MEMORIA DESCRIPTIVA

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se enmarca en el ámbito de la industria agropecuaria y alimenticia, en particular, se relaciona a un aditivo o suplemento de uso en la industria alimenticia. Los ingredientes activos son derivados de material vegetal que se caracterizan por su capacidad neuroprotectora que provee propiedades ventajosas como mejorar la estabilidad de los alimentos, manteniendo sus propiedades físicas y antioxidantes.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El interés por las características físicas de los alimentos comenzó alrededor del año 2010. Los consumidores aumentaron el consumo de los alimentos con mejor textura, donde la textura se asocia al placer y junto con el sabor, son componentes esenciales de la calidad y, por lo tanto, influyen en la aceptabilidad del consumidor.

La influencia positiva en la salud humana, farmacológica y terapéutica, de los polifenoles de la uva y el vino se ha investigado cada vez más durante las últimas décadas desde sus propiedades antioxidantes, antimicrobianas y antiinflamatorias y su posible efecto sobre la salud animal y/o humana. De hecho, varios estudios han sugerido efectos beneficiosos de las moléculas antioxidantes/anti-inflamatoñas, particularmente los taninos de uva, sobre la función celular/tisular. Sin embargo, la astringencia de los polifenoles, que se caracteriza por ser una percepción secante, ligada al amargor, limita su aplicación en alimentos.

Los polifenoles comprenden más de 8.000 compuestos bioactivos, caracterizados por anillos aromáticos con uno o más grupos hidroxilo, que se clasifican principalmente en grupos y subgrupos en función del número de anillos fenólicos y elementos estructurales unidos a los anillos cuya disposición, configuración, sustitución y el número de grupos hidroxilo influyen en la actividad antioxidante, como la actividad de eliminación de radicales y/o la capacidad de quelación de iones metálicos. Los taninos son polifenoles condensados derivados de la uva con alta capacidad antioxidante, y son muy importantes para la calidad del vino tinto debido a su papel en la astringencia y la estabilidad del color a largo plazo. De acuerdo con su estructura química y propiedades antioxidantes, es posible plantear la hipótesis de que los taninos de uva pueden ayudar a proteger contra la degeneración celular o mitigar el daño oxidativo.

Sin embargo, un problema importante que limita el potencial terapéutico de la uva o cualquier otra mezcla de polifenoles reside en su biodisponibilidad ¡n vivo, que depende de muchos factores como la tasa de ingesta y la absorción intestinal. De hecho, a pesar de que los polifenoles son abundantes en muchos alimentos diarios, son mal utilizados y otros ni siquiera se absorben, existiendo bajos niveles en el sistema circulatorio de las personas.

Por otro lado, durante la vida de un individuo, el sistema nervioso central (SNC) está constantemente expuesto a especies reactivas de oxígeno (ROS) y otros radicales libres que surgen de muchas fuentes, incluida la exposición a agentes oxidantes (humo, radiaciones ionizantes, agentes tóxicos) y oxidantes transmitidos por el cuerpo, como metabolites catecolaminas, metabolites secundarios mitocondriales y ácidos grasos poliinsaturados, que están abundantemente presentes en el SNC. Dada la limitada capacidad regenerativa de las neuronas, el SNC es particularmente vulnerable a las ROS, por lo tanto, mantener un correcto equilibrio entre antioxidantes y ROS es fundamental para prevenir el estrés oxidativo y la inflamación del SNC, que puede provocar daño o muerte neuronal y la consecuente neurodegeneración.

De hecho, es ampliamente aceptado que el estrés oxidativo y la inflamación neuronal juegan un papel importante en varias patologías neurodegenerativas crónicas del SNC, incluida la enfermedad de Parkinson (EP), la enfermedad de Alzheimer (EA), la enfermedad de Huntington (EH) y la esclerosis lateral amiotrófica (ELA).

En ese sentido, surge un gran interés en el desarrollo de compuestos antioxidantes y antiinflamatorios extraídos de productos naturales, como estrategias potenciales para reducir el ambiente oxidativo/inflamatorio dentro del SNC y preservar la integridad neuronal y la función cerebral manteniendo las funciones cognitivas como la memoria y el aprendizaje. Sin embargo, una limitación importante de las formulaciones antioxidantes naturales (principalmente polifenoles) es su reducida biodisponibilidad in vivo.

Las semillas de uva y la piel se consideran fuentes valiosas y ecológicas de compuestos bioactivos con potencial neuroprotector, ya que sus extractos muestran actividades neuroprotectoras contra la neurodegeneración, incluida la EA y la isquemia cerebral por varios mecanismos, incluida la eliminación de ROS, la prevención de la disfunción sinóptica y la muerte celular neuronal, y la inhibición de la neuroinflamación. Los polifenoles pueden ejercer su capacidad antioxidante a través de diferentes mecanismos, incluyendo la eliminación directa de ROS, la quelación de iones libres, la inhibición de enzimas involucradas en la producción de ROS, la regulación ascendente de enzimas antioxidantes y la regulación a la baja de genes proinflamatorios. Teniendo en cuenta el importante papel del estrés oxidativo y la neuroinflamación en la progresión de las enfermedades neurodegenerativas, así como el alto potencial de los polifenoles para mitigar estas respuestas por varias vías, surgen como candidatos adecuados para preservar la función del SNC y prevenir/disminuir las enfermedades neurodegenerativas.

Estado del Arte

En el estado del arte se han encontrado algunos desarrollos a suplementos o composiciones que comprenden compuestos fenólicos como agente activo.

Por ejemplo, en el documento US8017147B2 se describe un suplemento alimenticio que comprende al menos 15 compuestos activos que presentan acción neuroprotectora de extractos y/o fitocompuestos. Los micronutrientes o compuestos de baja biodisponibilidad pueden estar encapsulados y menciona diversas opciones para encapsularlos. En este documento se mencionan uvas, semillas de uva y taninos, pero no se mencionan directamente los taninos de semilla de uva. La solicitud de patente US2010143452A1 describe un producto farmacéutico de uso parenteral que contiene un portador coloidal donde el polifenol está en el interior del portador; dentro de los portadores se mencionan liposomas. Por otro lado, no hay mención explícita a taninos ni a semillas de uva y tampoco hay referencia a usos o efectos ventajosos en alimentos, ni a un efecto neuroprotector de la composición.

Por otro lado, Grgic, J. et al. (Antioxidants 2020, 9(10), 923) presenta las diversas opciones de encapsulación, aunque se presenta la elaboración de liposomas, el uso de taninos y menciona las semillas de uva, no muestra particularidades de estas tres características en conjunto. En cuanto a los taninos, menciona que no serían absorbidos por el organismo y respecto a los usos, se mencionan las propiedades generales de los compuestos fenólicos, incluyendo el efecto neuroprotector, antiinflamatoho y antioxidante, además de anticáncer y antidiabetes, aunque los taninos no figuran entre los principales compuestos para tales fines. El uso de películas o recubrimientos, solamente se menciona en relación con los agentes utilizados en el encapsulamiento como método propiamente tal.

El objetivo descrito en el documento US2008213441 A1 es la encapsulación de taninos para uso en alimentos, en donde la encapsulación se hace con lípidos, carbohidratos y/o proteínas, pero no se mencionan los liposomas o la fosfatidilcolina. Existe mención a recubrimientos, pero como equivalentes al encapsulante y no como una aplicación de la composición. Finalmente, en cuanto a los polifenoles, se mencionan algunos taninos; y si bien, en uno de los ejemplos se menciona un extracto de semilla de uva como fuente de polifenoles, no hay referencia a taninos u otros polifenoles específicos. Respecto a los usos, no se refiere a un efecto neuroprotector ni a mejoras en la estabilidad de los alimentos.

Por su parte, Montagner G. E. et al. (Future Foods, vol. 5, 2022, 100144) aborda la encapsulación de un extracto de semilla de uva con valor para la salud humana factible de ser usado en la industria alimenticia y de empaques sostenibles. Este documento no se refiere a taninos de uva, donde los taninos son mencionados como parte del desarrollo de un método para encapsular polvo de guaraná con contenido de taninos. Aunque se refiere a usos relacionados a antioxidantes, no hay referencia a un efecto neuroprotector. Tampoco se aborda algún efecto ventajoso para los alimentos a los que se adicionaría.

Existen también investigaciones que describen liposomas de catequina de semilla de uva recubiertos de quitosano que muestran una alta estabilidad a largo plazo. Dichos liposomas, cuando se administran por vía oral en roedores, alcanzan altas concentraciones plasmáticas, del orden de AUC0-24 de 12,183 ± 1760.00 ng/ml*hr.

Por lo tanto, si bien en el arte previo existen algunas aproximaciones al problema técnico descrito en la presente invención, no todas las composiciones se caracterizan por una comprobada biodisponibilidad de los polifenolescon capacidad de servir como aditivo alimenticio que actúa como neuroprotector a la vez que mejora la estabilidad del producto alimenticio al que se añaden, manteniendo sus características físicas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1 . Ensayo in-vitro utilizando células neuronales (CAD cells) expuestas a liposomas con taninos y especies reactivas al oxigeno (ROS) como H2O2 (peróxido de hidrógeno).

Figura 2. Efecto de los taninos de uva encapsulados en lípidos sobre la supervivencia de las células neuronales bajo estrés oxidativo. Supervivencia celular normalizada al número de células vivas de las placas de control. Control (- ), Control (+), Liposomas vacíos (LS) (+), Liposomas cargados (TLS) (n = 4), Suspensión de taninos (TS) (n = 5). Cada n representa una placa de células diferente de distintos lotes y todas las mediciones se realizaron por cuadruplicado en un día de experimento diferente. ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni. *:p<0,05.

Figura 3. Efecto de los taninos de uva encapsulados en lípidos sobre los niveles de especies oxidativas reactivas intracelulares. Respuesta de fluorescencia integrada inducida por H2O2. ANOVA de una vía y prueba post hoc de Bonferroni, *: p< 0,05. Control (n = 47 células), LS (n = 65 células), TLS (n = 51 células) y TS (n = 47 células). TLS: suspensión de taninos lipoencapsulados; TS: taninos, condensados. Figura 4. Evaluación de la evolución del tamaño medio de partícula (MPS) y del ensayo ABTS medido semanalmente desde el tiempo inicial y hasta 6 semanas.

Figura 5. Contenido total de fenoles evaluado en tiempo inicial y a 6 semanas de almacenamiento a -18°C, 4°C y 25°C, respectivamente

Figura 6. Propiedades Teológicas. Rampa de temperatura A) Yogur de control B) TLS 10% C) TLS 15% y D) TLS 20%

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención provee polifenoles encapsulados en lípidos para uso como aditivo o suplemento en la industria alimenticia, que son capaces de mejorar la estabilidad de los alimentos, manteniendo sus propiedades físicas, además de promover la defensa celular antioxidante/antiinflamatoña y conferir neuroprotección en individuos sanos y enfermos.

La invención comprende como polifenoles preferentes a los taninos de semilla de uva. Los taninos de uva incluyen particularmente a los taninos obtenidos desde la industria vitivinícola.

La biodisponibilidad de los polifenoles se logra mejorar al incorporar portadores moleculares que permiten la entrega adecuada de las moléculas antioxidantes a las células vivas. En este sentido, los liposomas facilitan la absorción de los polifenoles, tales como taninos de uva, por parte de los tejidos biológicos y proporcionan otras ventajas, como baja toxicidad, biocompatibilidad y estabilidad, tasas de aclaramiento más bajas, la capacidad de dirigirse a tejidos específicos y la liberación controlada de los compuestos que portan.

Es importante destacar que la estructura de los liposomas permite administrar medicamentos, lo que los convierte en un medio eficaz para controlar el estrés oxidativo y la inflamación celular después de un ataque oxidativo y además confieren neuroprotección.

La composición de acuerdo con la invención aporta beneficios para la salud mediante alimentos funcionales validados que conducen a la preferencia del consumidor al optar por la ingesta de antioxidantes. La incorporación de moléculas con alta capacidad antioxidante evita reacciones de oxidación. La presente invención incorpora las ventajas de los taninos encapsulados en nanosuspensiones liposomales en las propiedades físicas y antioxidantes de un alimento elaborado con dichas nanosuspensiones para evitar su oxidación con el tiempo.

Preparación de liposomas y encapsulación de taninos.

La invención provee una composición de tipo suplemento alimenticio que comprende polifenoles derivados de material vegetal en una concentración entre 0,1 a 10 mg/ml, encapsulados en una nanosuspensión liposomal elaborada con un compuesto fosfolipídico , un solvente y un tampón, en donde la nanosuspensión liposomal mantiene la biodisponibilidad de los polifenoles aislando su astringencia y amargor, mejorando la estabilidad del producto alimenticio al que se incorporan, sin afectar negativamente sus propiedades físicas.

Los polifenoles corresponden preferentemente a taninos de semillas de uva.

El compuesto fosfolipídico se usa en una concentración entre 0,1 a 10 mg/ml. El solvente se una en una concentración entre 0,1 a 10 mg/ml.

Se provee además un proceso para elaborar el suplemento alimenticio comprende polifenoles naturales nanoencapsulados que comprende las etapas de:

- disolver los polifenoles en una solución tampón;

- incorporar un compuesto fosfolipídico a la solución anterior;

- calentar y homogeneizar la mezcla anterior, incorporando un solvente; y

- reducir el tamaño de los liposomas mediante ciclos de ultrasonido.

Los polifenoles se disuelven en una solución tampón que comprende agua, etanol, glicerol, tween-80 y fosfato.

El compuesto fosfolipídico es preferentemente fosfatidilcolina.

El solvente corresponde preferentemente a glicerol, no obstante, pueden ser usados otros aceites vegetales o sintéticos, propilenglicol, etilenglicol, manitol o sorbitol, y combinaciones de los mismos. Asimismo, el solvente puede también combinarse con tween-20 y/o tween-80.

Las etapas de calentamiento y/o disolución se realizan a una temperatura entre 40 ^s C y 100 ^e C; las etapas de mezclado u homogenización se llevan a cabo entre 400 a 1000 rpm.

Ventajas y Usos

La composición de acuerdo con la invención se usa como aditivo alimenticio o suplemento dietético para alimentos funcionales y/o enriquecidos, con capacidad neuroprotectora que mejora la biodisponi bilidad de los polifenoles consumidos por vía oral.

Además del beneficio para la salud, la composición de acuerdo con la invención mejora la estabilidad de los alimentos, ampliando su vida útil y no afecta las propiedades físicas de los productos alimenticios que la contienen.

La invención que comprende polifenoles encapsulados de acuerdo con la invención permite reducir la astringencia y/o amargor de los alimentos a los que se añade la composición en comparación con añadir directamente los polifenoles.

El suplemento alimenticio que comprende polifenoles nanoencapsulados de acuerdo con la invención se incorpora directamente en los alimentos, tales como en yogurt u otros productos lácteos, sopas y cremas instantáneas; o bien, se podría aplicar en la superficie de los alimentos, mediante pulverizado, como por ejemplo en un recubrimiento para frutas frescas.

Al estar encapsulados, es posible valorizar los taninos poco deseados en la industria vitivinícola por ser altamente astringentes, secantes y amargos.

Ensayos de efectividad

Parte de los análisis se muestran en la sección de ejemplos de la descripción de la presente invención.

Se realizó un ensayo in-vitro utilizando células neuronales (CAD cells) las cuales fueron expuestas a liposomas con taninos y especies reactivas al oxigeno (ROS) como H2O2 (peróxido de hidrógeno). Esto con el objetivo de determinar el efecto protector de los liposomas con taninos. Los resultados mostraron que el H2O2 afecta significativamente la viabilidad celular, sin embargo, cuando se encuentran en el medio los liposomas enriquecidos, esta viabilidad aumenta. Por otro lado, desde el punto de vista de muerte celular, el tratamiento con H202+liposomas disminuyó significativamente este parámetro, evidenciando el efecto protector esperado (Figura 1 ).

A pesar de la baja actividad antioxidante de los liposomas, la suspensión de taninos de uva lipoencapsulados (TLS; del inglés “ lipid-encapsulated grape tannins") significativamente redujo los niveles intracelulares de ROS y redujo la expresión de citocinas proinflamatohas al ser analizado su efecto en células CAD, lo que respalda que la encapsulación de polifenoles corresponde a una forma eficiente para entregar los taninos de uva intracelularmente.

EJEMPLOS

Ejemplo 1 :

Elaboración y caracterización de una composición del suplemento alimenticio de acuerdo con la invención.

Para preparar 100 mi de taninos de uva encapsulados en lípidos (TLS) [1 mg/ml], se disolvieron 0,1 g de taninos en 20 mi de una solución (50:50% v/v) de tampón de etanol-citrato (0,1 M a pH 3), respectivamente a 7OD1 ^S C y 700 rpm. Una vez disuelto, se incorporó 1 [g] de fosfatidilcolina (PC) y se agitó a 700 rpm sin temperatura durante 5 minutos. La suspensión se calentó a 80 °C durante 1 h en un baño termorregulado. Pasado este tiempo, se añadieron 0,76 g de glicerol como lipoprotector disuelto en 40 mi de tampón citrato (0,1 M a pH 3,0) y calentado de nuevo a 80 ^s C durante 1 h.

Después de este segundo período de calentamiento, se agregaron los 40 mi restantes de tampón para completar el volumen y se aplicaron 5 ciclos de vórtice y 20 ciclos de ultrasonido, respectivamente, utilizando un disruptor de células ultrasónicas (HIELSCHER UP100H, Alemania, máx. 100 W) con un sonotrodo MS7 Micro tip 7 (7 mm de diámetro, 120 mm de longitud, densidad de potencia acústica de 130 W/cm2) trabajando al 90% de amperios y 22,5 Hz.

Se utilizó una suspensión de taninos (TS) condensados como control. Tamaño medio de partícula (MPS), índice de polidispersidad (PDI) y potencial z (□). Los análisis MPS, PDI y > para cada muestra se realizaron mediante dispersión dinámica de luz (DLS) con un ángulo de medición de 173 ^e Retroceso y un índice de refracción medio y fosfolípido de 1 ,330 y 1 ,334, respectivamente. (Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments, Reino Unido).

Tabla 1. Caracterización de taninos de uva encapsulados en lípidos

Los datos se muestran como ± S.D. N.N.E: Extractos no nitrogenados. GAE: Equivalentes de ácido gálico expresados en pg de ácido gálico por mi de extracto. TEAC: Capacidad antioxidante expresada como pM de equivalentes de Trolox por mi. Los ensayos de polifenoles totales y ABTS se realizaron por triplicado en 5 experimentos independientes. Pruebas t no emparejadas, * p<0,05 vs. TLS. Los resultados que se muestran en el Ejemplo 1 y la Tabla 1 , indican que la actividad antioxidante de TLS fue insignificante en comparación con TS.

Las muestras TS y TLS presentaron bajo contenido de proteína 0,08 [g/1 OOg], atribuido a la interacción de los taninos con las proteínas. En cuanto al contenido de grasa, TLS reportó un valor alto de 0,18 [g/1 OOg], lo que se atribuye principalmente a la adición de fosfatidi Icol ¡na de soya.

Ejemplo 2:

Evaluación del efecto en el estrés oxidativo y la neuroinflamación

Una composición de taninos de uva encapsulados en lípidos de acuerdo con la invención fue evaluada contra el estrés oxidativo y la neuroinflamación en una línea celular neuronal catecolaminérgica (CAD), evaluando sus efectos sobre la viabilidad celular en condiciones de estrés oxidativo, la producción intracelular de ROS y la expresión génica oxidativa / inflamatoria. Los resultados se muestran en la Fig. 2 según se describe a continuación.

Muerte celular inducida por peróxido de hidrógeno

Analizamos los efectos de LS, TS y TLS sobre la viabilidad celular en células CAD diferenciadas tratadas con o sin peróxido de hidrógeno, con el fin de explorar la capacidad de los liposomas y las suspensiones de taninos libres para prevenir la muerte celular neuronal inducida por ROS. En la Figura 2 se muestra que el tratamiento con H2O2 200 pM indujo la muerte celular en comparación con el control y el pretratamiento con TS y LS cargado impidió este efecto (100,00 ± 7,01 frente a 59,40 ± 17,62 % de supervivencia, control frente a H2O2, p<0,05). Curiosamente, tanto TS como TLS cargada previnieron la muerte celular inducida por peróxido de hidrógeno en células CAD en comparación con el control tratado con H2O2 (59,40 ± 17,62 % frente a 90,38 ± 1 1 ,17 y 95,38 ± 10,32 % de supervivencia; H2O2 frente a H2O2+TLS y H2O2 +TS respectivamente; p<0.05), a pesar de que TLS mostró una actividad antioxidante insignificante por el método ABTS y un contenido de polifenoles significativamente más bajo expresado como equivalentes de ácido gálico (mostrado en la Tabla 1 ).

Estos datos muestran que TLS entregó taninos de manera eficiente dentro de las células antes de la exposición al H2O2 y luego evitó la muerte de las células neuronales inducida por el peróxido de hidrógeno, ya que los liposomas vacíos no pudieron prevenir la muerte celular después del tratamiento con H2O2 en comparación con los liposomas cargados (48,72 ± 21 ,14 frente a 90,38 ± 1 1 ,17). % de supervivencia celular, H2O2+LS frente a H2O2+TLS respectivamente, p<0,05 Figura 2).

Producción de ROS intracelular después del tratamiento con peróxido de hidrógeno

Para confirmar si TLS ejerció su efecto neuroprotector mediante la eliminación eficiente de ROS intracelular, estimulamos previamente las células CAD con TLS y TS durante las mediciones intracelulares de ROS utilizando imágenes de células vivas. Después de la estimulación aguda con H2O2 10 mM, se observaron aumentos sostenidos de ROS intracelular en las células de control y tratadas con LS, lo que confirma que los liposomas perse no ejercen efectos neuroprotectores contra el estrés oxidativo. El análisis cuantitativo de las imágenes de lapso temporal mostró que el tratamiento con TLS y TS disminuye los niveles intracelulares de ROS en células CAD expuestas a H2O2 en comparación con los controles (Fig. 2B; p < 0,05). De hecho, la fluorescencia de CelIROX® (Figura 3) se redujo notablemente mediante TLS en células CAD después de la exposición a H2O2 (AUC 4,46*10 ⁶ ± 4,80*105 frente a 2,76*10 ⁶ ± 2,22*10 ⁵ unidades arbitrarias; control frente a TLS respectivamente, p<0,05). Como se esperaba, los niveles de ROS entre TLS y TS fueron comparables (AUC 2,76*10 ⁶ ± 2,22*10 ⁵ frente a 2,21 *10 ⁶ ± 3,68*10 ⁵ unidades arbitrarias; TLS frente a TS respectivamente).

Protección contra la inflamación inducida por ROS

Analizamos la capacidad de TLS para prevenir la neuroinflamación inducida por estrés oxidativo, así como para inducir la expresión de defensa génica antioxidante en las neuronas. Para ello, tratamos células CAD con H2O2 200 pM con o sin TLS durante 24 h y luego analizamos la expresión de citocinas pro/antiinflamatohas y enzimas antioxidantes mediante RT-qPCR cuantitativa.

El H2O2 resultó en marcados aumentos en la expresión de citocinas proinflamatohas y reducciones en la expresión de enzimas antioxidantes. Es importante destacar que el tratamiento con TLS redujo drásticamente la expresión de ARNm de dos citoquinas proinflamatohas principales después del tratamiento con H2O2 (factor de necrosis tumoral alfa, TNF-a: 400, 3±1 ,7 frente a 7,9±1 ,9 veces; e interleucina-1 beta, IL-1 (3: 423, 4± 1 ,3 vs 12,7±2,6 veces, p<0,05, H2O2 vs TLS+ H2O2, respectivamente), lo que sugiere un papel neuroprotector del TLS al reducir la inflamación neuronal.

El tratamiento con H2O2 dio como resultado una expresión reducida de dos enzimas antioxidantes principales, superóxido dismutasa soluble (CuZn-SOD, 1 ,03 ± 0,12 frente a 0,280...28 ± 0,08 veces, control frente a H2O2, p<0,05) y superóxido dismutasa mitocondrial (Mn- SOD, 1 ,59 ± 0,21 frente a 0,10 ± 0,06 veces, Control frente a H2O2, p<0,05) y, sorprendentemente, ni TLS ni TS pudieron restaurar sus niveles a la condición de control (CuZn-SOD, 0,28 ± 0,08 frente a 0,12 ± 0,04 y 0,26 ± 0,03 veces, H2O2 frente a H2O2 +TLS y H2O2+TS respectivamente, n.s., Mn-SOD, 0,10 ± 0,06 frente a 0,63 ± 0,22 y 0,44 ± 0,21 veces, H2O2 frente a H2O2+TLS y H2O2 +TS respectivamente, n.s.). Ni H2O2 ni TLS afectaron la expresión de óxido nítrico sintasa neuronal. Además, encontramos que el factor de crecimiento transformante beta-1 (TGF-[31 ) también aumentó con el tratamiento con H2O2 y esto se evitó con el tratamiento con TLS (1 ,03 ± 0,10 frente a 16,21 ± 1 ,65 frente a 0,34 ± 0,14 veces; control frente a 0,14 veces). H2O2 vs. H2O2 +TLS respectivamente, p<0,05 entre grupos).

Ejemplo 3:

Propiedades físicas y antioxidantes de un yogurt con nanosuspensiones liposomales con taninos encapsulados

Se elaboraron mezclas que contienen 10, 15 y 20 mi de nanosuspensión de TLS por cada 100 ml de yogurt (TLS 10%, TLS 15% y TLS 20%, respectivamente).

Se realizaron estudios de estabilidad (6 semanas) incluyendo análisis de: Tamaño medio de partícula (MPS), índice de polidispersidad (PDI), Potencial z (^), Ensayo TPC y Ensayo ABTS.

Las pruebas tuvieron en cuenta muestras de yogurt almacenadas a -18°C, 4°C y 25°C.

El aumento de MPS se atribuyó a la hidrólisis de los ásteres de fosfatidilcolina presentes en la formulación de las nanosuspensiones (Ver Fig. 4). En cuanto al PDI, se reportó una distribución de partículas homogénea y monodispersa, la actividad antioxidante disminuye al aumentar la temperatura, debido a la pérdida de la estructura de TLS.

En la Fig.5 se aprecia que el contenido de fenoles totales (TPC) en la muestra almacenada a -18 ^S C disminuyó debido a la exposición prolongada al agua, lo que provocó la degradación de los fenoles.

Para todas las muestras evaluadas (ver Fig. 6), el módulo de almacenamiento (G') es mayor que el módulo de pérdida (G"), mostrando un aumento en la consistencia del yogurt, lo que sugiere que los yogures evaluados tienen un comportamiento típico de estructuras gelificadas.

El yogur elaborado con TLS y almacenado durante 6 semanas a 4°C presentó mejor estabilidad que a -18 ^S C y 25°C, manteniendo sus propiedades físicas y antioxidantes. (TLS= yogur elaborado con nanosuspensiones liposomales que encapsulan los taninos).