Transporter spielen in der Funktion eines Organismus eine besondere Rolle. Zum einen entscheiden sie über die Aufnahme oder Abgabe eines Stoffes in eine oder aus einer Zelle bzw. einem Organismus, andererseits steuern sie den Transport und die Verteilung der Stoffe zwischen den Zellen. Transporter stehen in der Regel am Anfang oder Ende eines Stoffwechselwegs und nehmen daher grundsätzlich übergeordnete Kontrollfunktio- nen wahr.

Zu den Transportmetaboliten, die als Bausteine für Nukleinsäuren dienen, zählen Purin- basen, Pyrimidinbasen und die daraus abgeleiteten Nukleoside und Nukleotide. Die Auf- nahme dieser Substanzen hat zum Beispiel während der Pollenkeimung und der frühen Entwicklung des Embryos in keimenden Samen eine wichtige physiologische Bedeutung bei der Bereitstellung von Vorstufen für die Nukleinsäuresynthese. Cytokinine sind als Phytohormone strukturell eng mit den Purinbasen und den Purinnukleosiden verwandt.

Diese Phytohormone regulieren viele Prozesse während der Pflanzenentwicklung. Über den Ursprung dieser Hormone ist zwar wenig bekannt, ihr effektiver Transport in der Pflanze ist jedoch für deren Entwicklung und Funktion von entscheidender Bedeutung.

In Bakterien wurden Nukleobasen-Transpartsysteme für Adenin, Cytosin und Uracil cha- rakterisiert und die entsprechenden Gene konnten kloniert werden. In der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae wurden bisher drei unterschiedliche, aktive Transportsysteme für Nukleoside und Nukleobasen sowohl genetisch als auch physiologisch gut charakte- risiert. Nukleosidtransportersysteme sind in einer Vietzahl von Säugetierzellen beschrie- ben und charakterisiert worden. Neben diesen Nukleosidtransportersystemen wurden auch spezifische Transportsysteme für Nukleobasen in Säugetierzellen beschrieben.

In höheren Pflanzen sind Transportprozesse zur Verteilung von Assimilaten, Metaboliten und Phytohormonen von entscheidender physiologischer Bedeutung. Über den Trans- port von Nukleobasen und deren Derivate in Pflanzen ist jedoch nur sehr wenig bekannt und es wurden bisher im Gegensatz zu Bakterien, Pilzen und Säugetieren nur wenige Transportsysteme für diese Substanzen beschrieben. Eine Aufklärung der Nukleoba- sen-Transportvorgänge bei Pflanzen, die zu ähnlich detaillierten Informationen wie bei anderen Organismen führen würde, liegt nicht vor und ist wegen der Schwierigkeit der molekularbiologischen Analyse von Mutationen in Pflanzen kaum durchführbar. Es be- steht jedoch ein großes Interesse an der Identifizierung und Charakterisierung von Pflanzengenen, die für Nukleobasentransporter bzw. für Transporter für chemisch ver- wandte Stoffe kodieren. Ferner besteht aufgrund der zentralen Funktion der Transporter ein großes Interesse an Pflanzen, die in der Lage sind, größere Mengen Nukleobasen und ihre Derivate zu transportieren, sowie an der Bereitstellung von Möglichkeiten zur Veränderung der Verteilung von Nukleobasen in transgenen Pflanzen und Mutanten.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, für pflanzliche oder tierische Nukleobasentransporter kodierende Nukleinsäuren bereitzustellen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch eine Nukleinsäure ge ! öst, ausgewählt aus : a) Nukleinsäure, die erhältlich ist durch Komplementieren Nukleobasentransporter-defizi- enter Wirtszellen mit einer pflanzlichen oder tierischen Genbank und Selektieren auf Nukleobasentransporter-positive Wirtszellen ; b) Nukleinsäure mit einer Sequenz, die für ein Protein mit einer Sequenz nach SEQ ID NO 8 oder SEQ ID NO 9 kodiert ; c) Nukleinsäure, die mit einer Nukleinsäure nach b) hybridisiert ; d) Nukleinsäure, die unter Berücksichtigung der Degeneration des genetischen Codes mit einer Nukteinsäure nach b) oder mit der zu b) komplementären Sequenz hybridi- sieren würde ; e) durch Substitution, Addition, Inversion und/oder Deletion einer oder mehrerer Basen erhaltener Derivate einer Nukleinsäure nach a) bis d) ; f) Komplementäre Nukleinsäure zu einer Nukleinsäure nach einer der Gruppen a) bis e) ; ausgenommen sind Nukleinsäuren mit einer Sequenz nach einer der SEQ ID NO 3 bis 5.

Der Begriff"Nukleobase", wie hier verwendet, umfaßt nicht nur Nukleobasen und ihre Derivate, sondern auch mit den Nukleobasen chemisch verwandte Stoffe, beispielsweise Adenin, Guanin und seine Derivate, wie Xanthin, Hypoxanthin, Allantoin, Allantoat, Urat, Xanthosin oder Inosin, Cytosin und seine Vorstufen und Derivate wie Barbiturate oder Folsäure, Cytokinine, wie z. B. Zeatin, Isopentenyladenin oder Kinetin, und bestimmte Alkaloide, wie z. B. Koffein, Theobromin oder Nikotin. Diese pflanzlichen Alkaloide zeigen eine große strukturelle Ahnlichkeit mit der Nukleobase Purin, da sie ebenfalls basische, N-haltige Heterocyclen aufweisen. Cytokinine enthalten Adenin als hydrophiles Grundge- rüst, an dessen Aminogruppe in der Position 6 eine unpolare Seitenkette von relativ ge- ringer Spezifizität sitzt. Bei dem Kinetin handelt es sich um ein künstliches Cytokinin, welches vermutlich gar nicht natürlich in der Pflanze vorkommt. Weiterhin können die Nukleobasen modifiziert sein und an Zucker oder andere Bausteine gekoppelt sein, z. B.

Adenosin als Ribosid von Adenin, Cytidin als Ribosid von Cytosin, oder Cytokininribosi- de.

Der Ausdruck"Nukleobasentransporter"im Sinne der Erfindung bezeichnet ein Protein, das an dem Transport von mindestens einem der vorgenannten Metabolite durch eine Biomembran beteiligt ist. Dieser Transport kann aktiv oder passiv erfolgen. Zum Nach- weis der Nukleotransporter-Aktivität kann beispielsweise die von Ninnemann et al. (1994, EMBO J. 15,3464-3471) beschriebene Methode angewandt werden.

"Komplementation", wie hier verwendet, bezeichnet eine sich im Phänotyp widerspie- gelnde Kompensation eines genetischen Funktionsdefektes unter Beibehaltung der dem Defekt zugrundeliegenden Mutationen. Komplementation im Sinne der Erfindung liegt beispielsweise vor, wenn ein genetischer Defekt in einem Gen (z. B. das FCY2-Gen in Saccharomyces cerevisiae) durch die Anwesenheit eines gleichartigen, intakten Gens (z. B. das PUP1-Gen aus Arabidopsis thaliana) aufgehoben wird, das die Funktion des defekten Gens übernimmt.

Unter"Nukleobasentransporter-defizienten Wirtszellen"im Sinne der Erfindung versteht man Zellen, die aufgrund eines genetischen Defektes negativ veränderte Nukleobasen- transporteigenschaften aufweisen, die zu einem negativ selektierbaren Phänotyp führen.

Zur Ausführung der Erfindung bevorzugteNukleobasentransporter-defiziente Wirtszellen sind eukaryontische Zellen, z. B. pflanzliche oder tierische Zellen. Nukleobasentranspor- ter-defiziente Hefezellen sind besonders bevorzugt.

Nukleobasentransporter-positive Wirtszellen enthalten eine Nukleinsaure, die zumindest zur partielle Aufhebung des genetischen Defekts führt, und zeigen daher einen positiv selektierbaren Phänotyp.

Die Identifikation eines Nukleobasentransporters kann beispielsweise durch Komplemen- tation von spezifischen Mutationen in der Hefe Saccharomyces cerevisiae erfolgen. Zur Isolierung eines Gens, das ein Transportermolekül kodiert, aus einer pflanzlichen oder tierischen Genbank müssen zunächst geeignete Hefe-Mutanten verfügbar sein, die auf- grund eines Defektes in diesem Transportermolekül nicht in der Lage sind, eine be- stimmte Substanz aufzunehmen. Eine Mutante, die nicht in der Lage ist, in Medien mit Nukleobasen als einziger Stickstoffquelle zu wachsen, ist beispielsweise die von Gren- son (Grenson, 1969, Eur. J. Biochem. 11,249-260 ; Polak & Grenson, 1973, Eur.

J. Biochem. 32,276-282) beschriebene Mutante fcy2 (Stamm MG887). Um eine Kom- plementation mit pflanzlichen oder tierischen Genen durchführen zu können, wurde zu- satzlich das URA3-Gen zerstört und somit eine Uracil-Auxotrophie erzeugt (MG887ura3-).

Zum Erhalten einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure kann eine geeignete Hefemutan- te, wie beispielsweise die fcy2/ura3-Mutante, mit für die Verwendung in Hefe geeigneten Expressions-Plasmiden, die als Insertion cDNA-Fragmente aus einer pflanzlichen oder tierischen cDNA-Bibliothek tragen, transformiert werden. Durch Selektion von Transfor- manten, die infolge der Expression pflanzlicher oder tierischer cDNA-Sequenzen in der Lage sind, auf Nukleobasen als einziger Stickstoffquelle zu wachsen, werden pflanzliche bzw. tierischen Nukleobasentransporter identifiziert.

Es wurde nun überraschend gefunden, daß bei Expression einer cDNA-Bibliothek, bei- spielsweise aus Keimlingsgewebe von Araö/dops/s thaliana, mittels für die Verwendung in Hefe geeigneter Expressions-Plasmide, die den Promotor der Phosphoglyceratkinase aus Hefe enthalten, die Komplementation der Mutation fcy2 möglich ist, wenn die Ex- pressions-Plasmide bestimmte pflanzliche cDNA-Fragmente enthalten. Diese cDNA- Fragmente kodieren pflanzliche Nukleobasentransporter und werden von der vorliegen- den Erfindung umfaßt.

Das Merkmal"Nukleinsäure, die mit einer Nukleinsäure nach b) hybridisiert", wie hier verwendet, weist auf eine Nukieinsäure hin, die unter mäßig stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure nach b) hybridisiert. Beispielsweise kann die Hybridisierung mit der radioaktiven Genprobe in einer Hybridisierungslösung (25% Formamid ; 5 x SSPE ; 0,1% SDS ; 5 x Denhardt-Lösung ; 50 ug/ml Heringsperma-DNA ; zur Zusammensetzung der Einzelkomponenten vgl. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning : A laboratory manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA) 20 Stunden lang bei 37°C er- folgen. Die anschließende Entfernung unspezifisch gebundener Probe kann durch mehrfaches Waschen der Filter in 2 x SSC/0,1% SDS bei 42°C erfolgen. Vorzugsweise werden die Filter mit 0,5 x SSC/0,1% SDS, besonders bevorzugt mit 0,1 x SSC/0,1% SDS bei 42°C, gewaschen.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können in Plasmide eingebracht und mittels Standardverfahren der Mikrobiologie einer Mutagenese oder einer Sequenzveränderung durch Rekombination unterzogen werden. Dadurch ist eine besonders einfache Verän- derung der Spezifität des Nukleobasentransporters möglich. Nukleinsäuren, die für ver- änderte Nukleobasentransporter kodieren, können beispielsweise zur Transformation von landwirtschaftlich genutzten Pflanzen verwendet werden, mit dem Ziel, transgene Pflanzen herzustellen. Mit Hilfe von Standardverfahren (vgl. Sambrook et al., 1989, Mo- lecular cloning : A laboratory manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA) können Basenaustausche vorgenommen oder natürliche oder synthetische Se- quenzen hinzugefügt werden. Für die Verbindung von Fragmenten untereinander kön- nen an die Fragmente Adaptoren oder"Linker"angefügt werden. Ferner können Mani- pulationen, die passende Restriktionsschnittstellen bereitstellen oder überflüssige Se- quenzen oder Restriktionsschnittstellen entfernen, eingesetzt werden. Um Insertionen, Deletionen oder Substitutionen, wie z. B. Transitionen und Transversionen, vorzu- nehmen, bedient man sich bekannter Methoden, wie z. B. der in vitro-Mutagenese,"pri- mer repair", Restriktion oder Ligation. Zur Analyse der erfindungsgemäßen Nuklein- saure werden allgemeine Methoden, wie z. B. Sequenz-oder Restriktionsanalyse, sowie weitere biochemisch-molekularbiologische Methoden verwendet.

Eine Nukleinsäure, die ein Polypeptid oder Protein mit Nukleobasentransporter-Aktivität kodiert, das über seine gesamte Sequenz mindestens 40%, vorzugsweise mindestens 60%, besonders bevorzugt mindestens 80% Homologie zu einem von der Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO 1 oder der Nukleinsaure gemäß SEQ ID NO 10 kodierten Polypeptid aufweist, wird von der vorliegenden Erfindung ebenfalls umfaßt.

Im Sinne der Erfindung bezieht sich der Ausdruck"mindestens 40%, vorzugsweise min- destens 60%, besonders bevorzugt mindestens 80% Homologie"auf Übereinstimmung auf der Ebene der Aminosäuresequenz, die gemäß bekannter Verfahren, z. B. der com- putergestützten Sequenzvergleiche (Basic local alignment search tool, S. F. Altschul et al., J. Mol. Biol. 215 (1990), 403-410) bestimmt werden kann.

Der dem Fachmann bekannte Ausdruck"Homologie"bezeichnet den Grad der Ver- wandtschaft zwischen zwei oder mehrerer Polypeptid-Molekülen, der durch die Überein- stimmung zwischen den Sequenzen bestimmt wird, wobei unter Übereinstimmung so- wohl identische Übereinstimmung als auch konservativer Aminosäure-Austausch zu ver- stehen ist. Der Prozentsatz der"Homologie"ergibt sich aus dem Prozentsatz überein- stimmender Bereiche in zwei oder mehr Sequenzen unter Berücksichtigung von Lücken oder anderen Sequenzbesonderheiten.

Der Begriff"konservativer Aminosäure-Austausch"bezieht sich auf einen Austausch eines Aminosäurerestes durch einen anderen Aminosäurerest, wobei der Austausch nicht zu einer Änderung der Polarität oder Ladung führt. Ein Beispiel für einen konser- vativen Aminosäure-Austausch ist der Austausch eines unpolaren Aminosäurerestes durch einen anderen unpolaren Aminosäurerest. Konservative Aminosäure-Austausche im Sinne dieser Erfindung sind : G = A = S, I V L = M, D = E, N = Q, K = R, Y = F, S=T, G=A=I=V=L=M=Y=F=W=P=S=T.

Die Homologie miteinander verwandter Polypeptid-Moleküle kann mit Hilfe bekannter Verfahren bestimmt werden. In der Regel werden spezielle Computerprogramme mit den besonderen Anforderungen Rechnung tragenden Algorithmen eingesetzt. Bevorzugte Verfahren zur Bestimmung der Homologie erzeugen zunächst die größte Übereinstim- mung zwischen den untersuchten Sequenzen. Computerprogramme zur Bestimmung der Homologie zwischen zwei Sequenzen umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, das GCG-Programmpaket, einschließlich GAP (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12 (12) : 387 (1984) ; Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madi- son, (Wl)) ; BLASTP, BLASTN und FASTA (Altschul, S. et al., J. Molec Biol 215 : 403/410 (1990)). Das BLAST X Programm kann vom National Centre for Biotechnology Informa- tion (NCBI) und aus weiteren Quellen bezogen werden (BLAST Handbuch, Altschul S., et a/., NCB NLM NIH Bethesda MD 20894 ; Altschul, S., et a/., J. Mol. 215 : 403/410 (1990)). Auch der bekannte Smith Waterman-Algorithmus kann zur Bestimmung von Homologie verwendet werden.

Bevorzugte Parameter für den Sequenz-Vergleich umfassen die nachstehenden : Algorithmus : Needleman und Wunsch, J. Mol. Biol 48 : 443-453 (1970) Vergleichsmatrix : BLOSUM 62 von Henikoff und Henikoff, Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 89 : 10915-10919 (1992) Lücken-Wert (Gap Penalty) : 12 Lückenlängen-Wert (Gap Length Penalty) : 4 Schwellenwert der Ahnlichkeit : 0 Das GAP-Programm ist auch zur Verwendung mit den vorstehenden Parametern geeig- net. Die vorstehenden Parameter sind die Standardparameter (default parameters) für Aminosäuresequenz-Vergleiche.

Weitere beispielhafte Algorithmen, Lücken-Öffnungs-Werte (gap opening penalties), Lückenausdehnungs-Werte (gap extension penalties), Vergleichsmatrizen einschließlich der im Programm-Handbuch, Wisconsin-Paket, Version 9, September 1997, genannten können verwendet werden. Die Auswahl wird von dem durchzuführenden Vergleich ab- hängen und weiterhin davon, ob der Vergleich zwischen Sequenzpaaren, wobei GAP oder Best Fit bevorzugt sind, oder zwischen einer Sequenz und einer umfangreichen Sequenz-Datenbank, wobei FASTA oder BLAST bevorzugt sind, durchgeführt wird.

Von der Erfindung wird ebenfalls eine Nukleinsäure umfaßt, die ein Polypeptid oder Protein mit Nukleobasentransporter-Aktivitat kodiert, das über einen Teilbereich von mindestens 20 Aminosäuren mindestens 60%, vorzugsweise mindestens 75%, beson- ders bevorzugt mindestens 90% Homologie zu einem der von der Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO 1 und der Nukleinsaure gemäß SEQ ID NO 10 kodierten Polypeptide auf- weist. Vorzugsweise kodiert die erfindungsgemäße Nukleinsauresequenz ein Polypeptid oder Protein mit Nukleobasentransporter-Aktivitat, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 80%, besonders bevorzugt mindestens 90% Homologie zu einer der folgenden Aminosäuresequenzen aufweist : (a) LYAXGLXYLPVSTXSLIXXXQLAFXAXFS (SEQID NO 11) wobei X an den Positionen 4 und 7 für eine hydrophobe Aminosäure (G, A, I, V, L, M, Y, F, W, P, S oder T), an den Positionen 14 und 18-20 für eine beliebige Ami- nosäure, an der Position 25 für T oder N und an der Position 27 für I oder F steht ; <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> (b) LGXVGLiFXXSSLFSXVXXXXXLPV (SEQ ID NO 12)<BR> wobei X an den Positionen 3 und 18-22 für eine hydrophobe Aminosäure (G, A, I, V, L, M, Y, F, W, P, S oder T), an der Position 10 für eine beliebige Aminosäure, an der Position 9 für L oder E und an der Position 16 für G oder N steht ; (c) LLLXiWGFXSYXYX (SEQ iD NO 13) wobei X an den Positionen 9 und 12 für eine hydrophobe Aminosäure (G, A, I, V, L, M, Y, F, W, P, S oder T), an der Position 4 für S oder A und an der Position 14 für Q oder S steht.

Vorzugsweise umfaßt die Nukleinsäure die kodierende Sequenz einer der Sequenzen nach den SEQ ID NO 1,2,6,7 oder 10, oder ein von diesen durch Substitution, Addition, Inversion und/oder Deletion einer oder mehrerer Basen abgeleitetes Derivat. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Nukleinsäure eine DNA.

Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls ein Fragment der erfindungsgemäßen Nuklein- säure, das in Antisinnorientierung zu einem Promotor die Expression eines Nukleo- basentransporters in einer Wirtszelle hemmen kann. Dieses Fragment kann mindestens 10 Nukleotide, vorzugsweise mindestens 50 Nukleotide, ganz besonders bevorzugt min- destens 200 Nukleotide umfassen. Dieses Fragment kann in eine Wirtszelle eingebracht und dort in eine nicht-translatierbare RNA (Antisinn-RNA) transkribiert werden, die durch Bindung an ein endogenes Nukleobasentransporter-Gen oder an die daraus transkri- bierte mRNA deren Expression hemmen kann.

Femer betrifft die Erfindung ein Konstrukt, das eine erfindungsgemäße Nukfeinsäure und/oder ein erfindungsgemäßes Fragment derselben unter der Kontrolle von die Ex- pression regulierenden Elementen enthält. Beispiele für solche regulierenden Elemente sind konstitutive oder induzierbare Promotoren, wie z. B. für Bakterien der E. coli- Promotor araBAD (Carra& Schlief, 1993, EMBO J. 12,35-44), für Pilze der Hefepromo- tor PMA1 (Rentsch et al., 1995, FEBS Lett. 370,264-268) und für Pflanzen der virale CaMV35S Promotor (Pietrzak et al., 1986, Nucl. Acids Res. 14,5857-5868). Ferner kann die Nukleinsäure oder das Fragment mit einem Transkriptionsterminationssignal ver- sehen werden. Derartige Elemente sind bereits beschrieben worden (siehe z. B. Gielen et al., 1984, EM80 J. 8,23-29). Der transkriptionelle Startbereich kann sowohl nativ (homolog) als auch fremdartig (heterolog) zum Wirtsorganismus sein. Die Sequenz der Transkriptionsstart-und-terminationsregionen kann synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen sein oder eine Mischung aus synthetischen und natürlichen Bestandteilen enthalten. Vorzugsweise befindet sich die Nukleinsäure bzw. das Fragment in dem Kon- strukt in Antisinnorientierung zum dem regulatorischen Element. Das Konstrukt kann beispielsweise in das pflanzliche Genom eingeführt werden und nach seiner Trans- kription zur Unterdrückung der Bildung der pflanzeneigenen Nukleobasentransporter- Moleküle führen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung liegt das Konstrukt in einem Plasmid vor.

Das Plasmid kann ein Replikationssignal für E. co/i oder Hefe und ein Marker-Gen ent- halten, das die positive Selektion der mit dem Plasmid transformierten Wirtszellen er- laubt. Wird das Plasmid in eine pflanzliche Wirtszelle eingeführt, so können je nach Einführungsmethode weitere Sequenzen erfordertich sein, die dem Fachmann bekannt sind. Ist das erfindungsgemäße Plasmid beispielsweise ein Derivat des Ti-oder Ri-Plas- mids, so muß die einzuführende Nukleinsäure bzw. das einzuführende Fragment von T-DNA-Sequenzen flankiert werden, die die Integration der Nukleinsäure bzw. des Fragments ins Pflanzengenom ermöglichen. Die Verwendung von T-DNA für die Trans- formation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und u. a. in EP 120 516, Hoekema, The Binary Plant Vector System, Offset-drukkerij Kanters B. V. Ablasserdam, (1985), Ka- pitel V, Fraley et al., Crit. Rev. Plant Sci. 4,1-46 und An et al., 1985, EMBO J. 4,277-287 beschrieben worden. Ist die eingeführte Nukleinsäure bzw. das Fragment einmal im Ge- nom integriert, so sind sie dort in der Regel stabil und bleiben auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle erhalten. Die integrierte Sequenz kann ebenfalls einen Selektionsmarker enthalten, der den transformierten Pflanzenzellen Resistenz ge- genüber einem Biozid oder einem Antibiotikum, wie z. B. Kanamycin, G418, Bleomycin, Hygromycin oder Phosphinotricin vermittelt. Der individuell verwendete Marker sollte daher die Selektion transformierter Zellen gegenüber Zelien gestatten, denen die einge- fügte DNA fehlt.

Gegenstand der Erfindung ist ferner eine Wirtszelle, die eine erfindungsgemäße Nuklein- säure und/oder eine Nukleinsäure mit einer Sequenz nach einer der SEQ ID NO 3 bis 5 und/oder ein Fragment der vorgenannten Nukleinsäuren und/oder ein erfindungs- gemäßes Konstrukt enthält. Die Wirtszelle gemäß der vorliegenden Erfindung kann aus Bakterien, Hefe-, Säuger-und Pflanzenzellen ausgewählt werden.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung eine transgene Pflanze sowie Pflanzenteile und/oder Samen dieser Pflanze, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder eine Nukteinsäure mit einer Sequenz nach einer der SEQ ID NO 3 bis 5 und/oder ein Frag- ment der vorgenannten Nukleinsäuren und/oder ein erfindungsgemäßes Konstrukt ent- halten. Vorzugsweise ist die Nukleinsaure, das Fragment und/oder das Konstrukt an einer Stelle des Genoms integriert, die nicht seiner natürlichen Position entspricht.

Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein Protein, das durch Expression einer erfin- dungsgemäßen Nukleinsäure oder einer Nukfeinsäure mit einer Sequenz nach einer der SEQ ID NO 3 bis 5 in einer Wirtszelle erhältlich ist. Die jeweiligen Initiationscodons (ATG) der Sequenzen Nrn. 1 bis 7 wurden im Sequenzprotokoll durch Unterstreichung gekenn- zeichnet. Vorzugsweise besitzt das Protein die gleichen Nukleobasentransporteigen- schaften wie das von der SEQ ID NO 1 oder der SEQ ID NO 9 kodierte Protein. Zum Nachweis der Aktivität eines soichen Proteins können beispielsweise Aufnahmeexperi- mente durchgeführt werden, wie im Ausführungsbeispiel beschrieben. Antikörper, die mit einem erfindungsgemäßen Protein reagieren, werden von der Erfindung ebenfalls umfaßt.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zum Herstellen einer transgenen Pflanze. Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren gelost, das folgende Schritte umfaßt : -Einbringen einer erfindungsgemäßen Nukleinsaure oder einer Nukleinsäure mit einer Sequenz nach einer der SEQ ID NO 3 bis 5 und/oder eines erfindungsgemäßen Frag- ments der vorgenannten Nukleinsäuren in eine Pflanzenzelle ; und -Regenerieren einer Pflanze aus der transformierten Pflanzenzelle.

Transgene Pflanzen, die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden, können z. B. von Tabak-, Kartoffel-, Tomaten-, Zuckerrüben-, Sojabohnen-, Kaffee-, Erb- sen-, Bohnen-, Baumwoll-, Reis-oder Maispflanzen abgeleitet sein.

Für das Einbringen der Nukteinsäure bzw. des Fragments in eine Pflanzenzelle stehen neben der Transformation mit Hilfe von Agrobakterien noch zahireiche weitere Techni- ken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Fusion von Protoplasten, die Mikro- injektion von DNA, die Elektroporation sowie ballistische Methoden und Virusinfektion.

Aus den transformierten Pflanzenzelien können dann in einem geeigneten Medium, wel- ches Antibiotika oder Biozide zur Selektion enthalten kann, wieder ganze Pflanzen rege- neriert werden. Die so erhaltenen Pflanzen können dann auf Anwesenheit der einge- führten DNA getestet werden.

Anders als bei der Transformation mit Hilfe von Agrobakterien, werden bei der Injektion und Elektroporation an sich keine speziellen Anforderungen an den Vektor gestellt. Es können einfache Plasmide wie z. B. pUC-Derivate verwendet werden. Sollen aber aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, ist die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens vorteilhaft. Die transformierten Zellen wachsen inner- halb der Pflanzen in der üblichen Weise (siehe auch McCormick et al., 1986, Plant Cell Reports 5,81-84). Diese Pflanzen können wie üblich angezogen werden und mit Pflan- zen, die die gleiche transformierte Erbanlage oder andere Erbanlagen besitzen, gekreuzt werden. Die daraus entstehenden hybriden Individuen haben die entsprechenden phä- notypischen Eigenschaften.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ebenfalls ein Verfahren zum Beeinflussen der Nukleobasentransportereigenschaften einer Pflanze, eines Pflanzenteils, einer Pflanzenzelle und/oder von Samen, das den folgenden Schritt umfaßt : -Einbringen einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder einer Nukleinsäure mit einer Sequenz nach einer der SEQ ID NO 3 bis 5 und/oder eines erfindungsgemäßen Frag- ments der vorgenannten Nukleinsäuren in eine Pflanzenzelle und/oder eine Pflanze.

Zur Beeinflussung der Nukleobasentransportereigenschaften einer Pflanze eignen sich sowohl Veranderungen der Spezifität des Transportsystems, die den Transport neuer Verbindungen ermöglichen, als auch solche die eine Änderung des Transportmechanis- mus hervorrufen. Beispielsweise sind Veränderungen möglich, die die Affinität oder Substratspezifität des Transporters dahingehend verändern, daß es zu einem effizien- teren Nukleobasentransport in die Blätter oder zu einer Veränderungen der apikalen Dominanz, des Blühverhaltens oder der Seneszenz kommt, oder daß eine verbesserte Verteilung von Pestiziden ermöglicht wird.

Die erfindungsgemäßen Pflanzenzellen können zur Regeneration und Herstellung gan- zer Pflanzen verwendet werden. Die Nukleinsäure gemäß der Erfindung sowie Nuklein- säuren mit einer Sequenz nach einer der SEQ ID NO 3 bis 5 können dazu verwendet werden, homologe Sequenzen aus Bakterien, Pilzen, Pflanzen, Tieren und/oder Men- schen zu isolieren. Um nach homologen Sequenzen suchen zu können, müssen zu- nächst Genbanken angelegt werden, die für den Gehalt an Genen eines Organismus oder für die Expression von Genen in diesem Organismus repräsentativ sind. Erstere sind genomische, letztere sind cDNA-Banken. Aus diesen können mit Hilfe einer Sonde aus den vorgenannten Nukleinsäuren verwandte Sequenzen isoliert werden. Hat man die dazugehörigen Gene identifiziert und isoliert, ist eine Bestimmung der Sequenz und eine Analyse der Eigenschaften der von dieser Sequenz kodierten Proteine möglich.

Eine weitere Verwendung der vorgenannten Nukleinsäuren betrifft die Expression eines Nukleobasentransporters in pro-und/oder eukaryontischen Zellen. Werden die vorge- nannten Nukleinsäuren in eine prokaryontische Zelle eingeführt, so wird eine von Bakte- rien translatierbare RNA-Sequenz eines eukaryontischen Nukleobasentransporters ge- bildet, die trotz der erheblichen Unterschiede in den Membranstrukturen von Pro-und Eukaryonten in einen funktionalen eukaryontischen Nukleobasentransporter mit dessen Substratspezifizität translatiert wird. Dies ermöglicht die Verwendung von Bakterien- stämmen für Studien der Eigenschaften des Transporters sowie seiner Substrate. Die vorgenannten Nukleinsäuren können ebenfalls unter der Kontrolle eines regulatorischen Elements in Antisinnorientierung zur Hemmung der Expression eines endogenen Nu- kleobasentransporters in pro-und/oder eukaryontischen Zellen verwendet werden. Die Herstellung transgener Nutzpflanzen stellt eine weitere Verwendungsmöglichkeit dieser Nukleinsäuren dar.

Weitere Verwendungen sind : Wenn die Transporter essentiel für die Funktion der Pflanze sind, können sie als Her- bizidtarget dienen : Screeningverfahren in Hefe um nach Inhibitoren zu suchen, diese können im Hefesystem und durch chemische Modifikation optimiert werden und dann an Pflanzen getestet werden.

Da Substitutionen am Substratgrundgerüst erlaubt sind, kann man die Transporter nutzen, um Pestizide zu mobilisieren, z. B. durch Anhängen von Purin oder Pyrimidin- resten an Fungizid oder Insektizid.

Spezielle Verwendungen sind : 1. Substratklasse A : Transporter sind verantwortlich für den Transport von Sekundär- metaboliten bzw. Alkaloiden wie z. B. Koffein, Theobromin, Nikotin und ähnliche Sub- stanzen.

Überexpression oder ektopische Expression unter Kontrolle verschiedener Promoto- ren z. B. CaMV-35S oder spezifische Promotoren um Sekundärmetabolite dieser Stoffklasse besser in bestimmte Organe, z. B. Blätter zur Ernte, Samen und Knollen oder Rüben zu transportieren.

Cosuppression oder Antisense-Repression um den Gehalt an derartigen Sekundär- metaboliten, speziell toxischer Substanzen in bestimmten Organen, z. B. Nahrungs- produkten zu verringern ; z. B. als neuartiges Decaffeinierungs-Verfahren.

Sekundärmetabolite sind wichtige Abwehrstoffe der Pflanze gegen Infektionen und Tierfraß. Eine verbesserte Versorgung von betroffenen Organen kann zu verbesserter Resistenz und Widerstandskraft führen.

Sekundärmetabolite als pharmazeutische Produkte (Pflanze als Bioreaktor). Eine op- timale Versorgung von Ernteorganen ist essentiell für die Extrahierbarkeit und kann durch optimierten Transport in transgenen Pflanzen errreicht werden.

2. Substratklasse B : Transporter sind verantwortlich für den Transport von Nukleoba- sen und Derivaten, z. B. einerseits Adenin, Xanthin, Allantoin, Allantoat, Hypoxanthin, Urat, Xanthosin, Inosin ; andererseits Cytosin und seine Derivate wie Barbiturate und Folsäure, aber auch Nukleoside wie Adenosin etc. Umsteuerung von Transportpro- zessen in transgenen Pflanzen führen zu veränderter Zellteilungsaktivität und verbesserter Entwicklung autonomer Zellen : Nu- kleobasen spielen bei der DNA-und RNA-Synthese und damit der Zellteilungsaktivität eine wichtige Rolle, beispielsweise wird Pollen mit Nukleobasen versorgt. Einsatz zur Erzeugung männlich steriler Pollen durch Transportinhibition ; bei dem Transport von Allantoinsäure eine Rolle bei der Fixierung von atmosphäri- schem Stickstoff. Interzellulärer Transport ist wichtig für die Stickstoffassimilation der Pflanze.

* Adenin ist ein essentieller Baustein von ATP. Die externe Versorgung z. B. des Phloems mit ATP könnte durch Veränderung der Expression von PuP Transportern positiv oder negativ in transgenen Pflanzen beeinflußt werden.

3. Substratklasse C : Transporter sind verantwortlich für den Transport von Pflanzen- hormonen, z. B. Cytokininen und Cytokininderivaten, z. B. Ribosiden (siehe Adenin/Adenosin).

Da Cytokinine eine zentrale Rolle in der Steuerung von Entwicklungs-und Stoffwechsel- prozessen spielen, kann eine Änderung der Aktivität durch Überexpression, ektopische Expression oder Repression (durch Cosuppression oder Antisense) in transgenen Pflanzen zu verbesserten Erträgen (Steuerung von sink- source-Relationen), verändertem Verzweigungsgrad (Rolle in der apikalen Domi- nanz), Verbesserung des Keimungsverhaltens von Samen, Beschleunigung oder Verlangsamung der Knospenbildung und Beschleunigung oder Verlangsamung der Seneszenz (Cytokinine verlangsamen die Seneszenz) führen. Außerdem wird die Zellteilungsaktivität und damit die Bildung von Seitenwurzeln, die Größe und Kapazität von Ertragsorganen, die Morphogenese in Gewebekultur, die Expansion von Blättern und die Regulation der Wassereffizienz aufgrund des Einflusses auf Stomaöffnung und Plastidenentwicklung beeinflußt.

4. Transport von verwandten Substanzen : Auch Auxine stehen strukturell dem Spek- trum der von NukleobasenTransportern vermittelten Substraten nahe und konnten ebenfalls durch die Transporter vermittelt werden. Bei einer Veränderung des Trans- ports von Auxinen kann das gesamte Spektrum der Auxinwirkungen beeinflusst werden.

5. Modifikation der TransPorteiqenschaften der Transporter durch Mutaqenese : Erwei- terung des Substratspektrums, z. B. in Richtung des Transports von Alkaloiden, die bisher von den Transportern nicht erkannt werden, synthetischen Hormonen, die schlecht transportiert werden, Nukleobasen die nicht effizient genug transportiert werden als Ausgangsbasis zur Veränderung von Transportprozessen in transgenen Pflanzen.

Bisher konnten zu fast allen neuen pflanzlichen Transportern in tierischen/menschlichen Genomen Homologe gefunden werden (Beispiele : Glukosetransporter der pflanzlichen MST-Familie sind den tierischen GLUT-Transportern auf Sequenzebene verwandt ; Ami- nosäuretransporter der AAP-Familie wurden später in Tieren gefunden (VGAT, SN1) ; Aminosäuretransporter der CAT Familie in Tieren und Pflanzen sind verwandt). Auf Ba- sis der Ähnlichkeit der biochemischen Eigenschaften, die für den tierischen/mensch- lichen Transport von Adenin und die Kompetition durch Koffein gefunden wurde, wird postuliert, daß ein bisher noch nicht identifiziertes Homolog der PUP-Familie in diesen Systemen für den Nukleobasen/Nukleosid und Derivattransport verantwortlich ist. Die Expression dieses Systems in Hefezellen zum Funktionsnachweis ermöglicht erstens die Beschreibung, zweitens die Identifizierung von möglichen Erbkrankheiten, die durch Defekte in dem System hervorgerufen werden, die Identifizierung von neuen Leitstruktu- ren für Pharmazeutika und die Beeinflußung des Transports von Substanzen über die Blut/Hirnschranke, da der Adenin/Koffeintransport an dieser Stelle vorkommt.

Die folgenden Figuren und Beispiele erläutern die Erfindung.

Figur 1 zeigt eine Hydrophobizitätsanalyse des PUP-Nukleobasentransporterproteins nach Kyte und Doolittle.

Figue 2 zeigt die in Form eines Diagramms dargestellten Ergebnisse eines Aufnahme- experiments, bei dem die Cytosinaufnahmerate des Hefestamms MG877ura3- : : pFL61-PUP1 und des Wildtypstamms E1278b (Dubois & Grenson, 1979, Mol. Gen. Genet. 175,67-76) bei verschiedenen pH-Werten gemessen wurde.

Die Substratkonzentration betrug 100 aM.

Figur 3 zeigt die in Form eines Diagramms dargesteliten Ergebnisse eines Aufnahme- experiments, bei dem die Cytosinaufnahme des Hefestamms MG877ura3- : : pFL61- PUP1 mit und ohne Zugabe von Glukose gemessen wurde. Die Zellen wurden vor Be- ginn der Aufnahmemessung zweimal mit Wasser gewaschen und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Fünf Minuten nach Beginn der Messungen wurde einem der Versuchsansätze Glukose bis zu einer Endkonzentration von 1% zugesetzt.

Figur 4 zeigt eine Analyse der Substratspezifität des in Hefe exprimierten PUP1-Nukleo- basentransporters (schwarze Balken) im Vergleich zu dem Hefe-eigenen FCY2-Trans- porter (weiße Balken).

Figur 5 zeigt die in Form eines Diagramms dargestellten Ergebnisse eines Aufnahme- experiments, bei dem die Cytokininaufnahme des Hefestamms MG877ura3- : : PUP1 mittels 3H-markiertem Zeatin untersucht wurde. Angegeben ist die Aufnahme pro Zeit bei einer Konzentration von 100 uM trans-Zeatin. In diesem Fall wurde PUP1 unter Kontrolle des Hefe-ATPase Promotors PMA1 im Vektor pDR195 (Rentsch et ai., 1995, FEBS Lett.

370,264-368) in der Mutante MG877ura3- (FCY2) exprimiert. Als Kontrolle diente der leere Vektor (FCY2pDR195).

Figur 6a zeigt eine schematische Darstellung des Plasmids p35S-PUP1, ein Derivat des Plasmids pBIN19 (Bevan, 1984, Nucl. Acids Res. 12,8711-8721). A steht für ein Frag- ment aus dem Genom des Blumenkohimosaik-Virus, das den 35S-Promotor (nt 6909-7437) trägt. Das Promotor-Fragment wurde als EcoR//Kpn/-Fragment aus dem Plasmid pDH51 (Pietrzak et al., Nucl. Acids Res. 14,5857-5868) präpariert. B steht für ein Notl/Notl-Fragment der cDNA, flankiert von einer Polylinkerregion aus pT7T3 18U/Notl mit Kpnl und Xbal-Schnittstellen mit der kodierenden Region des Nu- kleobasentransporters von Arabidopsis thaliana in Sinnorientierung zum Fragment A.

Der in Fragment B eingezeichnete Pfeil gibt die Leserichtung der cDNA an. C steht für ein Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Plasmids pTiACH5 (Gielen et al., 1984 EMBO J. 3,835-846), Nukleotide 11749 bis 11939, welches als Pvull/Hindlil-Fragment aus dem Plasmid pAGV40 (Herrera-Estrelia et al., 1983, Nature 303,209-213) isoliert und nach Addition eines Sphl-Linkers an die Pvu//-Schnittstelle zwischen die Sphl-und die Hind/ll-Schnittstelle des Polylinkers von pBIN19 ktoniert wur- de.

Figur 6b zeigt eine schematische Darstellung des Plasmids p35S-a-PUP1, ein Derivat des Plasmids pBIN19 (Bevan, 1984, Nucl. Acids Res. 12,8711-8721). A und C stehen jeweils für den CaMV35S-Promotor und das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Plasmids pTiACH5 (siehe Figur 6a). B steht für ein Sspl/Hpal-Fragment der cDNA mit der kodierenden Region des Nukleobasentransporters von Arabidopsis tha- liana in Antisinnorientierung zum Fragment A. Der in Fragment B eingezeichnete Pfeil gibt die Leserichtung der cDNA an.

Figur 7 zeigt die Messung von einwärts gerichteten Strömen in Xenopus-Oozyten, die PUP1 exprimieren, bei einer Haltespannung von-80mV. Es werden einwärts gerichtete Ströme gemessen, sobald Adenin zugegeben wird. Die Stromstärke ist konzentrations- abhängig (Balken geben auf der Ordinate den Strom und auf der Abszisse die Zeit an).

Figur 8 zeigt : (A) das Wachstum von DM734-284DpDR195 auf 150 sLM Adenosin (Kon- trolle) und (B) das Wachstum von DM734-284DpDR195PuP1 auf 150 pM Adenosin.

Figur 9 zeigt das Wachstum von Saccharomyces cerevisiae MG877ura3 (K) und mit dem Konstrukt pDR195PUP1 (1) bzw. mit dem Konstrukt pDR195PUP2 transformierten Klonen auf Koffein-Platten mit verschiedenen Koffein-Konzentrationen.

BEISPIELE Attoemeine Methoden a) Klonierunqsverfahren : Zur Klonierung in E. coli wurde der Vektor pT7T3 18U (Phar- macia) und zur Transformation von Hefen der Vektor pFL61 (Minet & Lacroute, 1990, Curr. Genet. 18,287-291) eingesetzt. Zur Pflanzentransformation wurden die Gen- konstruktionen in den binären Vektor pBinAR, ein Derivat von pBIN19 (Bevan, 1984, Nucl. Acids Res. 12,8711-8721), kloniert. b) Bakterien-und Hefestämme : Für die pT7T3 18U-und pFL61-Vektoren sowie für die pBinAR-Konstrukte wurde der E. coli-Stamm DH5a verwendet. Als Ausgangsstamm für die Expression der cDNA-Bibliothek in Hefe wurde der Hefestamm MG887 (Dubois & Grenson, 1979, Mol. Gen. Genet. 175,67-76) mit der Mutation fcy2 verwendet, nachdem eine ura3-Defizienz eingeführt worden war. c) Transformation von Aqrobacterium tumefaciens : Der DNA-Transfer in die Agrobakte- rien erfolgte durch direkte Transformation nach der Methode von Höfgen und Willmit- zer (1988, Nucl. Acids Res. 16,9877). Die Plasmid-DNA transformierter Agrobakte- rien wurden nach der Methode von Birnboim und Doly (1979, Nucl. Acids Res. 7, 1513-1523) isoliert und nach geeigneter Restriktionsspaltung gelelektrophoretisch analysiert. d) Pflanzentransformation : Die Pflanzentransformationen kann durch Agrobacterium tu- mefaciens (Stamm C58C1, pGV2260)-vermittelten Gentransfer erfolgen (Deblaere et al., 1985, Nucl. Acids Res. 13,4777-4788). Die Transformation von A. thaliana wird beispielsweise mittels Vakuum-infiltration (modifiziert nach Bechtold et al. (1993) Comptes Rendus de I'Academie des Sciences Serie III, Sciences de la Vie 316 : 1194- 1199) ausgeführt. Töpfe (Durchmesser 10 cm) werden mit Erde gefülit und anschlie- Rend mit einem Fliegennetz überspannt. Auf diesem Netz werden A. thaliana-Samen ausgesät. Sechs bis acht Wochen nach dem Aussäen wurden die Pflanzen für die Vakuum-Infiltration benutzt. Zur Vakuum-Infiltration wurden von den entsprechenden Agrobacterium-Stämmen 2 x 1 Liter Kulturen in YEB + Antibiotikum (50 ug/ml Kan und 100 pg/ml Rifl bei 28°C angezogen. Bei einer OD600 von 1,5 werden die Zellen bei 3000 g geerntet und in 600 ml Infiltrationsmedium (0,5 x MS Medium (Sigma), 5% Saccharose, 44 uM Benzylaminopurin) resuspendiert. Die Bakteriensuspension wird in 250 mi Weckgläser gefüllt und in einen Exsikkator gestellt. Die A. thaliana-Pflanzen werden"kopfüber"in die Bakteriensuspension getaucht, dann wird für 5 min Vakuum angelegt. Nach 3-4 Wochen werden die Samen dieser Pflanzen geerntet. Zur Ober- flächensterilisation werden die Samen 10 min lang in 4% Natriumhypochlorid, 0,02% Triton geschüttelt, bei 1500 g abzentrifugiert, viermal mit sterilem Wasser gewaschen und in 3 ml 0.05% Agarose pro 5000 Samen resuspendiert. Die Samen-Agarose- Lösung wird auf MSS Medium (1 x MS, 1% Saccharose, 0,8% Agarose, 50 ug/ml Ka- namycin, pH 5,8) ausgebreitet (Platten mit 13,5 cm Durchmesser für 5000 Samen).

Zur Regierung des Feuchtigkeitsverlustes werden die Platten mit Parafilme ver- schlossen. Die Kanamycin-resistenten Pflanzen werden in Erde umgesetzt. Samen dieser Pflanzen werden geerntet und analysiert. e) Nachweis der Nukleobasentransporter-Aktivität : Der Aktivitätsnachweis kann bei- spielsweise durch Aufnahmeexperimente mit radioaktiven Substraten (z. B.

['4C]-Adenin) in die mit dem pflanzlichen Transportergen unter Kontrolle des Hefe- promotors transformierten fcy2-Hefemutante (MG877ura3- : : pFL61-PUP1), prinzipiell wie bei Ninnemann et al., 1994 (EMBO J. 15,3464-3471) beschrieben, durchgeführt werden. Alternativ können andere Expressionsysteme, z. B. Xenopus-Oocyten (Boo- rer et al., 1996, J. Biol. Chem. 271,2213-2220), unter Verwendung elektrophysiologi- scher Meßmethoden eingesetzt werden.

Beispiel 1 : Klonierunq des PUP1-Nukleobasentransporterqens aus Arabidoosis thaliana Die Klonierung des PUP1-Nukleobasentransporters erfolgt durch Komplementation des Hefe-Stamms MG887ura3 (fcy2) (diese Arbeit ; Vorstufe MG887 Grenson 1969, Eur.

J. Biochem. 11,249-260) mit einer cDNA-Genbank aus Arabidopsis thaliana und Selek- tion der Nukleobasentransporter-positiven Zellen. Die fcy2-Hefemutante kann in Medien mit Adenin oder Cytosin als einziger Stickstoffquelle nicht wachsen (Grenson, 1969, Eur.

J. Biochem. 11,249-260 ; Polak & Grenson, 1973, Eur. J. Biochem. 32,276-282). Zur Einführung eines Auxotrophiemarkers (ura3 wurde die Nukleobasenaufnahme- defiziente Mutante MG887 (Dubois & Grenson, 1979, Mol. Gen. Genet. 175,67-76) mit einem Fragment des URA3-Gens transformiert, welches eine interne Deletion trägt.

Durch Selektion auf der toxischen Vorstufe 5-Fluoroorotat konnte eine URA3-defiziente Mutante MG887ura3 isoliert werden.

Zur Komplementation der Nukleobasentransport-Mutation des Hefestamms MG887ura3 wird im Hefe-Expressionsvektor pFL61 (Minet & Lacroute, 1990, Curr. Ge- net. 18,287-291) klonierte cDNA aus jungen Keimlingen von Arabidopsis thaliana (Zwei- Blatt-Stadium) verwendet (Minet et al., 1992, Plant J. 2,417-722). Etwa 1 ; j. g des Vek- tors mit einer cDNA-lnsertion wurden in den Hefestamm MG887ura3 nach der Methode von Dohmen et al. (1991, Yeast 7,691-692) transformiert. Hefetransformanten, die auf Minimalmedium mit 1 mM Adenin als einziger Stickstoffquelle wachsen konnten, wurden vermehrt. Aus diesen Klonen wurde Plasmid-DNA nach Standardverfahren isoliert. Der Stamm MG887ura3 wurde erneut mit dem isolierten Plasmid transformiert. Auf diese Weise wurde ein Plasmid pFL61-PUP1 erhalten, das die fcy2-Mutation komplementieren kann. Dieses Plasmid hat eine Insertion mit einer Größe von 1,2 kb, die das PUP1-Nu- kleobasentransportergen enthält.

Der durch Transformation von MG887ura3 mit dem Plasmid pFL61-PUP1 erhaltene Hefestamm MG887ura3 : : pFL61-PUP1 wird für Aufnahmestudien mit Adenin oder Nu- kleobasen verwendet. Durch gentechnische Veränderung der Kodierregion des Nukle- obasentransportergens PUP1 nach Standardverfahren (vgl. Sambrook et al., 1989, Mo- lecular cloning : A laboratory manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA) können dessen Spezifität bzw. die Eigenschaften des Transportmechanismus ver- ändert werden. Der Stamm MG887ura3 : : pFL61-PUP1 eignet sich direkt für die Unter- suchung von Inhibitoren oder Promotoren des Nukleobasentransports.

Das von dem Hefestamm M887ura3 : : pFL61-PUP1 exprimierte PUP1-Protein wurde einer Hydrophobizitätsanalyse nach Kyte und Doolittle unterzogen. Wie aus Fig. 1 er- sichtlich, weist das PUP1-Protein 9-12 stark hydrophobe Regionen (positive Werte auf der Y-Achse) auf, die lang genug sind, um jeweils einmal die Membran zu durch- spannen. Die erste hydrophobe Region ist nicht bei allen PUP-Proteinen konserviert.

Sequenzanalyse der cDNA-Insertion des Plasmids PFL61-pup1 Aus dem Hefe-Stamms MG887ura3 : : pFL61-PUP1 wurde das Plasmid pFL61-PUP1 isoliert und mit Hilfe synthetischer Oligonukleotide wurde die Insertion nach der Methode von Sanger et al. (1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74,5463-5467) sequenziert. Die kodierende Sequenz des PUP1-Gens wird in SEQ ID NO 1 und die davon abgeleitete Proteinsequenz in SEQ ID NO 8 wiedergegeben.

Beispiel 2 : Aufnahmestudien mit'4C-markiertem Adenin,'4C-markiertem Cytosin und 3H-markierten Cytokininen an dem Hefe-Stamm MG887ura3 : : pFL61-PUP1 Für die Messung der Aufnahmeraten wurden die Hefe-Stämme MG887ura3 : : pFL61, MG887ura3 : : pFL61-PUP1 und deren Ausgangsstamm E1278b (Dubois & Grenson, 1979, Mol. Gen. Genet. 175,67-76) in Vollmedium (YPD) ohne Uracil und mit 2% Glu- kose als Kohlenstoffquelle bis zu einer ODsoo von 0,6 bei 28°C angezogen. Die Zellen <BR> <BR> <BR> wurden bei 3000 g geerntet, zweimal mit Wasser gewaschen und mit Natriumphosphat- puffer (100 mM, pH 4,5), 1% Glukose auf eine OD600 von 12 eingestellt. Die Zell- suspension wurde in 100 NI Portionen bis zum Beginn des Aufnahmeexperiments auf Eis gelagert. Vor dem Start der Aufnahmemessungen wurden die Zellen für 2 min bei 30°C vorinkubiert. Die Reaktion wurde dann gestartet, indem zu 100 u ! Zettsuspension 100 u ! der radioaktiv markierten Substratlösung gegeben wurde. Das Reaktionsgemisch wurde bei 30°C inkubiert und nach Sekunden wurde jeweils 50 ul der Sus- pension entnommen und in 4 ml eiskaltes Wasser gegeben (bei Messungen über 180 Sekunden wurde dementsprechend mehr Zellsuspension und Substratlösung ein- gesetzt). Die Zellen wurden auf Glasfiberfilter gesaugt und mit 4 ml eiskaltem Wasser gewaschen. Die Radioaktivität auf den Filtern wurde anschließend im Flüssigkeits-Szintil- lationszähler ermittelt.

Substratlösung : Bei der Substratlösung handelt es sich um einen 100 mM Natriumphos- phatpuffer pH 4,5 mit 1 % Glukose und 9,25 Bq/pl des radioaktiv markierten Substrats (25-100 uM ['4C]-Adenin oder ['4C]-Cytosin). Darüber hinaus enthält die Substrat ! ösung das nicht markierte Substrat, eventuelle Inhibitoren und Kompetitoren in 2facher End- konzentration. Zur Bestimmung des pH-Optimums wurde auch der pH-Wert des Natri- umphosphatpuffers verändert. Bei der Messung des Einflusses von Glukose auf die Auf- nahmeraten enthielt weder die Zellsuspension noch die Substratlösung Glukose. Glu- kose wurde erst nach dem Start der Aufnahmemessungen zum Meßansatz in einer End- konzentration von 1% hinzugefügt. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß auch PUP2 in der Lage ist, Adenin zu transportieren.

In Tabelle 1 wird die durch den PUP1-Nukleobasentransporter vermittelte Aufnahme von radioaktiv markiertem Adenin und Cytosin durch den Hefestamm MG887ura3 : : pFL61- PUP1 angegeben. Zur Berechnung der intrazellulären Konzentration wurde das Zell- volumen auf das vierfache des Trockengewichts geschätzt (Ninnemann et al, 1994, EM80 J. 15,3464-3471). Die Aufnahme erfolgt entgegen einem Konzentrationsgradien- ten.

Tabelle 1 Anfangskonz. Endkonz. Endkonz. Anreicherungs- Medium Medium Zellen faktor Adenin 200 µM 155 µM 2350 uM 15 C tosin 200 M 145 M 2660 M 18 Der Einfluß von verschiedenen Inhibitoren auf die durch den PUP1-Nukleobasen- transporter vermittelte Adenin-bzw. Cytosinaufnahme in dem Hefestamm MG887ura3 : : pFL61-PUP1 wird in Tabelle 2 gezeigt. Die Inhibitoren wurden fünf Minu- ten vor Anfang der Messungen zu den Zellen hinzugegeben. Die Protonophoren Car- bonyl-Cyanid-m-Chlorphenylhydratzon (CCCP) und 2,4-Dinitrophenol (2,4-DNP) und der H+/ATPase-Inhibitor Diethylstilbestrol blockieren die Aufnahme. Dies kann als klarer Hin- weis auf einen sekundäraktiven, protonengekoppelten Aufnahmemechanismus gewertet werden.

Tabelle 2 Inhibitor relative Adeninaufnahme relative Cytosinaufnahme fI II ohneInhibitor 100 100 100, uM Diethylstilbestrol 4 8 100 M DCCD 47 55 100 M CCCP 13 20 100 M 2, 4-DNP 54 58 10iug/ml Cycloheximid 95 97 Figur 2 zeigt, daß die durch den PUP1 Nukleobasentransporter vermittelte Cytosin- aufnahme in den Hefestamm MG877ura3 : : pFL61-PUP1 von dem pH-Wert abhängig ist. Ahnliche Ergebnisse wurden für die Adeninaufnahme erzielt (Daten nicht gezeigt).

Wie in Fig. 3 gezeigt, ist die durch den PUP1-Nukleobasentransporter vermittelte Cyto- sinaufnahme in dem Hefestamm MG877ura3 : : pFL61-PUP1 glukoseabhängig. Ähnliche Ergebnisse wurden für die Adeninaufnahme erzielt (Daten nicht gezeigt). Die Aktivitäts- zunahme bei Glukosezugabe kann als Hinweis auf eine Energieabhängigkeit gewertet werden. Dieses so wie die beobachtete Aktivitätszunahme bei abnehmendem pH-Wert deutet auf einen sekundäraktiven, protonengekoppelten Aufnahmemechanismus hin.

Zur Untersuchung der Subtratspezifität des in Hefe exprimierten PUP1-Nukleobasen- transporters im Vergleich zu dem Hefe-eigenen FCY2-Transporter wurden Kompetitions- experimente mit nicht-radioaktiven Subtraten durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Expe- rimente werden in Fig. 4 gezeigt. Die Aufnahme von radioaktiv markiertem Adenin wurde gemessen und als 100% gesetzt (entspricht 1,7 bzw. 0,9 nmol. min-'. mg-' Trocken- gewicht). Die Messungen wurden bei einer Substratkonzentration von 25 ; j. M durch- geführt. Die Kompetitoren wurden in 10fachem molarem Überschuß eingesetzt.

Zur Analyse der kompetitiven Inhibition des durch den PUP1-Nukleobasentransporters vermittelten Adenintransports durch die Cytokinine Kinetin und Zeatin wurden Aufnah- meversuche mit verschiedenen Konzentrationen von radioaktiv markiertem Adenin so- wie unterschiedlichen Kompetitor-Konzentrationen durchgeführt. Aus Lineweaver/Burk- Auftragungen wurden die Inhibitor-Konstanten Ki ermittelt (35 4M for Kinetin und 30 M für Zeatin).

Direkte Aufnahmeexperimente in PUP1-exprimierenden Hefezellen mit 3H-markierten Cytokininen (Zeatin und 2-Isopentenyladenin) zeigen, daß PUP1 auch Cytokinine trans- portieren kann (Figur 5). Die Aufnahmeexperimente wurde mit 3H-markiertem Zeatin in MG887ura3 wie für Adenin durchgeführt. Pro Reaktionsansatz wurden 87,3 Bq/pl des radioaktiven Substrates bei einer Gesamtkonzentration von 100 uM trans-Zeatin einge- setzt. Die Ergebnisse von drei unabhängigen Experimenten zeigten für die PUP1-exprimierenden Hefe-Klone gegenüber der mit dem Kontrollplasmid pDR195 transformierten Kontrollstämme eine 70-fach erhöhte Aufnahme an radioaktiv markier- tem trans-Zeatin. Dies zeigt, daß PUP1 den Transport von trans-Zeatin vermittelt.

Beispiel 3 : Transformation von Pflanzen mit Konstruktionen zur Überexpression bzw.

Antisinn-Repression eines Nukleobasentransporterqens Das Einbringen einer für einen pflanzlichen Nukleobasentransporter kodierenden Nu- kleinsaure und die Überexpression bzw. die Antisinn-Repression eines Nukleobasen- transportergens zur Veränderung des Transports von Nukleobasen und ihren Derivaten wird hier am Beispiel von Arabidopsis thaliana beschrieben. Die Anwendung ist aber nicht auf diese Spezies beschränkt. a) Überexpression : Das 1.2kb Notl-Fragment aus dem Plasmid pFL61-PUP1, das als Insertion die cDNA für einen Nukleobasentransporter von Arabidopsis thaliana ent- halt, wurde in den mit Notl geschnittenen Vektor pT7T3 18U/Notl kloniert. Der Vektor pT7T3 18U/A/o/wurde erzeugt, indem in die Sma/-Schnittstelle von pT7T3 18U (Pharmacia) ein Not/-Linker eingefügt wurde. Die Orientierung des Fragments wurde durch eine Restriktionsspaltung überprüft. Der Vektor enthält eine Kpnl-und eine Xba/-Schnittstelle in der multiplen Klonierungsstelle, so daß die PUP1-cDNA aus die- sem Vektor als Kpnl-Xbal-Fragment isoliert werden konnte. Dieses 1.2kb Kpnl-Xbal- Fragment wurde in den Kpnl-Xbal geschnittenen Vektor pBinAR, ein Derivat von pBIN19 (Bevan, 1984, Nucl. Acids Res. 12,8711-8720), kloniert. Das resultierende Plasmid wurde p35S-PUP1 genannt. b) Antisinn-Repression : Aus dem Plasmid pFL61-PUP1 wurde ein 1,1 kb großes Hpal- Ssp/-PUP1-Fragment isoliert und in Antisinn-Orientierung in die Sma/-Schnittstelle von pBinAR kloniert. Die Orientierung des Fragments wurde durch eine Restriktions- spaltung überprüft. Das resultierende Plasmid wurde p35-a-PUP1 genannt.

Die PUP1-cDNA Fragmente tragen in den Figuren 6a und 6b die Bezeichnung"B". Je nachdem, ob B in Sinnorientierung zum CaMV-35S-Promotor von pBinAR eingeführt wurde oder nicht, tragt das entstandene Plasmid die Bezeichnung p35S-PUP1 bzw. p35S-a-PUP1. Zwischen dessen EcoRl-und Kpn/-Schnittstellen wurde ein Fragment aus dem Genom des Blumenkohimosaik-Virus, das den 35S-Promotor (nt 6909-7437) trägt, eingefügt. Das Promotorfragment wurde als EcoR//Kpn/-Fragment aus dem Plas- mid pDH51 (Pietrzak et al., Nucl. Acids Res. 14,5857-5868) prapariert. In der Plasmid- karte trägt das Promotorfragment die Bezeichnung"A". Zwischen der Sphl-und der Hind///-Schnittstelle von pBinAR ist außerdem das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Plasmids pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3,835-846) eingefügt. Hierzu war ein Pvuil/Hindl/l-Fragment (nt 11749-11939) aus dem Plasmid pAGV 40 (Herrera- Estrella et al., 1983, Nature 303,209-2139) an der Pvu//-Schnittstelle mit einem Sphl-Linker versehen worden. Das Polyadenylierungssignal trägt in der Plasmidkarte die Bezeichnung"C".

Nach Transformation von Agrobakterien mit den Plasmiden p35S-PUP1 und <BR> <BR> <BR> <BR> p35S-a-PUP1 wurden diese zur Vakuuminfiltration von Arabidopsis thaliana eingesetzt.

Zehn unabhängig erhaltene Transformanten für beide Konstrukte, in denen die Präsenz des intakten, nicht rearrangierten chimären Gens mit Hilfe von"Southern blot"-Analysen nachgewiesen worden war, wurden bezüglich der Veränderungen im Nukleobasen- transport untersucht.

Beispiel 4 : Expression des PUP1-Gens in Xenopus-Oozyten Die cDNA für PUP1 wurde mit Notl geschnitten und in einen Oozytenexpressionsvektor kloniert, der untranslatierte 5'-und 3'-Bereiche des ß-Globins aus Xenopus enthält. Die cDNA wurde dann mittels PCR vervielfältigt. Als Vorwärtsprimer wurde SP6 (aus dem Oozytenvektor) benutzt, als Rückwärtsprimer wurde ein Primer, der das STOP-Codon von PUP1 zerstört und gleichzeitig eine Notl-Schnittstelle einfügt, benutzt. Dieses PCR- Fragment wurde Notl und Hindlll geschnitten und in einen Oozytenexpressionsvektor ligiert, der zusätzlich hinter der Noti-Schnittstelle das Gen für GFP ("green floureszent protein"aus der Qualle) enthalt. So entsteht ein offener Leserahmen für ein Fusions- protein aus PUP1 und GFP. Durch Einfügen der Not/-Schnittstelle entsteht ein Linker mit drei für Alanin codierende Basenpaare. Das Plasmid wurde mit Mlul linearisiert, und RNA wurde in vitro mittels SP6-Polymerase transkribiert und zu etwa 1 ng/nl in Wasser aufge- nommen. Je Oozyte (Reifestadium 5 bis 6) wurden 50 nl injiziert. Nach zweitägiger Inku- bation bei 16° wurden Oozyten zum Messen in eine entsprechende Meßkammer gelegt und mit verschiedenen Lösungen überspült. Die Lösungen enthielten : 100 mM N-Methyl- D-Glutaminchlorid, 2 mM Calziumchlorid, 5 mM MES, pH 5,0 oder 7,3 und entsprechen- de Konzentrationen Adenin.

Zur Spannungsmessung wurde eine Glaselektrode (gefülit mit 3 M KCI) in die Oozyte eingestochen. Mit einem Dagan-Verstärker wurde das Potential relativ zur Referenze- lektrode gemessen. Diese war über eine Agarbrücke mit der Badlösung verbunden. In Lösungen ohne Adenin bei pH 7,3 hatten Oozyten ein typisches Ruhepotential von etwa -30 mV (siehe Figur 7). Adenin in der Badlösung ruft eine Depolarisation der Oozyte hervor. Dies zeigt, daß PUP1 auch in Oocyten Adenin transportiert.

Zur Strommessung wurde die Oozyte auf eine Spannung von-80 mV geklemmt.

Adenin in der Badlösung ruft einen einwärtsgerichteten Strom hervor. Da Adenin selbst nicht geladen ist, deutet das auf einen Cotransport mit geladenen lonen, z. B. Protonen, hin.

Beispiel 5 : PUP1-vermittelter Transport von Adenosin in Hefe Der Saccharomyces cerevisiae-Stamm DM734-284D (Genotype : ade8-18. ade2-1, arg4- 16, leu2-27, trp1-1, Iys2, ura3 ; Yeast Genetic Stock Center) wurde für Wachstumsstudi- en benutzt. Dieser Hefe-Stamm ist durch die Mutationen in den Gen-Loci ade 8-18 und ade 2-1 nicht in der Lage selbst Adenin zu synthetisieren. Daher benötigt dieser Stamm Adenin aus dem Außenmedium, um wachsen zu können. Dieses Adenin wird über den Purin/Cytosin-Transporter FCY2 der Hefe aufgenommen. Der Stamm DM734-284D ist jedoch in der Lage, auch auf Medium zu wachsen, welches statt Adenin Adenosin ent- hält, sofern ein Adenosin-Transport in die Hefezelle durch einen gentechnisch einge- brachten Adenosin-Transporter vermittelt wird. Saccharomyces cerevisiae selbst besitzt einen derartigen Adenosin-Transporter nicht. Daher eignet sich der Stamm DM734- 284D als Komplementationssytem für die Isolierung von Adenosin-Transportern aus ver- schiedenen Organismen.

Um zu überprüfen, ob PUP1 den Transport von Adenosin vermittelt, wurde der Stamm DM734-284D mit den Konstrukten pDR195PUP1 und pDR195 als Kontrolle (Rentsch et al., 1995, FEBS Lett. 370,264-368) nach Standardprotokoll zur Hefetransformation transformiert (Dohmen et al., 1991, Yeast 7,691-692). Anschließend wurden zur Über- prüfung der Transformation die Transformationsansätze auf Minimal-Medium plattiert, welches 150 pM Adenin und die zum Wachstum erforderlichen Aminosäuren Arginin, Leucin, Tryptophan (je 60 mg/I) und Lysin (70 mg/I) enthielt. Als Transformationsmarker diente Uracil. Drei unabhängige positive Klone der Kontrolle und der PUP1 exprimieren- den Kione wurden auf Minimal-Medium plattiert, welches statt 150 uM Adenin 150 uM Adenosin enthielt. Bei den PUP1-1 exprimierenden Klone zeigte sich nach drei Tagen deutliches Wachstum, während die mit dem Vektor pDR 195 transformierten Klone kein Wachstum zeigten (siehe Figur 8). Dies zeigt, daß PUP1 den Transport des Nucleosids und Adenin-Derivats Adenosin vermittelt.

Beispiel 6 : PUP1-vermittelter Transport von Koffein in Hefe Um zu überprüfen, ob PUP1 den Transport von Koffein vermittelt, wurde die Sensitivtät des Saccharomyces cerevisiae-Stammes MG877ura3 auf Koffein-haltigen Minimal- Medium ermittelt. Koffein wirkt ab bestimmten Konzentrationen auf Hefe toxisch (Bard et al., 1980, J. Bacteriol. 141,999-1002), was zu langsameren Wachstum bzw. Tod der Hefen führt. Wenn PUP1 den Transport von Koffein vermittelt, so ist anzunehmen, daß ein Hefe-Stamm, welcher dieses Protein exprimiert, gegenüber Koffein eine höhere Sen- sitivität als der entsprechende Kontrollstamm besitzt, was sich in vermindertem Wachs- tum äussert.

Bei diesem Test wurden verschiedene Koffein-Konzentrationen zwischen 0 bis 1,5% Koffein im Minimal-Medium eingesetzt. 16 Stunden in flüssigem Minimalmedium ge- wachsene Hefe-Klone wurden auf den entsprechenden Platten ausgestrichen und für 6 Tage bei 28°C inkubiert. Dabei zeigte sich, daß PUP1 exprimierende Hefen gegenüber dem Kontrollstamm MG877ura3 und dem PUP2 exprimierenden Stamm ab der Kon- zentration von 0,2% Koffein ein deutlich verlangsamtes Wachstum aufwies (siehe Fi- gur 9). Dies muß auf die erhöhte Aufnahme des toxischen Koffeins zurückgeführt wer- den und zeigt, daß PUP1 den Transport von Koffein vermittelt.