CAMPO TÉCNICO

La presente invención se enmarca en el campo de sistemas de expresión optogenéticos en levadura. El sistema de expresión optogenético permite solucionar muchos de los problemas asociados a la expresión genética controlada con inductores químicos, dado que la luz resulta no tóxica, su efecto puede ser reversible, y no es necesario agregar pasos extra a procesos productivos para retirar del medio de cultivo inductores químicos.

ANTECEDENTES Y ARTE PREVIO

En el contexto de la presente invención, se considera que un fotorreceptor corresponde a una proteína sensible a la luz.

La regulación de la expresión génica es un importante aspecto de algunas invenciones biotecnológicas. Para el control exógeno de la expresión de genes, se han utilizado diversos inductores químicos. Dado que cada compuesto puede ser captado de manera distinta, no es posible controlar a voluntad la temporalidad de la expresión, ni la permanencia de dicho inductor en las células. Además, los inductores químicos suelen tener efectos tóxicos, dada su capacidad de activar respuestas fisiológicas o vías de señalización paralelas. También, la inducción química es prácticamente irreversible, dado que es muy complejo remover estos inductores del medio de cultivo. En este sentido, la luz es un inductor ideal de la expresión génica, ya que es un recurso de bajo costo y no-tóxico, y por su naturaleza, tampoco requiere de pasos adicionales para retirarla del medio de cultivo.

La optogenética es una herramienta a través de la cual se pueden controlar diversos procesos celulares, mediante inducción por luz. Los sistemas de expresión optogenéticos se comportan como verdaderos interruptores que llevan a la activación transcripcional, y presentan considerables ventajas con respecto a los sistemas de expresión de inducción química. Entre ellas se encuentra que la luz es un recurso no-tóxico, de bajo costo y de fácil entrega (inmediata y reversible), permitiendo una alta resolución espacio-temporal de la expresión. Por esta razón, implementar sistemas de expresión inducidos por luz en levadura constituye una poderosa herramienta para controlar de manera no-invasiva la expresión de genes de interés. Por un largo tiempo, la mayoría de los sistemas optogenéticos se centró en el uso de fotorreceptores del tipo opsinas, capaces de permitir la entrada de iones (a nivel de la membrana plasmática) en respuesta a luz, acoplándose dichos cambios de potencial a vías de señalización y a la regulación de algún gen de interés. A pesar de lo invaluable de esas primeras aproximaciones, la entrada de iones produce además otros cambios que pueden potencialmente entregar ruido en el sistema. Así, en los últimos años es posible encontrar sistemas de expresión optogenéticos basados en el fundamento del ensayo de doble híbrido. Es decir, dos proteínas que contienen dominios que responden a luz (fotorreceptores) se expresan como proteínas de fusión, una junto a un dominio de unión a DNA y la otra junto a un dominio de transactivación. Al exponer las células a luz, las proteínas fotosensibles sufren un cambio conformacional e interactúan, reconstituyendo un factor de transcripción funcional capaz de unirse al promotor inducible que controla un gen de interés. Así, se han reportado sistemas de expresión basados en distintos fotorreceptores, que han permitido controlar la expresión génica en diversos organismos.

Así, si bien la levadura S. cerevisiae no posee fotorreceptores activos, hay una serie de organismos que sí poseen fotorreceptores bien caracterizados, y que pueden servir como fuente de piezas para implementar nuevos interruptores optogenéticos. De esta forma, por ejemplo, el hongo filamentoso Neurospora crassa presenta dos fotorreceptores de luz azul. El primero es White Collar 1 (WC-1), un factor de transcripción tipo GATA que contiene un dominio de unión al cromóforo FAD (Flavin Adenin Dinucleotide) y dos dominios PAS (Per- Arnt-Sim) para interacciones proteína-proteína. WC-1 es capaz de sensar la luz mediante el cromóforo FAD presente en su dominio LOV (Light Oxygen Voltage), un tipo especializado de dominio PAS. El segundo fotorreceptor de luz azul en N. crassa es la proteína VIVID (WD), que también posee un dominio LOV con su respectivo FAD unido. En N. crassa WC-1 no actúa solo, sino que dimeriza con el factor de transcripción White Collar 2 (WC-2) formando el denominado White Collar Complex (WCC), interacción proteica mediada por dominios PAS presentes en ambas proteínas. Sin embargo, las características de WCC son aún más complejas: se ha descrito que en condiciones de oscuridad constante (DD) dicho complejo es capaz de reconocer un elemento cis denominado c-box, el cual lleva a transcripción circadiana de genes, incluyendo el gen frequency (frq). La proteína FRQ se considera como el elemento negativo del reloj circadiano, ya que al ser producido inhibe al WCC lo que lleva a que la expresión de nuevo frq cese, mientras que el FRQ que está presente es progresivamente fosforilado hasta ser incapaz de seguir inhibiendo a WCC. Así, un nuevo ciclo de expresión de frq comienza. De esta forma WCC participa de un bucle de retroalimentación transcripcional traduccional negativo, que se repite aproximadamente cada 24 horas. Por otra parte, en presencia de luz, el complejo WCC es capaz de formar un multímero con otro WCC, a través de interacciones LOV-LOV de los WC-1 presentes en cada complejo. Así, el WCC activado por luz cambia su especificidad de secuencia y en vez de promover transcripción desde secuencias tipo c-box, se une como multímero a los elementos de respuesta a luz (pLRE, proximal Light Response Element) que se encuentran en los promotores de cientos de genes, entre ellos el mismo gen vvd. Así, la proteína WD que se empieza a acumular es excitada por luz, llevando a un cambio conformacional a nivel de su dominio LOV. Esto último permite que VVD pueda interactuar a través de dicha región con el dominio LOV fotoactivado presente en WC-1. De esta manera, VVD compite por la interacción WC-1/WC-1 (que ocurre en el megacomplejo WCC-WCC) siendo capaz de heterodimerizar con WC-1. Como consecuencia de la disminución de los niveles de WCC fotoactivado en condiciones de luz constante, la transcripción de los cientos de genes que responden a luz, comienza a atenuarse, proceso conocido como fotoadaptación.

A fin de describir de mejor manera la presente invención, se realizó una búsqueda de arte previo, y a continuación se resumen los documentos cercanos encontrados.

US2013345294 describe un sistema de expresión génica activable por luz, que comprende como principales elementos un factor de transcripción recombinante que puede ser activado/desactivado por luz e incluye 1) un dominio de unión a DNA, 2) un dominio activable por luz, y 3) un dominio regulador de transcripción; además de una unidad de transcripción blanco, incluyendo un elemento reconocido por el primer polipéptido, un promotor regulado, y una secuencia de DNA para transcribirse, y la publicación EP2886653A1 que describe un sistema similar al descrito en US2013345294, pero adaptado a una bacteria procarionte.

WO2015086818A1 describe proteínas quimera, que comprenden una sección sensible a la luz, y un dominio receptor asociado a quinasa. Se describe que los dominios sensibles a luz se obtienen de distintos organismos, y se menciona VIVID de N. crassa.

En la búsqueda realizada también se encontraron publicaciones científicas que describen sistemas de expresión, y a continuación se presenta un breve resumen de las más relevantes.

"Light-lnducible System for Tunable Protein Expression in Neurospora crassa"; Jennifer M. Hurley, Chen-Hui Chen, Jennifer J. Loros, and Jay C. Dunlap. G3 (Bethesda). 2012 Oct; 2(10): 1207-1212. Esta publicación describe un sistema de expresión regulado por el promotor VVD, indicando que puede convertirse en un instrumento útil para el control eficiente de expresión genética. Se menciona que la expresión de mRNA es gradual dependiente de luz. Como prueba de concepto, esta publicación reporta la expresión de 3 genes bajo el control del promotor VVD: wc-1 , gfp, gh5-1.

"Spatio-temporally precise activation of engineered receptor tyrosine kinases by light". Michael Grusch, Karin Schelch, Robert Riedler, Eva Reichhart, Christopher Differ, Walter Berger, Alvaro Inglés-Prieto, and Harald Janovjak. EMBO J. 2014 Aug 1 ; 33(15): 1713-1726. Esta publicación describe proteínas quimera que combinan una porción de un receptor asociado a tirosina quinasa (RTK) y a un dominio sensor de luz. Se postula este sistema o proteínas quimera como una aproximación poderosa para controlar señalización celular.

"Fine tuning the LightOn light-switchable transgene expression system." Ma Z, Du Z, Chen X, Wang X, Yang Y. Biochem Biophys Res Commun. 2013 Oct 25;440(3):419-23. Aquí se describe una sintonización fina que permite controlar el nivel de expresión del sistema LightOn, donde se indica que dependiendo del tamaño de un espaciador que une al promotor con la secuencia UASG permite controlar el nivel de expresión, más allá de un switch "on-off".

"Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system." Wang X, Chen X, Yang Y. Nat Methods. 2012 Feb 12;9(3):266-9. Esta publicación describe un sistema similar al sistema LightOn (EP2682469A1 o US2013345294) pero lleva el sistema de control a células animales y organismos multicelulares (ratón).

"Photoadaptation in Neurospora by Competitive Interaction of Activating and Inhibitory LOV Domains" Erik Malzahn et al, Cell 142, 762-772, September 3, 2010.

Esta publicación describe las respuestas a la luz de Neurospora crassa expuesta a distintas condiciones de iluminación, y describen la fotoadaptación que depende de los dominios LOV presentes en el complejo WCC y en el regulador WD, describiendo cómo la luz induce la expresión de WD y que posteriormente, WD compite en la formación de homodímeros WCC- WCC produciéndose heterodímeros WC1-WD, que bloquean o detienen la transcripción mediada por WCC-WCC, y que finalmente representan la adaptación a la luz del sistema.

En ninguna de las publicaciones encontradas se encuentran todos y cada uno de los elementos que conforman el sistema de expresión optogenética de la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1 : (A) muestra un esquema del sistema de expresión optogenético WC-1/VVD. En condiciones de oscuridad, los fotorreceptores WC-1 LOV y VVDLOV no son capaces de interactuar y la transcripción de los genes se encuentra apagada. Al exponer las células a luz, WC-1 LOV y VVDLOV interactúan, lo cual reconstituye un factor de transcripción GAL4 quimérico. Así, se activa la transcripción de los genes FL01 y TUP1, que están bajo el control de los promotores pGAL1 y p5XGAL1.

Figura 1 (continuación): Evaluación de expresión de gen reportero luciferasa en cepa BY4741 wt transformada con los plásmidos pRS423-WC1 y pRS425-VVD más el plásmido que contiene pGAL1-Luc o p5XGAL1-Luc, bajo condiciones de luz constante (LL) y oscuridad constante (DD). Los resultados mostraron altos niveles de expresión bajo condiciones LL con bajos niveles de expresión de fondo en DD (Figura 1 B), mostrando una inducción máxima de luciferasa de 1258 veces (LL/DD) bajo el control de pGAL1 y 315 veces bajo el control del promotor p5XGAL1 (Figura 1 F). En cepa BY4741 con deleciones de GAL4 y GAL80 {gal4A- gal80A) con el sistema WC1-VVD, los resultados mostraron los mayores niveles de expresión del gen reportero en LL (Figura 1 C), con una inducción máxima de luciferasa 3386 veces bajo el control de promotor pGAL1 y 4116 veces bajo el control del promotor p5XGAL1 (Figura 1 F). Expresión de luciferasa en el locus GAL3 para las cepas BY4741 wt y BY4741 gal4A-gal80A, bajo condiciones LL y DD, (Figura 1 D y E). Una expresión máxima de luciferasa de 55 veces y 21 veces para promotores pGAL1 y p5XGAL1 fue observada en la cepa BY4741 wt (Figura 1 G). Niveles comparables de expresión de luciferasa fueron observados en la cepa BY4741 gal4A/gal80A, con 56 veces y 96 veces para promotores pGAL1 y p5XGAL1 , respectivamente (Figura 1 G).

Figura 2: Evaluación de expresión de genes involucrados en floculacion de levaduras. Los promotores endógenos de FL01, FL011 y TUP1 fueron intercambiados por los promotores pGAL1 y p5XGAL1 en la cepa BY4741 wt. Utilizamos estas cepas para introducir episomalmente el sistema WC1-VVD y controlar la floculacion por la luz. Se muestra el índice de floculacion entre condiciones LL y DD, para cepas con el intercambio de promotores para FL01 y TUP1 que llevan el sistema WC1-VVD.

Figura 3: Evaluación de reversibilidad del fenotipo de floculacion. La reversibilidad fue evaluada bajo diferentes condiciones de LL y DD. Inicialmente, se crecieron las cepas 24 horas en LL seguido por 24 horas en DD, mostrando una fuerte floculacion en las cepas con el intercambio de promotor en FL01 que llevan el sistema WC1-VVD (Figura 3A y C). Sin embargo, las cepas con intercambio de promotor para TUP1 más el sistema WC1-VVD, mostraron floculacion en DD y ninguna reversión del fenotipo después de 24 horas en LL (Figura 3B y D). Luego, evaluamos los fenotipos de floculacion creciendo las cepas 24 horas en DD seguido por 24 horas en LL, mostrando floculacion en LL y ninguna reversión del fenotipo después de 24 horas en DD para las cepas con el intercambio de promotor en FL01 más el sistema WC1-VVD (Figura 3A y E). Cuando las cepas se crecieron con el intercambio de promotor en TUP1 y con el sistema WC1-VVD durante 24 horas en LL, observamos un fenotipo sin floculacion, que estuvo totalmente activo después de 24 horas de DD (Figura 3B y F). Figura 4: Evaluación de expresión del gen limoneno sintasa (LS) de Cannabis sativa. El gen de LS fue clonado en un plásmido pYES2 (pYES2-LS-V5), permitiendo el control del promotor pGAL1 y marcando con V5 la proteína (Figura 4A). La cepa BY4741 fue co-transformada con el sistema WC1-VVD más el plásmido pYES2-LS-V5 y analizamos los niveles de proteínas mediante western-blot en condiciones LL y DD. Estos resultados mostraron un alto nivel de expresión de LS en LL con bajos niveles en DD, y comparable con los niveles de proteína obtenida por inducción con galactosa (Figura 4B y C). El sistema WC1-VVD mostró una inducción de proteína de 110 veces (LL/DD), 2,5 veces mayor que la inducción por galactosa/glucosa (inducción promedio de 44 veces) (Figura 4D).

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La invención corresponde a un sistema de expresión optogenético en levadura y un método para regular la expresión de un gen en una célula hospedera, donde el sistema de expresión optogenético comprende al menos dos fotorreceptores, o proteínas sensibles a luz, distintos que pueden formar un factor de transcripción quimérico, donde una vez que el sistema se expone a la luz, se genera un cambio conformacional que permite la dimerización entre ambos fotorreceptores distintos, formándose así el factor de transcripción, permitiendo la unión de dicho factor de transcripción al promotor, generando así la transcripción del gen de interés.

Más específicamente, el sistema de expresión optogenético comprende al menos:

i. un primer fotorreceptor expresado como proteína de fusión con un dominio de unión a DNA,

¡i. un segundo fotorreceptor expresado como proteína de fusión con un dominio de transactivación,

Ni. un factor de transcripción funcional formado por la interacción de los dos fotoreceptores, con un dominio de unión a DNA asociado al primer fotorreceptor y el dominio de trans-activación asociado al segundo fotorreceptor, donde dicho factor de transcripción funcional es capaz de unirse a elementos de respuesta predeterminados presentes en un promotor específico, y

iv. al menos una proteína de interés cuya expresión se encuentre regulada por el promotor específico.

La presente invención también considera un método para regular la expresión de un gen en una célula hospedera, que comprende los pasos de: a. transformar una célula hospedera de manera que sea capaz de expresar un sistema de expresión optogenético como el descrito previamente;

b. exponer a la luz a la célula hospedera transformada de manera de promover el cambio conformacional tanto del primer fotorreceptor como del segundo fotorreceptor de manera que interactúen entre sí, permitiendo que el dominio de unión a DNA asociado al primer fotorreceptor y el dominio de trans-activación asociado al segundo fotorreceptor formen el factor de transcripción funcional, y así permitir la unión de dicho factor de transcripción funcional a elementos de respuesta presentes en un promotor específico; y

c. expresar una proteína de interés que se encuentra regulada por el promotor específico mencionado en el punto anterior.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Tal como se ha indicado previamente, la presente invención corresponde a un sistema de expresión optogenético en levadura. A fin de ejemplificar la invención y mostrar los principales elementos que la componen, se realizará la descripción de la misma utilizando un caso particular, y en la sección de ejemplos, se muestran 3 distintas realizaciones de la invención considerando el control de la expresión por medio de la luz en 3 casos distintos, expresión de un gen reportero (luciferasa), expresión de una proteína heterologa (limoneno sintasa), y control de floculacion en levadura (expresión de proteínas FLO y TUP). No debe entenderse la aplicación particular del sistema de expresión optogenético elegido para ilustrar la presente invención, como una limitante a su alcance.

La elección de la realización particular correspondiente a la promoción de floculacion en levaduras utilizando el sistema de expresión optogenético descrito en la presente invención, se debe a que la levadura Saccharomyces cerevisiae es uno de los microorganismos más relevantes en biotecnología.

S. cerevisiae ha sido ampliamente utilizado como plataforma biológica con el fin de producir metabolitos de alto valor. Para ello, se fermenta la levadura en quimiostatos o biorreactores, lo cual aumenta el rendimiento en la producción de estos compuestos. Sin embargo, una vez que los procesos de fermentación han finalizado, las células deben ser removidas del medio de cultivo. Este proceso de separación suele hacerse mediante filtración o centrifugación a gran escala, lo cual significa grandes gastos para la industria biotecnológica.

Una solución particular al problema de separación de las levaduras desde el medio de cultivo, corresponde a la aplicación del sistema de expresión optogenético de la presente invención al caso particular en que el sistema de expresión optogenético controla la expresión de genes responsables de la floculacion en levaduras.

La floculacion es un proceso de agregación celular, en donde proteínas de superficie tipo lectinas - codificadas por los genes FLO (floculacion) - interactúan con los residuos de mañosa de las células adyacentes, generando agregación y sedimentación de las células en suspensión. Así, la floculacion constituye un fenotipo altamente relevante, ya que es considerado como un método de separación sencillo y de bajo costo en procesos de fermentación. Se han reportado estudios en donde se induce el fenotipo de floculacion, sin embargo, la mayoría de ellos dependen de la administración de algún químico exógeno, el cual debe ser captado por las células para poder ejercer su efecto inductor.

Luego, el sistema de expresión optogenético de la presente invención, comprende al menos:

a. un primer fotorreceptor, o proteína sensible a la luz, unido operativamente como proteína de fusión con un dominio de unión a DNA;

b. un segundo fotorreceptor, o proteína sensible a la luz, unido operativamente como proteína de fusión con un dominio de trans-activación;

c. un factor de transcripción funcional formado por la interacción del primer fotorreceptor y del segundo fotorreceptor, donde en presencia de luz ambos fotorreceptores sufren un cambio conformacional que permite que interactúen entre sí, permitiendo que el dominio de unión a DNA asociado al primer fotorreceptor y el dominio de trans-activación asociado al segundo fotorreceptor formen dicho factor de transcripción funcional, donde dicho factor de transcripción funcional es capaz de unirse a elementos de respuesta presentes en un promotor específico, y

d. al menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína de interés, donde la expresión de dicha proteína de interés se encuentra regulada por el promotor específico mencionado en el punto anterior.

Para el caso específico de aplicación utilizado para ejemplificar la presente invención, se considera lo siguiente:

El primer fotorreceptor corresponde al dominio LOV presente en la proteína WC-1 , que es expresado como proteína de fusión incorporando un dominio de unión a DNA de GAL4; y el segundo fotorreceptor corresponde al dominio LOV presente en la proteína WD, que es expresado como proteína de fusión incorporando un dominio de trans-activación de GAL4. Este caso particular de aplicación del sistema de expresión optogenético de la presente invención se encuentra ilustrado en la Figura 1.

De manera alternativa, se pueden intercambiar los dominios de unión a DNA y dominio de trans-activación, de manera que: el primer fotorreceptor corresponde a WC-1 que incluye un dominio LOV, que es expresado como proteína de fusión incorporando un dominio de transactivación de GAL4; y el segundo fotorreceptor corresponde a WD que incluye in dominio LOV, que es expresado como proteína de fusión incorporando un dominio de unión a DNA de GAL4.

Por tanto, en una realización específica, en el sistema de expresión optogenético, el primer fotorreceptor corresponde al dominio LOV (secuencia nucleotídica SEC N° 3, secuencia aminoacídica SEC N° 4) presente en una proteína White Collar 1 de Neurospora crassa (WC- 1) (secuencia nucleotídica SEC N° 1 , secuencia aminoacídica SEC N° 2), que está unido operativamente como proteína de fusión incorporando un dominio de unión a DNA de GAL4 (secuencia nucleotídica SEC N° 9, secuencia aminoacídica SEC N° 10), y porque el segundo fotorreceptor corresponde al dominio LOV (secuencia nucleotídica SEC N° 7, secuencia aminoacídica SEC N° 8) presente en una proteína VIVID de Neurospora crassa (WD) (secuencia nucleotídica SEC N° 5, secuencia aminoacídica SEC N° 6), que está unido operativamente como proteína de fusión incorporando un dominio de trans-activación de GAL4 (secuencia nucleotídica SEC N° 11 , secuencia aminoacídica SEC N° 12). Alternativamente, en el sistema de expresión optogenético, el primer fotorreceptor corresponde al dominio LOV presente en una proteína White Collar 1 de Neurospora crassa (WC-1) (secuencia nucleotídica SEC N° 3, secuencia aminoacídica SEC N° 4) , que está unido operativamente como proteína de fusión incorporando un dominio de trans-activación de GAL4 (secuencia nucleotídica SEC N° 11 , secuencia aminoacídica SEC N° 12), y porque el segundo fotorreceptor corresponde al dominio LOV (secuencia nucleotídica SEC N° 7, secuencia aminoacídica SEC N° 8) presente en una proteína VIVID de Neurospora crassa (WD) (secuencia nucleotídica SEC N° 5, secuencia aminoacídica SEC N° 6), que está unido operativamente como proteína de fusión incorporando un dominio de unión a DNA de GAL4 (secuencia nucleotídica SEC N° 9, secuencia aminoacídica SEC N° 10).

En otro aspecto de la presente invención, se considera un método para regular la expresión de un gen en una célula hospedera.

En una realización particular, el método para regular la expresión de un gen en una célula hospedera comprende los pasos de:

a. transformar una célula hospedera de manera que sea capaz de expresar un sistema de expresión optogenético, como el descrito previamente;

b. exponer a la luz a la célula hospedera transformada de manera de promover el cambio conformacional tanto del primer fotorreceptor como del segundo fotorreceptor de manera que interactúen entre sí, permitiendo que el dominio de unión a DNA asociado al primer fotorreceptor y el dominio de trans-activación asociado al segundo fotorreceptor formen el factor de transcripción funcional, y así permitir la unión de dicho factor de transcripción funcional a elementos de respuesta presentes en un promotor específico; y

c. expresar una proteína de interés que se encuentra regulada por el promotor específico mencionado en el punto anterior.

En una realización específica del método para regular la expresión de un gen en una célula hospedera, el primer fotorreceptor corresponde al dominio LOV (secuencia nucleotídica SEC N° 3, secuencia aminoacídica SEC N° 4) presente en una proteína White Collar 1 de Neurospora crassa (WC-1) (secuencia nucleotídica SEC N° 1 , secuencia aminoacídica SEC N° 2), que está unido operativamente como proteína de fusión incorporando un dominio de unión a DNA de GAL4 (secuencia nucleotídica SEC N° 9, secuencia aminoacídica SEC N° 10), y porque el segundo fotorreceptor corresponde al dominio LOV (secuencia nucleotídica SEC N° 7, secuencia aminoacídica SEC N° 8) presente en una proteína VIVID de Neurospora crassa (WD) (secuencia nucleotídica SEC N° 5, secuencia aminoacídica SEC N° 6), que está unido operativamente como proteína de fusión incorporando un dominio de trans-activación de GAL4 (secuencia nucleotídica SEC N° 11 , secuencia aminoacídica SEC N° 12).

En una realización alternativa del método para regular la expresión de un gen en una célula hospedera, el primer fotorreceptor corresponde al dominio LOV presente en una proteína White Collar 1 de Neurospora crassa (WC-1) (secuencia nucleotídica SEC N° 3, secuencia aminoacídica SEC N° 4), que está unido operativamente como proteína de fusión incorporando un dominio de trans-activación de GAL4 (secuencia nucleotídica SEC N° 11 , secuencia aminoacídica SEC N° 12), y porque el segundo fotorreceptor corresponde al dominio LOV (secuencia nucleotídica SEC N° 7, secuencia aminoacídica SEC N° 8) presente en una proteína VIVID de Neurospora crassa (WD) (secuencia nucleotídica SEC N° 5, secuencia aminoacídica SEC N° 6), que está unido operativamente como proteína de fusión incorporando un dominio de unión a DNA de GAL4 (secuencia nucleotídica SEC N° 9, secuencia aminoacídica SEC N° 10).

En una realización específica del método para regular la expresión de un gen en una célula hospedera, el promotor es pGAL1 (SEC N° 27) o p5XGAL1 (SEC N° 28). En otra realización específica del método para regular la expresión de un gen en una célula hospedera, la célula hospedera es una levadura.

En otra realización específica del método para regular la expresión de un gen en una célula hospedera, la levadura es Saccharomyces cerevisiae.

En otra realización específica del método para regular la expresión de un gen en una célula hospedera, la proteína de interés es luciferasa (secuencia nucleotídica SEC N° 19, secuencia aminoacídica SEC N° 20).

En otra realización específica del método para regular la expresión de un gen en una célula hospedera, la proteína de interés es limoneno sintasa (secuencia nucleotídica SEC N° 21 , secuencia aminoacídica SEC N° 22).

En otra realización específica del método para regular la expresión de un gen en una célula hospedera, la proteína de interés es TUP1 (secuencia nucleotídica SEC N° 17, secuencia aminoacídica SEC N° 18).

En otra realización específica del método para regular la expresión de un gen en una célula hospedera, la proteína de interés es FL011 (secuencia nucleotídica SEC N° 15, secuencia aminoacídica SEC N° 16).

En otra realización específica del método para regular la expresión de un gen en una célula hospedera, la proteína de interés es FL01 (secuencia nucleotídica SEC N° 13, secuencia aminoacídica SEC N° 14).

EJEMPLOS DE APLICACIÓN

EJEMPLO 1 : Descripción de Materiales y Métodos en la aplicación de la presente invención

Cepas de levadura, medio y condiciones de cultivo

Las cepas BY4741 wt (MATa; his3M; leu2A0; met15A0; ura3A0) y BY4741 con deleciones de GALA y GAL80 (MATa; his3A1; leu2A0; met15A0; ura3A0, gal4A::NatMx, gal80A::HphMx) de Saccharomyces cerevisiae se usaron como fondo genético para deleciones genéticas e intercambio de promotores. Las cepas usadas y generadas en este trabajo se mantuvieron en medio YDPA (2% glucosa, 2% peptona, 1 % extracto de levadura y 2% agar) a 30°C y sus genotipos se detallan en la Tabla 1. Las cepas que llevan plásmidos con marcadores auxotróficos se mantienen en medio sintético completo (Se) (0,67% base nitrógeno de levadura sin amino ácidos, glucosa 2%, mezcla dropout 0,2% y agar 2%) menos el amino ácido correspondiente (mezcla dropout). Los cultivos de levadura que crecen bajo condiciones diferentes de luz (LL) u oscuridad (DD) se llevan a cabo en incubadoras Pervival (Percival Scientific, USA), usando una intensidad de luz blanca de 100 μΜ m ² s ^_1 . Los experimentos con luz azul se llevaron a cabo usando una lámpara LED con una intensidad de luz de 22 μΜ m ² s ^"1 .

Tabla 1. Cepas de Saccharomyces cerevisiae utilizadas en la realización de los ejemplos descritos de la presente invención.

Construcción de plásmidos y generación de cepas.

Los plásmidos que contienen los dominios foto recepto res LOV de WC1 (pMB1 , SEC N° 23) y VVD (pMB2, SEC N° 24) fueron obtenidos de (Malzahn et al., 2010) [Photoadaptation in Neurospora by Competitive Interaction of Activating and Inhibitory LOV Domains, Malzahn, Erik et al.;Cell , Volume 142 , Issue 5 , 762 - 772]. Los plásmidos usados y generados en este trabajo se describen en la Tabla 2. Usamos los plásmidos pMB1 (SEC N° 23) y pMB2 (SEC N° 24) para amplificación por PCR y clonación de los constructos que contienen los dominios LOV en plásmidos pRS423 (pRS423-WC1 o WC1 , SEC N° 25) y pRS425 (pRS425-VVD o VVD, SEC N° 26) para selección auxotrofica por HIS3 y LEU2, respectivamente. Todos los experimentos y constructos genéticos fueron generados usando clonación por recombinación mediante ensamblaje in vivo.

Tabla 2. Plásmidos utilizados en los ejemplos de la presente invención, generados usando clonamiento recombinante en levadura.

La versión sintética del promotor pGAL1 (SEC N° 27), llamada p5XGAL1 (SEC N° 28), que lleva cinco sitios de unión a DNA para el factor de transcripción Gal4 (GAL4-UAS) fue sintetizada usando el servicio de síntesis Genewiz. En el ensamble de constructos, los promotores pGAL1 (SEC N° 27) y p5XGAL1 (SEC N° 28), fueron amplificados por PCR usando Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix (Thermo scientific, USA). Adicionalmente, la resistencia a antibiótico KanMx fue también amplificada por PCR e incluyó los constructos genéticos en la dirección reversa, la superposición entre productos de PCR fue de 50 bp. Los productos de PCR fueron co-transformados con el plásmido lineal pRS426 en la cepa de levadura BY4741 para clonamiento por recombinación en levadura. Los plásmidos circulares generados en levadura fueron transferidos a la cepa E. coli DH5a y fue analizada por PCR de colonias bajo condiciones estándar, dos clones fueron seleccionados para secuenciación usando el servicio de secuenciación Macrogene. Las cepas BY4741 wt y BY4741 con deleciones en GAL4 y GAL80, fueron transformadas con los constructos genéticos completos (KanMxRV-pGAL1 con SEC N° 30 o KanMxRv-p5XGAL1 con SEC N° 31), que fueron amplificados por PCR usando Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix (Thermo scientific, USA) y partidores de 70 bp para recombinación homologa directa en el locus diana, permitiendo el intercambio de la región del promotor. El intercambio de promotor de FL01, FL011 y TUP1 fue confirmado por PCR en condiciones estándar, los partidores usados para ensamble de plásmidos, intercambio de promotor y confirmaciones de intercambio de promotores se muestran en Tablas 3, 4 y 5. Tabla 3. Cebadores usados para construcción de plásmidos usando clonamiento recombinante.

Tabla 4. Cebadores usados para intercambio de promotores.

Tabla 5. Cebadores usados para confirmar intercambio de promotores.

El mismo procedimiento de ensamble fue seguido para construir diferentes versiones del gen reportero luciferasa bajo el control de promotores pGAL1 y p5XGAL1. La deleción de GAL4, GAL80 e integraciones de gen reportero luciferasa en locus GAL3 fue llevado a cabo usando una estrategia de deleción por recombinación por PCR en un paso. Los partidores usados para deleción del gen e integración del gen reportero en el genoma se lista en Tablas 6 y 7.

Tabla 6. Cebadores usados para eliminar genes y para integrar el gen reportero al genoma.

Tabla 7. Cebadores usados para comprobar las eliminaciones e integraciones en el genoma.

Ensayos de western blot (WB) y expresión de luciferasa.

Hemos usado un luciferasa desestabilizada descrita anteriormente para la cuantificación de la expresión génica en levadura. Hemos clonado en el plásmido pRS426 (SEC N° 29) el gen reportero luciferasa bajo el control de promotores pGAL1 y p5XGAL1 usando clonación por recombinación en levadura como hemos descrito anteriormente. La expresión de luciferasa fue medida en el tiempo bajo condiciones de DD y LL usando un lector de microplacas Cytation 3 (Biotek, USA). La expresión de luciferasa en medio de cultivo Se se normalizó por OD (600 nm) del cultivo de levaduras, todos los experimentos se realizaron en seis réplicas biológicas.

La enzima limoneno sintasa de Cannabis sativa fue optimizada en sus codones para S. cerevisiae (secuencia nucleotídica SEC N° 21 , secuencia aminoacídica SEC N° 22) y clonado en el vector de expresión pYES2 (pYES-LS-V5) (SEC N° 32). La cepa BY4741 wt fue co- transformada con pYES-LS-V5 (SEC N° 32) más pRS423-WC1 (SEC N° 33) y pRS425-VVD (SEC N° 34). Las cepas que llevan los tres plásmidos fueron cultivadas en condiciones de DD y LL hasta obtener OD600=1 , y se realizó la extracción de proteína celulares de levadura. Usamos un total de 25 μg de proteína total de cada una de las muestras para ensayos de western blot, que fueron conducidos en tres réplicas biológicas con un anticuerpo a-V5 (Invitrogen, USA), usando una dilución de 1/500.

Fenotipos de floculación.

Las cepas portadoras del intercambio de promotor en FL01 (secuencia nucleotídica SEC N° 13, secuencia aminoacídica SEC N° 14), FL011 (secuencia nucleotídica SEC N° 15, secuencia aminoacídica SEC N° 16) y TUP1 (secuencia nucleotídica SEC N° 17, secuencia aminoacídica SEC N° 18) fueron co-transformadas con el plásmido pRS423-WC1 (SEC N° 32) y pRS425-VVD (SEC N° 34), y se evaluaron bajo condiciones de DD y LL. Imágenes y análisis del fenotipo de floculación fueron tomadas después de 24 horas de crecimiento en frascos de cultivo bajo condiciones DD o LL. Adicionalmente, las cepas fueron transformadas con un plásmido pRS426 que lleva mCherry controlado por el promotor PTDH3 (pRS426- mCherry, SEC N° 35), imágenes de células de levadura fueron tomadas con microscopía de campo claro y fluorescencia utilizando un microscopio modelo Cytation 3 (BioTek, USA).

La floculación de cada cepa se cuantificó por OD 600 nm mediante el índice de floculación, el cual se calculó como la diferencia de OD en un cultivo de levadura después de 30 min de incubación estática: 1- (OD Final/OD inicial).

EJEMPLO 2: Aplicación del sistema de expresión optogenético de la invención para controlar la expresión de un gen reportero: Luciferasa (LUC)

En este primer ejemplo, se buscó implementar en levadura el sistema optogenético de acuerdo a la presente invención, basado en luz azul para controlar la expresión génica.

Las construcciones genéticas fueron diseñadas in silico y ensambladas in vivo usando clonamiento por recombinación en levadura.

Con el objetivo de implementar un interruptor sintético de acuerdo al sistema de expresión optogenético de la presente invención, basado en la interacción WC1-VVD, usamos los plásmidos pMB1 (SEC N° 23) y pMB2 (SEC N° 24) previamente descritos (Malzahn et al., 2010). Usamos los plásmidos pMB1 (SEC N° 23) y pMB2 (SEC N° 24) para amplificación por PCR y clonación de los constructos que contienen los dominios LOV en plásmidos pRS423 (pRS423-WC1 o WC1) (SEC N° 33) y pRS425 (pRS425-VVD o WD) (SEC N° 34) para selección auxotrófica por HIS3 y LEU2, respectivamente. Así, en respuesta a la estimulación con luz, la interacción WC1-VVD a través de sus dominios LOV activa la transcripción del gen reportero luciferasa (Luc) bajo el control de los promotores pGAL1 y p5XGAL1 (Figura 1A).

Co-transformamos la cepa BY4741 wt con los plásmidos pRS423-WC1 (SEC N° 33) y pRS425-VVD (SEC N° 32) más el plásmido que contiene pGAL1-Luc (SEC N° 36) o p5XGAL1- Luc (SEC N° 37), y evaluamos la expresión de luciferasa de las cepas bajo condiciones de luz constante (LL) y oscuridad constante (DD). Los resultados mostraron altos niveles de expresión bajo condiciones LL con bajos niveles de expresión en DD (Figura 1 B), mostrando una inducción máxima de luciferasa de 1258 veces (LL/DD) bajo el control de pGAL1 (SEC N° 27) y 315 veces bajo el control del promotor p5XGAL1 (SEC N° 28) (Figura 1 F). Dado que el sistema sintético (mencionado en adelante como sistema WC1-VVD) está basado en la reconstitución del factor de transcripción GAL4, y con el objetivo de aumentar los niveles de expresión del gen reportero, desarrollamos una cepa BY4741 con deleciones de GAL4 y GAL80 (ga!4A-gal80A) y evaluamos el sistema WC1-VVD en este fondo genético bajo condiciones LL y DD. Los resultados mostraron los mayores niveles de expresión del gen reportero en LL (Figura 1C), con una inducción máxima de luciferasa 3386 veces bajo el control de promotor pGAL1 (SEC N° 27) y 4116 veces bajo el control del promotor p5XGAL1 (SEC N° 28) (Figura 1 F). Esto representó un aumento de 13 veces en la expresión de luciferasa bajo control del promotor p5XGAL1 (SEC N° 28) en la cepa gal4A-gal80A con respecto al fondo genético tipo silvestre. En general, los altos niveles de expresión de luciferasa confirmaron la activación del sistema WC1-VVD en respuesta a estimulación de luz.

Además, integramos el gen reportero luciferasa en el locus GAL3 de cepas BY4741 wt y BY4741 gal4A-gal80A. Medimos la expresión del gen reportero luciferasa activado por el sistema WC1-VVD en estas dos cepas bajo condiciones LL y DD, mostrando en ambos fondos genéticos, altos niveles de expresión en LL con baja expresión de fondo en DD (Figura 1 D y E). Una expresión máxima de luciferasa de 55 veces y 21 veces para promotores pGAL1 y p5XGAL1 fue observada en la cepa BY4741 wt (Figura 1G). Niveles comparables de expresión de luciferasa fueron observados en la cepa BY4741 gal4A/gal80A, con 56 veces y 96 veces para promotores pGAL1 (SEC N° 27) y p5XGAL1 (SEC N° 28), respectivamente (Figura 1G).

En conclusión, estos resultados demuestran la factibilidad del sistema WC1-VVD para controlar dinámicamente la expresión de luciferasa, episomalmente y también integrada en el genoma de la levadura, abriendo la posibilidad de controlar promotores endógenos, y en definitiva, modular los fenotipos de levadura por la luz.

EJEMPLO 3: Expresión de proteínas heterólogas controladas por luz

Exploramos la posibilidad de expresar proteínas heterólogas por estimulación de luz. Por lo tanto, optimizamos los codones para la expresión del gen de Limoneno Sintasa (LS) de Cannabis sativa (secuencia aminoacídica SEC N°21 , secuencia aminoacídica SEC N° 22), y clonamos este gen en un plásmido pYES2 (pYES2-LS-V5) (SEC N°32), permitiendo el control del promotor pGAL1 (SEC N°27) y marcando con V5 la proteína (Figura 4A). Co- transformamos la cepa BY4741 con el sistema WC1-VVD más el plásmido pYES2-LS-V5 (SEC N°27) y analizamos los niveles de proteínas mediante western-blot en condiciones LL y DD. Estos resultados mostraron un alto nivel de expresión de LS en LL con bajo fondo en DD, y comparable con los niveles de proteína obtenida por inducción con galactosa (Figura 4B y C). El sistema WC1-VVD mostró una inducción de proteína de 110 veces (LL/DD), 2,5 veces mayor que la inducción por galactosa/glucosa (inducción promedio de 44 veces) (Figura 4D). Además, se evaluó la expresión de la proteína después de 2 horas en pulsos de luz azul y luz blanca, mostrando altos niveles de expresión de proteínas sin diferencias entre ambas fuentes de luz. En general, los resultados demuestran la factibilidad del sistema WC1-VVD para expresión de proteínas heterólogas, con una inducción superior que la inducción química con galactosa.

EJEMPLO 4: Aplicación del sistema de expresión optogenético de la invención para controlar la floculación de levaduras, tanto en condiciones de luz constante (LL) como de oscuridad constante (DD)

Con el fin de modular los fenotipos de levadura por la luz, hemos usado el sistema de expresión optogenético de la presente invención para controlar el fenotipo de floculación en la levadura. Inicialmente, hemos intercambiado los promotores endógenos de FL01, FL011 y TUP1 por los promotores pGAL1 (SEC N°27) y p5XGAL1 (SEC N°28) en la cepa BY4741 wt. Confirmamos el intercambio correcto de los promotores endógenos creciendo en cepas en galactosa y glucosa como fuentes de carbono. Usando microscopía de campo brillante observamos una fuerte agregación celular en cepas con intercambio del promotor de FL01 y agregación celular moderada en cepas con intercambio del promotor de FL011, cuando las células se crecieron en galactosa. Como era de esperar, el intercambio de promotor en TUP1 mostró una fuerte agregación celular en glucosa pero no en galactosa, confirmando el fenotipo de floculación por inactivación de TUP1 y el fenotipo opuesto por su expresión en galactosa. En general, nuestros resultados mostraron el correcto intercambio de promotor para estos tres genes relacionados a la floculación de levadura.

Utilizamos estas cepas para introducir episomalmente el sistema WC1-VVD y controlar la floculación por luz. Microscopía de fluorescencia de células de levadura expresando mCherry mostraron altos niveles de agregación celular en LL y poca o ninguna agregación en DD, para cepas con intercambio de promotor FL01 y que llevan el sistema WC1-VVD. Un fenotipo de floculación moderada se observó en LL para cepas con intercambio de promotor FL011; y el fenotipo opuesto de agregación celular fue observado en cepas con intercambio de promotores para TUP1 que llevan el sistema WC1-VVD, mostrando altos niveles de agregación celular en DD pero no en LL. El fenotipo de agregación celular observada en las cepas con diferentes intercambios de promotores y que llevan el sistema WC1 -VVD fue confirmado por microscopía de campo claro. El fenotipo de floculación macroscópico observada en frascos de cultivo se confirmó con el índice de floculación de cada cepa. Los resultados mostraron diferencias significativas (t-test, p<0,01) en el índice de floculación entre condiciones LL y DD, para cepas con el intercambio de promotores para FL01 y TUP1 que llevan el sistema WC1-VVD (Figura 2). En general, los resultados demostraron la viabilidad del sistema WC1-VVD para controlar el fenotipo de floculacion en levadura.

La reversibilidad del fenotipo de floculacion fue evaluada bajo diferentes condiciones de LL y DD. Inicialmente, se crecieron las cepas 24 horas en LL seguido por 24 horas en DD, mostrando una fuerte floculacion en las cepas con el intercambio de promotor en FL01 que llevan el sistema WC1-VVD (Figura 3A y C). Sin embargo, las cepas con intercambio de promotor para TUP1 más el sistema WC1-VVD, mostraron floculacion en DD y ninguna reversión del fenotipo después de 24 horas en LL (Figura 3B y D). Luego, evaluamos los fenotipos de floculacion creciendo las cepas 24 horas en DD seguido por 24 horas en LL, mostrando floculacion en LL y ninguna reversión del fenotipo después de 24 horas en DD para las cepas con el intercambio de promotor en FL01 más el sistema WC1-VVD (Figura 3A y E). Como era de esperar, cuando crecimos las cepas con el intercambio de promotor en TUP1 y con el sistema WC1-VVD durante 24 horas en LL, observamos un fenotipo sin floculacion, que estuvo totalmente activo después de 24 horas de DD (Figura 3B y F). En conclusión, los resultados mostraron una fuerte activación del fenotipo de floculacion, especialmente desde la condición de no floculacion a condición de floculacion, y mostrando las potenciales aplicaciones de este interruptor sintético para fermentaciones industriales.

APLICACIÓN INDUSTRIAL

La presente invención tiene una gran aplicación en la industria biotecnológica, puesto que permite un gran avance en la inducción de la expresión de proteínas por medio de la luz, lo que representa grandes ventajas con respecto a métodos tradicionales de inducción química. Así también, la presente invención brinda una innovadora aplicación para el control de la floculacion de levaduras, permitiendo que cepas de interés floculen en condiciones de LL o en condiciones de DD, dependiendo de cómo se implemente el sistema.