MATERIAL HíBRIDO ORGáNICO-INORGáNICO PARA ALMACENAMIENTO Y LIBERACIóN DE PRINCIPIOS ACTIVOS

DESCRIPCIóN

Campo técnico de Ia invención

La presente invención pertenece al sector de los materiales orgánicos-inorgánicos estructurados, particularmente a materiales híbridos compuestos por nanopartículas que alojen en su interior moléculas y, más particularmente, a materiales que son de utilidad como contenedores y liberadores de moléculas con aplicaciones biomédicas, entre otras.

Objetos de Ia invención

La presente invención tiene como un primer objeto generar un nuevo tipo de partículas de tamaño nanométrico formadas, en su interior, por una fase micelar que contiene uno o más principios activos estabilizados y, en el que se organiza alrededor de dicho principio o principios, una cubierta orgánica-inorgánica susceptible de ser modificada para lograr Ia salida de las moléculas alojadas en su interior. Un segundo objeto de Ia invención es un método de preparación de las nanopartículas híbridas y sus condiciones de síntesis más adecuadas para obtener un producto adecuado para ser utilizado como almacén y emisor de moléculas y estructuras moleculares.

Estado de Ia técnica anterior a Ia invención

En las últimas décadas, uno de los grandes objetivos dentro del campo de los materiales biocompatibles ha sido Ia preparación de sistemas capaces de almacenar y administrar controladamente principios activos. En sus comienzos y debido a su versatilidad, fueron los sistemas orgánicos los más empleados. Entre estos sistemas cabe destacar las micelas, liposomas o nanopartículas poliméricas, siendo el caso de las fases liposomales los que proporcionaron mejores resultados de encapsulación de drogas [T. NH, F. Ishii, Internacional Journal of Pharmaceutics 298 (2005) 198-205]. En concreto, los liposomas son

vesículas consistentes de una o más esferas concéntricas de capas lipídicas separadas unas de otras por moléculas de agua. Su especial composición, los hace altamente efectivos para encapsular en su interior principios activos, tanto hidrófilos como lipófilos, por interacción con Ia fase acuosa o fosfolipídica que los constituyen. Sin embargo, los liposomas y, en general, todos los sistemas orgánicos de encapsulación tienen serias limitaciones, ya que son inestables desde un punto de vista hidrotermal y químico, siendo, además, rápidamente atacados y eliminados por el sistema inmunológico. Todo ello hace que nuevas alternativas sean necesarias para solventar dichos inconvenientes [S. Bégu, AA. Pouéssel, DA. Lerner, C. Tourné-Péteilh, JM. Devoisselle, Journal of Controlled Reléase 118 (2007) 1-6].

En otros trabajos, se utilizan partículas de silicio, cuya preparación ha sido ampliamente descrita en el estado del arte. Este tipo de nanopartículas son estables ante agentes externos y, además, biocompatibles, pudiéndose almacenar en su interior, durante su proceso de síntesis, moléculas bioactivas [N. E. Botterhuis, Q. Sun, P. C. M. M. Magusin, RA. van Santen, N A. J. M. Sommerdijk, Chemistry European Journal 12 (2006) 1448-1456]. Estas partículas silíceas cargadas con principios activos pueden ser obtenidas combinando diferentes métodos de preparación, tales como hidrólisis y condensación, "spray-drying" o por métodos de emulsión. No obstante, el método más comúnmente empleado es el de Ia tecnología sol-gel, siendo ésta una técnica sencilla de polimerización inorgánica a temperatura ambiente, partiendo de precursores silícicos neutros [RK. Rana, Y. Mastai, A. Gedanken, Advanced Materials 14 (2002) 1414-1418]. Sin embargo, aunque las metodologías empleadas permiten el control preciso del tamaño de las partículas silíceas obtenidas, existen diferentes problemas en cuanto a Ia liberación del principio activo interno, ya que en función de Ia porosidad de Ia matriz silícea y del tamaño de Ia molécula activa, se podrá liberar dicha droga con mayor o menor facilidad.

Para superar este inconveniente, se prepararon nanopartículas silíceas con paredes externas mesoporosas que contenían principios activos en su interior, empleando surfactantes durante el proceso de preparación [H. Djojoputro, X. F. Zhou, S. Z. Qiao, LZ. Wang, CZ. Yu, G. Q.

Lu, Journal of the American Chemical Society 128 (2006) 6320-6321]. Con esta metodología se pretendía facilitar Ia difusión de las moléculas bioactivas hacia el exterior de Ia nanoesfera, sin que hubiese restricciones impuestas por Ia presencia de poros con diámetro demasiado restringido. No obstante, en estos sistemas también se encontraron serios inconvenientes, ya que las paredes externas de naturaleza mesoporosa, exhiben una estabilidad hidrotermal muy baja. Además, no se consigue controlar de manera eficaz Ia liberación del principio activo, produciéndose un proceso de emisión continuo a través de las cavidades mesoporosas. Para paliar este fenómeno, se han realizado estudios funcionalizando las paredes mesoporosas con otros grupos orgánicos que limiten y controlen Ia salida de las moléculas activas [Y. Zhu, J. Shi, W. Shen, X. Dong, J. Feng, M. Rúan, Y. Li, Angewandte Chemie Internacional Edition 44 (2005) 5083-5087]. Sin embargo, los resultados reportados en Ia bibliografía no son satisfactorios.

Con el objeto de superar todos los problemas hasta ahora enumerados en los sistemas de almacenaje y liberación controlada de principios activos, se plantea un nuevo tipo de material formado por nanoesferas híbridas y que se reivindica en Ia presente solicitud. Más específicamente, se trata de esferas en las que en su interior se encuentra uno o más principios activos aislados por una fase micelar, tal como una fase liposomal, puramente orgánica y, recubriendo a ésta, se auto- ensambla una red orgánica-inorgánica compuesta por ejemplo, por unidades silíceas y grupos orgánicos alternados entre sí. Esta cubierta organosilícea permitirá estabilizar en gran medida Ia fase micelar o liposomal y a los principios activos, tales como moléculas bioactivas, protegiéndolos y aislándolos del exterior. Más aún, Ia parte inorgánica del material permitirá el anclaje de moléculas, como por ejemplo polietilenglicol, y/o estructuras moleculares destinadas a aumentar Ia selectividad de interacción entre las nanopartículas y los receptores deseados. Posteriormente, cuando estas nanoesferas se encuentren en el medio adecuado y ante Ia presencia de un agente externo concreto, se produciría Ia rotura de las unidades orgánicas de su cubierta exterior, permitiendo Ia emisión controlada de las moléculas activas presentes en su interior.

Descripción de Ia invención

La presente invención se refiere a un material híbrido compuesto por partículas de naturaleza orgánica-inorgánica caracterizado porque dichas partículas tienen un diámetro comprendido entre 10 y 800 nm, y está estructurado en dos partes:

- una parte interna que comprende una fase micelar en Ia que se encuentran inmersos uno o más principios activos,

- una parte externa compuesta por una red orgánica-inorgánica formada por unidades inorgánicas y unidades orgánicas covalentemente enlazadas entre sí, formando una red esférica recubriendo Ia fase micelar.

El material de Ia presente invención tiene una morfología variable, y es preferentemente esférica, estando su tamaño dentro de Ia escala nanométrica con diámetros comprendidos entre 10 y 800 nm y, preferentemente con una distribución estrecha de tamaños de partícula.

Según una realización particular adicional dichas partículas son esferas cuya parte externa está formada por fragmentos inorgánicos y por unidades orgánicas constituidas por un grupo orgánico susceptible de ser degradado química, térmica, enzimática o fotoquímicamente, provocando Ia ruptura de Ia red orgánica-inorgánica.

Según una realización particular adicional estas nanopartículas están constituidas, en su interior, por una micela orgánica, preferentemente formada por una bicapa fosfolipídica con características liposomales que aloja el o los principios activos estabilizados. Alrededor de dicha micela orgánica se organiza, por auto-ensamblaje, una red esférica orgánico-inorgánica, tal como una red organosilícea constituida por unidades orgánicas e inorgánicas enlazadas entre sí covalentemente.

De manera preferente dichas partículas son esferas cuya parte interna liposomal contiene como principios activos moléculas útiles en medicina.

Dichos principios activos pueden ser preferentemente cualquier molécula susceptible de ser usada con fines terapéuticos, por ejemplo tales como: a) analgésicos, b) anticancerígenos,

c) fragmentos de ADN, d) fragmentos de ARN, e) marcadores biológicos y f) combinaciones de dos o más de a),b), c), d) y e). Algunos principios activos concretos son, de modo no limitativo, por ejemplo ibuprofeno, campotecina y ciclofosfamida.

Las nanopartículas de Ia invención son según realizaciones concretas, esferas cuya parte externa está formada por fragmentos inorgánicos y por unidades orgánicas constituidas por un grupo orgánico susceptible de ser degradado química, térmica, enzimática o fotoquímicamente, provocando Ia ruptura de Ia red orgánica-inorgánica.

Preferentemente, dicha red orgánica-inorgánica en Ia parte externa comprende compuestos organosilíceos.

De acuerdo con una realización particular Ia estructura de las nanopartículas puede ser dividida en dos partes: Ia interna, y Ia externa o superficial:

(i) Parte interna: Fase micelar con morfología esférica formada por una bicapa orgánica de moléculas de tipo lipídico o fosfolipídico. Interaccionando con este medio se encuentran estabilizados principios activos, tales como moléculas bioactivas, las cuales están inmersas bien en Ia fase acuosa, más interna, o bien en Ia bicapa orgánica que constituye Ia parte más superficial de Ia fase micelar, tal como un liposoma, dependiendo de su naturaleza hidrófila o hidrófoba.

(ii) Parte externa: Envolviendo a dicha fase micelar, tal como un liposoma, se organiza una red orgánica-inorgánica conformada por unidades inorgánicas, como por ejemplo de SíO2, unidas a grupos orgánicos (R) degradables ante una respuesta en el medio en el que se deseen liberar las moléculas o, estructuras moleculares, como por ejemplo

ADN. Dicha red híbrida presenta una fracción que se va sucediendo del tipo Oi ₅ Sí-R-SíO _{1 5} .

Según una realización particular adicional, dichas partículas son esferas cuya parte externa está formada por fragmentos de SíO2 y por unidades orgánicas seleccionadas entre acétales, carbamatos, esteres y disulfuros, y, en general, cualquier grupo orgánico susceptible de ser degradado.

El material híbrido de Ia invención tiene según realizaciones particulares una composición que puede expresarse de acuerdo con Ia siguiente fórmula empírica: SiO ₂ : wR : xLIP : yβ : zH ₂ O en Ia que w tiene un valor igual o inferior a 0.5, preferentemente inferior a 0.4, y más preferentemente inferior a 0.3; x tiene un valor igual o inferior a 1 , preferentemente inferior a 0.5, y más preferentemente inferior a 0.2; y tiene un valor igual o inferior a 1 , preferentemente inferior a 0.5, y más preferentemente inferior a 0.1 , z tiene un valor igual o inferior a 200, preferentemente inferior a 100, y más preferentemente inferior a 50, R es un fragmento orgánico que se intercala entre unidades inorgánicas en Ia parte externa de Ia nanoesfera y que, posteriormente, será degradado en función del medio en el que se encuentre,

LIP es Ia fase micelar, tal como una fase liposomal que conforma Ia parte interna de Ia nanoesfera; B es el principio activo que se encuentra alojado enla parte interna liposomal y que saldrá al exterior una vez los fragmentos orgánicos de Ia parte externa sean degradados.

Según una realización más preferente, en dicha fórmula w tiene un valor igual o inferior a 0.3; x tiene un valor igual o inferior a 0.2; y tiene un valor igual o inferior a 0.1. z tiene un valor igual o inferior a 50,

R es un fragmento orgánico que se intercala entre unidades inorgánicas en Ia parte externa de Ia nanoesfera y que, posteriormente, será degradado en función del medio en el que se encuentre.

LIP es Ia fase liposomal que conforma Ia parte interna de Ia nanoesfera;

B es el principio activo que se encuentra alojado en Ia parte interna liposomal y que saldrá al exterior una vez los fragmentos orgánicos de Ia parte externa sean degradados.

Una realización más preferida aún es aquélla en Ia que el material híbrido definido anteriormente, tiene una composición en Ia cual, en dicha fórmula empírica: w tiene un valor igual o inferior a 0.3; x tiene un valor igual o inferior a 0.2; y tiene un valor igual o inferior a 0.1. z tiene un valor igual o inferior a 50,

- dichas partículas son esferas cuya parte externa está formada por fragmentos de SíO2 y por unidades orgánicas seleccionadas entre acétales, carbamatos, esteres y disulfuros y cuya parte interna liposomal contiene principios activos seleccionados entre: a) analgésicos, b) anticancerígenos, c) fragmentos de ADN, d) fragmentos de ARN, e) marcadores biológicos y f) combinaciones de dos o más de a), b) c), d) y e).

El sistema nanoparticulado aquí descrito presenta una estabilidad térmica propia de materiales organosilíceos que se sitúa entre 300 y 600 ⁰ C. Los grupos orgánicos presentes en Ia parte externa son susceptibles de ser descompuestos en función del medio en el que se encuentren, a través de diferentes reacciones, como por ejemplo de hidrólisis acida o básica, oxidativas, reductivas, térmicas, fotoquímicas o enzimáticas. Estos procesos favorecen Ia ruptura de Ia parte externa orgánica-inorgánica, permitiendo Ia liberación de los principios activos que se encuentran inmersos en Ia fase liposomal interna.

La presente invención también se refiere a un método de preparación de nanopartículas híbridas orgánicas-inorgánicas que cumplan Ia misión de almacenar y liberar controladamente principios activos estabilizados en su interior.

Así, un segundo objeto de Ia invención es un procedimiento para sintetizar el material compuesto por nanopartículas definido anteriormente, que comprende dos etapas.

- una primera etapa en Ia que se prepara una fase micelar, tal como una fase liposomal, acuosa donde se encapsulan uno o más principios activos, tales como moléculas bioactivas, que comprende formar una primera emulsión de dichos principios activos disueltos en un solvente orgánico con agua, formar una segunda emulsión,

- una segunda etapa en Ia que se produce Ia formación de una red esférica orgánica-inorgánica en torno a Ia fase micelar, tal como liposomas, cargado a con principios activos, preparada en Ia etapa anterior.

Según una realización particular, Ia primera etapa comprende disolver moléculas de lípidos o fosfolípidos en un solvente orgánico. Dichas moléculas de lípidos o fosfolípidos están en una concentración en Ia fase orgánica comprendida entre 0.05 y 20 mM, preferentemente 1.00 mM.

Dicho fosfolípido es preferentemente lecitina.

Dicho solvente orgánico es preferentemente cloroformo.

Según una realización particular, Ia primera etapa comprende disolver moléculas seleccionadas entre lípidos y fosfolípidos en cloroformo, estando dichos lípidos y fosfolípidos en una concentración 1.00 mM en Ia fase orgánica de De manera particular, dicha primera etapa comprende: - formar una primera emulsión usando agua

- adicionar agua desionizada,

- formar una segunda emulsión, Ia cual se mantiene en agitación durante un tiempo comprendido entre 30 minutos y 48 horas, formándose una suspensión acuosa de liposomas que contienen el principio activo y - someter Ia suspensión a centrifugación.

Una realización particular adicional del procedimiento comprende en Ia primera etapa disolver moléculas seleccionadas entre lípidos y fosfolípidos en cloroformo, estando dichas moléculas de lípidos o fosfolípidos en una concentración en el cloroformo de 1.00 mM y, formar una primera emulsión usando agua, adicionar agua desionizada, formar

una segunda emulsión, Ia cual se mantiene en agitación, formándose una suspensión acuosa de liposomas que contienen uno o más principios activos y someter Ia suspensión a centrifugación hasta alcanzar una concentración de 100 mg de liposoma por 1 ml_ de agua desionizada. Según una realización preferente, en Ia primera etapa se prepara una fase liposomal acuosa donde se encapsulan uno o más principios activos, tales como moléculas bioactivas solubles o insolubles en agua. Para ello, moléculas de lípidos o fosfolípidos (preferentemente lecitina) se disuelven en un solvente orgánico (preferentemente cloroformo) en el que previamente se han disuelto uno o más principios activos. La concentración de lípidos en Ia fase orgánica oscila entre 0.05 y 20 mM, siendo preferentemente 1.00 mM. La cantidad de agua empleada oscila entre 1 y 100 mL, siendo preferentemente 10 mL, y más preferentemente 5 mL. La mezcla formada se emulsiona por agitación entre 1000 y 10000 rpm, preferentemente 5000 rpm, durante 1 a 120 minutos, preferentemente 10 minutos, durante un tiempo y condiciones adecuadas para conseguir Ia eliminación del disolvente orgánico incorporado al inicio, formándose una primera emulsión. Seguidamente se adiciona entre 50 y 1000 mL de agua desionizada, preferentemente 200 mL, manteniéndose entre 35 ⁰ C y 100 ⁰ C, preferentemente 45 ⁰ C, con agitación constante, durante 60 minutos a 24 horas, preferentemente 120 minutos. Transcurrido este periodo se forma una segunda emulsión, Ia cual se mantiene en agitación durante un tiempo comprendido entre 30 minutos y 48 horas, preferentemente 120 minutos, formándose una suspensión acuosa de liposomas que contienen el principio activo. Finalmente, sometiendo Ia solución a un proceso de centrifugación a 15000 rpm durante un tiempo nunca inferior a 120 minutos, se alcanza una concentración de 100 mg de liposoma por 10 mL de agua desionizada y, más preferentemente de 100 mg de liposoma por 1 mL de agua desionizada. Por último, se separa Ia fase liposomal de Ia fase acuosa, alcanzándose Ia concentración de liposoma en agua deseada.

Los principios activos se disuelven bien en el disolvente orgánico o bien en el acuoso, en función de sus propiedades hidrofílicas.

Según una realización particular del procedimiento Ia segunda etapa comprende:

- Ia formación de Ia red esférica orgánica-inorgánica en torno a una fase micelar, preferentemente formada por liposomas, cargadas con uno o más principios activos, tales como moléculas bioactivas, preparada en Ia primera etapa, mediante los siguientes pasos: - realizar una hidrólisis y condensación entre precursores organosilíceos,

- preparar una mezcla de reacción formada por moléculas de disilanos y/o monosilanos, Ia suspensión acuosa de Ia fase micelar y agua desionizada, - mantener Ia mezcla de reacción en agitación constante, entre 200 y 500 rpm, a temperatura ambiente durante un periodo comprendido entre 12 y 96 horas,

- añadir una sal inorgánica, en una proporción que represente entre un 1 % y un 15% del silicio total incorporado en Ia mezcla de reacción, - continuar con agitación constante durante un periodo comprendido entre 12 y 170 horas y,

- recuperar las nanoesferas por centrifugación.

Una realización más concreta del procedimiento es aquélla en Ia que Ia segunda etapa comprende:

- Ia formación de Ia red esférica orgánica-inorgánica en torno a liposomas, cargados con uno o más principios activos, tales como moléculas bioactivas, preparados en Ia primera etapa, mediante los siguientes pasos: - realizar una hidrólisis y condensación entre precursores organosilíceos, siendo dichos precursores disilanos de fórmula molecular (RO) ₃ Si-R-Si(OFO ₃ ,

- preparar una mezcla de reacción formada por moléculas de disilanos y/o monosilanos, Ia suspensión acuosa de liposomas y agua desionizada, presentando dicha mezcla Ia composición siguiente:

SiO ₂ : mLIP : nH ₂ O donde m tiene un valor igual o inferior a 1 , preferentemente inferior a 0.5, y más preferentemente inferior a 0.2;

n tiene un valor igual o inferior a 200, preferentemente inferior a 100, y más preferentemente inferior a 50;

LIP es Ia fase liposomal que conforma Ia parte interna de Ia nanoesfera, - mantener Ia mezcla de reacción en agitación constante, entre 200 y 500 rpm, a temperatura ambiente durante un periodo comprendido entre 1 y 96 horas, más preferentemente comprendido entre 12 y 96 horas, y más preferentemente entre 12 y 80 horas,

- añadir una sal inorgánica, en una proporción que represente entre un 1 % y un 15% del silicio total incorporado en Ia mezcla de reacción, siendo preferentemente un 4% del silicio total incorporado en Ia mezcla de reacción,

- continuar con agitación constante durante un periodo comprendido entre 1 y 170 horas, preferentemente, entre 12 y 150 horas, y, - recuperar las nanoesferas por centrifugación entre 12000 y

18000rpm, preferentemente a 15000 rpm durante 2-4 horas y secado entre 50 y 75 ⁰ C, preferentemente a 6O ⁰ C, en un periodo comprendido entre 10 minutos y 50 horas, preferentemente entre 24 y 48 horas.

Según una realización particular adicional, en Ia segunda etapa se usan precusores silíceos monosilanos y disilanos, siendo el porcentaje de moles de silicio que corresponden a disilano y monosilano entre un 5% y un 100% de moles de silicio del disilano, junto a un 95% y un 0% de moles de silicio del monosilano.

Según una realización particular adicional, en Ia segunda etapa se insertan en Ia red externa de las esferas grupos orgánicos seleccionados entre acétales, carbamatos, esteres y disulfuros y, en general, cualquier grupo orgánico susceptible de ser degradado.

En Ia segunda etapa el proceso de hidrólisis y condensación final entre moléculas de disilano se puede realizar en presencia de monosilanos, tales como monosilanos seleccionados entre Aerosil, Ludox y tetraetilortosilicato (TEOS).

La sal inorgánica puede ser por ejemplo, un halogenuro de amonio o de sodio, tales como fluoruro amónico ó fluoruro sódico.

Los disilanos para Ia segunda etapa se pueden preparar en una etapa previa siguiendo Ia metodología ampliamente descrita en Ia

bibliografía y, que básicamente consiste en: i) reacciones con reactivos tipo organomagnesio, siguiendo Ia metodología de Grignard, o organolitio, los cuales reaccionan con compuestos silíceos ii) sililaciones de bromuros o ioduros arílicos empleando catalizadores de paladio, iii) condensaciones utilizando trietoxisilanos adecuados.

Con Ia utilización de estos disilanos se conseguirá insertar diferentes grupos orgánicos, R, tales como por ejemplo acétales, carbamatos, esteres, disulfuros y, en general, cualquier grupo orgánico susceptible de ser degradado, provocando Ia ruptura de Ia red orgánica- inorgánica y, liberando el principio activo. La presencia en estos disilanos de, por ejemplo, grupos alcóxidos terminales, OR', donde R' es un radical alcoxi de un número variable de átomos de carbono, preferentemente entre 1 y 10 átomos de carbono, tipo metóxido, etóxido o propóxido, facilitarán Ia condensación posterior entre ellos para formar Ia red orgánica-inorgánica.

El proceso de hidrólisis y condensación final entre, por ejemplo, moléculas de disilano se podrá realizar en presencia o ausencia de monosilanos, como por ejemplo Aerosil, Ludox, tetraetilortosilicato (TEOS) o cualquier otra fuente de silicio conocida.

Durante toda Ia segunda etapa del procedimiento es conveniente mantener el medio de reacción en completa oscuridad, para preservar Ia integridad de Ia fase liposomal cargada con principio activo, evitando así su descomposición. Las nanopartículas, preferentemente esferas, de tamaño nanométrico finalmente obtenidas, en las que están almacenadas moléculas bioactivas inmersas en una fase liposomal a su vez recubierta por una red orgánica-inorgánica, son susceptibles de ser empleadas como sistemas de almacenaje y emisión de principios activos. Así, por ejemplo, podrían ser empleadas para Ia emisión de principios activos en seres vivos. Para probar esta afirmación es necesario someter in vitro a dichas nanoesferas a las condiciones reales en las que se van a encontrar para su actuación. Estas condiciones serán específicas para llevar a cabo Ia degradación de los grupos orgánicos presentes en Ia parte externa de las esferas, permitiendo Ia emisión selectiva y controlada de los principios

activos presentes en su interior. De esta manera, podremos incorporar en

Ia red exterior un grupo orgánico altamente específico, susceptible de ser descompuesto, en función del lugar y de las condiciones del medio donde vayan a localizarse las nanoesferas híbridas. En los ejemplos que se muestran a continuación, se ilustrarán algunos casos in vitro donde se evidencia Ia emisión de moléculas bioactivas.

Los materiales de naturaleza híbrida orgánica-inorgánica de Ia invención son útiles en el almacenamiento y posterior liberación controlada de moléculas, especialmente en el campo de Ia medicina. La rotura de los fragmentos orgánicos presentes en Ia parte externa de estos materiales nanoparticulados, por acción de agentes químicos externos presentes en el medio, permite Ia liberación controlada de moléculas presentes en el interior de las partículas, a través de las "puertas abiertas" generadas en Ia superficie exterior.

Breve descripción de las figuras

Como parte integrante de Ia presente memoria descriptiva figuran una serie de figuras:

En Ia figura 1 se muestra una representación gráfica de las nanoesferas aquí descritas, indicando las diferentes partes de las que se compone.

En Ia figura 2 se muestra un esquema del proceso de liberación de las moléculas activas que ocurre tras Ia ruptura de los fragmentos orgánicos situados en Ia parte externa de Ia nanoesfera, ilustra el proceso de salida de las moléculas bioactivas tras el proceso de ruptura de Ia red externa.

La figura 3 es un espectro de RMN de ¹³ C de un disilano con fórmula molecular (R'O)3Si-R-Si(OR')3 preparado para recubrir Ia fase liposomal que contiene grupos acétales (R). La figura 4 es un espectro de RMN de ¹³ C del material compuesto por nanoesferas en cuya parte externa se encuentran intactos grupos acétales.

La figura 5 es un espectro de RMN de ²⁹ Si del material compuesto por nanoesferas donde se comprueba que Ia parte externa está formada por unidades orgánicas e inorgánicas enlazadas entre sí.

La figura 6 se trata de fotografías de microscopía electrónica de transmisión del material obtenido, observándose esferas de tamaño nanométrico.

La figura 7 muestra un gráfico donde se representa el porcentaje de moléculas de ibuprofeno que salen al exterior después de tratar a las nanoesferas a pH=4 durante diferentes periodos de tiempo.

La figura 8 es un espectro de RMN de ¹³ C del material compuesto por nanoesferas después de un tratamiento a pH=4 durante 15 minutos, observándose que los grupos acétales presentes en Ia red externa han sido hidrolizados.

La figura 9 se trata de fotografías de microscopía electrónica de transmisión de Ia muestra sometida a pH=4 durante un periodo de 15 minutos, donde ya no se observan esferas nanométricas.

La figura 10 muestra un gráfico donde se representa el porcentaje de moléculas de ibuprofeno que salen al exterior después de tratar a las nanoesferas a pH=7.5 durante diferentes periodos de tiempo.

Realizaciones de Ia invención

A continuación, se describirán los siguientes ejemplos de realización de Ia invención.

Ejemplo 1 : Preparación de fase liposomal conteniendo ibuprofeno

En este primer ejemplo se describe Ia preparación de liposomas esféricos en fase acuosa, los cuales contienen en su interior moléculas de principios activos, concretamente ibuprofeno. Para ello, 1.0 g de lecitina (fosfatidilcolina) se disuelven en 10 mL de cloroformo en el que se habían disuelto 0.128 g de ibuprofeno. Una vez se ha formado una suspensión transparente, se adicionan 5 mL de agua desionizada y se somete Ia suspensión durante 10 minutos a una fuerte agitación de 5000 rpm. Transcurrido este periodo, se forma una primera emulsión.

A continuación se añaden 150 mL de agua desionizada, poco a poco y con agitación constante, formándose una suspensión que se mantiene a 45 ⁰ C durante 120 minutos para lograr Ia eliminación, por evaporación, del cloroformo incorporado inicialmente. Transcurrido este

tiempo, se forma una segunda emulsión que se mantiene en agitación durante 120 minutos, generándose una suspensión acuosa de liposomas.

Finalmente, se somete dicha suspensión a un proceso de centrifugación a 15000 rpm durante 120 minutos, para conseguir Ia precipitación de una fase concentrada de liposomas, eliminándose Ia mayor cantidad de agua empleada durante el proceso. La concentración finalmente alcanzada en Ia fase liposomal fue de 100 mg de liposoma por 1 ml_ de agua desionizada.

Siguiendo, por Io tanto, este procedimiento, se han obtenido liposomas en fase acuosa formados por una bicapa de lecitina que contienen en su interior ibuprofeno. Estudios realizados por espectroscopia ultravioleta-visible de Ia fase acuosa que se separa de Ia fase liposomal revelan ausencia de ibuprofeno, concluyéndose que todo el principio activo, utilizado durante Ia preparación, se ha introducido en Ia fase liposomal.

En Ia espectroscopia ultravioleta-visible, las moléculas de ibuprofeno son seguidas observando Ia banda centrada a 264 nm característica de este principio activo.

Ejemplo 2: Preparación de precursor organosilíceo tipo (ROhSi-R- Si(OR') ₃ donde R es un grupo acetal.

Se prepara una mezcla formada por benzaldehído (10 mmol), trietilortoformato (10 mmol), metanol anhidro (0.02 mmol) e hidroximetiltrietoxisilano (30 mmol) en diclorometano (50 ml_). A esta mezcla inicial, una vez homogeneizada, se añade NBS (5% mol). La solución resultante, se agita a temperatura ambiente hasta conseguir el consumo completo del aldehido. Tras este proceso, el solvente es eliminado, permaneciendo un crudo de reacción que es purificado por destilación a vacío y cuyo rendimiento es del 32%. El producto formado, (bis-(trietoxisilano-metoxi-metil))-benceno, presenta Ia siguiente fórmula molecular:

Los resultados de RMN de este producto se detallan a continuación: ¹ H RMN (400 MHz, CDCI ₃ ): δ = 1.23 (18H, t, J = 6.9Hz, CH ₃ CH ₂ ); 3.66 (4H, s, CH ₂ O); 3.87 (12H, q, J = 6.3Hz, CH ₃ CH ₂ ); 5.51 (1 H, s, CHO); 7.24-7.50

(5H, m, AROM); ¹³ C RMN (100.6 MHz, CDCI ₃ ): δ = 18.2, 58.7, 61.2, 102.8,

126.8, 127.9, 138.4.

En Ia Figura 3 se muestra el espectro de RMN de ¹³ C del precursor organosilíceo aquí descrito.

Ejemplo 3: Preparación de Ia red orgánica-inorgánica alrededor de los liposomas cargados con ibuprofeno.

En este ejemplo, se describe Ia etapa final de preparación de las esferas híbridas formadas por una red externa organosilícea, donde existen grupos acétales susceptibles de ser hidrolizados, y una parte interna formada por una fase liposomal que contiene moléculas de ibuprofeno.

Para ello, a una mezcla, previamente formada, con 1.734 g de TEOS y 1.989 g de disilano-acetal (preparado en el ejemplo 2) se añaden 15.750 mi de Ia fase liposomal que contiene ibuprofeno cuya concentración es de 100 mg por 1 ml_ de agua desionizada (preparada en el ejemplo 1 ). La suspensión formada se mantiene en agitación (300 rpm) durante 24 horas, transcurridas las cuales se adicionan 0.028 g de NaF para iniciar el proceso de condensación de los grupos silanos. El proceso de agitación se mantiene 48 horas más y, posteriormente, el sólido formado se recupera centrifugando a 15000 rpm durante 2 horas en presencia de agua destilada. Finalmente el sólido formado se seca en estufa a 6O ⁰ C durante 24 horas.

En Ia Figura 4 y Figura 5 se muestran los espectros de RMN de ¹³ C y obtenidos de Ia muestra preparada, respectivamente. En el caso del espectro de RMN de ¹³ C, se observan todas las bandas asignadas a los átomos de carbono presentes en el disilano de partida, incluido el grupo acetal situado a -100 ppm, Io cual demuestra Ia integridad de Ia red oganosilícea. Por otra parte, en el RMN de ²⁹ Si, se observan las bandas características de los enlaces Si-C situadas a -62 y -76 ppm, correspondientes a átomos de silicio de tipo T2 (SiC(OH)(OSi)2) y T3 (SiC(OSi)3), junto a las bandas características de Ia sílice polimerizada de tipo Q ₃ (Si(OH)(OSi) ₃ ) y Q ₄ (Si(OSi) ₄ ) situados a -102 pmm y -112 ppm, respectivamente. Estos resultados muestran que Ia red externa orgánica- inorgánica que envuelve a los liposomas se ha formado, enlazando grupos orgánicos de tipo acetal con unidades SíO2 covalentemente de manera alternada. En Ia Figura 6 se muestras diferentes imágenes de microscopía de transmisión electrónica, donde se observan las nanoesferas formadas, las cuales tienen diámetros comprendidos entre 50 y 150 nm.

Ejemplo 4: Proceso de ruptura del grupo orgánico de Ia red exterior y liberación del ibuprofeno utilizando un medio a pH=4.

En el presente ejemplo se lleva a cabo Ia hidrólisis de los grupos acétales presentes en Ia red exterior de las nanoesferas obtenidas en el ejemplo 3, con Ia consiguiente liberación de las moléculas de ibuprofeno que estaban almacenadas en Ia parte interna liposomal. Para ello, Ia muestra obtenida en el ejemplo 3 se divide en diferentes viales, en cada uno de los cuales se introducen 0.020 g de muestra compuesta por nanoesferas formando una suspensión con 10 mL de una disolución de HCI/EtOH de manera que el pH se mantenga constante y en el valor de 4.0. En cada uno de los viales, Ia concentración máxima de ibuprofeno que podría ser liberado es de 1.4x10 ^"3 M. Las suspensiones de cada vial se mantienen en agitación constante (300 rpm) durante diferentes tiempos (5, 15, 30, 45, 60, 90 y 120 minutos), transcurridos los cuales se para Ia agitación y se filtra Ia muestra, recuperándose el líquido filtrado, el cual es analizado a través de espectroscopia ultravioleta-visible. A través de esta técnica fue seguida Ia

concentración de ibuprofeno presente en el líquido recuperado, midiendo Ia absorbancia de Ia banda situada a 264 nm, teniendo en cuenta que Ia recta de calibrado para este compuesto fue A=(181.32xC)-0.0007, siendo A Ia absorbancia de esta banda y C Ia concentración de ibuprofeno. Los resultados obtenidos se muestran en Ia Figura 7, comprobándose que a pH=4 se produce Ia hidrólisis de los grupos acétales, provocando Ia salida de las moléculas de ibuprofeno al exterior. Transcurridos 15 minutos, Ia totalidad del ibuprofeno ha sido liberado. En Ia Figura 8 se muestra el espectro de RMN de ¹³ C de de Ia muestra sometida a 15 minutos de tratamiento con Ia disolución a pH=4, observándose como Ia banda situada a -100 ppm, característica de los grupos acetálicos, ha desaparecido. Este hecho confirma Ia hidrólisis de estos grupos orgánicos y, por Io tanto, Ia ruptura de red externa que cubría Ia fase liposomal. En Ia Figura 9, se muestran las fotografías de transmisión electrónica de esta misma muestra tratada a pH=4, donde ya no se observan Ia presencia de nanoesferas, las cuales se han degradado, lográndose Ia liberación de los principios activos que almacenaban.

Ejemplo 5: Proceso de ruptura del grupo orgánico de Ia red exterior y liberación del ibuprofeno utilizando un medio a pH=7.5.

Se repite el experimento llevado a cabo en el ejemplo 4, pero esta vez sometiendo a las nanoesferas que contienen ibuprofeno a un tratamiento con una solución en EtOH a pH=7.5. Los experimentos fueron realizados a 30 minutos, 3 y 7 horas y, 1 , 2, 3, 6, 7, 8 y 10 días. En Ia Figura 10 se muestran los resultados obtenidos referentes a Ia salida de ibuprofeno, observándose que Ia presencia de principio activo se mantiene constante, entre 8 y 10%, debiéndose tratar de ibuprofeno residual presente en Ia superficie externa de las nanoesferas, no detectándose una salida de Ia droga interna como ocurría en el ejemplo 4. En el espectro de RMN de ¹³ C de Ia muestra tratada durante 7 días, se observa Ia banda situada a -100 ppm característica de los grupos orgánicos tipo acetal, confirmándose que en estas condiciones de pH=7.5 no se produce Ia hidrólisis y ruptura de Ia red híbrida externa.