Beschreibung

Die vorliegende Erfindung betrifft neue omega-3 mehrfach unge¬ sättigte Fettsäurederivate, deren Herstellung und ihre Verwendung zur Behandlung von Entzündungsprozessen und von septischem Schock.

Eicosapentaensäure (EPA) und Docosahexaensäure (DHA), die in der Natur in relativ hohen Konzentrationen in Fischölen auftreten, sind für ihre antiinflammatorischen Eigenschaften bekannt [Acta. Med. Scand. 208, 401 (1980); J. Clin. Immunol . tS, 402 (1986)]. Inzwischen wurde erkannt, daß einer der Wirkungsmechanismen dieser Fettsäuren auf den Einfluß auf die Arachidonsäure-Kaskade zurückzuführen ist. So führt z.B. eine EPA-Diät zu einer ver¬ mehrten Bildung des Intermediärproduktes Leukotrien B5 bei gleichzeitiger Verminderung von Leukotrien B4. letzteres besitzt ein wesentlich höheres inflammatorisches Potential als Leuko¬ trien B ₅ [J. Clin. Invest. j ^" 4 1922 (1984); J. Biol. Chem. 259, 7615 (1984)]; ebenso ist die endogene Bildung des platelet activating factor reduziert [Biochem. Biophys. Acta 922, 214 (1987)].

Eine Reihe von anderen Funktionen wird durch EPA und DHA beein¬ flußt. In Tieren und menschlichen Probanden wurde die Hemmung der Freisetzung von Mediatoren aus Monozyten (Tumornekrosefaktor, Interleukin 1) nach hinreichend langer Diät beschrieben [N. Engl. J. Med. 320, 265 (1989)]; ebenso wird die Thrombozyten-Aggrega- tion durch EPA gehemmt [Nephron 43, 196 (1986)]. Auf die Prolife¬ ration von Ly phozyten wirkt EPA dämpfend; darüberhinaus in¬ hibiert es die Freisetzung von lytischen Enzymen, Sauerstoff¬ radikalen und die Adhärenz von Granulozyten an das Endothelium [N. Engl. J. Med. 312, 1217 (1985); Biochem. Biophys. Res. Comm. 137, 10094 (1986)].

Die kurz umrissenen Hemmeffekte können in den verschiedensten Krankheitsbildern von therapeutischem Nutzen sein; insbesondere

bei akuten und chronischen Entzündungsprozessen [J. Immunol. 134, 1914 (1985)], rheumatoiden Erkrankungen [J. Rheumatol. 1_5_, 1471 (1988)], Thrombosen und Infarkt, Psoriasis [Lancet Vol.l, 378 (1988)] und septischem Schock. Ebenso ist eine protektive Wirkung bei Graft versus Host Disease zu erwarten. Im Falle des septischen Schocks muß der Fettsäureester intravenös appliziert werden, um einen schnellen Schutzeffekt zu erreichen. Kürzlich wurde gezeigt, daß eine wirksame Reduktion von LTB4 bei Verwen¬ dung von Eicosapentaensäuretriclycerid bereits 6 Stunden nach i.v. Gabe erreichbar ist [Abstract 7th Intern. Conf. on

Prostaglandis and Related Compounds, Florence 1990, S. 47].

Es wurden nun Verbindungen mit besseren Eigenschaften gefunden.

Gegenstand der Erfindung sind Verbindungen der Formel I

Rl-X-Y- NR2R3 I,

worin

Ri der Acylrest von 5,8, 11, 14, 17-Eicosapentaensäure,

4,7,10, 13,16, 19-Docosahexaensäure oder 9, 12, 15-0ctadeca- triensäure,

X ein Sauerstoffatom oder ein NH-Gruppe,

Y eine C2- ₃ -Alkylengruppe,

R2 und R3 Wasserstoffatome oder Cι_2-Alkylgruppen

darstellen, sowie deren Salze mit physiologisch verträglichen Säuren und Cι_2-Trialkylammoniumsalze.

5, 8, 11 , 14, 17-Ei cosapentaensäure (= EPA) hat die Formel

-COOH,

4, 7, 10, 13, 16, 19-Docosahexaensäure (= DHA ) di e Formel OOH und

9, 12, 15-Octadecatriensäure (= o-Linolensäure) die Formel COOH.

In der Formel I ist von den Säureresten der der Eicosapentaen- säure bevorzugt. X ist vorzugsweise ein Sauerstoffatom, Y ist vorzugsweise eine C2-Alkylengruppe und R2 und R3 sind vorzugs¬ weise Methyl- oder Ethylreste, inbesondere aber Methylreste. Vorzugsweise liegen die Verbindungen als Salze mit physiologisch verträglichen Säuren vor.

Als physiologisch verträgliche Säuren sind insbesondere zu nennen: Salzsäure, Zitronensäure, Weinsäure, Milchsäure, Phos¬ phorsäure, Methansulfonsäure, Essigsäure, Ameisensäure, Malein¬ säure, Fumarsäure, Äpfelsäure, Bernsteinsäure, Malonsäure, Schwefelsäure, L-Glutaminsäure, L-Asparaginsäure, Brenztrauben- säure, Schleimsäure, Benzoesäure, Glucuronsäure, Oxalsäure,

Ascorbinsäure, Acetylglycin, Orotsäure. Bevorzugte Salze sind die Hydrochloride und die Trialkylaπunoniumchloride.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen lassen sich nach allgemeinen Methoden zur Synthese von Carbonsäureestern bzw. Carbonsäure- amiden und gegebenenfalls anschließender Ammoniumsalzbildung herstellen.

Zur Synthese der Carbonsäureester bzw. Carbonsäureamide sind vorzugsweise die Umsetzung der Carbonsäurechloride mit den ent¬ sprechenden Alkoholen bzw. Aminen in Gegenwart tertiärer Amin- basen, z.B. 4-Dimethylaminopyridin, oder die Umsetzung der Carbonsäuren mit den entsprechenden Alkoholen bzw. Aminen in Gegenwart wasserentziehender Mittel, z.B. Dicyclohexylcarbodi imid mit 4-Dimethylaminopyridin als Aktivator, geeignet.

Die Knüpfung der Ester- bzw. Amidbindungen geschieht bei Tempe¬ raturen von -10 bis 100°C, vorzugsweise bei Temperaturen von 0 bis 40°C in inerten Lösungsmitteln wie Ethern, Alkanen, chlorier¬ ten Kohlenwasserstoffen, vorzugsweise in Dichlormethan, Chloro- form oder 1, 1, 1-Trichlorethan.

Die Ammoniu salze werden durch Umsetzung der eine A inogruppe enthaltenden Carbonsäureester bzw. Carbonsäureamide mit einer Säure bzw. mit Alkylhalogeniden hergestellt.

So erhält man die Hydrochloride bei Temperaturen von -10 bis 40°C, vorzugsweise bei 0 bis 20°C, in inerten Lösungsmitteln, vorzugsweise in Hexan, durch Einleiten von gasförmigem HC1.

Die erschöpfend alkylierten Ammoniumverbindungen werden bei

Temperaturen von 0 bis 100°C, vorzugsweise bei Temperaturen von 20 bis 60°C, in inerten Lösungsmitteln, vorzugsweise in polaren Lösungsmitteln wie Nitro ethan, durch Umsetzung der Carbonsäure¬ ester bzw. Carbonsäureamide mit C__2-Alkylhalogeniden, vorzugs- weise mit Methylchlorid, hergestellt.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden vorzugsweise unter Inertatmosphäre und Lichtausschluß bei Temperaturen von -30 bis 4°C aufbewahrt.

Die neuen Verbindungen eignen sich zur Behandlung von akuten und chronischen Entzündungsprozessen, rheumatische Erkrankungen, Thrombose und Infarkten, Psoriasis, Schocklunge und septischem Schock. Weiter zeigen sie eine protektive Wirkung bei Graft versus Host Disease.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in üblicher Weise je nach Indikation oral oder parenteral (subkutan, intravenös, intramuskulär, intraperitoneal) verabfolgt werden.

Die Dosierung hängt vom Alter, Zustand und Gewicht des Patienten sowie von der Applikationsart ab. In der Regel beträgt die täg¬ liche Wirkstoffdosis zwischen etwa 10 und 1000 mg/kg Körper¬ gewicht bei oraler Gabe und zwischen etwa 1 und 100 mg/kg Körper- gewicht bei parenteraler Gabe.

Die neuen Verbindungen können in den gebräuchlichen galenischen Applikationsformen fest oder flüssig angewendet werden, z.B. als Tabletten, Filmtabletten, Kapseln, Pulver, Granulate, Dragees, Suppositorien, Lösungen, Salben, Cremes oder Sprays. Diese werden in üblicher Weise hergestellt. Die Wirkstoffe können dabei mit den üblichen galenischen Hilfsmitteln wie Tablettenbindern, Füll¬ stoffen, Konservierungsmitteln, Tablettensprengmitteln, Flie߬ reguliermitteln, Weichmachern, Netzmitteln, Dispergiermitteln, Emulgatoren, Lösungsmitteln, Retardierungsmitteln, Antioxidantien und/oder Treibgasen verarbeitet werden (vgl. H. Sucker et al :

Pharmazeutische Technologie, Thie e-Verlag, Stuttgart, 1978). Die so erhaltenen Applikationsformen enthalten den Wirstoff normaler¬ weise in einer Menge von 0,1 bis 99 Gew.-%.

Die im folgenden aufgeführten Beispiele beschrieben die Erfindung detailliert, schränken die Erfindung aber in keiner Weise ein.

HerstellVorschriften:

Allgemeine Arbeitsvorschriften (AAV) :

AAV 1: Herstellung der Carbonsäurechloride:

1 Äquivalent Carbonsäure wird in absolutem Chloroform oder 1,1,1- Trichlorethan vorgelegt (3 bis 5 ml/mmol Carbonsäure) und unter N2~Atmosphäre bei 20°C vorsichtig mit 2 bis 10 Äquivalenten Oxal¬ säuredichlorid versetzt. Nach 2 h bei 20°C werden Lösungsmittel und überschüssiges Oxalsäuredichlorid unter reduziertem Druck bei 40°C abdestilliert. Das Säurechlorid wird in die weiteren Umset- Zungen roh eingesetzt.

AAV 2: Herstellung der Carbonsäureester und Carbonsäureamide:

0,65 bis 1,5 Äquivalente Alkohol bzw. Amin und 0,75 bis 1,1 Äqui- valente Base (4-Dimethylaminopyridin) werden in absolutem Di- chlormethan, Chloroform oder 1, 1, 1-Trichlorethan (3 bis 5 ml/mmol Carbonsäurechlorid) unter N2~Atmosphäre bei 20°C vorsichtig mit 1 Äquivalent in wenig Lösungsmittel gelöstem Carbonsäurechlorid umgesetzt. Nach beendeter Reaktion (DC-Kontrolle) wird die Reak- tionsmischung unter reduziertem Druck bei 40°C eingeengt und das Produkt chromatographisch über Kieselgel 60 gereinigt.

AAV 3: Herstellung der Hydrochloride:

In eine Lösung von Aminoverbindung in Hexan (5 bis 25 ml/mmol Amin) wird unter N2~Atmosphäre bei 20°C 30 min HC1 gasfärmig ein- geleitet. Anschliessend wird das Lösungsmittel unter reduziertem Druck bei 40 bis 50°C abdestilliert.

Spezielle Arbeitsvorschriften

Beispiel 1

Eicosapentaensäure-(2-dimethylaminoethyl)-ester

3,0 mmol Eicosapentaensäurechlorid wurden aus 0,92 g (3,0 mmol) EPA und 1,0 g (7,9 mmol) Oxalsäuredichlorid in 10 ml Chloroform nach AAV 1 hergestellt und mit 0,4 g (4,5 mmol) 2-Dimethylamino- ethanol und 0,25 g (2,0 mmol) 4-Dimethylaminopyridin in 10 ml Dichlormethan nach AAV 2 umgesetzt (Reaktionszeit 14 h). Das Produkt wurde chromatographisch gereinigt (MTB/Hex/EtOH 1:1:1). Die Ausbeute betrug 0,86 g (76 %) .

1H-NMR (270 MHz, CDCl ₃ ), δ (pp ) : 0.98 (t,J=8HZ,3H) ; 1.70 (m,2H) ; 2.05-2.15(kB,4H); 2.25(s,6H); 2.35(t,J=8Hz,2H) ;2.60(t, >=5,5Hz, 2H); 2.80-3.00(kB,8H) ; 4.20(t,J=5,5HZ,2H) ; 5.20-5.50(kB, 10H) .

Beispiel 2

Eicosapentaensäure-(2-dieth laminoethy1)-ester

16,6 mmol Eicosapentaensäurechlorid wurden aus 5,0 g (16,6 mmol) EPA und 15,0 g (118,1 mmol) Oxalsäuredichlorid in 75 ml Chloro¬ form nach AAV 1 hergestellt und mit 1,94 g (16,6 mmol) 2-Diethyl- a inoethanol und 2,03 g (16,6 mmol) 4-Dimethylaminopyridin in 70 ml Dichlormethan nach AAV 2 umgesetzt (Reaktionszeit 18 h) .

Das Produkt wurde chromatographisch gereinigt (MTB/Hex/EtOH 1:1:1). Die Ausbeute betrug 3,24 g (49 %) .

1H-NMR (360 MHZ, CDC1 ₃ ), . (ppm) : 0.98(t, J=8Hz, 3H) ; 1.05(t, =8HZ, 6H) ; 1.70(m,2H); 2.05-2.15(kB, 4H) ; 2.35(t, J=8Hz, 2H) ; 2.58(q, J=8HZ,4H); 2.70(t,J=6Hz,2H); 2.75-2.90(kB, 8H) ; 4.15(t, J=6Hz, 2H) ; 5.30-5.45(kB, 10H).

Beispiel 3

Eicosapentaensäure-(3-dimethylaminopropyl)-ester

16,6 mmol Eicosapentaensäurechlorid wurden aus 5,0 g (16,6 mmol) EPA und 15,0 g (118,1 mmol) Oxalsäuredichlorid in 75 ml Chloro¬ form nach AAV 1 hergestellt und mit 1,71 g (16,6 mmol) 3-Di- methylaminopropanol und 2,03 g (16,6 mmol) 4-Dimethylaminopyridin in 70 ml Dichlormethan nach AAV 2 umgesetzt (Reaktionszeit 18 h). Das Produkt wurde chromatographisch gereinigt (MTB,MTB/EtOH 1:1). Die Ausbeute betrug 1,99 g (31 %) .

1H-NMR (250 MHz, CDCI3), δ (ppm): 0.98(t, =8Hz, 3H) ; 1.65-1.85(kB, 4H); 2.05-2.20(kB,4H); 2.20(s,6H); 2.25-2.40(kB,4H) ; 2.80-2.90 (kB,8H); 4.10(t,J=6Hz,2H); 5.25-5.45(kB, 10) .

Beispiel 4

Eicosapentaensäure-(l-methyl-2-dimethylaminoethyl)ester

16,6 mmol Eicosapentaensäurechlorid wurden aus 5,0 g (16,6 mmol) EPA und 15,0 g (118,1 mmol) Oxalsäuredichlorid in 75 ml Chloro¬ form nach AAV 1 hergestellt und mit 1,54 g (14,9 mmol) 1-Di- methylamino-2-propanol und 2,03 g (16,6 mmol) 4-Dimethylamino- pyridin in 70 ml Dichlormethan nach AAV 2 umgesetzt (Reaktions¬ zeit 18 h). Das Produkt wurde chromatographisch gereinigt (MTB, MTB/EtOH 1:1). Die Ausbeute betrug 2,44 g (38 %) .

1H-NMR (250 MHZ, CDCl ₃ ), δ (ppm): 0.98(t, =8Hz, 3H) ; 1.20(d, =8Hz, 3H); 1.65-1.75(m,2H); 2.00-2.15(kB, 4H) ; 2.25(s,6H); 2.25-2.35 (kB,3H); 2.50(dd,J=13Hz/8Hz, 1H); 2.75-2.90(kB,8H) ; 5.05(m, 1H); 5.25-5.45(kB, 10H).

Beispiel 5

Ei cosapentaensäure- ( 2-d imethy 1 ami noethy 1 ) -ami d

16,6 mmol Eicosapentaensäurechlorid wurden aus 5,0 g (16,6 mmol) EPA und 15,0 g (118,1 mmol) Oxalsäuredichlorid in 75 ml Chloro¬ form nach AAV 1 hergestellt und mit 1,32 g (14,9 mmol) N,N-Di- methylethylendiamin und 2,03 g (16,6 mmol) 4-Dimethylaminopyridin in 70 ml Dichlormethan nach AAV 2 umgesetzt (Reaktionszeit 18 h). Das Produkt wurde Chromatographiseh gereinigt (MTB/Hex/EtOH 1:1:1). Die Ausbeute betrug 1,31 g (24 %).

1H-NMR (300 MHz, CDC1 ₃ ), _ (ppm): 0.98(t, =8Hz, 3H) ; 1.70(m,2H); 2.00-2.25(kB,6H); 2.20(s,6H); 2.40(t,0=6Hz,2H) ; 2.75-2.90(kB, 8H) ; 3.32(m,2H); 5.30-5.50(kB, 10H) ; 6.00(s,lH).

Beispiel 6

Docosahexaensäure-(2-dimethy1aminoeth l)-ester

9,2 mmol Docosahexaensäurechlorid wurden aus 3,0 g (9,2 mmol) DHA und 2,92 g (23,0 mmol) Oxalsäuredichlorid in 45 ml 1,1,1-Tri- chlorethan nach AAV 1 hergestellt und mit 0,82 g (9,2 mmol) 2-Dimethylaminoethanol und 1,10 g (9,2 mmol) 4-Dimethylamino- pyridin in 30 ml 1, 1, 1-Trichlorethan nach AAV 2 umgesetzt (Reak¬ tionszeit 18 h). Das Produkt wurde chromatographisch gereinigt (MTB/Hex/EtOH 1:1:1). Die Ausbeute betrug 1,35 g (37 %) .

IH-NMR (250 MHZ, CDCI3), δ (ppm): 0.98(t, J=8Hz, 3H) ; 2.10(m,2H) ; 2.25(s,6H); 2.35-2.40(kB, 4H) ; 2.60(t, _=6Hz, 2H) ; 2.80-2.90(kB, 10H); 4.20(t,J=6Hz,2H); 5.25-5.45(kB, 12H) .

Beispiel 7

Octadecatr i ensäure- ( 2-d imethy 1 ami noethy 1 ) -ester

10,8 mmol Octadecatriensäurechlorid wurden aus 3,0 g (10,8 mmol) Octadecatriensäure und 3,40 g (26,8 mmol) Oxalsäuredichlorid in 45 ml Chloroform nach AAV 1 hergestellt und mit 0,97 g (10,8 mmol) 2-Dimethylaminoethanol und 1,33 g (10,8 mmol) 4-Di- methylaminopyridin in 30 ml Dichlormethan nach AAV 2 umgesetzt (Reaktionszeit 18 h). Das Produkt wurde chromatographisch ge- reinigt (MTB/Hex/EtOH 1:1:1). Die Ausbeute betrug 1,65 g (44 %) .

IH-NMR (250 MHz, CDCI3), δ (ppm): 0.95(t, J=8Hz, 3H) ; 1.15-1.35(kB, 8H); 1.55(m,2H); 1.90-2.05(kB,4H) ; 2.20(s,6H); 2.22(t, J=8HZ, 2H) ; 2.50(t,J=6Hz,2H); 2.65-2.75(kB, 4H) ; 4.10(t, =6Hz, 2H) ; 5.15-5.35 (kB,6H).

Beispiel 8

Eicosapentaensäure-(2-dimeth 1aminoethyl)-ester-hydrochlorid

2,0 g (5,4 mmol) Substanz des Beispiels 1 wurden in 50 ml Hexan nach AAV 3 mit gasförmiger HC1 umgesetzt. Die Ausbeute betrug 2,16 g (98 %) .

IH-NMR (360 MHZ, CDC1 ₃ ), δ (ppm): 0.98(t, =9Hz, 3H) ; 1.72 (m,2H) ; 2.05-2.15 (kB,4H); 2.43(t, J=8Hz, 2H) ; 2.75-2.85(kB, ΘH) ; 2.95(d, J=8Hz,6H); 3.45(m,2H); 4.55(t, J-5, 5Hz, 2H) ; 5.30-5.45(kB, 10H) ; 11.15(m,lH).

Beispiel 9

Eicosapentaensäure-(2-aminoeth l)-ester-hydrochlorid

1. N-tert.-Butyloxycarbonyl-2-aminoethanol

5,06 g (82,8 mmol) 2-Aminoethanol wurden mit 8,38 g (82,8 mmol) Triethyla in in 200 ml Dichlormethan vorgelegt und bei 20°C mit 18,07 g (82,8 mmol) Pyrokohlensäure-di-tert.-butylester umge- setzt. Nach 20 h wurde die Reaktionsmischung zweimal mit 100 ml ges. NaCl-Lösung und einmal mit 1 N HCl gewaschen, über NaS0 getrocknet und unter reduziertem Druck bei 60°C eingeengt. Die Ausbeute betrug 8,26 g (62 %) .

2. Eicosapentaensäure-(2-tert.-butyloxycarbonyl-aminoethyl)-es ter

16,6 mmol Eicosapentaensäurechlorid wurden aus 5,0 g (16,6 mmol) EPA und 15,0 g (118,1 mmol) Oxalsäuredichlorid in 75 ml Chloro¬ form nach AAV 1 hergestellt und mit 2,65 g (16,6 mmol) N-tert.- Butyloxycarbonyl-2-aminoethanol und 1,5 g (12,3 mmol) 4-Dimethyl- a inopyridin in 50 ml Dichlormethan nach AAV 2 umgesetzt (Reak¬ tionszeit 4 h). Das Produkt wurde chromatographisch gereinigt (MTB/Hex/EtOH 1:1:2). Die Ausbeute betrug 7,04 g (92 %).

IH-NMR (270 MHz, CDCl ₃ ), δ (ppm): 0.98(t, =8Hz,3H) ; 1.45(s,9H); 1.70(m,2H); 2.00-2.15 (kB,4H); 2.35(t,J=8Hz, 2H) ; 2.75-2.90(kB, 8H); 3.35(m,2H); 4.10(t, J=5,5Hz, 2H) ; 5.08(s,lH); 5.25-5.50 (kB,10H).

3. Eicosapentaensäure-(2-aminoethyl)-ester-hydrochlorid

1,00 g (2,3 mmol) Eicosapentaensäure-(2-tert.-butyloxycarbonyl- aminoethyl)-ester wurden in 40 ml Dichlormethan bei 20°C mit 2 ml (26,1 mmol) Trifluoressigsäure versetzt. Nach 2 h wurde die Reaktionsmischung mehrmals mit gesättigter NaHC0 -Lösung und

dreimal mit wenig Wasser gewaschen und über NaSO^ kurz getrock¬ net. Anschließend wurde bei 20°C 10 min gasförmiges HC1 einge¬ leitet und die Reaktionsmischung anschließend sofort unter redu¬ ziertem Druck bei 40°C eingeengt. Die Ausbeute betrug 0,83 g (97 %).

IH-NMR (300 MHz, CDC1 ₃ ), δ (ppm): 0.98(t, J=8Hz, 3H) ; 1.70(m,2H); 1.95-2.20(kB,4H); 2.45(t, =8Hz, 2H) ; 2.70-3.00(kB,8H) ; 3.35(s, br,2H): 4.42(s,br, 2H) ; 5.20-5.60(kB, 10H) ; 8.25(s,br, 3H) .

Beispiel 10

Docosahexaensäure-(2-dimeth laminoethyl)-ester-hydrochlorid

0,3 g (0,75 mmol) der Substanz des Beispiels 6 wurden in 20 ml Hexan nach AAV 3 mit gasförmiger HC1 umgesetzt. Die Ausbeute betrug 0,31 g (95 %) .

IH-NMR (300 MHZ, CDC1 ₃ ), δ (ppm): 0.98(t, J=8Hz,3H) ; 2.08(m,2H); 2.35-2.50(kB,4H) ; 2.70-3.10(kB, 16H) ; 3.35(t,J=6Hz, 2H) ; 4.80(t, J=6HZ,2H); 5.25-5.55(kB, 12H) ; 13.0(s,lH).

Beispiel 11

Octadecatriensäure-(2-dimethylaminoethy1)-ester-hydrochl orid

0,7 g (2,0 mmol) der Substanz des Beispiels 7 wurden in 10 ml Hexan nach AAV 3 mit gasförmigem HC1 umgesetzt. Die Ausbeute betrug 0,77 g (100 %) .

IH-NMR (250 MHZ, CDC1 ₃ ), δ (ppm): 1.00(t,J=8HZ, 3H) ; 1.15-1.40(kB, 8H); 1.55(m,2H); 1.90-2.10(kB,4H) ; 2.40(t, =8Hz, 2H) ; 2.65-2.85 (kB,4H); 2.90(d,J=6Hz,6H) ; 3.40(m,2H); 4.55(t, J=6Hz, 2H) ; 5.20-5.55(kB,6H); 12.10(s,lH).

In folgenden Versuchen wurde die Wirkung der neuen Verbindungen gezeigt:

Versuch 1: Einfluß auf die Granulozyten-Aktivierung

Granulozyten stellen den dominierenden Zelltyp unter den Leuko¬ zyten-Populationen des Menschen dar und sind insbesondere am frühen als auch am späten Organversagen (early/late organ failure) bei Sepsis und Trauma beteiligt. Es sind die Zellen, die sich aktiv als erste in einem Entzündungsherd anreichern und die erste Reihe der antimi robiellen Abwehr bilden. Die hohe Reakti¬ vität dieses Zelltyps auf alle möglichen inflammatorisehen Stimuli trägt stark zur hohen Lethalität in ARDS (=Adult Respi- ratory Distress Syndrome; Schocklunge) und beim septischen Schock bei [Infect. Immun. 50, 527 (1985); Prostaglandins 27, 227

(1987)]. Stimulierte Granulozyten sind charakterisiert durch die Freisetzung einer großen Zahl lytischer Enzyme und insbesondere von großen Mengen an verschiedenen Sauerstoffradikalen.

Daher wurde zur Beurteilung der omega-3-Fettsäurederivate zu¬ nächst die He mwirkung auf mit verschiedenen Stimuli aktivierte neutrophile Granulozyten in einem Chemilumineszenz Assay ge¬ messen. Die Chemilumineszenz Technik ist ein sehr sensitives Detektionssystem für Sauerstoffradikale.

Zur Isolierung von PMN aus menschlichem Vollblut [J. Clin. Invest. 77, 925 (1986)] und Messung der Aktivität wurden poly- morphonukleäre Neutrophile aus heparinisiertem Vollblut gesunder Spender durch Dextran Sedimentation (Dextran T250, 3 %; 1 x g; 1 h bei Raumtemperatur) und anschließender Auftrennung über einem Percoll-Zweistufen-Gradienten (60 %/68 % PERCOLL in HBSS ohne Ca ^z+ /Mg ^z+ ) mit 600 x g über 30 min bei 4°C, gewonnen. Die Zell¬ fraktion aus der 60 %/68 % PERCOLL Zwischenphase wurden zweimal gewaschen und bestand zu > 98 % aus neutrophilen Granulozyten. Die Che ilumineszenz-Messungen [Meth. Enzym. 133, 449 (1986)] wurden in einem BIOLUMAT 9505 (Fa. Berthold, Wildbad) bei 37°C durchgeführt. Die Proben setzten sich wie folgt zusammen: Lucigenien 10 μM, HBSS mit Ca ²⁺ /Mg ²⁺ je 1 mM und 0,2 % HSA in einem Gesamtvolumen von 0,5 ml. Stimuli (wie TNF, PAF, fMLP oder

PMA) wie auch Inhibitoren (mehrfach ungesättigte Fettsäurederi¬ vate) in verschiedenen Konzentrationen wurden in 20 μl Volumina zugesetzt. Die Ergebnisse wurden als kumulierte Chemilumineszenz- Impulse über eine Periode von 30 min gewonnen, die prozentuale Hemmung bezogen auf den verwendeten Stimulus errechnet und daraus die halbmaximale Hemmkonzentration bestimmt.

Tabelle 1 zeigt, daß die neuen Substanzen bei 5 min. Vorinkuba¬ tion eine gute Hemmwirkung auf die Aktivierung von humanen poly- morphonukleären Neutrophilen besitzen. Die Beispiele 1 und 8 zeigen, daß die Esterform eine deutlich bessere Hemmwirkung aus¬ übt als die Esterkomponenten alleine bzw. als eine äquimolare Mischung der Säure- und der Aminoalkoholkomponente. Die Referenzsubstanz Pentoxifyllin ergibt ebenfalls geringere Hemmeffekte.

Tabelle 1

Hemmung der Aktivierung von humanen polymorphonukleären Neutro- philen (PMN) nach Stimulierung der Zellen mit rHuTNF (1 ng/ml)

Substanz des Beispiels IC50 [μM]

1 16.5

2 11.0 4 7.5

6 17.4

7 6.2

8 6.7

9 24.3 10 8.1

11 11.2

Eicosapentaensäure (EPA) > 100

Dimethylaminoethanol (DMAE) 44.5

EPA + DMAE (äquimolar) 39.0 Pentoxifyllin 72.0

Tabelle 2 zeigt, daß die Substanz des Beispiels 8 eine hohe Wirk¬ stärke gegen andere natürliche Stimuli (PAF/fMLP) der PMN-Akti- vierung besitzt, nicht jedoch gegen den Phorbolester und PKC-Aktivator PMA.

Tabelle 2

Hemmung der Stimulierung von polymorphonukleären Neutrophilen (PMN)

Vergleich der Wirkung bei verschiedenen Stimuli

Stimulus Inhibitor IC50 [μM] rHuTNF Substanz des Beispiels 8 6.7 fMLP Substanz des Beispiels 8 10.0

PAF Substanz des Beispiels 8 14.5

PMA Substanz des Beispiels 8 > 50

Tabelle 3 zeigt die Überlegenheit des Beispiels 8 gegenüber dem Tri-EPA-Glyzerin in Bezug auf schnelle Entfaltung der Hemmwirkung in humanen PMN. Der schnelle Effekt auf die Radikalfreisetzung ist weder auf etwaige Radikalfängereigenschaften (Kontrolle im zellfreien System negativ) noch auf eine zytotoxische Wirkung der Testsubstanz auf die Effektorzellen zurückzuführen. Die Viabili- tat nach 4 h Vorinkubation und 30minütiger Exposition gegen TNF war stets > 90 %.

Tabel le 3

Hemmung der Granulozyten - Stimulierung

Abhängigkeit von der Vorinkubationsdauer

Vorinkubation Konzentration Hemmung (in %, bezogen auf

TNF-behandelte Zellkontrolle)

T [h] [μM] Beispiel 8 Tri-EPA-Glyzerin 0 20

5

0.5 20

5

20

5

2 20 5

3 20

5

4 20

5

* Es wurde keine Hemmung sondern eine Stimulierung beobachtet

Versuch 2: Hemmung der Lymphozyten Proliferation

Zur Evaluierung der Wirkung der omega-3-Fettsäuren und ihrer Derivate auf die Lymphoproliferation wurden Splenozyten von Balb/c Mäusen verwendet. Stimulierung der Splenozytenkultur mit LPS führt zur Proliferation der B-Zell Subpopulation, Stimulie¬ rung mit Enterotoxin B zur T-Zellproliferation.

Die Splenozytenkulturen wurden 2 h mit verschiedenen Konzentra¬ tionen der Testsubstanzen in Mi rotiterplatten vorinkubiert und anschließend mit LPS bzw. Enterotoxin B zur Proliferation indu¬ ziert. Die relative Wachstumshemmung, bezogen auf die entspre¬ chende Kontrolle ohne Inhibitor, wurde aus der Zählausbeute des eingebauten [3H]-Thymidin nach zwei Tagen Inkubation bei 37°C und anschließendem 6 stündigem 3H-Tymidinpulse (1 μCi/ 200 μl/well) berechnet und danach die halbmaximale Hemmkonzentrationen (IC50) bestimmt.

Tabelle 4 zeigt für Eicosapentaensäure und für die Ester der Beispiele 1 und 8 einen gleich stark ausgeprägten antiprolife- rativen Effekt sowohl auf die B- wie T-Zellsubpopulation von Maus-Splenozyten

Tabelle 4

Splenozyteπ Proliferation

Effekt von EPA und EPA-Derivaten

Eicosapentaensäure Beispiel 1 Beispiel 8

Versuch 3: Effekt der Testsubstanzen im Endotoxinschock

Die Sensitivitat von Mäusen gegen Lipopolysaccharid ist abhängig von Stamm und Alter der Tiere. Vorversuche mit Balb/c Mäusen ergaben eine lethale Dosis von 20 mg/kg i.v. bei 6-8 Wochen alten Tieren.

Der Effekt der Testsubstanzen im Endotoxinschock wurde unter¬ sucht, indem die Inhibitoren 30 min vor der LPS-Gabe (20 mg/Kg) i.v. appliziert wurden.

In diesen Versuchen zeigten die neuen Verbindungen und insbe¬ sondere die Substanz des Beispiels 8 sehr gute Wirkungen.

Tabelle 5 zeigt die protektiven Effekte der Substanzen im Ver¬ gleich zu Eicosapentaensäure und Eicosapentaensäuretriglycerid. Die Tiere (Balb/c Mäuse, 6-8 Wochen alt) wurden mit verschiedenen Dosen der Beispielsubstanzen einmal (Bolus, i.v.) behandelt. 30 min später erfolgte eine i.v. Applikation mit 20 mg/kg Lipo¬ polysaccharid (LPS) aus E. coli, Serotyp 0 111 B4. Diese Dosis erwies sich in der Kontrollgruppe als 100 % lethal. Pro Dosis der Testsubstanzen wurden je 5-10 Tiere in mindestens 2 unabhängigen Experimenten getestet. In der Tabelle ist die prozentuale über- lebensrate für den angegebenen Dosisbereich aufgelistet.

Tabelle 5

Protektion gegen lethale LPS-Effekte in vivo

Maximale Protektion nach 48 h überlebende Balb/c Dosis zur Pro- [%] Mäuse tektion [mg/kg]

Substanz des Beispiels 1 80-100 10-20

Substanz des Beispiels 2 60- 80 20

Substanz des Beispiels 4 80 20

Substanz des Beispiels 5 60 10-20

Substanz des Beispiels 7 80-100 20 Substanz des Beispiels 8 80-100 5-20

Substanz des Beispiels 9 60 20

Eicosapentaensäure (EPA) 40- 60 20

Tri-EPA-Glycerin 60- 80 10-20

Die in der Beschreibung verwendeten Abkürzungen haben folgende Bedeutungen:

DC Dünnschichtchromatographie

EtOH Ethanol fMLP Formyl-Methionyl-Leucyl-Phenylalanin

HBSS Hanks balanced salt solution

Hex n-Hexan

HSA Human-Serumalbumin i.v. intravenös MTB Methyl-tert.-butyl-ether

NMR Kernresonanzspektroskopie s=Singulett, d=Dublett, t=Triplett, q=Quartett, m=Multiplett, kB=komplexer Bereich, br=breit

LPS Lipopolysaccharid

PAF Platelet Activating Factor

PMA Phorbol-12-myristat-13-acetat

PMN Polymorphonucleare neutrophile Leukozyten

TNF Tumornekrosefaktor