Farbstoffe auf Oxazinbasis sind weit verbreitet. Man findet sie oftmals im Bereich der Textilindustrie zum Färben von Stoffen verschiedener Art. So beschreibt die EP-B-0 603 129 Oxazinfarbstoffe, die jeweils an den Benzolringen exoständige Aminogruppen, die substituiert sein können, aufweisen. Die schwer löslichen Salze dieser basischen Oxazinfarbstoffe eig- nen sich zum Färben oder zum Bedrucken von natürlichen Fasern und voll synthetischen Fasern.

Aus der US-A-5656759 ist ein kationischer Oxazinfarbstoff be- kannt, der ebenfalls zwei exoständige Aminogruppen, die sub- stituiert sein können, aufweist. Die Oxazinfarbstoffe, die durch Substitution anorganischer Anionen hydrophob gemacht werden können, werden insbesondere in der Farbschicht eines Farbbandes für den Thermotransferdruck verwendet.

Aus der EP-A-0 747 447 sind Oxazinfarbstoffe bekannt, die als Fluoreszenzmarker in Verbindung mit biologischen Molekülen verwendet werden. Der Absorptionsbereich dieser Konjugate liegt bei 645-700 nm und entspricht dem roten Spektralbe- reich. Die kupplungsfähigen Oxazinderivate sind mindestens tetrazyklische Systeme, in denen mindestens einer der beiden exozyklischen Stickstoffe in die Ringstruktur integriert ist.

Auf Grund des komplexen polyzyklischen Grundgerüsts ist aller- dings der Aufwand zur Synthese dieser Farbstoffe sehr hoch.

Insbesondere für das Hochdurchsatzscreening mit konfokaler Fluoreszenzspektroskopie werden Farbstoffe benötigt, die sich durch eine hohe Fluoreszenzquantenausbeute, hohe Wasserlös- lichkeit, hohe Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln, hohe chemische Stabilität, hohe Fotostabilität sowie die Fähigkeit, an biologische und nicht-biologische Materialien bzw. Moleküle zu binden, auszeichnen.

Durch den kostengünstigen Zugang zu rotemittierenden Laser- Lichtquellen sowie die geringe Hintergrundfluoreszenz (Auto- fluoreszenz) von biologischem Material bei roter Anregung ge- genüber energiereicheren Anregungswellenlängen kommt dem Ein- satz von rot-anregbaren Fluoreszenzfarbstoffen, zu denen unter anderem auch die Oxazin-Farbstoffe zählen, steigende Bedeutung zu.

Durch herkömmliche Markierungsverfahren, insbesondere Protein- markierungsverfahren beispielsweise unter Verwendung von fluo- reszenten Detektionsmarkern werden immer mehrere reaktive Gruppen dieser Moleküle angesprochen, so dass es durch die Markierungsreaktion zu einer statistischen Markierung kommt, d. h. einige Proteine besitzen keine, andere eine, zwei oder mehr Markierungen. In hochempfindlichen Analysetechniken kommt es durch die heterogene Analytmischung zu unerwünschten hete- rogenen Signalverteilungen, die die Messergebnisse verfälschen oder gar unbrauchbar machen. Darüber hinaus kommt es bei- spielsweise innerhalb von mehrfach markierten Proteinen durch die Wechselwirkung zwischen den einzelnen Markierungen zu ei- ner Abschwächung des Signals.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, Fluores- zenzfarbstoffe zur Verfügung zu stellen, die die vorstehend genannten Nachteile der bekannten Fluoreszenzfarbstoffe ver- meiden und die genannten positiven Eigenschaften aufweisen.

Des Weiteren ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren zur Herstellung dieser Fluoreszenzfarbstoffe und ein Verfahren zur Markierung von Material bzw. Molekülen unter Verwendung dieser Farbstoffe zur Verfügung zu stellen. Die Aufgabe besteht insbesondere darin, rotanregbare Fluoreszenz- farbstoffe zur Verfügung zu stellen, die gut wasserlöslich sind, wobei die photochemischen Eigenschaften erhalten blei- ben. Des weiteren soll der Farbstoff in der Weise aktiviert sein, dass er zur Anknüpfung an biologische und nicht- biologische Materialien bzw. Moleküle befähigt ist, ohne dass es zu einer negativen Wechselwirkung mit den zu markierenden Materialien bzw. Molekülen kommt.

Die Lösungider Aufgabe erfolgt erfindungsgemäß durch Stoffe und Verfahren mit den Merkmalen der Ansprüche 1, 31 oder 34.

Gegenstand der Erfindung sind insbesondere Oxazinderivate der allgemeinen Formel I worin (a) die Reste R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, Rg und Rlo von- einander unabhängig Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl, Alke- nyl, Alkenoxy, Aryl, Aryldiazo, Alkylaryl, Arylalkoxyl, Al- koxy, Alkoxycarbonyl, Hydroxy, Halogen, Cyan, Carbonyl, A- cyl, Acyloxy, Carboxyl, Carbonamid, Halogencarbonamid, Sul- fonyl, Sulfonylhalogenid, Säureester, Säureanhydrid, Säure- halogenid, Imid, Imidylester, Isothiocyanat, Phosphoramidit, Azid, Dithionicotin-Derivat oder Amin bedeuten und gegebe- nenfalls substituiert sind, (b) Ri mit R2 und/oder Rg mit Rlo eine gesättigte oder unge- sättigte C3-oder C4-Brücke bilden kann/können, die gegebe- nenfalls substituiert ist/sind ; (c) die Substituenten unabhängig voneinander Alkyl, Cyclo- alkyl, Alkenyl, Alkenoxy, Aryl, Aryldiazo, Alkylaryl, Ary- lalkoxyl, Alkoxy, Alkoxycarbonyl, Hydroxy, Halogen, Cyan, Carbonyl, Acyl, Acyloxy, Carboxyl, Carbonamid, Halogencarbo- namid, Sulfonyl, Sulfonylhalogenid, Säureester, Sauren- hydrid, Säurehalogenid, Imid, Imidylester, Isothiocyanat, Phosphoramidit, Azid, Dithionicotin-Derivat oder Amin bedeu- ten können ; und (d) mindestens einer der Reste R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, Rg oder Rio mindestens eine reaktive Gruppe für die Bindung an ein zu untersuchendes Material umfasst, oder mindestens eine reaktive Gruppe zusätzlich besitzt, oder ein Salz davon.

Die Unteransprüche betreffen bevorzugte Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Oxazinderivate, Herstellungs-und Markie- rungsverfahren.

Im erfindungsgemäßen Sinne können die Reste R1 bis Rio die re- aktive Gruppe umfassen, d. h. beispielsweise darstellen und/oder diese enthalten. Beispielsweise kann ein Substituent die reaktive Gruppe darstellen. Zusätzlich kann das Oxazinde- rivat eine reaktive Gruppe besitzen, wenn die Reste keine re- aktive Gruppe umfassen. Diese reaktive Gruppe kann z. B. an die nicht-reaktiven Substituenten gebunden sein.

Die erfindungsgemäßen Oxazinderivate können als Tri-bzw. Tet- ra-/Pentazyklus vorliegen. In einer bevorzugten Ausführungs- form bildet Ri mit R2 und/oder Rg mit Rio eine gesättigte oder ungesättigte C4-Brücke. Insbesondere bildet R1 mit R2 oder Rg mit Rio eine gesättigte oder ungesättigte C4-Brücke, womit ein weiterer Sechsring am Trizyklus entsteht, der gegebenenfalls substituiert ist. Ganz besonders bevorzugt bildet R1 mit R2 eine ungesättigte C4-Brücke.

Die reaktive Gruppe dient dazu, den Farbstoff zu aktivieren, d. h. eine Stelle anzubieten, die eine Bindung zu dem zu un- tersuchenden Material schafft. Reaktive Gruppen im Sinne der Erfindung umfassen aktivierbare und aktivierte Gruppen. Die Bindung zum zu untersuchenden Material kann kovalenter oder nicht-kovalenter Natur sein, wobei allerdings die kovalente Anknüpfung bevorzugt ist. Bevorzugt ist, dass nur eine reakti- ve Gruppe pro Farbstoffmolekül vorhanden ist. Die Aktivierung kann z. B. auch durch Licht erfolgen (Photoaktivierung).

Die reaktive Gruppe kann jede Gruppe sein, die zu einer Ver- knüpfung mit dem zu untersuchenden Material befähigt. Wenn das zu untersuchende Material beispielsweise ein Protein ist, dann bieten sich verschiedene Gruppen für die Anknüpfung an den Farbstoff an. Dazu zählen beispielsweise Amine aus Lysinresten oder Thiole aus freien Cystin-oder Cysteinresten. Zur Markie- rung von Oligonukleotiden mit den erfindungsgemäßen Oxazinde- rivaten bereits während der Synthese des Oligonukleotides er- folgt vorzugsweise die Verwendung eines erfindungsgemäßen Oxa- zinderivates mit einer Phosphoramiditgruppe als reaktive Grup- pe. Die besondere hohe Basenstabilität dieser Oxazinderivate ermöglicht die einfache und schnelle Verwendung in solchen Synthesereaktionen.

Eine beispielhafte Aufzählung von bevorzugten reaktiven Gruppen umfasst Gruppierungen, wie ein Säureester, Sauren- hydrid, Säurehalogenid, Imid, Imidylester, Carboxyl, Carbo- namid, Halogencarbonamid, Sulfonylhalogenid, Isothiocyanat, Phosphoramidit, Amin, Aryldiazo, Azid, Aryldiazo, Aldehyd, Keton oder Dithionicotin-Derivat.

Besonders bevorzugte reaktive Gruppen sind ein Säureester, Säureanhydrid, Säurehalogenid, Imid, Imidylester, Carboxyl, Carbonamid, Halogencarbonamid, Sulfonylhalogenid, Isothiocya- nat, Phosphoramidit, Phosphoramidit, Amin, Azid, Aryldiazo o- der Dithionicotin-Derivat.

Ganz besonders bevorzugte reaktive Gruppen sind ein N- Succinimidylester, der ggf. substituiert ist, Maleimid, Carbo- xyl, Halogenacetamid, Isothiocyanat, Phosphoramidit, Aryldia- zo, Azid, Sulfonylchlorid, Sulfo-Tetrafluorphenolester oder primäres bzw. sekundäres Amin.

Für den Fall, dass der N-Succinimidylester substituiert ist, ist ein bevorzugter Substituent die Sulfonsäuregruppe.

Es hat sich erfindungsgemäß herausgestellt, dass die Oxazin- derivate ebenfalls eine Linkerverbindung enthalten können.

Diese Linkerverbindung ist zwischen reaktiver Gruppe und einem nicht-brückebildenden Rest R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, Rg oder Rlo geschaltet. Vorzugsweise erfolgt eine Verbindung einer reakti- ven Gruppe eines nicht-brückebildenden Restes mit der Linker- verbindung. An die Linkerverbindung ist vorzugsweise auch nach der Verbindung noch mindestens eine reaktive Gruppe gebunden.

Die Linkerverbindungen werden eingeführt, wenn ein Bedarf da- hingehend besteht, die reaktive Gruppe auf einfachem Weg zu verändern, d. h. die Funktionalität zu ändern. Beispielsweise kann mittels einer Linkerverbindung die Carbonsäure oder der N-Succinimidylester in ein Amin umgewandelt werden. Zum ande- ren ermöglichen es die Linkerverbindungen, den Abstand zwi- schen Farbstoff und dem zu untersuchenden Material zu variie- ren. Mittels der Linkerverbindungen läßt sich auf einfachem Wege die Löslichkeit der Oxazinderivate an die jeweiligen Lö- sungsmittel anpassen.

Zu geeigneten Linkerverbindungen zählen beispielsweise Polyo- xyalkyleinheiten, aliphatische, cykloaliphatische oder aroma- tische Einheiten. Sie können verzweigt oder unverzweigt sein und gegebenenfalls ungesättigte Einheiten und Heteroatome, z. B. Stickstoff, enthalten.

Die genannten Polyoxyalkyleinheiten sind polymere oder oligo- mere organische Reste, die über Sauerstoffbrücken miteinander verknüpft sind. Dazu zählen beispielsweise Polyether, Polyole, lösliche Carbohydrate, Derivate davon oder wasserlösliche Po- lymere.

Exemplarisch können Linkerverbindungen wie folgt dargestellt werden (Y bedeutet in den nachfolgenden Beispielen"reaktive Gruppe") : -CH2-CH2-0-CH2-CH2-Y -CH2-CH2-0-CH2-CH2-0-CH2-CH2-Y<BR> -CH2-CH2-Y<BR> -CH2-CH2-CH2-Y<BR> -CH2-CH2-CH2-CH2-Y<BR> -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-Y<BR> -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-Y - [ (CH2) n~°] m~ (CH2) 1-Y (sowie ortho-und meta-Substitution) Die Reste und Substituenten Alkyl, Cycloalkyl, Alkenyl, Alke- noxy, Alkylaryl, Arylalkoxy, Alkoxy, Halogencarbonamid und Alkoxycarbonyl weisen in der Regel 1 bis 10, bevorzugt 1 bis 7 Kohlenstoffatome auf und können geradkettig oder verzweigt sein. Besonders bevorzugt sind 1 bis 4 Kohlenstoffatome. Bei Aryl handelt es sich vorzugsweise um Benzolringe.

Bevorzugt sind R3, R4, R7 und R8 Alkylreste, die ggf. substitu- iert sind und die reaktive Gruppe umfassen. Andere nicht- elektronenziehende Reste sind ebenfalls in verschiedenen Aus- führungsformen bevorzugt. Diese Derivate zeigen eine besonders hohe Fluoreszenzquantenausbeute.

Als Halogene kommen Fluor, Chlor, Brom oder Jod in Frage.

Als Gegenion kann jedes zur Ladungsneutralisierung geeignete und mit dem kationischen Grundgerüst kompatible Anion verwen- det werden, das die Wasserlöslichkeit oder die Löslichkeit in anderen Lösungsmitteln, wie z. B. DMSO, DMF oder Alkoholen der Gesamtverbindung nicht herabsetzt. Bevorzugt sind Halogenidio- nen, BF4-oder Tetraphenylborat. Besonders bevorzugt sind Chlorid-oder Bromidionen oder Tetraphenylborat.

Besonders bevorzugte Oxazinderivate sind spezielle Ausfüh- rungsformen, die durch die Formeln II bis V und VIII-IX wie- dergegeben werden : worin X OH, Phosphoramidit, oder eine N-Succinimidylester- gruppe, die ggf. substituiert ist, bedeutet, wobei ebenfalls Salze davon eingeschlossen sind.

Die Vorteile der erfindungsgemäßen Oxazinfarbstoffe gegenüber den bisher bekannten UV-Farbstoffen, wie Cumarine oder Farb- stoffen, die mit blauem oder grünen Licht angeregt werden, wie Fluoresceine und Rhodamine, sind die folgenden : -hohe Reaktivität gegenüber Aminen, so dass ein großer Be- reich von zu untersuchenden Substanzen auf einfache Weise kovalent markiert werden kann ; -hohe Wasserlöslichkeit, was zu einer minimalen Adsorption und einer minimalen unspezifischen Bindung führt ; -hohe Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln, wie bei beipielsweise DMSO, DMF oder Alkoholen ; -Anregung bei 630 bis 650 nm mittels kostengünstiger Laserdi- oden oder HeNe-Lasern ; -Emission mit einem Maximum im Bereich von 670 nm, wobei üb- liche Filteranordnungen verwendet werden können ; -hohe Fluoreszenzquantenausbeute, was klare und deutliche Fluoreszenzsignale hervorbringt ; -Lösungsmittelstabilität und pH-Stabilität (pH 1-10), so dass sie für sehr viele Anwendungen geeignet sind ; -neutrale Gesamtladung, was dazu führt, dass kein elektrosta- tischer Einfluß auf das markierte Molekül stattfindet ; -chemische Stabilität und daher eine außerordentliche Eignung in der organischen Chemie (Lösung und Festphase) ; und -NIR-Anregbarkeit, was zu einer geringen Hintergrundfluores- zenz (Autofluoreszenz) des zu untersuchenden Materials führt.

Die hohe Symmetrie der erfindungsgemäßen Oxazinderivate, ins- besondere der Derivate II, III, IV und V, bewirkt eine beson- ders hohe Fluoreszenzquantenausbeute, hohe Lichtabsorption und scharfe Absorptionsbanden.

Am folgenden Beispiel der Proteinmarkierung soll ein weite- rer entscheidender Vorteil der erfindungsgemäßen Farbstoffe gezeigt werden. Durch herkömmliche Markierungsverfahren, insbesondere Proteinmarkierungsverfahren, wie z. B. die Um- setzung einer aktivierten Carbonsäure mit Lys-Resten des Proteins bzw. von Maleimiden mit freien Thiol-Gruppen des Proteins werden immer mehrere dieser Gruppen des Proteins angesprochen, so dass es durch die Markierungsreaktion zu einer statistischen Verteilung der Markierung auf dem Prote- in kommt, d. h. einige Proteinmoleküle besitzen keinen, ande- re einen, zwei, drei oder mehrere Markierungen. Beispiels- weise in hochempfindlichen Fluoreszenztechniken, wie z. B.

FCS (Fluorescence Correlation Spectroscopy) und FIDA (Fluo- rescence Intensity Distribution Analysis), kommt es durch diese heterogene Analytmischung auch zu heterogenen Signal- verteilungen, die eine Auswertung der Daten erschwert. Dar- über hinaus kommt es in Proteinen, die zwei, drei oder meh- rere Label tragen, zu Farbstoff-Farbstoff-Wechselwirkungen, die das Fluoreszenzsignal drastisch abschwächen.

Mit den erfindungsgemäßen Oxazinderivaten ist es allerdings möglich, ein einfach markiertes zu untersuchendes Material für die Analyse zur Verfügung zu stellen. Damit ist gewähr- leistet, dass keine heterogene Signalverteilungen und Farb- stoff-Farbstoff-Wechselwirkungen auftreten. Dies führt zu einer erheblichen Verbesserung der Messergebnisse.

Prinzipell kann jeder messbare Detektionsmarker, beispielswei- se auch radioaktive Detektionsmarker etc., eingesetzt werden.

Bevorzugt werden Farbstoffmarker, insbesondere Fluoreszenzmar- ker, verwendet werden. Ganz besonders bevorzugt werden die er- findungsgemäßen Oxazinderivate eingesetzt.

Anstelle der einfach markierten Fraktionen des zu untersuchen- den Materials, kann es beispielsweise auch bevorzugt sein, zweifach, dreifach etc. markierte Fraktionen zu isolieren.

Die erfindungsgemäßen Oxazinderivate können zusätzlich min- destens einen Affinitätsmarker aufweisen, der eine einfache Reinigung durch Affinitätschromatographie ermöglicht. Der Affinitätsmarker kann z. B. an die Linkerverbindung gebunden sein.

In einer bevorzugten Ausführungsform weisen die Oxazinderi- vate nur einen Affinitätsmarker auf. Im Prinzip kann jeder Affinitätsmarker verwendet werden, der geeignet ist, in der nachfolgenden Affinitätschromatographie eine saubere Tren- nung durchzuführen. Als Beispiele können an dieser Stelle Affinitätsmarker, wie Biotin, Hexa-His oder Haptene genannt werden.

Ein Verfahren zur gezielten Markierung von zu untersuchendem Material mittels der affinitätsmarkierten Oxazinderivate kann wie folgt durchgeführt werden : a) Bereitstellen einer Probe, umfassend ein zu untersu- chendes Material ; b) Umsetzung des zu untersuchenden Materials mit einem o- ben beschriebenen, einen Affinitätsmarker enthaltenden Oxa- zinderivat, wobei sich ein markiertes zu untersuchendes Ma- terial bildet, das als Mischung kein, ein oder mehrere Oxa- zinderivate als Markierung aufweist ; und c) Auftrennung des zu untersuchenden Materials in nicht, einfach oder mehrfach markierte Fraktionen durch Affini- tätschromatographie.

Das Verfahren zur gezielten Markierung von zu untersuchendem Material mittels affinitätsmarkierter Detektionsmarker kann wie folgt durchgeführt werden : a) Bereitstellen einer Probe, umfassend ein zu untersuchendes Material ; b) Umsetzung des zu untersuchenden Materials mit einem oben beschriebenen, einen Affinitätsmarker enthaltenden Detekti- onsmarker, wobei sich ein markiertes zu untersuchendes Ma- terial bildet, das als Mischung kein, ein oder mehrere De- tektionsmarker als Markierung aufweist ; und c) Auftrennung des zu untersuchenden Materals in nicht, ein- fach oder mehrfach markierte Fraktionen durch Affini- tätschromatographie.

Nachfolgend wird beispielhaft eine derartige Affinitätsauf- reinigung unter Verwendung der erfindungsgemäßen Oxazinderi- vate mit dem System Biotin/Avidin (Affinitätsmar- ker/Trägermaterial) vorgestellt.

Durch den Einsatz des unten dargestellten affinitätsmarkierten erfindungsgemäßen Farbstoff-Reaktiv-Moleküls kann der oben be- schriebene Nachteil der bekannten Markierungstechniken umgan- gen werden. Dabei steht die Biotin-Einheit stellvertretend für einen beliebigen Affinitätsmarker, Oxazinderivat III für einen beliebigen Farbstoffmarker, insbesondere einen erfindungsgemä- ßen Farbstoff und der N-Succinimidylester für eine beliebige reaktive Gruppe. Ein solches Molekül reagiert analog den her- kömmlichen Markierungsverfahren mit dem Protein, was in einer heterogenenen Mischung wie oben beschrieben resultiert. Durch eine nachfolgende Affinitätsreinigung an einem geeigneten Trä- germaterial (hier monomeres Avidin) werden unmarkierte Protei- ne aus der Probe entfernt. Durch nachfolgende vorsichtige Elu- tion können einfachmarkierte Proteine eluiert werden, während doppel-und höhermarkierte Proteine aufgrund der kooperativ verstärkten Bindung an das Trägermaterial gebunden bleiben.

Somit kann ein homogener Analyt mit exakt einem erfindungsge- mäßen Oxazinderivat pro Proteinmolekül erhalten werden.

Das zu untersuchende Material kann kovalent oder nicht- kovalent an das Oxazinderivat gebunden sein, wobei es aller- dings bevorzugt kovalent gebunden ist. Bei dem zu untersuchen- den Material handelt es sich vorzugsweise um ein biologisches Material, eine chemische Verbindung, insbesondere eine biolo- gisch aktive Substanz und/oder einen pharmazeutischen Wirk- stoff, einen synthetischen oder biologischen Mikropartikel o- der eine Kombination davon.

Die chemischen Verbindungen können alle synthetischen Verbin- dungen umfassen, die als ein einzelnes Molekül oder Aggregat, beispielsweise als kleine organische Verbindung und auch als Oligomer oder Polymer vorliegen. Vorzugsweise handelt es sich bei den chemischen Verbindungen um biologisch aktive Substan- zen und/oder pharmazeutische Wirkstoffe.

Synthetische Mikropartikel, d. h. insbesondere lösliche und suspendierbare Trägermaterialien, bezeichnen jede Art von syn- thetischen Mikropartikeln, die in einer Flüssigkeit, insbeson- dere einer wässrigen Lösung, gelöst oder suspendiert werden können. Die Durchmesser d der Mikropartikel sind gleich oder kleiner als 1 um, bevorzugt liegen sie im Bereich von 1 nm zu d < 1 um, besonders bevorzugt im Bereich von 10 nm < d < 500 nm, ganz besonders bevorzugt im Bereich von 50 nm < d < 300 nm.

Beispiele für die synthetischen Mikropartikel umfassen solche aus organischen Polymeren. Zum Beispiel können Polymere auf Dendrimer-Basis, bevorzugt Polyethylenglykol auf Dendrimer- Basis verwendet werden. Es können jedoch alle synthetischen Mikropartikel verwendet werden, die unter den experimentellen Bedingungen löslich oder suspendierbar sind, insbesondere Glaspartikel mit definierter Porengröße, Cellulose-, Silika- gel-und andere Typen von Polystyrolpartikeln, letztere gege- benenfalls vernetzt mit Divinylbenzol und/oder gepropft mit Polyethylenglykol und/oder funktionalisiert mit Amino, Hydro- xy, Carboxyl oder Halogen. Weitere Beispiele von möglichen synthetischen Mikropartikeln umfassen gepropfte Co-Polymer-, Polyacrylamid-, Latex-, gegebenenfalls mit N, N'-bis- Acryloylethylendiamin gepropfte Dimethylacrylamidpartikel und polymerüberzogene Glaspartikel. Bei den biologischen Mikropar- tikeln handelt es sich vorzugsweise um vesikuläre Partikel o- der virus-ähnliche Partikel.

Bei dem biologischen Material kann es sich beispielsweise um Nukleotide, Oligonukleotide, Zucker, Lipide, Membranen, Zel- len, Zellbestandteile, DNA, RNA, Peptide, Proteine, Antikör- per, Haptene oder Antigene handeln.

Die Markierung von zu untersuchenden Materialien, insbesondere biologischem Material kann sowohl in flüssiger als auch in Verbindung mit festen Phasen erfolgen. Dabei ist sowohl die Verwendung von aktivierten als auch aktivierbaren Oxazinderi- vaten möglich. Beispielsweise erfolgt die Aktivierung der ak- tivierbaren Oxazinderivate, z. B. der Carboxyderivate, in-situ mit Aktivierungsreagenzien, wie z. B. Benzotriazol-1-yl-oxy- tris-pyrrolidino-phosphonium Hexafluorophosphat (PyBOB). Vor- zugsweise wird eine solche Aktivierung bei Reaktionen an der festen Phase durchgeführt.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Kit zur Markierung eines, wie oben beschriebenen, zu untersuchenden Materials.

Dieses Kit umfasst, neben üblichen Bestandteilen, ein Oxazin- derivat nach der allgemeinen Formel I. Übliche Bestandteile sind z. B. Puffer, Analysegefäße und Instruktionen zur Durch- führung der Untersuchungen. In einer bevorzugten Ausführungs- form enthält das Kit ein Oxazinderivat der Formel II, III, IV, V, VIII oder IX, insbesondere in Form eines N- Succinimidylesters, der ggf. substituiert sein kann. Besonders bevorzugt sind Kits mit Oxazinderivaten der Formel II, III, IV oder V.

Das zu untersuchende Material ist vorzugsweise ein biologi- sches Material, eine chemische Verbindung, insbesondere eine biologisch aktive Substanz und/oder ein pharmazeutischer Wirk- stoff, ein synthetischer oder biologischer Mikropartikel oder eine Kombination davon. Die einzelnen Materialien sind bereits oben beschrieben worden.

Die erfindungsgemäßen Oxazinderivate eignen sich hervorragend für chemische oder biotechnische Untersuchungen. Dazu zählen : die Identifizierung und Charakterisierung von biologischem Ma- terial oder chemischen Verbindungen, Suche nach biologisch ak- tiven Substanzen und/oder pharmazeutischen Wirkstoffen, die Identifizierung von Analyten in diagnostischen und/oder thera- peutischen Verfahren, die Genomanalyse (z. B. SNP-Analysen) oder die Reinigung und Konzentrierung von Substraten.

Die genannten Untersuchungen werden bevorzugt mittels Laser- lichtanalytik und Fluoreszenzdetektion durchgeführt.

Die dabei angewandten Messverfahren schließen praktisch alle Verfahren ein, mit denen das Oxazinderivat gemessen werden kann. Zu diesen Verfahren zählen die Spektrometrie, Mehrpho- tonenanregung, insbesondere Zwei-Photonen-Anregung, Laser- Scanning-Mikroskopie, Nahfeldspektroskopie, Photonenvertei- lungsanalysen, insbesondere FIDA und 2-D-FIDA, Fluoreszenz- Lebensdauer-Analyse und Fluoreszenz-Polarisationsanalyse.

Ganz besonders bevorzugt werden die Messungen unter Verwen- dung eines konfokalen Mikroskops oder anderen konfokalen Op- tiken durchgeführt.

Die Auswertung der Daten erfolgt schließlich vorzugsweise durch Autokorrelationsanalyse und/oder Kreuzkorrelations- analyse.

Bei der 2-D-FIDA und Kreuz-Korrelationsanalyse wird ein Mess- volumen einer Probe mit zwei Wellenlängen simultan bestrahlt und die Information über eine zeitliche Koinzidenzanalyse von zwei Farbstoffspezies, wie die erfindungsgemäßen Oxazinderiva- te in Kombination mit grün anregbaren Fluoreszenzfarbstoffen, erhalten.

Ähnlich ist der Einsatz in Fluoreszenz-Resonanz-Energie- Transfer-Experimenten (FRET) von großem Nutzen, wobei die er- findungsgemäßen Oxazinderivate mit einer Reihe von bekannten Xanthenen als Paar für den Energie-Transfer verwendet werden.

Die erfindungsgemäßen Oxazinderivate können ebenfalls sehr gut in FISH- (Fluorescence-in-situ-hybridization) oder PCR- Verfahren (Polymerase-chain reaction) verwendet werden.

Die erfindungsgemäßen Oxazinfarbstoffe sind synthetisch ein- fach zugänglich, was sie von den wesentlich schwerer herstell- baren Verbindungen des Standes der Technik unterscheidet. Die erfindungsgemäßen Farbstoffe, insbesondere die Derivate II, III, IV oder V, weisen alle eine sehr kompakte molekulare Struktur auf, so dass die Wechselwirkung mit dem zu untersu- chenden Material als äußerst gering einzuschätzen ist. Insbe- sondere werden die biologischen Eigenschaften von biologischem Material nicht verändert. Die in der Regel neutrale Gesamtla- dung minimiert die elektrostatische Wechselwirkung zwischen dem Farbstoff und der markierten Komponente. Die erfindungsge- mäßen Fluoreszenzfarbstoffe weisen eine hohe Reaktivität ge- genüber den zu untersuchenden Materialien, insbesondere Ami- nen, eine hohe Fluoreszenzquantenausbeute, eine hohe Lösungs- mittelbeständigkeit und pH-Beständigkeit, eine hohe chemische Stabilität und eine NIR-Anregbarkeit auf. Die Farbstoffe der vorliegenden Erfindung sind durch eine geringe Anregungsener- gie und somit einer geringen Photozerstörung gekennzeichnet.

Die besonderen Anregungs-und Emissionswellenlängen der erfin- dungsgemäßen Farbstoffe ermöglichen die Verwendung von kommer- ziell erhältlichen Filtersystemen. Vorteilhaft ist weiterhin die geringe Hintergrundfluoreszenz (Autofluoreszenz) von che- mischen und biologischen Materialien bei roter Anregung gegen- über energiereicheren Anregungwellenlängen. Die erfindungsge- mäßen Farbstoffe sind somit sehr gut im roten Spetralbereich einsetzbar. Die hohe chemische Stabilität ist insbesondere un- ter Bedingungen der Festphasensynthese von Bedeutung. Die er- fingungsgemäßen Farbstoffe zeigen eine geringe Adsorptions- oder unspezifische Bindungstendenz und sind sehr gut wasser- löslich. Sie sind somit ideal für chemische und biotechnische Untersuchungen in wässrigen Lösungen, DMSO, DMF oder Alkoholen verwendbar.

Die erfindungsgemäßen Oxazinderivate sind beispielsweise auf folgendem Wege darstellbar : Ein 3-Aminophenol der Formel VI wird mit einer Nitrosophenylverbindung der Formel VII im sauren Medium bei mittlerer Hitze während eines Zeitraumes von 10 Minuten bis 5 Stunden umgesetzt. Die Reste RI bis Rlo haben die bereits oben angegebenen Bedeutungen.

Es hat sich herausgestellt, dass die Reaktion bei einer Tempe- ratur im Bereich von 50 bis 70°C, vorzugsweise 55 bis 65°C, durchgeführt wird. Dazu wird die 3-Amino-Phenol-Verbindung in bspw. Eisessig gelöst, wonach innerhalb eines Zeitraumes im Bereich von 10 Minuten bis 5 Stunden die Nitrosoverbindung hinzugegeben wird. Nach Entstehen einer tiefblauen Lösung wird die Reaktion in der Regel beendet sein. Anschließend wird ge- reinigt, normalerweise über eine Säulenchromatographie.

Des Weiteren sind noch folgende Synthesemöglichkeiten einge- schlossen, in denen die Ausgangsverbindungen die nachfolgend gezeigten Strukturen aufweisen : Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der vorlie- genden Erfindung.

Beispiele Beispiel 1 0 il OH N O +/1 Eisessig Ja 4\ oN 2 NaB (C6Hs) 4 XN O N N N / O -B (C6H5) 4 OH HO 0,1 mol 3-Diethylaminophenol wurde in 20 ml Eisessig gelöst und auf 60°C erwärmt. Zu der Lösung wurde innerhalb von 30 Mi- nuten 0, 1 mol 3- (N-Methyl-N- (4-nitrosophenyl)-amino)- propionsäure in 10 ml Eisessig zugegeben. Die nun intensiv blaue Lösung wurde wurde 2 Stunden zum Rückfluss erhitzt. Nach Abdestillation des Eisessigs wurde der Rückstand säulenchroma- tographisch gereinigt (Eluent : Ethanol/H20 : 5/1 ; Träger : Si02). Das bronzefarbene Produkt (2-Carboxy-ethyl)- methylamino)-diethylaminophenoxazin-5-ylium wurde in Wasser gelöst und mittels Natriumtetraphenylborat ausgefällt.

Beispiel 2 0 N N \ OH + I N , ?"' +, I /2. NaOH/Ha0 \ T zu O /O 3 0,1 mol N- (3-Hydroxyphenyl)-N-methylamino-propionsäuremethyl- ester wurde in 50 ml Eisessig gelöst und auf 60°C erwärmt. Zu dieser Lösung wurde innerhalb einer Stunde 0,1 mol 3- (N-ethyl- N- (4-nitroso-3-hydroxyphenyl)-amino) propan-sulfonsäure porti- onsweise zugegeben. Nach kurzer Zeit entstand eine tiefblaue Lösung. Nach dreistündiger Reaktionszeit wurde die Lösung ein- geengt und säulenchromatgraphisch (Eluent : Ethanol ; Träger : Si02) gereinigt. Das so erhaltene Produkt wurde in 1 N NaOH- Lösung aufgenommen und in der Siedehitze mehrere Stunden be- handelt. Anschließend wurde die Lösung zur Trockne eingedampft und das Rohprodukt säulenchromatographisch (Eluent : Etha- nol/H2O : 10/1 ; Träger : SiO2) separiert. Nach Umkristallisation aus Methanol wurden bronzefarbene Kristalle von [ (2-Carboxy- <BR> <BR> ethyl)-methyl-amino]- [ethyl- (3-sulfo-propyl)-amino]-phenoxazin- 5-ylium erhalten.

Beispiel 3 zu fi Eisessig +I / NH k Ill nu O O OU HO 0,1 mol 3- (7-Sulfo-naphthylamino)-propionsaure und 0,1 mol 5- (Diethylamino)-2-nitroso-phenol wurden zusammen in 20 ml Eis- essig 30 Minuten zum Rückfluss erhitzt. Beim Abkühlen der Re- aktionslösung schieden sich grüne Kristalle von (2-Carboxy- ethylamino)-diethylamino-sulfobenzo [a] phenoxazin-7-ylium ab.

Das Lösungsmittel wurde abgezogen und das Rohprodukt säulen- chromatographisch (Eluent : Ethanol/Wasser : 20/1 ; Träger : Si02) aufgereinigt. Umkristallisation erfolgte aus Eisessig.

Beispiel 4 0 11 N N 1. Eisessig NH Nu xi nu I\ °90~ C \N ° NH 0 OH 03 p 0,1 mol N- (4-Nitrosonaphtyl)-aminopropansulfonsäure und 0,1 mol N- (3-Hydroxyphenyl)-N-methylaminopropionsäuremethylester wurden zusammen in 20 ml Eisessig 30 Minuten zum Rückfluss erhitzt. Nach Abkühlen der Reaktionslösung wurde die Lösung zur Trockne eingedampft und der Rückstand aus Aceton umkris- tallisiert. Das erhaltene Produkt wurde in einem Gemisch aus 10 ml Wasser und 10 ml Aceton gelöst, mit 1 ml 1 N HCl-Lösung versetzt und 8 Stunden zum Rückfluss erhitzt. Anschließend wurde das Lösungsmittelgemisch abgezogen und das Rohprodukt säulenchromatographisch (Eluent : Ethanol/H2O : 10/1 ; Träger Si02) separiert. Nach Umkristallisation aus Methanol wurden bronzefarbene Kristalle des (2-Carboxy-ethylamino)-ethyl- (3- sulfo-propyl)-amino-benzo [a] phenoxazin-7-ylium erhalten.

Ausbeute : 10 % Beispiel 5 N +'/ S 0\n 1 N-Succinimidylester Diisopropylcarbodiimid 2 umol [ (2-Carboxy-ethyl)-methyl-amino]- [ethyl- (3-sulfo- propyl)-amino]-phenoxazin-5-ylium werden in 200 ul N, N- Dimethylformamid gelöst und eine Lösung von 10 umol N- Hydroxysuccinimid in 100 ul N, N-Dimethylformamid sowie 2,4 pmol Diisopropylcarbodiimid zugegeben. Diese Lösung wird 3 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt und dann zur Trockne eingeengt. Der Umsatz zu [ (2-Carboxy-ethyl)-methyl-amino]- [ethyl- (3-sulfo-propyl)-amino]-phenoxazin-5-ylium- succinimidylester ist > 90 %, daher ist eine weitere Aufreini- gung nicht notwendig.

Beispiel 6 NH 2 o S NH w N-Succinimidylester aus Bsp. 5 1 30 H 1 umol 5-Carboxyamidotryptamin (5-CT) wird in 50 ul N, N- Dimethylformamid gelöst und einer Lösung von 1,5 umol [(2- Carboxy-ethyl)-methyl-amino]- [ethyl- (3-sulfo-propyl)-amino]- phenoxazin-5-ylium-succinimidylester in 200 ul N, N- Dimethylformamid zugegeben. Dieser Lösung werden 250 ul 0,15 M Borat-Puffer pH 8,6 zugesetzt und die Reaktionslösung 3 Stun- den bei Raumtemperatur geschüttelt. Danach wird die Lösung zur Trockne eingeengt und das Rohprodukt säulenchromatographisch (Eluent : Methanol/Wasser Gradient : 0 % Methanol bis 100 % Methanol in 30 Minuten ; Träger : Reversed Phase C18) aufgerei- nigt.

Beispiel 7 03 S03 N) nui N N + Protein/ I I -N-Hydroxysuccinimid O N I N I N N Nt\NzN O ° NH N 0-+N SHX 0 10 nmol Bovine IgG werden in 150 ul Wasser gelöst. Diese Lö- sung wird mit 15 ul 1 M Natriumcarbonatlösung pH 9,3 und 331,4 ul 0,1 M Natriumcarbonatlösung pH 9,3 sowie einer Lösung von 50 nmol [ (2-Carboxy-ethyl)-methyl-amino]- [ethyl- (3-sulfo- propyl)-amino]-phenoxazin-5-ylium-succinimidylester in 3,6 ul N, N-Dimethylformamid versetzt und die Reaktionslösung 1 Stunde bei Raumtemperatur geschüttelt. Dann wird die Reaktion durch Zugabe von 50 ul 1,5 M Hydroxylaminlösung abgestoppt. Das Roh- produkt wird durch Ausschlusschromatographie (Eluent : PBS pH 7,4) aufgereinigt. Beispiel 8 Einführung eines Linkers in Oxazinderivat (III) 1.2,0 eq Boc-cadaverin 1,0 eq Oxazinderivat (III) 2,0 eq PyBOP 5,0 eq DIPEA 2.20% TFA in DCM 2 umol [ (2-Carboxy-ethyl)-methyl-amino]- [ethyl- (3-sulfo- propyl)-amino]-phenoxazin-5-ylium (Oxazinderivat III) werden in 200 ul N, N-Dimethylformamid gelöst und eine Lösung von 4umol mono-t-Butoxycarbonyl-1, 5-diaminopentan (Boc-cadaverin) in 50 ul N, N-Dimethylformamid, eine Lösung von 4 umol Benzotriazol-1-yl-oxy-tris-pyrrolidino-phosphonium Hexafluorophosphat (PyBOP) in 50 ul N, N-Dimethylformamid sowie 10 umol N-Ethyl-diisopropyl-amin (DIPEA) zugegeben. Diese Lö- sung wird 16 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt und dann zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird mit 300 ul einer Lö- sung von 20 % Trifluoressigsäure (TFA) in Dichlormethan (DCM) versetzt und 30 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt. Die Lösung wird zur Trockne eingeengt und das Rohprodukt säulench- romatographisch über HPLC aufgereinigt.

Beispiel 9 Einführung eines Linkers in Oxazinderivat (III) 1.2,0 eq Boc-CHA 1,0 eq Oxazinderivat (III) 1,0 eq PyBOP 4,0 eq DIPEA 2.20% TFA in DCM 2 umol [ (2-Carboxy-ethyl)-methyl-amino]- [ethyl- (3-sulfo- propyl)-amino]-phenoxazin-5-ylium (Oxazinderivat III) werden in 200 ul N, N-Dimethylformamid gelöst und eine Lösung von 4 umol mono-t-Butoxycarbonyl-trans-1, 4-diaminocyclohexan (Boc-CHA) in 50 ul N, N-Dimethylformamid, eine Lösung von 2 umol Benzotriazol-1-yl-oxy-tris-pyrrolidino-phosphonium Hexafluorophosphat (PyBOP) in 50 ul N, N-Dimethylformamid sowie 8 umol N-Ethyl-diisopropyl-amin (DIPEA) zugegeben. Diese Lö- sung wird 16 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt und dann zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird mit 300 ul einer Lö- sung von 20 % Trifluoressigsäure (TFA) in Dichlormethan (DCM) versetzt und 30 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt. Die Lösung wird zur Trockne eingeengt und das Rohprodukt säulench- romatographisch über HPLC aufgereinigt.

Beispiel 10 Affinitätsmarkierung l mmol N-s- (9-Fluorenylmethoxycarbonyl)-aminohexansäure wurden in 1200 ul Dichlormethan und 300 ul N, N-Dimethylformamid (DMF) gelöst und auf 0°C abgekühlt. 500 umol N, N'-Diisopropyl- carbodiimid wurden in 80 ul N, N-Dimethylformamid gelöst und zur Lösung der Aminosäure hinzugegeben. Die Reaktionslösung wurde 30 Minuten bei 0°C stehengelassen und anschließend das Dichlormethan im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde mit 1000 ul N, N-Dimethylformamid aufgenommen, wobei eine klare Lösung erhalten wurde. Diese Lösung wurde zu 100 umol Wang Harz (Wang Resin) in einer 5 ml Spritze mit Fritte gegeben. Zu der Sus- pension wurden 10 umol Dimethylaminopyridin in 25 ul N, N-Dimethylformamid gegeben, die Mischung wurde über Nacht stehengelassen.

Das Harz wurde anschließend sechsmal mit 2 ml N, N-Dimethyl- formamid und dreimal mit 2 ml Dichlormethan und sechsmal mit 2 ml t-Butylmethylether gewaschen, getrocknet und zur Bestimmung der Beladung ausgewogen. Die bestimmte Beladung des Harzes be- trug 0.8 mmol/g Harz. Zur weiteren Beladung wurde zunächst die 9-Fluorenylmethoxycarbonyl-Schutzgruppe (FMOC) mittels zweima- liger Behandlung für 5 bzw. 15 Minuten mit einer Lösung von 20 % Piperidin in N, N-Dimethylformamid abgespalten. Das Harz wurde danach sechsmal mit 2 ml N, N-Dimethylformamid gewaschen.

1 mmol N-a- (9-Fluorenylmethoxycarbonyl)-E- (4-methyltrityl)-L- lysin, gelöst in 120 ul N, N-Dimethylformamid sowie 1 mmol 1- [Bis (dimethylamino) methyliumyl]-lH-1, 2,3-triazolo [4,5- b] pyridin-3-oxid hexafluorophosphat gelöst in 120 ul N, N-Dimethylformamid wurden zusammen mit 2 mmol N, N-Diisopropylethylamin zum Harz gegeben. Die Reaktionslösung wurde nach 30 Minuten abgezogen und der Vorgang der Beladung unter identischen Bedingungen nochmals wiederholt. Nach sechs- maligem Waschen des Harzes mit je 2 ml N, N-Dimethylformamid wurde die 9-Fluorenylmethoxycarbonyl Schutzgruppe mittels zweimaliger Behandlung für 5 bzw. 15 Minuten mit einer Lösung von 20 % Piperidin in N, N-Dimethylformamid abgespalten. Das Harz wurde danach wiederum sechsmal mit 2 ml N, N-Dimethylformamid gewaschen. Anschließend erfolgte die Um- setzung mit 250 umol Biotinoylaminohexanoyl-N-hydroxy- succinimidylester in 300 ul N, N-Dimethylformamid. Nach 10 stündiger Reaktion wurde die Reaktionslösung abgesaugt und das Harz sechsmal mit 2 ml N, N-Dimethylformamid und dreimal mit 2 ml Dichlormethan und sechsmal mit 2 ml t-Butylmethylether ge- waschen und getrocknet.

Zur Beladung mit dem Fluoreszenzfarbstoff (dye) wurden 10 umol des Harzes abgenommen und in eine 5 ml Spritze überführt.

Nachdem das Harz in 2 ml Dichlormethan vorgequollen wurde, er- folgte die Abspaltung der 4-Methyltrityl-Schutzgruppe (MTT) mittels fünfmaliger jeweils dreiminütiger Behandlung mit je 2 ml 30 % Hexafluorisopropanol (HFIP) in Dichlormethan. Danach wurde das Harz sechsmal mit 2 ml Dichlormethan und dreimal mit 2 ml N, N-Dimethylformamid gewaschen. Anschließend erfolgte die Umsetzung mit 25 umol [(2-Carboxy-ethyl)-methyl-amino]-ethyl- (3-sulfo-propyl)-amino]-phenoxin-5-ylium-succinimidylester in 300 ul N, N-Dimethylformamid für drei Stunden bei Raumtempera- tur. Nach erfolgter Reaktion wurde das Harz sechsmal mit 2 ml N, N-Dimethylformamid, sechsmal mit 2 ml Dichlormethan, sechs- mal mit 2 ml Methanol und sechsmal mit 2 ml t-Butylmethylether gewaschen und getrocknet. Das Produkt wurde nunmehr mittels einer Mischung von 95 % Trifluoressigsäure (TFA), 2,5 % Wasser und 2,5 % Triispropylsilan (TIS) vom Harz abgespalten. Nach zweistündiger Reaktionszeit wurde die Lösung vom Harz abfilt- riert und im Vakuum eingeengt. Das als Rückstand verbleibende Rohprodukt wurde anschließend in Methanol aufgenommen und chromatographisch aufgereinigt. Mtt-NH 0 H smog..NH N -Wang resin O i) piperidine/DMF ii) 5 eq biotin-X, NHS Mtt NH H H p Yang H0 resin H HN t\S zon H H i) 30 % HFIP in DCM ii) 5 eq dye, NHS dyeH H 0N H -Wang p rosin H E HNt\S OU N H H i) 95 TFA, 2,5 % H20 2, 5 % TIS