilizados para identificar in vitro la reacción celular al alérgeno Ole e 1 o al alérgeno Ole e 2 de polen de olivo de una variedad definida de olivo. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de un péptido de la invención en la identificación in vitro de la reacción celular al alérgeno Ole e 1 o al alérgeno Ole e 2 de polen de olivo de una variedad definida de olivo, mediante la estimulación o inhibición de dicha reacción celular. En una realización particular, dicho péptido de la invención comprende un péptido cuya secuencia aminoacídica comprende, o está constituida por, una secuencia de aminoácidos seleccionada entre cualquiera de las SEQ ID NO: 27-50 o SEQ ID NO: 133-212, o un fragmento de las mismas que comprende, al menos, un epítopo del alérgeno Ole e 1 o del alérgeno Ole e 2 de polen de olivo. Los métodos empleados para medir dicha reacción celular son conocidos por los expertos en la materia e incluyen, entre otros, a título ilustrativo, métodos para medir la activación de células T [Thomas et al. "Recombinant allergens for analysing T-cell responses". Methods. 2004; 32(3):255-64], métodos para medir la activación de basófilos [Valent et al. "Assays for measuring in vitro basophil activation induced by recombinant allergens". Methods. 2004; 32(3):265-70], métodos para medir la liberación de histamina [Valent et al. (2004) citado supra]. Por otra parte, a partir del análisis de las secuencias nucleotídicas y/o aminoacídicas de los alérgenos determinados para cada cultivar de olivo y de los datos de reactividad de las correspondientes proteínas recombinantes frente a los diferentes ensayos propuestos, la conservación en las diferentes secuencias de epítopos de células T y B, etc., es posible definir estrategias para diseñar moléculas recombinantes que cubran el espectro de epítopos (es decir, mantengan la inmunogenicidad), pero que presenten alergenicidad reducida. Estas moléculas pueden ser construidas a partir de las secuencias precursoras obtenidas de variedades, mediante ingeniería genética,

mutagénesis dirigida, modificación química de los alérgenos, síntesis de péptidos etc. Una vez obtenidas, estas moléculas hipoalergénicas pueden ser ensayadas en pruebas de reactividad, y en inmunoterapia de pacientes alérgicos.

Por tanto, los ácidos nucleicos de la invención y los péptidos de la invención pueden ser utilizados, además, para obtener y/o producir productos derivados de dichos ácidos nucleicos y péptidos de la invención, por ejemplo, sondas, construcciones antisentido, anticuerpos, etc. Dichos productos derivados de dichos ácidos nucleicos y péptidos de la invención pueden ser útiles en investigación, diagnóstico, terapia y/o prevención de alergia al polen de olivo y/o en la caracterización de cultivares de olivo, por ejemplo, en la caracterización de variedades definidas de olivo.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de un ácido nucleico de la invención para obtener productos derivados de dichos ácidos nucleicos, potencialmente útiles en investigación, diagnóstico, terapia y/o prevención de alergia al polen de olivo y/o en la caracterización de cultivares de olivo. En una realización particular, dicho ácido nucleico de la invención comprende un ácido nucleico cuya secuencia nucleotídica comprende, o está constituida por, una secuencia de nucleótidos seleccionada entre cualquiera de las SEQ ID NO: 1-24 o SEQ ID NO: 53-132, o un fragmento de las mismas que codifica un péptido que comprende, al menos, un epítopo del alérgeno Ole e 1 o del alérgeno Ole e 2 de polen de olivo. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichos productos derivados de dichos ácidos nucleicos de la invención comprenden sondas ADN, sondas ARN, vacunas ADN, construcciones antisentido, construcciones hipoalergénicas o hiperalergénicas modificadas, construcciones para la sobreexpresión del alérgeno recombinante, construcciones de "knocking out" de genes de alérgenos, etc. Dichas sondas (ADN o ARN) pueden estar, opcionalmente, marcadas, por ejemplo, con haptenos o moléculas indicadoras o genes testigo ("repórter genes"), moléculas fluorescentes, moléculas radiactivas, partículas de oro, enzimas, etc., y se basan en las secuencias nucleotídicas de los ácidos nucleicos de la invención, correspondiéndose con las secuencias totales o parciales, fusionadas o generadas mediante transcripción in vitro, PCR, nick-translation o cualquier otro método, incluida la síntesis química. Las vacunas ADN para inmunización genética pueden incluir, opcionalmente, otras secuencias inmunomodul antes o co-estimulantes, secuencias para

péptidos señal, adaptaciones al código genético humano, etc. [Hartl et al. "DNA vaccines for allergy treatment. Methods. 2004; 32(3):328-339],

En una realización particular, dicha construcción antisentido, construcción hipolergénica o hiperalergénica modificada, construcción para la sobreexpresión del alérgeno recombinante, o construcción para "knocking out" de genes de alérgenos puede ser utilizada para obtener plantas de olivo u otras Oleáceas transformadas genéticamente capaces de expresar características deseables. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de plantas con características deseables incluyen plantas que muestren depleción de los niveles de proteínas alergénicas, es decir, con un polen incapaz de desencadenar fenómenos alérgicos; estas plantas son plantas cuyo uso preferencial es de tipo ornamental en áreas urbanas o de gran densidad de población, jardines, interior de edificios, fijadores de suelo en obras públicas (autopistas e incluso repoblación). En el caso de ambos alérgenos, Ole e 1 y Ole e 2, y debido a sus importantes papeles en la hidratación y germinación del polen, las plantas en las que consiguiera "knocking out" de alguno de estos alérgenos serían probablemente andró estén les, e incapaces de producir polen fisiológicamente funcional, por lo que poseerían un gran uso potencial en programas de mejora genética, actuando exclusivamente como receptoras de polen. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de otras Oleáceas susceptibles de ser transformadas incluyen Fraxinus ornus, Fraxinus excelsior, Fraxinus angustifolia, Fraxinus oxycarpa, Ligustrum vulgaris, Syringa vulgaris, Forsithya suspensa, Olea africana, Phillyrea angustifolia, Phillirea latifolia, Jasminum qfficinalis, etc.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de un péptido de la invención para obtener productos derivados de dichos péptidos, potencialmente útiles en investigación, diagnóstico, terapia y/o prevención de alergia al polen de olivo y/o en la caracterización de cultivares de olivo. En una realización particular, dicho péptido de la invención comprende un péptido cuya secuencia aminoacídica comprende, o está constituida por, una secuencia de aminoácidos seleccionada entre cualquiera de las SEQ ID NO: 27-50 o SEQ ID NO: 133-212, o un fragmento de las mismas que comprende, al menos, un epítopo del alérgeno Ole e 1 o del alérgeno Ole e 2 de polen de olivo. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichos productos derivados de dichos péptidos de la invención comprenden oligómeros de péptidos de la invención, anticuerpos y fragmentos de los mismos que reconocen epítopos de dichos péptidos de

la invención o mimotopos (péptidos que mimetizan el lugar de reconocimiento de un anticueφo pero que no corresponden a la secuencia lineal del antígeno conocido). Dichos productos derivados de los péptidos de la invención pueden obtenerse por métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia. A modo ilustrativo, pueden obtenerse oligómeros de los péptidos de la invención fusionando la secuencia nucleotídica codificante de un péptido de la invención a un dominio de oligomerización, por ejemplo, un dominio de dimerización, trimerización, tetramerización, etc., de manera que cuando se expresa se producen los oligómeros. Los anticuerpos pueden obtenerse por métodos convencionales tal como se ha mencionado previamente, por ejemplo, inoculando péptidos de la invención a un animal de experimentación. Los fragmentos de anticuerpos pueden obtenerse por técnicas convencionales, por ejemplo, sometiendo los anticuerpos a la acción de las enzimas apropiadas o bien mediante métodos recombinantes para obtener scFv, etc.

Los productos derivados de los ácidos nucleicos de la invención y los productos derivados de los péptidos de la invención, potencialmente útiles en investigación, diagnóstico, terapia y/o prevención de alergia al polen de olivo y/o en la caracterización de cultivares de olivo, también forman parte de la presente invención.

Por tanto, en otro aspecto, la invención lo constituye un producto derivado de un ácido nucleico de la invención, potencialmente útil en investigación, diagnóstico, terapia y/o prevención de alergia al polen de olivo y/o en la caracterización de cultivares de olivo. En una realización particular, dicho producto derivado de un ácido nucleico de la invención comprende una sonda ADN, una sonda ARN, una vacuna ADN, una construcción antisentido, una construcción hipo al er geni ca o hiperalergénica modificada, una construcción para la sobreexpresión del alérgeno recombinante, una construcción de "knocking out" de genes de alérgenos, etc. Dichas sondas (ADN o ARN) pueden estar, opcionalmente, marcadas, por ejemplo, con haptenos o con moléculas indicadoras o genes testigo ("repórter genes"), moléculas fluorescentes, moléculas radiactivas, partículas de oro, enzimas, etc. En una realización particular, el ácido nucleico de la invención del que deriva dicho producto derivado de ácido nucleico de la invención comprende un ácido nucleico cuya secuencia nucleotídica comprende, o está constituida por, una secuencia de nucleótidos seleccionada entre cualquiera de las SEQ ID NO: 1- 24 o las SEQ ID NO: 53-132, o un fragmento de las mismas que codifica un péptido

que comprende, al menos, un epítopo del alérgeno Ole e 1 o del alérgeno Ole e 2 de polen de olivo.

En otro aspecto, la invención lo constituye un producto derivado de un péptido de la invención, potencialmente útil en investigación, diagnóstico, terapia y/o prevención de alergia al polen de olivo y/o en la caracterización de cultivares de olivo. En una realización particular, dicho producto derivado de un péptido de la invención comprende un oligómero de un péptido de la invención, un anticuerpo de la invención, un mimotopo, etc. En una realización particular, el péptido de la invención del que deriva dicho producto derivado de péptido de la invención comprende un péptido cuya secuencia nucleotídica comprende, o está constituida por, una secuencia de aminoácidos seleccionada entre cualquiera de las SEQ ID NO: 27-50 o SEQ ID NO: 133-212, o un fragmento del mismo que comprende, al menos, un epítopo del alérgeno Ole e 1 o del alérgeno Ole e 2 de polen de olivo.

H. Método in vitro para identificar el alérgeno de Ia variedad de olivo causante de alergia en un sujeto

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para identificar el alérgeno del polen de la variedad de olivo {Olea europaea) causante de alergia en un sujeto o para identificar la variedad de olivo {Olea europaea) causante de alergia en un sujeto que comprende: a) poner en contacto, por separado, una muestra biológica procedente de un sujeto con cada uno de los péptidos que constituyen una pluralidad de péptidos, en donde cada uno de dichos péptidos presente en dicha pluralidad de péptidos está separado del resto de péptidos y comprende, al menos, un epítopo de un alérgeno de polen de olivo específico de una variedad definida de olivo; y b) determinar el título de IgE y, opcionalmente, de IgG, frente a dichos péptidos en dicha muestra biológica.

El título de IgE y, en su caso, de IgG frente a los péptidos en cuestión, se puede determinar por cualquier método convencional conocido por los expertos en la materia, por ejemplo, los métodos citados previamente en esta descripción (véase, por ejemplo, el apartado E).

En una realización particular, cada uno de los péptidos presentes en dicha pluralidad de péptidos comprende, al menos, un epítopo de un alérgeno de polen de olivo específico de una variedad definida de olivo, en donde dicho alérgeno de polen de olivo se selecciona entre los alérgenos Ole e 1, Ole e 2, Ole e 3, Ole e 4, Ole e 5, Ole e 6, Ole e 7, Ole e 8, Ole e 9, Ole e 10 y sus mezclas.

En otra realización particular, dicha pluralidad de péptidos contiene, al menos, un péptido que comprende, al menos, un epítopo del alérgeno Ole e 1 o del alérgeno Ole e 2 de polen de olivo específico de una variedad definida de olivo. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dicha variedad definida de olivo incluye las variedades de olivo denominadas Picholine, Menara, Lucio, Picual, Loaime, Hojiblanca, Arbequina, Bella de España, Lechín de Sevilla, Verdial de Vélez-Málaga, Verdial de Huevar, Picudo, Manzanilla de Sevilla, Cornicabra, Blanqueta, Empeltre, Farga, Frantoio, Galega, Leccino, Lechín de Granada, Morrut, Sevillenca, Sourani, Villalonga y Acebuche. En otra realización particular de dicho método, dicha pluralidad de péptidos comprende, al menos, un péptido de la invención, tal como un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las secuencias identificadas como SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41,

SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46,

SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 y un fragmento de las mismas que comprende, al menos, un epítopo del alérgeno Ole e 1 de polen de olivo.

En otra realización particular de dicho método, dicha pluralidad de péptidos comprende, al menos, un péptido de la invención, tal como un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las secuencias identificadas como SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150; SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 160,

SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 212 y un fragmento de las mismas que comprende, al menos, un epítopo del alérgeno Ole e 2 de polen de olivo.

En otra realización particular, dicho método comprende, antes de la etapa a), la etapa de poner en contacto una muestra biológica de dicho sujeto con una mezcla de alérgenos de polen de olivo. En una realización concreta, dicha mezcla de alérgenos de polen de olivo comprende un extracto proteico de polen de olivo de cualquier variedad de olivo. En otra realización concreta, dicha mezcla de alérgenos de polen de olivo contiene dos o más péptidos comprendiendo cada uno de dichos péptidos, al menos, un epítopo de un alérgeno de polen de olivo específico de una variedad definida de olivo. En una realización particular, dicho alérgeno de polen de olivo se selecciona entre los alérgenos Ole e 1, Ole e 2, Ole e 3, Ole e 4, Ole e 5, Ole e 6, Ole e 7, Ole e 8, Ole e 9, Ole e 10 y sus mezclas.

I. Diagnóstico e inmunoterapia personalizada

Una característica de la presente invención es que permite el diseño de métodos de diagnóstico personalizados y el diseño de inmunoterapias desensibilizantes personalizadas.

Diseño de métodos de diagnóstico personalizados

Una vez obtenido un panel representativo de alérgenos recombinantes, que comprenden, al menos un péptido de la invención, para las variedades de olivo a

determinar, y tras su estandarización, se procede a su empleo en diagnóstico personalizado de pacientes potencialmente atópicos. Para ello se diseñan pruebas de diagnóstico que incluyan dichos alérgenos recombinantes específicos de las distintas variedades, especialmente aquellas pruebas in vitro que permitan el ensayo simultáneo de muestras biológicas de los pacientes frente a un gran número de alérgenos, tales como las pruebas de tipo RAST, RIA, ELISA, chips o microarrays de alérgenos, etc. Con los alérgenos recombinantes es posible, además, realizar otras pruebas in vitro tales como la respuesta de activación de células T, la determinación de la activación de basófilos, la medida de la liberación de histamina, etc. Además de las pruebas in vitro es posible diseñar pruebas in vivo, por ejemplo, del tipo SPT, intradérmicas, de provocación nasal, bronquial, conjuntival, etc., sujetas a la aprobación del uso de dichos productos recombinantes y la adaptación de dichas pruebas a la normativa aplicable.

En este tipo de diagnósticos y, fundamentalmente, para el caso de pruebas in vivo, se podría seguir una aproximación en dos, e incluso en más etapas, como las descritas en la solicitud de patente española ES 2196952, que incluiría el ensayo primario de un panel de alérgenos recombinantes procedentes del polen de las variedades de olivo consideradas variedades dominantes en la región geográfica correspondiente del paciente. Tras esta primera aproximación, y en el caso de que se obtengan resultados positivos, se procede a la determinación de la reactividad frente a los diversos alérgenos recombinantes específicos de variedad de olivo de forma individualizada, así como a variedades consideradas "secundarias" de la comarca olivarera de origen del paciente, con objeto de ajustar en el mayor grado posible la(s) variedad(es) y el(los) alérgeno(s) responsables de la hipersensibilidad. Obviamente, el kit de diagnóstico debe contener al igual que los kits comercializados actualmente, diversos controles positivos (i.e. histamina hidroclórica), así como controles negativos (el mismo tampón en que se realizan las diluciones de los extractos, proteínas alergénicas recombinantes de variedades con baja/nula reactividad etc.).

Diseño de inmuno terapias desensibilizantes personalizadas Una vez establecido el diagnóstico con la mayor precisión posible, se puede personalizar la composición de la vacuna correspondiente para aquellos pacientes en los que la inmunoterapia sea el tratamiento de elección de acuerdo a parámetros médicos

bien definidos (e.g., imposibilidad de aislamiento físico frente al agente alergénico, mantenimiento de los síntomas incluso en pacientes tratados con medicamentos, prevención de la aparición o exacerbación de asma, etc.). Las vacunas o tratamientos desensibilizantes deberían contener un número adecuado de unidades comparativas totales de potencia inmunológica, repartidas proporcionalmente entre los distintos alérgenos recombinantes de las distintas variedades causantes de la alergia para cada paciente en base a la reactividad de éste a las distintas pruebas de diagnóstico in vitro e in vivo. El protocolo de inmunoterapia podría seguir las recomendaciones ya establecidas para los extractos comerciales, de los que ya se posee amplia experiencia clínica.

Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un método para diseñar una terapia personalizada para un sujeto que padece alergia al polen de olivo de una variedad definida de olivo que comprende:

(i) identificar el alérgeno del polen de la variedad de olivo (Olea europaea) o la variedad de olivo (Olea europaea) causante de alergia en dicho sujeto; y

(ii) preparar una composición farmacéutica que comprende el alérgeno identificado en (i) o una variante hipo al er geni ca del mismo o un anticuerpo capaz de unirse a dicho alérgeno.

La identificación del alérgeno del polen de la variedad de olivo o de la variedad de olivo causante de alergia en dicho sujeto puede llevarse a cabo mediante el procedimiento descrito previamente (véase el apartado H de esta descripción).

La composición farmacéutica y su preparación pueden llevarse a cabo mediante la metodología descrita en el apartado D de esta descripción.

La variante hipoalergénica y su obtención pueden llevarse a cabo mediante la metodología descrita en el apartado B de esta descripción.

J. Método de tratamiento

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para prevenir y/o tratar una reacción alérgica causada por alergia al polen de olivo en un sujeto que comprende administrar a dicho sujeto un péptido de la invención o una composición farmacéutica de la invención.

Los siguientes ejemplos ilustran la invención y no deben ser considerados en sentido limitativo de la misma.

EJEMPLO 1

GENERACIÓN DE ALÉRGENOS DE Ole e 1 RECOMBINANTES DE DISTINTAS VARIEDADES DE OLIVO Y SU UTILIZACIÓN EN

DIAGNÓSTICO E INMUNOTERAPIA 1.1 Obtención de las secuencias alergénicas Las muestras de polen de Olea europaea L. fueron obtenidas durante los meses de Mayo y Junio de 2001 y 2003 de árboles perfectamente determinados vari etalm ente de los cultivares Loaime, Menara, Picholine marocaine, Lucio, Arbequina, Hojiblanca, Bella de España y Picual. Las muestras de polen fueron recolectadas individualmente en, al menos, dos árboles de cada variedad, a partir de numerosas ramas mediante agitación de las inflorescencias englobadas en el interior de bolsas de papel. De forma previa a su congelación en nitrógeno líquido y almacenaje, el polen fue purificado mediante tamizado a través de mallas de 150 μm para eliminar los restos de corolas, anteras y otros contaminantes. Tras análisis con técnicas microscópicas, se estimó que la presencia de pólenes anormales morfológicamente o pólenes de otras especies era inferior a 0,1 % y que la presencia de partículas contaminantes de materiales vegetales era inferior a 0,5% en todas las variedades.

Se extrajo ARN total del polen de cada variedad utilizando un kit RNeasy Plant Total RNA (Quiagen, USA). Para ello, las muestras de polen fueron molidas en un mortero preenfriado con nitrógeno líquido y posteriormente procesadas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Tanto la calidad como la concentración del ARN total fueron determinadas mediante electroforesis en geles desnaturalizantes y mediante determinación de la relación A260/A280. El ARN fue procesado inmediatamente mediante transcripción inversa acoplada a la reacción en cadena de la polimerasa (RT- PCR) o almacenado a -8O ⁰ C. Se llevó a cabo la transcripción inversa de 5 μg de ARN total por muestra, utilizando como transcriptasa inversa la enzima M-MLV reverse transcriptase (Promega, USA) y un adaptador oligo-dT como cebador (SEQ ID NO: 51). Las

reacciones de PCR se llevaron a cabo en muestras de 250 ng de cada una de las reacciones de transcripción inversa correspondientes a un volumen de 5 μl tras la adición de 5 μl de tampón de PCR 1Ox, 25 ng de cada cebador: Ole e 1 (SEQ ID NO: 52) y adaptador oligo-dT (SEQ ID NO: 51), dNTPs hasta una concentración final de 1 mM cada uno, 2,5 U DynaZyme DNA polymerase (Finnzymes Oy, Finland) y agua hasta un volumen final de 50 μl. Las muestras fueron desnaturalizadas durante 2 minutos a 95 ⁰ C y sometidas a amplificación mediante PCR con 30 ciclos de 94 ⁰ C durante 1 minuto, 57 ⁰ C durante 2 minutos y 72 ⁰ C durante 1 minuto. El oligonucleótido cebador Ole e 1 fue diseñado a partir de las secuencias del alérgeno mayoritario del polen del olivo Ole e 1 ya descritas en las bases de datos. Los productos de la reacción de amplificación (5 μl), fueron analizados mediante electroforesis en geles de agarosa al 1% en TAE [Tris-acetato/EDTA (ácido etilendiaminotetraacético)]. En dichos geles, aparecen bandas de aproximadamente 612 pares de bases (pb) que fueron escindidas y purificadas utilizando un kit específico (Prep-A-Gene de Bio-Rad). Los fragmentos amplificados fueron posteriormente clonados usando un sistema pGEM-T Easy (Promega). Un mínimo de tres clones por cada variedad fueron secuenciados.

A continuación se procedió al análisis de las secuencias utilizando el programa Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn) (Altschul SF, Gish SF, Miller W, Myers EW and Lipman DJ (1990). Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215, 403-410) y a su remisión a la base de datos GenBank™/EMBL, aunque sin acceso público hasta la fecha de presentación de esta solicitud de patente. El 80% de las secuencias obtenidas muestra una similitud de 97% con la forma 1/3 C del alérgeno mayoritario Ole e 1 que existe en la base de datos GenBank™/EMBL (Número de acceso: X 76395) (Villalba M, Batanero E, Monsalve RI, González de la Peña MA, Lahoz C, Rodríguez R. Cloning and expression of Ole e I, the major allergen from olive bree pollen. J Biol Chem 1994; 269:15217-15222). Los tres clones correspondientes a la variedad Bella de España presentan una homología del 93% con la forma 1/5C de Ole e 1 (GenBank™/EMBL Número de acceso: X 76396). En la Tabla 9 se ilustra el nombre así como el número de acceso de cada clon remitido a la base de datos.

Tabla 9

Las secuencias obtenidas fueron analizadas mediante programas de análisis adecuado, obteniéndose los alineamientos correspondientes (Software Clustal_X 1.81), y un análisis de clústers (Software TreeView 1.6.5), que ha permitido establecer las relaciones correspondientes entre las variedades (Figura 4). Los resultados indican que la variabilidad presente en la secuencia a nivel intravarietal es mucho menor que la variabilidad intervarietal, lo que permite definir secuencias consenso para cada variedad analizada. Dichas secuencias consenso representan la secuencia más probable por cada variedad y permiten simplificar aquellos procedimientos en los que el trabajo con la

totalidad de las secuencias no sea practicable (por ejemplo, expresión recombinante y pruebas clínicas subsecuentes).

Las microheterogeneidades detectadas en las secuencias nucleotídicas llegan a afectar en algunos casos a las secuencias aminoacídicas (SEQ ID NO: 27-50).

1.2 Obtención de las proteínas recombinantes

Cada una de las secuencias correspondientes a Ole e 1 de cada variedad analizada son subclonadas desde pGEM-T easy (Promega) hasta la región polylinker de un vector comercial de expresión PinPoint Xa (Promega Corporation, Madison, WI, USA) adecuado para la inserción "en fase" de los fragmentos (plásmidos Xa-I, Xa-2 ó Xa-3) previamente linearizado, mediante procedimientos estándar. La construcción resultante es usada para transformar células competentes de E. coli de tipo DH5α (GIBCO BRL Life Technologies, Paisley, UK). Los transformantes resistentes a ampicilina son aislados y sometidos a análisis de restricción y a secuenciación con la utilización de un cebador PinPoint Sequencing Primer (Promega Corporation, Madison, WI, USA) para asegurar el mantenimiento de la correcta pauta de lectura y confirmar la presencia de las secuencias de Ole e 1.

La expresión y purificación de las proteínas de fusión de Ole e 1 en las distintas variedades se lleva a cabo básicamente según los procedimientos descritos por Alché y col., en Prot. Express. Purif. 16, 251-260. 1999. Brevemente y para cada producto recombinante: una única colonia recombinante aislada es cultivada en medio LB (Luria Bertani)/ampicilina (20 μg/ral); tras inducir la expresión con IPTG (isopropiltio-β-D- galactósido) 1 mM y posterior incubación, las células bacterianas son separadas del medio, y la presencia de la proteína Ole e 1 de fusión analizada tanto en el medio de cultivo como en el sobrenadante de un lisado crudo de las células bacterianas. Para dicho análisis se recurre a experimentos de Westem-blotting utilizando tanto un anticuerpo monoclonal frente a Ole e 1 (Alché JD, Castro AJ, Olmedilla A, Fernández MC, Rodríguez R, Villalba M and Rodríguez-García MI: 'The major olive pollen allergen (Ole e 1) shows both gametophytic and sporophytic expression during anther development, and its synthesis and storage takes place in the RER". J. CeIl Sci. 112(15), 2501-2509. 1999) como un reactivo streptavidina-conjugado con fosfatasa alcalina (Alché JD, Paul E and Dickinson HG: 'Ηeterogously expressed polypeptide from the

yeast meiotic gene HOPl binds preferentially to yeast DNA". Prot. Express. Purif. 16, 251-260. 1999) capaces de detectar la proteina y el polipéptido biotinilado de fusión respectivamente.

En la mayor parte de las proteínas de fusión, se observa una cantidad significativa de proteína expresada de forma soluble, por lo que se procede a su purificación directamente mediante cromatografía en una columna de la resina SoftLink Soft Reléase Avidin Resin (Promega Corporation, Madison, WI, USA), capaz de eluir la proteina de fusión en condiciones no desnaturalizantes, tales como incubación con biotina 5 mM en un tampón Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 50 mM, 5% glicerol. Cada una de las proteínas de fusión obtenidas es sometida a una digestión con endoproteinasa (factor Xa) para liberar el polipéptido biotinilado. La digestión se realiza añadiendo 0,01 μl de factor Xa (Promega Corporation, Madison, WI, USA) por μg de proteína de fusión, en tampón de reacción 1 X optimizado para dicho enzima (Promega Corporation, Madison, WI, USA ). La mezcla de reacción se incuba durante 3 horas a 37 ⁰ C. La digestión se detiene mediante precipitación con ácido tricloroacético (TCA) (concentración final 10%) a 4 ⁰ C, centrifugación, desecación del precipitado y posterior resuspensión en tampón Tris-HCl 10 mM (pH 8,0). Los resultados de las digestiones son de nuevo analizados mediante Western-blotting, y las proteínas recombinantes Ole e 1 resultantes purificadas mediante elución diferencial en una columna de exclusión molecular "Superosa 12" (Pharmacia LKB FPLC system, Pharmacia LKB Biotechnology, Milton Keynes, UK). En cada aislamiento se cargan 200 μl de solución de la proteina digerida sobre la columna y se realiza la elución con tampón Tris-HCl 10 mM (pH 8,0) según el siguiente esquema:

VOLUMEN ELUIDO* FRACCIONAMIENTO

10 mi 2 fracciones x 5 mi

3 mi 6 fracciones x 0,5 mi

4 mi 20 fracciones x 0,2 mi 7 mi 7 fracciones x 1 mi

Volumen total = 24 mi N ⁰ total de fracciones = 35

*La proleína Ole e 1 aparece como un pico en las mediciones de densidad óptica (280nm) presente en las fracciones 15 a 20. El análisis SDS-PAGE de dichas fracciones ofrece una banda única correspondiente a la proteína Ole e 1 recombinante.

1.3 Estandarización de los productos recombinantes

Los productos recombinantes obtenidos se someten a un análisis final mediante cuantificación proteica, SDS-PAGE y Western blotting con la utilización de un panel de anticuerpos monoclonales anti-Ole e 1 de forma similar a la caracterización de los extractos proteicos crudos de polen de olivo (Castro AJ, Al che JD, Cuevas J, Romero PJ, Al che V and Rodríguez-García MI: "Pollen from different olive tree cultivars contains varying amounts of the major allergen Ole e 1". Int. Arch. Allergy Clin Immunol 131, 164-173. 2003).

Finalmente, se determina la potencia biológica de cada una de las proteínas recombinantes utilizando técnicas de diagnóstico in vitro que incluyen el análisis de la reactividad de sueros de pacientes en experimentos de Western-blot (Castro AJ: "Aproximación a la función biológica del alérgeno mayoritario del polen del olivo (Ole e 1). Implicaciones clínicas y ambientales" Tesis Doctoral. Universidad de Granada. 2001) y mediante titulación por técnicas de ELISA (Quiralte J, Florido F, Arias de Saavedra JM, Gómez A, Sáenz de San Pedro B, González E and Rodríguez R: "Olive allergen-specific IgE responses in patients with Olea euroapea pollinosis" Allergy 57 (Suppl. 71):47-52. 2002). En ambos casos se utiliza un panel de sueros de pacientes preanalizados según técnicas estándar y reconocidos como positivos y negativos, y en comparación con extractos comerciales de reconocida eficacia y potencia inmunológica.

1.4 Elaboración de un kit de diagnóstico y ejemplo de diagnóstico de un paciente

Protocolo general

Las soluciones de alérgenos recombinantes obtenidas constituyen la base para un kit experimental para dicho diagnóstico. A modo ilustrativo, los pacientes sintomáticos de los que se sospecha poseen hipersensibilidad tipo I a aeroalérgenos pueden ser chequeados de forma primaria mediante SPT con un kit que contendría extractos alergénicos comunes, entre los que se encontrarían diversas mezclas de alérgenos recombinantes de polen de olivo correspondientes a las variedades dominantes en la comunidad autonómica correspondiente. Tras esta primera aproximación, y en el caso

de positividad, se procedería a la determinación de reactividad frente a los diversos alérgenos recombinantes de forma individualizada, así como a alérgenos recombinantes de variedades consideradas "secundarias" de la comarca olivarera de origen del paciente, con objeto de ajustar en el mayor grado posible la(s) variedad(es) responsables de la hipersensibilidad. Obviamente, dicho kit contendría, al igual que los kits comercializados actualmente, diversos controles positivos (por ejemplo, histamina hidrocloruro), así como controles negativos (el mismo tampón en que se realizan las diluciones de los extractos, extractos de variedades con baja/nula reactividad o extractos de variedades irrelevantes o americanas).

Caso hipotético (Ejemplo de aplicación de la invención ^" )

Paciente varón, de 46 años de edad, nacido y residente en Granada con historial de rinitis y conjuntivitis estacional, diagnosticado de asma bronquial medíante espirometría y test de broncodilatador, y de alergia al polen del olivo tras SPTs con extractos comerciales. Tras supresión de tratamiento antihistamíníco, el suero del paciente es sometido a pruebas de reactividad en un ensayo de tipo ELISA [Quiralte et al., Allergy 57 (Suppl. 71):47-52 (2002)] con un kit experimental que contiene diferentes alérgenos recombinantes correspondientes a Ole e 1 de las variedades dominantes en Andalucía (Picual, Hojiblanca, Lechín de Sevilla, Manzanilla de Sevilla, Verdial de Huevar, Gordal Sevillana, Verdial de Velez-Málaga, Aloreña, Lechín de Granada, Manzanilla Prieta), así como de las variedades secundarias de la comarca granadina "La Vega" (Lucio, Loaime y Cornezuelo), los cuales pueden ser obtenidos según la metodología desciita en esta memoria. Al tratarse de un ejemplo hipotético está redactado según lo que se considera que debería hacerse en un caso de un paciente de la región de La Vega granadina, independientemente de que en el momento actual no se disponga de las secuencias de Ole e 1 de todas las variedades implicadas.

La estandarización de dichos alérgenos recombinantes, realizada según el método descrito en el apartado 1.3, han permitido cuantificar su contenido en alérgeno mayoritario Ole e 1 en 50 μg/ml, y su potencia inmunológica en 100 BU (unidades biológicas, del inglés "biological units")/ml. Una vez cuantificado el ELISA, el paciente muestra la reactividad mostrada en la Tabla 10.

Tabla 10

donde

"-" significa que el paciente no es sensible al polen del olivo de la variedad en cuestión;

"+" significa que el paciente es muy poco sensible al polen del olivo de la variedad en cuestión;

"++" significa que el paciente es poco sensible al polen del olivo de la variedad en cuestión;

"+++" significa que el paciente es sensible al polen del olivo de la variedad en cuestión; y

"++++" significa que el paciente es muy sensible al polen del olivo de la variedad en cuestión

1.5 Preparación de vacunas personalizadas y ejemplo de la inmunoterapia de un paciente

Una vez establecido el diagnóstico con la mayor precisión posible, se puede personalizar la composición de la vacuna correspondiente para aquellos pacientes en los que la inmunoterapia sea el tratamiento de elección de acuerdo a parámetros médicos bien definidos (p. e., imposibilidad de aislamiento físico frente al agente alergénico, mantenimiento de los síntomas incluso en pacientes tratados con medicamentos, prevención de la aparición o exacerbación de asma, etc.). Dichas vacunas deben contener el número adecuado de unidades comparativas totales de potencia inmunológica, aunque repartidas proporcionalmente para cada una de las formas recombinantes de alérgenos correspondientes a las variedades causantes de la alergia para cada paciente en base a la reactividad de éste a los SPTs. El protocolo de inmunoterapia seguirá las recomendaciones ya establecidas para extractos comerciales, de los que ya se posee amplia experiencia clínica.

Como continuación del caso hipotético de diagnóstico de un paciente [apartado 1.4], seguidamente se documenta un ejemplo de preparación de un tratamiento de inmunoterapia personalizada para dicho paciente. El paciente es considerado candidato a inmunoterapia en base a la imposibilidad de aislamiento físico de la fuente alergénica, la baja respuesta a tratamiento farmacológico y el aumento progresivo de los síntomas. El estudio de reactividad de su suero sugiere la siguiente composición de alérgenos recombinantes para el tratamiento, a partir de soluciones concentradas de cada una de las variedades:

La pauta de administración de la inmunoterapia se realiza según patrones establecidas por el Subcomité de Inmunoterapia de la EAACI, hasta llegar a dosis de mantenimiento según la tolerancia del paciente. Periódicamente se irían haciendo nuevas pruebas de diagnóstico con el fin de evaluar si se va produciendo una disminución generalizada de la reactividad en todas las variedades testadas, lo que sería indicativo de una mejora de la condición alérgica en el paciente.

EJEMPLO 2 GENERACIÓN DE ALÉRGENOS RECOMBINANTES DE Ole e 2 DE

DISTINTAS VARIEDADES DE OLIVO Y SU UTILIZACIÓN EN

DIAGNÓSTICO E INMUNOTERAPIA 2.1 Obtención de las secuencias alergénicas

Las muestras de polen de Olea europaea L. fueron obtenidas durante los meses de Mayo y Junio de 2001 y 2003 de árboles perfectamente determinados vari etalm ente de los cultivares Lechín de Sevilla, Verdial de Vélez-Málaga, Hojiblanca, Verdial de

Huevar, Picudo, Manzanilla de Sevilla, Arbequina, Cornicabra, Blanqueta, Loaime,

Lucio, Bella de España, Empeltre, Farga, Frantoio, Galega, Leccino, Lechín de

Granada, Morrut, Sevillenca, Sourani, Villalonga, Acebuche y Picual. Las muestras de polen fueron recolectadas individualmente en, al menos, dos árboles de cada variedad, a partir de numerosas ramas mediante agitación de las inflorescencias englobadas en el interior de bolsas de papel. De forma previa a su congelación en nitrógeno líquido y almacenaje, el polen fue purificado mediante tamizado a través de mallas de 150 μm para eliminar los restos de corolas, anteras y otros contaminantes. Tras análisis con técnicas microscópicas, se estimó que la presencia de pólenes anormales morfológicamente o pólenes de otras especies era inferior a 0,1% y que la presencia de partículas contaminantes de materiales vegetales era inferior a 0,5% en todas las variedades.

Se extrajo ARN total del polen de cada variedad utilizando un kit RNeasy Plant Total RNA (Qiagen, USA). Para ello, las muestras de polen fueron molidas en un mortero preenfriado con nitrógeno líquido y posteriormente procesadas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Tanto la calidad como la concentración del ARN total

fueron determinadas mediante electroforesis en geles desnaturalizantes y mediante determinación de la relación A260/A280. El ARN fue procesado inmediatamente mediante transcripción inversa acoplada a la reacción en cadena de la polimerasa (RT- PCR) o almacenado a -8O ⁰ C. Se llevó a cabo la transcripción inversa de 5 μg de ARN total por muestra, utilizando como transcriptasa inversa la enzima M-MLV reverse transcriptase (Promega, USA) y un adaptador oligo-dT como cebador (SEQ ID NO: 51). Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en muestras de 250 ng de cada una de las reacciones de transcripción inversa correspondientes a un volumen de 5 μl tras la adición de 5 μl de tampón de PCR 1Ox, 25 ng de cada cebador: OL-I (SEQ ID NO: 213) y OL-2 (SEQ ID NO: 214), dNTPs hasta una concentración final de 1 mM cada uno, 2,5 U DynaZyme DNA polymerase (Finnzymes Oy, Finland) y agua hasta un volumen final de 50 μl. Las muestras fueron desnaturalizadas durante 2 minutos a 95 ⁰ C y sometidas a amplificación mediante PCR con 30 ciclos de 94 ⁰ C durante 1 minuto, 57 ⁰ C durante 1 minuto y 72 ⁰ C durante 1 minuto. Los productos de la reacción de amplificación (5 μl), fueron analizados mediante electroforesis en geles de agarosa al 1% en TAE [Tris-acetato/EDTA (ácido etilendiaminotetraacético)]. En dichos geles, aparecen bandas de aproximadamente 400 pares de bases (pb) que fueron escindidas y purificadas utilizando un kit especifico (Prep-A-Gene de Bio-Rad). Los fragmentos amplificados fueron posteriormente clonados usando un sistema pGEM-T Easy (Promega). Un mínimo de tres clones por cada variedad fueron secuenciados.

A continuación se procedió al análisis de las secuencias utilizando el programa Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn) (Altschul SF, Gish SF, Miller W, Myers EW and Lipman DJ (1990). Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215, 403-410) y a su remisión a la base de datos GenBank™/EMBL, aunque sin acceso público hasta la fecha de presentación de esta solicitud de patente. La mayoría de las secuencias obtenidas muestran una similitud elevada (> 90%) con las formas del alérgeno mayoritario Ole e 2 que existen en la base de datos GenBank™/EMBL (Números de acceso: Y12430, Y12429 e Y12425) [Asturias et al. Cloning and expression of the panallergen profilin and the major allergen (Ole e 1) frora olive tree pollen. J Allergy Clin Immunol. 1997 Sep; 100(3):365-72; Martínez et al. The allergenic relevance of profilin (Ole e 2) from Olea europaea pollen. Allergy. 2002;57 Suppl 71 :17-23]. En la

Tabla 11 se ilustra el nombre así como el número de acceso de cada clon remitido a la base de datos.

Tabla 11

Remisión de secuencias Ole e 2 a GenB ank ™/ EMBL

Variedad/clon N° Acceso SEQ ID

NO:

Lechín de Sevilla Cl DQ028766 53

Lechín de Sevilla C2 DQ061976 54

Lechín de Sevilla C3 DQ061977 55

Lechín de Sevilla C4 DQ061978 56

Verdial de Vélez-Málaga C l DQ138358 57

Verdial de Vélez-Málaga C2 DQ 138359 58

Verdial de Vélez-Málaga C3 DQ138360 59

Verdial de Vélez-Málaga C4 DQ 138361 60

Hojiblanca C l DQ061979 61

Hojiblanca C2 DQ061980 62

Hojiblanca C3 DQ061981 63

Hojiblanca C4 DQ061982 ^' 64

Verdial de Huevar C l DQ 1 17902 65

Verdial de Huevar C2 DQ1 17903 66

Verdial de Huevar C3 DQ1 17904 67

Verdial de Huevar C4 DQ1 17905 68

Verdial de Huevar C5 DQ117906 69

Picudo Cl DQ1 17907 70

Picudo C2 DQ1 17908 71

Picudo C3 DQ1 17909 72

Picudo C4 DQ1 17910 73

Manzanilla de Sevilla C l DQ l 1791 1 74

Manzanilla de Sevilla C2 DQ 138324 75

Manzanilla de Sevilla C3 DQ138325 76

Manzanilla de Sevilla C4 DQ 138326 77

Arbequina Cl DQ138327 78

Arbequina C2 DQ138328 79

Arbequina C3 DQ138329 80

Arbequina C4 DQ138330 81

Cornicabra Cl DQ138331 82

Cornicabra C2 DQ138332 83

Cornicabra C3 DQ138333 84

Cornicabra C4 DQ138334 85

Blanqueta Cl DQ138335 86

Blanqueta C2 DQ138336 87

Blanqueta C3 DQ138337 88

Blanqueta C4 DQ138338 89

Loaime Cl DQ138339 90

Loaime C2 DQ138340 91

Loaime C3 DQ138341 92

Lucio Cl DQ138362 93

Lucio C2 DQ138363 94

Lucio C3 DQ138365 95

Lucio C4 DQ138364 96

Bella de España Cl DQ317563 97

Bella de España C2 DQ317564 98

Empeltre Cl DQ138342 99

Empeltre C2 DQ138343 100

Empeltre C3 DQ138344 101

Farga Cl DQ317565 102

Farga C2 DQ317566 103

Farga C3 DQ317567 104

Frantoio Cl DQ317568 105

Frantoio C2 DQ317569 106

Galega Cl DQ317570 107

Leccino Cl DQ138345 108

Leccino C2 DQ138346 109

Leccino C3 DQ138347 1 1 0

Lechín de Granada C l DQ3 17571 1 1 1

Lechín de Granada C2 DQ317572 1 12

Morrut C l DQ3 17573 1 13

Morrut C2 DQ31 7574 1 14

Morrut C3 DQ317575 1 15

Morrut CA DQ317576 1 1 6

Sevillenca Cl DQ138348 1 17

Sevillenca C2 DQ138349 1 1 8

Sevillenca C3 DQ13835O 1 19

Sourani Cl DQ317577 120

Sourani C2 DQ3 17578 121

Sourani C3 DQ317579 122

Villalonga Cl DQ138351 123

Villalonga C2 DQ138352 124

Villalonga C3 DQ138353 125

Villalonga C4 DQ138354 126

Acebuche Cl DQ 138355 127

Acebuche C2 DQ138356 128

Acebuche C3 DQ138357 129

Picual Cl DQ317580 130

Picual C2 DQ3 17581 13 1

Picual C3 DQ317582 132

Las secuencias obtenidas fueron analizadas mediante programas de análisis adecuado, obteniéndose los alineamientos correspondientes (Software Clustal_X 1.81), y un análisis de clústers (Software TreeView 1.6.5), que ha permitido establecer las relaciones correspondientes entre las variedades (Figura 5). Los resultados indican que la variabilidad presente en la secuencia a nivel intravarietal es mucho menor que la variabilidad intervarietal, lo que permite definir secuencias consenso para cada variedad analizada. Dichas secuencias consenso representan la secuencia más probable por cada

variedad y permiten simplificar aquellos procedimientos en los que el trabajo con la totalidad de las secuencias no sea practicable (por ejemplo, expresión recombinante y pruebas clínicas subsecuentes).

Las microhelerogeneidades detectadas en las secuencias nucleotídicas llegan a afectar en algunos casos a las secuencias aminoacídicas (SEQ ID NO: 133-212).

2.2 Obtención de las proteínas recombinantes

Cada una de las secuencias correspondientes a Ole e 2 de cada variedad analizada son subclonadas desde pGEM-T easy (Promega) hasta la región polylinker de un vector comercial de expresión PinPoint Xa (Promega Corporation, Madison, WI, USA) adecuado para la inserción "en fase" de los fragmentos (plásmidos Xa-I, Xa-2 ó Xa-3) previamente linearizado, mediante procedimientos estándar. La construcción resultante es usada para transformar células competentes de E. coli de tipo DH5α (GIBCO BRL Life Technologies, Paisley, UK). Los transformantes resistentes a ampicilina son aislados y sometidos a análisis de restricción y a secuenciación con la utilización de un cebador PinPoint Sequencing Primer (Promega Corporation, Madison, WI, USA) para asegurar el mantenimiento de la correcta pauta de lectura y confirmar la presencia de las secuencias de Ole e 2.

La expresión y purificación de las proteínas de fusión de Ole e 2 en las distintas variedades se lleva a cabo básicamente según los procedimientos descritos por Alché y col., en Prot. Express. Purif. 16, 251-260. 1999. Brevemente y para cada producto recombinante: una única colonia recombinante aislada es cultivada en medio LB (Luria Bertani)/ampicilina (20 μg/ml); tras inducir la expresión con IPTG (isopropiltio-β-D- galactósido) 1 mM y posterior incubación, las células bacterianas son separadas del medio, y la presencia de la proteína Ole e 2 de fusión analizada tanto en el medio de cultivo como en el sobrenadante de un lisado crudo de las células bacterianas. Para dicho análisis se recurre a experimentos de Western-blotting utilizando tanto un anticuerpo policlonal frente a Ole e 2 (Alché JD, Castro AJ, Olmedilla A, Fernández MC, Rodríguez R, Villalba M and Rodríguez-García MI: "The major olive pollen allergen (Ole e l) shows both gametophytic and sporophytic expression during anther development, and its synthesis and storage takes place in the RER". J. CeIl Sci. 1 12(15), 2501-2509. 1999) como un reactivo streptavidina-conjugado con fosfatasa alcalina

(Alché JD, Paul E and Dickinson HG: "Heterogously expressed polypeptide from the yeast meiotic gene HOP l binds preferentially to yeast DNA". Prot. Express. Purif. 16, 251-260. 1999) capaces de detectar la proteina y el polipéptido biotinilado de fusión respectivamente. En la mayor parte de las proteínas de fusión, se observa una cantidad significativa de proteína expresada de forma soluble, por lo que se procede a su purificación directamente mediante cromatografía en una columna de la resina SoftLink Soft Reléase Avidin Resin (Promega Corporation, Madison, WI, USA), capaz de emu ^¬ la proteina de fusión en condiciones no desnaturalizantes, tales como incubación con biotina 5 mM en un tampón Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 50 mM, 5% glicerol.

Cada una de las proteínas de fusión obtenidas es sometida a una digestión con endoproteinasa (factor Xa) para liberar el polipéptido biotinilado. La digestión se realiza añadiendo 0,01 μl de factor Xa (Promega Corporation, Madison, WI, USA) por μg de proteína de fusión, en tampón de reacción IX optimizado para dicho enzima (Promega Corporation, Madison, WI, USA ). La mezcla de reacción se incuba durante 3 horas a 37 ⁰ C. La digestión se detiene mediante precipitación con ácido tricloroacético (TCA) (concentración final 10%) a 4 ⁰ C, centrifugación, desecación del precipitado y posterior resuspensión en tampón Tris-HCl 10 mM (pH 8,0). Los resultados de las digestiones son de nuevo analizados mediante Western-blotting, y las proteínas recombinantes Ole e 2 resultantes purificadas mediante elución diferencial en una columna de exclusión molecular "Superosa 12" (Pharmacia LKB FPLC system, Pharmacia LKB Biotechnology, Milton Keynes, UK). En cada aislamiento se cargan 200 μl de solución de la proteina digerida sobre la columna y se realiza la elución con tampón Tris-HCl 10 mM (pH 8,0) según el siguiente esquema:

VOLUMEN ELUIDO* FRACCIONAMIENTO

10 mi 2 fracciones x 5 mi

3 mi 6 fracciones x 0,5 mi

4 mi 20 fracciones x 0,2 mi 7 mi 7 fracciones x 1 mi

Volumen total = 24 mi N ⁰ total de fracciones = 35

*La proteína Ole e 2 aparece como un pico en las mediciones de densidad óptica (28 Oran) presente en las fracciones 15 a 20. El análisis SDS-PAGE de dichas fracciones ofrece una banda única correspondiente a la proteína Ole e 2 recombinante.

Alternativamente, se puede hacer uso de la propiedad de las profilinas ampliamente caracterizada de unirse específicamente a secuencias de Poli (L-prolina) y utilizar un procedimiento de expresión recombinante sin la utilización de "tag" (es decir sin la formación de una proteína de fusión). Posteriormente se utilizaría un sistema de purificación cromatográfica mediante columnas de sefarosa-poli(L-prolina), y posterior elución de la columna mediante soluciones concentradas de urea. Existen numerosos ejemplos detallados del aislamiento de profilinas recombinantes utilizando estos métodos como: Asturias et al. Cloning and expression of the panallergen profilin and the major allergen (Ole e l) from olive tree pollen. J Allergy Clin Immunol. 1997 Sep; 100(3):365-372. Asturias et al. PCR-based cloning and immunological characterization of Parietaria judaica pollen profiling. J. Invest. Allergol Clin Immunol. 2004; 14:43- 48. Westphal et al. Tomato profiling Lyc e 1 : IgE cross-reactivity and allergenic potency. Allergy. 2004; 59:526-532. Para revisión consultar: Wallner et al. Lab scale and médium scale production of recombinant allergens in Escherichia coli. Methods. 2004; 32:219-226.

2.3 Estandarización de los productos recombinantes

Los productos recombinantes obtenidos se someten a un análisis final mediante cuantificación proteica, SDS-PAGE y Western blotting con la utilización de un panel de anticuerpos monoclonales/policlonales anti-Ole e 2 de forma similar a la caracterización de los extractos proteicos crudos de polen de olivo (Castro AJ, Alché JD, Cuevas J, Romero PJ, Alché V and Rodríguez-García MI: "Pollen from different olive tree cultivars contains varying amounts of the major allergen Ole e 1". Int. Arch. Allergy Clin Immunol 131, 164-173. 2003). Finalmente, se determina la potencia biológica de cada una de las proteínas recombinantes utilizando técnicas de diagnóstico in vitro que incluyen el análisis de la reactividad de sueros de pacientes en experimentos de Westem-blot (Castro AJ: "Aproximación a la función biológica del alérgeno mayoritario del polen del olivo (Ole

e l). Implicaciones clínicas y ambientales" Tesis Doctoral. Universidad de Granada. 2001) y mediante titulación por técnicas de ELISA (Quiralte J, Florido F, Arias de Saavedra JM, Gómez A, Sáenz de San Pedro B, González E and Rodríguez R: "Olive allergen-specifíc IgE responses in patients with Olea euroapea pollinosis" Allergy 57 (Suppl. 71):47-52. 2002). En ambos casos se utiliza un panel de sueros de pacientes preanalizados según técnicas estándar y reconocidos como positivos y negativos, y en comparación con extractos comerciales de reconocida eficacia y potencia inmunológica.

2.4 Elaboración de un kit de diagnóstico y ejemplo de diagnóstico de un paciente Protocolo general

Las soluciones de alérgenos recombinantes obtenidas constituyen la base para un kit experimental para dicho diagnóstico. A modo ilustrativo, los pacientes sintomáticos de los que se sospecha poseen hipersensibilidad tipo I a aeroalérgenos pueden ser chequeados de forma primaria mediante SPT con un kit que contendría extractos alergénicos comunes, entre los que se encontrarían diversas mezclas de alérgenos recombinantes de polen de olivo correspondientes a las variedades dominantes en la comunidad autonómica correspondiente. Tras esta primera aproximación, y en el caso de positividad, se procedería a la determinación de reactividad frente a los diversos alérgenos recombinantes de forma individualizada, así como a alérgenos recombinantes de variedades consideradas "secundarias" de la comarca olivarera de origen del paciente, con objeto de ajustar en el mayor grado posible la(s) variedad(es) responsables de la hipersensibilidad. Obviamente, dicho kit contendría, al igual que los kits comercializados actualmente, diversos controles positivos (por ejemplo, histamina hidrocloruro), así como controles negativos (el mismo tampón en que se realizan las diluciones de los extractos, extractos de variedades con baja/nula reactividad o extractos de variedades irrelevantes o americanas).

Caso hipotético (Ejemplo de aplicación de la invención)

Paciente varón, de 46 años de edad, nacido y residente en Granada con historial de rinitis y conjuntivitis estacional, diagnosticado de asma bronquial mediante espirometría y test de broncodilatador, y de alergia al polen del olivo tras SPTs con extractos comerciales. Tras supresión de tratamiento antihistamínico, el suero del

paciente es sometido a pruebas de reactividad en un ensayo de tipo ELISA [Quiralte et al, Allergy 57 (Suppl. IX)Al -52 (2002)] con un kit experimental que contiene diferentes alérgenos recombinantes correspondientes a Ole e 2 de las variedades dominantes en Andalucía (Picual, Hojiblanca, Lechín de Sevilla, Manzanilla de Sevilla, Verdial de Huevar, Gordal Sevillana, Verdial de Velez-Málaga, Aloreña, Lechín de Granada, Manzanilla Prieta), así como de las variedades secundarias de la comarca granadina "La Vega" (Lucio, Loaime y Cornezuelo), los cuales pueden ser obtenidos según la metodología descrita en esta memoria. Al tratarse de un ejemplo hipotético está redactado según lo que se considera que debería hacerse en un caso de un paciente de la región de La Vega granadina, independientemente de que en el momento actual no se disponga de las secuencias de Ole e 2 de todas las variedades implicadas.

La estandarización de dichos alérgenos recombinantes, realizada según el método descrito en el apartado 1.3 han permitido cuantifϊcar su contenido en alérgeno mayoritario Ole e 2 en 50 μg/ml, y su potencia inmunológica en 100 BU/ml. Una vez cuantificado el ELISA, el paciente muestra la reactividad mostrada en la Tabla 12.

Tabla 12 Reactividad

donde

"-" significa que el paciente no es sensible al polen del olivo de la variedad en cuestión;

^α +" significa que el paciente es muy poco sensible al polen del olivo de la variedad en cuestión;

"++" significa que el paciente es poco sensible al polen del olivo de la variedad en cuestión; "+++" significa que el paciente es sensible al polen del olivo de la variedad en cuestión; y

"++++" significa que el paciente es muy sensible al polen del olivo de la variedad en cuestión

2.5 Preparación de vacunas personalizadas y ejemplo de la inmunoterapia de un paciente

Una vez establecido el diagnóstico con la mayor precisión posible, se puede personalizar la composición de la vacuna correspondiente para aquellos pacientes en los que la inmunoterapia sea el tratamiento de elección de acuerdo a parámetros médicos bien definidos (p. e., imposibilidad de aislamiento físico frente al agente alergénico, mantenimiento de los síntomas incluso en pacientes tratados con medicamentos, prevención de la aparición o exacerbación de asma, etc.). Dichas vacunas deben contener el número adecuado de unidades comparativas totales de potencia inmunológica, aunque repartidas proporcionalmente para cada una de las formas recombinantes de alérgenos correspondientes a las variedades causantes de la alergia para cada paciente en base a la reactividad de éste a los SPTs. El protocolo de inmunoterapia seguirá las recomendaciones ya establecidas para extractos comerciales, de los que ya se posee amplia experiencia clínica.

Como continuación del caso hipotético de diagnóstico de un paciente [apartado 1.4], seguidamente se documenta un ejemplo de preparación de un tratamiento de inmunoterapia personalizada para dicho paciente. El paciente es considerado candidato a inmunoterapia en base a la imposibilidad de aislamiento físico de la fuente alergénica, la baja respuesta a tratamiento farmacológico y el aumento progresivo de los síntomas. El estudio de reactividad de su suero sugiere la siguiente composición de alérgenos recombinantes para el tratamiento, a partir de soluciones concentradas de cada una de las variedades:

La pauta de administración de la inmunoterapia se realiza según patrones establecidas por el Subcomité de Inmunoterapia de la EAACI, hasta llegar a dosis de mantenimiento según la tolerancia del paciente. Periódicamente se irían haciendo nuevas pruebas de diagnóstico con el fin de evaluar si se va produciendo una disminución generalizada de la reactividad en todas las variedades testadas, lo que sería indicativo de una mejora de la condición alérgica en el paciente".

EJEMPLO 3

CONSTRUCCIÓN Y ADMINISTRACIÓN DE VARIANTES HIPOALERGÉNICAS RECOMBINANTES DE Ole e 1

La comparación de las secuencias nucleotídicas y aminoacídicas del alérgeno Ole e 1 en las distintas variedades, junto con el análisis de la reactividad de extractos de polen de las distintas variedades frente a un pool de IgEs de pacientes alérgicos, permite diferenciar modificaciones en posiciones de la secuencia que afectan a epítopos inmunodominantes de Ole e 1 responsables de la unión a células T con una probable implicación en la reactividad de los pacientes. En este ejemplo se describe la producción de tres formas recombinantes de Ole e 1, de distintas variedades de olivo, que presuntamente poseen actividad hipoalergénica acrecentada con respecto a las formas nativas de Ole e 1. Dichas proteínas se producen mediante recombinación de las

modificaciones presuntamente hipo al er geni cas que han sido detectadas en las regiones 91-102 y 109-120 de la secuencia aminoacídica de Ole e 1 definida por Villaba et al, (Villaba M, Batanero E, López-Otín et al. "The amino acid sequence of Ole e 1, the major allergen from olive tree (Olea europaea) pollen". Eur. J. Biochem. 216:863-869. 1993), en tres de los clones descritos en esta memoria. Dichas regiones han sido caracterizadas como epítopos inmunodominantes de Ole e 1 responsables de la unión a células T (Cardaba B, del Pozo V, Jurado A, Gallardo S, Cortegano I, Arrieta I, del Amo A, Tramón P, Florido F, Sastre J, Palomino P and LaHoz C, "Olive pollen allergy: searching for inmmunodominant T-cell epitopes on the Ole e 1 molecule" Clin. Exper. Allergy 28:413-422. 1998). El método de producción se describe esquemáticamente en la Figura 6.

3.1 Material de partida

Se utilizan como material de partida las siguientes construcciones: • Construcción 1 : SEQ ID NO: 1 1 (651 pb) clonada en el vector pGEM-T

Easy (Promega Corporation) (3.015 pb), como se describe en el Ejemplo

1 de esta memoria. Tamaño total de la construcción: 3.666 pb

• Construcción 2: SEQ ID NO: 22 (613 pb) clonada en el vector pGEM-T

Easy (Promega Coiporation) (3.015 pb), como se describe en el Ejemplo 1 de esta memoria. Tamaño total de la construcción: 3.628 pb. La SEQ

ID NO: 22 codifica un polipéptido (SEQ ID 48) con dos modificaciones aminoacídicas (DEIPVEGWVKPS) en la región 78-89, correspondiente a la secuencia 91-102 de la secuencia aminoacídica de Ole e 1 (NEIPTEGWVKPS) (Villaba M, Batanero E, López-Otín et al, "The amino acid sequence of Ole e I ₅ the major allergen from olive tree (Olea europaea) pollen". Eur. J. Biochem. 216:863-869. 1993), que corresponde a un epítopo inmunodominante de Ole e 1 responsable de la unión a células T. Dichas modificaciones son potencialmente responsables de alergenicidad reducida de Ole e 1 en el polen de esta variedad.

Construcción 3: SEQ ID NO: 16 (641 pb) clonada en el vector pGEM-T Easy (Promega Corporation) (3.015 pb), como se describe en el Ejemplo 1 de esta memoria. Tamaño total de la construcción: 3.656 pb. La SEQ ID NO: 16 codifica un polipéptido (SEQ ID 42) con una modificación aminoacídica (TVN GTTRTINP L) en la región 93-104, correspondiente a la región 109-120 de la secuencia aminoacídica de Ole e 1 (TVNGTTRTVNPL) (Villaba M, Batanero E, López-Otín et al. "The amino acid sequence of Ole e 1, the major allergen from olive tree (Olea europaea) pollen". Eur. J. Biochem. 216:863-869. 1993), que corresponde a un epítopo inmunodominante de Ole e 1 responsable de la unión a células T. Dicha modificación es potencialmente responsable de alergenicidad reducida de Ole e 1 en el polen de esta variedad.

3.2 Generación de la quimera hipoalergénica 1 Tras un detallado mapeo de restricción de las secuencias SEQ ID NO: 1 1 y SEQ

ID NO: 22 se ha determinado que los enzimas de restricción Bse XI y Tas I (Fermentas) son capaces de liberar un fragmento de DNA que incluye la secuencia que codifica la región 91-102 de la secuencia aminoacídica de Ole e 1 (Villaba M, Batanero E, López- Otín et al. "The amino acid sequence of Ole e 1, the major allergen from olive tree (Olea europaea) pollen". Eur. J. Biochem. 216:863-869. 1993), que corresponde a un epítopo inmunodominante de Ole e 1 responsable de la unión a células T. Dichos enzimas no poseen otras secuencias de reconocimiento en las construcciones 1 y 2. Se realiza una digestión secuencial de las construcciones 1 y 2 con los enzimas de restricción Bse XI y Tas I (Fermentas) de acuerdo a las instrucciones aportadas por el fabricante. Una alícuota de los productos de la digestión se analiza mediante electroforesis en geles de agarosa al 1% en TAE (Tris-acetato/EDTA). En dichos geles, aparecen bandas de 3.586 pb (construcción 1) y 3.548 pb (construcción 2) que son escindidas y purificadas utilizando un kit especifico (Prep-A-Gene, de Bio-Rad). De forma paralela, otra alícuota de los mismos productos de la digestión se analiza mediante electroforesis en geles de agarosa al 3% en TAE (Tris-acetato/EDTA). En dichos geles, aparecen bandas de 80 pb (construcción 1) y 80 pb (construcción 2) que son escindidas y purificadas utilizando un kit especifico (Prep-A-Gene de Bio-Rad). Se

realiza una reacción de ligación entre los productos purificados de 3,586 pb de la construcción 1 y de 80 pb de la construcción 2. El producto de dicha ligación (quimera hipoalergénica 1) se utiliza para transformar células competentes de E. coli DH5α, y las células transformadas son seleccionadas con la utilización de medio de cultivo adicionado con ampicilina mediante métodos estándar (Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual. CoId Spring Harbor, NY: CoId Spring Harbor Laboratory Press).

3.3 Generación de la quimera hipoalergénica 2 Tras un detallado mapeo de restricción de las secuencias SEQ ID NO: 1 1 y SEQ

ID NO: 16 se ha determinado que los enzimas de restricción Xap I y Hinf I (Fermentas) son capaces de liberar un fragmento de DNA que incluye la secuencia que codifica la región 109-120 de la secuencia aminoacídica de Ole e 1 (Villaba M, Batanero E, López-Otín et al. "The amino acid sequence of Ole e 1, the major allergen from olive tree (Olea europaea) pollen". Eur. J. Biochem. 216:863-869. 1993), que corresponde a un epítopo inmunodominante de Ole e 1 responsable de la unión a células T. Dichos enzimas no poseen otras secuencias de reconocimiento en las construcciones 1 y 3. Se realiza una digestión secuencial de las construcciones 1 y 3 con los enzimas de restricción Xap I y Hinf I (Fermentas) de acuerdo a las instrucciones aportadas por el fabricante. Una alícuota de los productos de la digestión se analiza mediante electroforesis en geles de agarosa al 1% en TAE (Tris-acetato/EDTA). En dichos geles, aparecen bandas de 3.634 pb (construcción 1) y 3.624 pb (construcción 3) que son escindidas y purificadas utilizando un kit especifico (Prep-A-Gene, de Bio-Rad). De forma paralela, otra alícuota de los mismos productos de la digestión se analiza mediante electroforesis en geles de agarosa al 3% en TAE (Tris-acetato/EDTA). En dichos geles, aparecen bandas de 32 pb (construcción 1) y 32 pb (construcción 3) que son escindidas y purificadas utilizando un kit especifico (Prep-A-Gene, de Bio-Rad). Se realiza una reacción de ligación entre los productos purificados de 3.634 pb de la construcción 1 y de 32 pb de la construcción 3. El producto de dicha ligación (quimera hipoalergénica 2) se utiliza para transformar células competentes de E. coli DH5α, y las células transformadas son seleccionadas con la utilización de medio de cultivo adicionado con ampicilina mediante métodos estándar (Sambrook, J., Fritsch, E.F., and

Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual. CoId Spring Harbor, NY: CoId Spring Harbor Laboratory Press).

3.4 Generación de la quimera hipoalergénica 3 Tras un detallado mapeo de restricción de la secuencia predicha para la quimera hipoalergénica 1 y de la secuencia SEQ ID NO: 16 se ha determinado que los enzimas de restricción Xap I y Hinf I (Fermentas) son capaces de liberar un fragmento de ADN que incluye la secuencia que codifica la región 109-120 de la secuencia aminoacídica de Ole e 1 (Villaba M, Batanero E, López-Otín et al. "The amino acid sequence of Ole e 1, the major allergen from olive tree (Olea europaea) pollen". Eur. J. Biochem. 216:863- 869. 1993), que corresponde a un epítopo inmunodominante de Ole e 1 responsable de la unión a células T. Dichos enzimas no poseen otras secuencias de reconocimiento en la quimera hipoalergénica 1 ni en la construcción 3. Se realiza una digestión secuencial de la quimera hipoalergénica 1 y la construcción 3 con los enzimas de restricción Xap I y Hinf I (Fermentas) de acuerdo a las instrucciones aportadas por el fabricante. Una alícuota de los productos de la digestión se analiza mediante electroforesis en geles de agarosa al 1% en TAE (Tris-acetato/EDTA). En dichos geles, aparecen bandas de 3.634 pb (quimera hipoalergénica 1) y 3.624 pb (construcción 3) que son escindidas y purificadas utilizando un kit especifico (Prep-A-Gene, de Bio-Rad). De forma paralela, otra alícuota de los mismos productos de la digestión se analiza mediante electroforesis en geles de agarosa al 3% en TAE (Tris-acetato/EDTA). En dichos geles, aparecen bandas de 32 pb (quimera hipoalergénica 1) y 32 pb (construcción 3) que son escindidas y purificadas utilizando un kit especifico (Prep-A-Gene, de Bio-Rad). Se realiza una reacción de ligación entre los productos purificados de 3.634 pb de la quimera hipoalergénica 1 y de 32 pb de la construcción 3. El producto de dicha ligación (quimera hipoalergénica 3) se utiliza para transformar células competentes de E. coli DH5α, y las células transformadas son seleccionadas con la utilización de medio de cultivo adicionado con ampicilina mediante métodos estándar (Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual. CoId Spring Harbor, NY: CoId Spring Harbor Laboratory Press).

3.5 Obtención de las proteínas recombinantes, estandarización y utilización en diagnosis e inmunoterapia

Los métodos de obtención de las proteínas quiméricas recombinantes, su estandarización y su utilización en métodos de diagnóstico e inmunoterapia son idénticos a los descritos en el Ejemplo 1. En ausencia de evidencias experimentales in vivo, cabe esperar de estas quimeras recombinantes una menor alergenicidad que las correspondientes proteínas nativas, dada la naturaleza y la acumulación de las modificaciones incluidas en ellas

EJEMPLO 4

CONSTRUCCIÓN Y ADMINISTRACIÓN DE VARIANTES HIPOALERGÉNICAS RECOMBINANTES DE Ole e 2

La comparación de las secuencias nucleotídicas y aminoacídicas del alérgeno Ole e 2 en las distintas variedades, junto con el análisis de la reactividad de extractos de polen de las distintas variedades frente a un pool de IgEs de pacientes alérgicos, permite diferenciar modificaciones en posiciones de la secuencia que afectan a epítopos inmuno dominantes de Ole e 2 responsables de la unión a células T con una probable implicación en la reactividad de los pacientes.

Siguiendo un protocolo similar al descrito en el Ejemplo 3 es posible producir diferentes formas recombinantes de Ole e 2, de distintas variedades de olivo, con actividad hipoalergénica acrecentada con respecto a las formas nativas de Ole e 2. En general, dichas proteínas pueden producirse mediante recombinación de las modificaciones presuntamente hipoalergénicas detectadas en distintas regiones de la secuencia aminoacídica de Ole e 2. Las distintas quimeras hipoalergénicas generadas pueden utilizarse para transformar células competentes (e.g., de E. coli DH5α). La obtención de las proteínas quiméricas recombinantes, su estandarización y su utilización en métodos de diagnóstico e inmunoterapia se puede llevar a cabo mediante la metodología descrita en el Ejemplo 2. En ausencia de evidencias experimentales in vivo, cabe esperar de estas quimeras recombinantes una menor alergenicidad que las correspondientes proteínas nativas, dada la naturaleza y la acumulación de las modificaciones incluidas en ellas.