本発明において、以下、検出目的の変異� ��発生しているabl遺伝子を「変異遺伝子また� ��検出対象遺伝子」、検出目的の変異が発生� ��ている配列であって、プローブによる検出� ��象の配列を「変異配列または検出対象配列� ��、検出目的の変異が発生していないabl遺伝� ��を「正常遺伝子または非検出対象遺伝子」� ��検出目的の変異が発生していない配列を「� ��常配列または非検出対象配列」、変異の有� ��を検出する試料中のDNAを「標的DNA」ともい� ��。本発明において検出する変異としては、� ��えば、一塩基多型(SNP)等があげられる。

 <プローブ>
 本発明のプローブは、前述のように、abl遺� ��子の変異を検出するためのプローブであっ� ��、前記(A1)~(I1)からなる群から選択された少� ��くとも一つのオリゴヌクレオチドからなる� ��とを特徴とする。abl遺伝子のcDNA配列(mRNA配� ��)を、配列番号1に示す。なお、この配列は� �NCBIアクセッションNo.NM_005157に登録されてい� ��。以下に、これらのプローブについて説明� ��る。

 下記(A1)および(A2)のオリゴヌクレオチドか� �なるプローブは、それぞれ、配列番号1の塩� ��配列における730番目の塩基Aの変異(A→G)を� �出するためのプローブである。下記配列番� �2または配列番号3のオリゴヌクレオチドによ れば、順鎖における変異を確認でき、これら の相補的オリゴヌクレオチドによれば、逆鎖 における変異を確認できる。
(A1)配列番号2の塩基配列からなるオリゴヌク� ��オチドまたはその相補的オリゴヌクレオチ� ��
(A2)配列番号3の塩基配列からなるオリゴヌク� ��オチドまたはその相補的オリゴヌクレオチ� ��
  5’-tgtgcttcaCggtgatgtcc-3’   (配列番号2)
  5’-gtgcttcaCggtgatgtccgtgcgttcc-3’   (配列番� �3)

 下記(B1)および(B2)のオリゴヌクレオチドか� �なるプローブは、それぞれ、配列番号1の塩� ��配列における749番目の塩基Gの変異(G→A)を� �出するためのプローブである。下記配列番� �4または配列番号5のオリゴヌクレオチドによ れば、順鎖における変異を確認でき、これら の相補的オリゴヌクレオチドによれば、逆鎖 における変異を確認できる。
(B1)配列番号4の塩基配列からなるオリゴヌク� ��オチドまたはその相補的オリゴヌクレオチ� ��
(B2)配列番号5の塩基配列からなるオリゴヌク� ��オチドまたはその相補的オリゴヌクレオチ� ��
  5’-caagctgggcgAgggcc-3’   (配列番号4)
  5’-cacaagctgggcgAggg-3’   (配列番号5)

 下記(C1)および(C2)のオリゴヌクレオチドか� �なるプローブは、それぞれ、配列番号1の塩� ��配列における943番目の塩基Aの変異(A→G)を� �出するためのプローブである。下記配列番� �6または配列番号7のオリゴヌクレオチドによ れば、順鎖における変異を確認でき、これら の相補的オリゴヌクレオチドによれば、逆鎖 における変異を確認できる。
(C1)配列番号6の塩基配列からなるオリゴヌク� ��オチドまたはその相補的オリゴヌクレオチ� ��
(C2)配列番号7の塩基配列からなるオリゴヌク� ��オチドまたはその相補的オリゴヌクレオチ� ��
  5’-ctcagCgatgatatagaacgg-3’   (配列番号6)
  5’-cagCgatgatatagaacggg-3’   (配列番号7)

 下記(D1)および(D2)のオリゴヌクレオチドか� �なるプローブは、それぞれ、配列番号1の塩� ��配列における944番目の塩基Cの変異(C→T)を� �出するためのプローブである。下記配列番� �8または配列番号9のオリゴヌクレオチドによ れば、順鎖における変異を確認でき、これら の相補的オリゴヌクレオチドによれば、逆鎖 における変異を確認できる。
(D1)配列番号8の塩基配列からなるオリゴヌク� ��オチドまたはその相補的オリゴヌクレオチ� ��
(D2)配列番号9の塩基配列からなるオリゴヌク� ��オチドまたはその相補的オリゴヌクレオチ� ��
  5’-ctcaAtgatgatatagaacg-3’   (配列番号8)
  5’-actcaAtgatgatatagaac-3’   (配列番号9)

 下記(E1)のオリゴヌクレオチドからなるプロ ーブは、それぞれ、配列番号1の塩基配列に� �ける951番目の塩基Cの変異(C→G)を検出するた めのプローブである。下記配列番号10のオリ� ��ヌクレオチドによれば、逆鎖における変異� ��確認でき、これらの相補的オリゴヌクレオ� ��ドによれば、順鎖における変異を確認でき� ��。
(E1)配列番号10の塩基配列からなるオリゴヌク レオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチ ド
  5’-ttcccgtaggtcatCaac-3’   (配列番号10)

 下記(F1)のオリゴヌクレオチドからなるプロ ーブは、それぞれ、配列番号1の塩基配列に� �ける1052番目の塩基Tの変異(T→C)を検出する� �めのプローブである。下記配列番号11のオリ ゴヌクレオチドによれば、順鎖における変異 を確認でき、これらの相補的オリゴヌクレオ チドによれば、逆鎖における変異を確認でき る。
(F1)配列番号11の塩基配列からなるオリゴヌク レオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチ ド
  5’-gtcagccaCggagtacc-3’   (配列番号11)

 下記(G1)および(G2)のオリゴヌクレオチドか� �なるプローブは、それぞれ、配列番号1の塩� ��配列における1064番目の塩基Aの変異(A→G)を� ��出するためのプローブである。下記配列番� ��12または配列番号13のオリゴヌクレオチドに よれば、順鎖における変異を確認でき、これ らの相補的オリゴヌクレオチドによれば、逆 鎖における変異を確認できる。
(G1)配列番号12の塩基配列からなるオリゴヌク レオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチ ド
(G2)配列番号13の塩基配列からなるオリゴヌク レオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチ ド
  5’-gtttttcttcCccaggtactc-3’   (配列番号12)
  5’-gtttttcttcCccaggtactcc-3’   (配列番号13)

 下記(H1)および(H2)のオリゴヌクレオチドか� �なるプローブは、それぞれ、配列番号1の塩� ��配列における1075番目の塩基Tの変異(T→G)を� ��出するためのプローブである。下記配列番� ��14または配列番号15のオリゴヌクレオチドに よれば、順鎖における変異を確認でき、これ らの相補的オリゴヌクレオチドによれば、逆 鎖における変異を確認できる。
(H1)配列番号14の塩基配列からなるオリゴヌク レオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチ ド
(H2)配列番号15の塩基配列からなるオリゴヌク レオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチ ド
  5’-gatgaCgtttttcttctcc-3’   (配列番号14)
  5’-tgtggatgaCgtttttcttc-3’   (配列番号15)

 下記(I1)のオリゴヌクレオチドからなるプロ ーブは、配列番号1の塩基配列における1187番� ��の塩基Aの変異(A→G)を検出するためのプロ� �ブである。下記配列番号16のオリゴヌクレオ チドによれば、順鎖における変異を確認でき 、これらの相補的オリゴヌクレオチドによれ ば、逆鎖における変異を確認できる。
(I1)配列番号16の塩基配列からなるオリゴヌク レオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチ ド
  5’-ccagcaCgggctgtgtaggtgtcc-3’   (配列番号16)

 本発明のプローブは、標識物質で標識化� ��れたプローブであることが好ましい。前記� ��識物質は、制限されないが、蛍光色素(蛍光 団)があげられる。前記標識化プローブの具� �例として、例えば、前記蛍光色素で標識さ� �た、単独で蛍光を示し且つハイブリッド形� �により蛍光が減少(例えば、消光)するプロー ブが好ましい。このような蛍光消光現象(Quenc hing phenomenon)を利用したプローブは、蛍光消� ��プローブと呼ばれる。中でも、前記プロー� ��としては、オリゴヌクレオチドの3’末端も しくは5’末端が蛍光色素で標識化されてい� �ことが好ましく、標識化される前記末端の� �基は、Cであることが好ましい。この場合、� ��記標識化プローブがハイブリダイズする検� ��対象配列において、前記標識化プローブの� ��端塩基Cと対をなす塩基もしくは前記対をな す塩基から1~3塩基離れた塩基がGとなるよう� �、前記標識化プローブの塩基配列を設計す� �ことが好ましい。このようなプローブは、� �般的にグアニン消光プローブと呼ばれ、い� �ゆるQProbe(登録商標)として知られている。こ のようなグアニン消光プローブが検出対象配 列にハイブリダイズすると、蛍光色素で標識 化された末端のCが、前記検出対象DNAにおけ� �Gに近づくことによって、前記蛍光色素の発� ��が弱くなる(蛍光強度が減少する)という現� �を示す。このようなプローブを使用すれば� �シグナルの変動により、ハイブリダイズと� �離とを容易に確認することができる。

 前記蛍光色素は、制限されないが、例え� ��、フルオレセイン、リン光体、ローダミン� ��ポリメチン色素誘導体等があげられ、市販� ��蛍光色素としては、例えば、BODIPY FL(商標� �、モレキュラー・プローブ社製)、FluorePrime(� ��品名、アマシャムファルマシア社製)、Fluore dite(商品名、ミリポア社製)、FAM(ABI社製)、Cy3� ��よびCy5(アマシャムファルマシア社製)、TAMRA (モレキュラープローブ社製)等があげられる� ��プローブの検出条件は、特に制限されず、� ��用する蛍光色素により適宜決定できるが、� ��えば、Pacific Blueは、検出波長450~480nm、TAMRA� ��、検出波長585~700nm)、BODIPY FLは、検出波長51 5~555nmで検出できる。このようなプローブを� �用すれば、シグナルの変動により、ハイブ� �ダイズと解離とを容易に確認することがで� �る。また、同一反応液中で、二種類の変異� �検出する際には、各変異に応じたプローブ� �二種類以上併用することができる。この場� �、各プローブを異なる検出波長の蛍光色素� �標識化することで、同一反応液を用いて二� �類以上の変異を検出することも可能である� �

 また、本発明のプローブは、例えば、3’ 末端にリン酸基が付加されてもよい。後述す るように、変異の有無を検出するDNA(標的DNA)� ��、PCR等の遺伝子増幅法によって調製するこ� ��ができ、この際、本発明のプローブを遺伝� ��増幅反応の反応液中に共存させることがで� ��る。このような場合、プローブの3’末端に リン酸基を付加させておけば、プローブ自体 が遺伝子増幅反応によって伸長することを十 分に防止できる。また、3’末端に前述のよ� �な標識化物質を付加することによっても、� �様の効果が得られる。

 本発明のプローブは、前述のように、abl� ��伝子の変異の検出に使用することができる� ��検出方法は、何ら制限されず、検出対象配� ��とプローブとのハイブリダイズを利用する� ��法であればよい。本発明のプローブを適用� ��る方法の一例として、Tm解析を利用した変� �の検出方法について、以下に説明する。

 <変異検出方法>
 本発明の変異検出方法は、前述のように、a bl遺伝子における変異の検出方法であって、� ��記工程(1)~(3)を含むことを特徴とする。なお 、本発明の変異検出方法は、本発明のプロー ブを使用することが特徴であって、その他の 構成や条件等は、以下の記載に制限されない 。
(1)DNAを含有する試料と本発明のプローブとを 含む反応液を調製する工程
(2)前記反応液の温度を変化させ、前記DNAと前 記プローブとのハイブリッド形成体の融解状 態を示すシグナル値を測定する工程
(3)温度変化に伴う前記シグナル値の変動から 、変異の有無を決定する工程

 本発明において、試料中のDNAは、一本鎖D NAでもよいし二本鎖DNAであってもよい。前記D NAが二本鎖DNAの場合は、例えば、前記(2)工程� ��先立って、加熱により前記二本鎖DNAを解離� ��せる工程を含むことが好ましい。二本鎖DNA� ��一本鎖DNAに解離することによって、本発明� ��プローブとのハイブリダイズが可能となる� ��

 本発明において、試料に含まれるDNAは、� ��えば、生体試料に元来含まれるDNAでもよい� ��、検出精度を向上できることから、生体試� ��に元来含まれている核酸を鋳型としてPCR等� ��より増幅させた増幅産物であることが好ま� ��い。増幅産物の長さは、特に制限されない� ��、例えば、50~1000merであり、好ましくは80~200 merである。また、前記核酸としては、例えば 、DNA、RNA(トータルRNA,mRNA等)等でもよいし、� �記RNAからRT-PCR(Reverse Transcription PCR)により合 成したcDNA等であってもよい。

 本発明の変異検出方法を適用する試料は� ��特に制限されず、abl遺伝子が存在する試料� ��あげられる。具体例としては、白血球細胞� ��の血球試料、全血試料等があげられる。な� ��、本発明において、試料の採取方法、DNAの� ��製方法等は、制限されず、従来公知の方法� ��採用できる。

 本発明において、前記試料中のDNAに対す� ��、本発明のプローブの添加割合(モル比)は� �制限されないが、例えば、検出シグナルを� �分に確保できることから、1倍以下が好まし� ��、より好ましくは、0.1倍以下である。この� ��、試料中のDNAとは、例えば、検出目的の変� ��が発生している検出対象DNAと前記変異が発� ��していない非検出対象DNAとの合計でもよい� ��、検出目的の変異が発生している検出対象� ��列を含む増幅産物と前記変異が発生してい� ��い非検出対象配列を含む増幅産物との合計� ��もよい。なお、試料中のDNAにおける前記検� ��対象DNAの割合は、通常、不明であるが、結� ��的に、前記プローブの添加割合(モル比)が� �検出対象DNA(検出対象配列を含む増幅産物)に 対して10倍以下となることが好ましく、より� ��ましくは5倍以下、さらに、好ましくは3倍� �下である。また、その下限は特に制限され� �いが、例えば、0.001倍以上であり、好ましく は0.01倍以上であり、より好ましくは0.1倍以� �である。

 前記DNAに対する本発明のプローブの添加� ��合は、例えば、二本鎖DNAに対するモル比で� ��よいし、一本鎖DNAに対するモル比でもよい� ��

 Tm値について説明する。二本鎖DNAを含む� �液を加熱していくと、260nmにおける吸光度が 上昇する。これは、二本鎖DNAにおける両鎖間 の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖DNA に解離(DNAの融解)することが原因である。そ� ��て、全ての二本鎖DNAが解離して一本鎖DNAに� ��ると、その吸光度は加熱開始時の吸光度(二 本鎖DNAのみの吸光度)の約1.5倍程度を示し、� �れによって融解が完了したと判断できる。� �の現象に基づき、融解温度Tmとは、一般に、 吸光度が、吸光度全上昇分の50%に達した時の 温度と定義される。

 本発明の前記(2)工程において、前記DNAと� ��記プローブとのハイブリッド形成体の融解� ��態を示すシグナル値の測定は、前述のよう� ��原理から、260nmの吸光度測定でもよいが、� �発明のプローブに付加した標識物質のシグ� �ル測定であることが好ましい。このため、� �発明のプローブとして、前述の標識化プロ� �ブを使用することが好ましい。前記標識化� �ローブとしては、例えば、単独でシグナル� �示し且つハイブリッド形成によりシグナル� �示さない標識化プローブ、または、単独で� �グナルを示さず且つハイブリッド形成によ� �シグナルを示す標識化プローブがあげられ� �。前者のようなプローブであれば、検出対� �配列とハイブリッド(二本鎖DNA)を形成してい る際にはシグナルを示さず、加熱によりプロ ーブが遊離するとシグナルを示す。また、後 者のプローブであれば、検出対象配列とハイ ブリッド(二本鎖DNA)を形成することによって� ��グナルを示し、加熱によりプローブが遊離� ��るとシグナルが減少(消失)する。したがっ� �、この標識物質によるシグナルをシグナル� �有の条件(吸光度等)で検出することによって 、前記260nmの吸光度測定と同様に、融解の進� ��ならびにTm値の決定を行うことができる。� �識化プローブにおける標識化物質は、例え� �、前述のとおりである。

 次に、本発明の変異検出方法について、� ��発明のプローブとして、蛍光色素で標識化� ��れた標識化プローブを使用する例をあげて� ��明する。なお、本発明の変異検出方法は、� ��発明のプローブを使用すること自体が特徴� ��あり、その他の工程や条件については何ら� ��限されない。

 まず、全血からゲノムDNAを単離する。全� ��からのゲノムDNAの単離は、従来公知の方法� ��よって行うことができ、例えば、市販のゲ� ��ムDNA単離キット(商品名GFX Genomic Blood DNA P urification kit;GEヘルスケアバイオサイエンス� �製)等が使用できる。

 次に、単離したゲノムDNAを含む試料に本� ��明の標識化プローブを添加する。前記標識� ��プローブとしては、例えば、前述のようなQ Probeが好ましい。このQProbeとは、一般に、プ� ��ーブ末端のシトシン塩基を蛍光色素で標識� ��したプローブであり、これが検出対象配列� ��ハイブリッドすることで前記蛍光色素と検� ��対象配列のグアニン塩基とが相互作用し、� ��の結果、蛍光が減少(または消光)するもの� �ある。標識化プローブの配列は、前述の通� �であって、検出目的の変異に応じて、適宜� �択すればよい。

 前記検出用プローブの添加のタイミング� ��、特に制限されず、例えば、後述する遺伝� ��増幅処理の後、増幅産物に対して添加して� ��よいし、遺伝子増幅処理前に添加してもよ� ��。このようにPCR等による増幅処理前に前記� ��出用プローブを添加する場合は、例えば、� ��述のように、その3’末端に、蛍光色素を付 加したり、リン酸基を付加することが好まし い。

 前記検出用プローブは、単離したゲノムDNA� ��含む液体試料に添加してもよいし、溶媒中� ��ゲノムDNAと混合してもよい。前記溶媒とし� ��は、特に制限されず、例えば、Tris-HCl等の� �衝液、KCl、MgCl ₂ 、MgSO ₄ 、グリセロール等を含む溶媒、遺伝子増幅反 応液等、従来公知のものがあげられる。

 続いて、単離したゲノムDNAを鋳型として� ��PCR等の遺伝子増幅法によって検出目的の点� ��然変異を生じる部位を含む配列(検出対象配 列および非検出対象配列)を増幅させる。前� �遺伝子増幅法は、制限されず、例えば、PCR(P olymerase Chain Reaction)法、NASBA(Nucleic acid sequen ce based amplification)法、TMA(Transcription-mediated a mplification)法、SDA(Strand Displacement Amplification)� ��等があげられ、中でもPCR法が好ましい。な� ��、以下、PCR法を例にあげて、本発明を説明� ��るが、これには制限されない。また、PCRの� ��件は、特に制限されず、従来公知の方法に� ��り行うことができる。

 PCRのプライマーの配列は、目的の検出対� ��配列を増幅できるものであれば特に制限さ� ��ず、目的の配列に応じて、従来公知の方法� ��より適宜設計できる。プライマーの長さは� ��特に制限されず、一般的な長さ、例えば、1 0~30merに設定できる。以下に、前記(A1)~(I1)の� �ローブを使用する際の、検出対象配列の増� �に使用できるプライマーセットの一例を示� �。なお、これらは例示であって、本発明を� �限するものではない。

  A1プローブおよびA2プローブ用の� �ライマーセット
センスプライマー 配列番号17
5’-gacaagtgggagatggaacgc-3’
アンチセンスプライマー 配列番号18
5’-cacggccaccgtcagg-3’
  B1プローブおよびB2プローブ用の� �ライマーセット
センスプライマー 配列番号19
5’-gacaagtgggagatggaacgc-3’
アンチセンスプライマー 配列番号20
5’-cacggccaccgtcagg-3’
  C1プローブおよびC2プローブ用の� �ライマーセット
センスプライマー 配列番号21
5’-ggacggacggaccgtcctcgttgtcttgttggc-3’
アンチセンスプライマー 配列番号22
5’-ggacggacggaccgcactccctcaggtagtccag-3’
  D1プローブおよびD2プローブ用の� �ライマーセット
センスプライマー 配列番号23
5’-ggacggacggaccgtcctcgttgtcttgttggc-3’
アンチセンスプライマー 配列番号24
5’-ggacggacggaccgcactccctcaggtagtccag-3’
  E1プローブ用のプライマーセット
センスプライマー 配列番号25
5’-ggacggacggaccgtcctcgttgtcttgttggc-3’
アンチセンスプライマー 配列番号26
5’-ggacggacggaccgcactccctcaggtagtccag-3’
  F1プローブ用のプライマーセット
センスプライマー 配列番号27
5’-ggccggccccgtggtgctgctgtacatg-3’
アンチセンスプライマー 配列番号28
5’-cacgccctgtgactccatg-3’
  G1プローブおよびG2プローブ用の� �ライマーセット
センスプライマー 配列番号29
5’-ggccggccccgtggtgctgctgtacatg-3’
アンチセンスプライマー 配列番号30
5’-cacgccctgtgactccatg-3’
  H1プローブおよびH2プローブ用の� �ライマーセット
センスプライマー 配列番号31
5’-ggccggccccgtggtgctgctgtacatg-3’
アンチセンスプライマー 配列番号32
5’-cacgccctgtgactccatg-3’
  I1プローブ用のプライマーセット
センスプライマー 配列番号33
5’-acctacctacctagatcttgctgcccgaaactg-3’
アンチセンスプライマー 配列番号34
5’-acctacctacctcttgttgtaggccaggctctc-3’

 次に、得られたPCR増幅産物の解離、およ� ��、解離により得られた一本鎖DNAと前記標識� ��プローブとのハイブリダイズを行う。これ� ��、例えば、反応液の温度変化によって行う� ��とができる。

 前記解離工程における加熱温度は、前記� ��幅産物が解離できる温度であれば特に制限� ��れず、例えば、85~95℃である。加熱時間も� �に制限されず、通常、1秒~10分であり、好ま� ��くは1秒~5分である。

 解離した一本鎖DNAと前記標識化プローブ� ��のハイブリダイズは、例えば、前記解離工� ��の後、前記解離工程における加熱温度を降� ��させることによって行うことができる。温� ��条件としては、例えば、40~50℃である。

 前記反応液における各組成の体積や濃度� ��、特に制限されない。具体例としては、前� ��反応液におけるDNAの濃度は、例えば、0.01~1� �Mであり、好ましくは0.1~0.5μM、前記標識化プ ローブの濃度は、例えば、前記DNAに対する添 加割合を満たす範囲が好ましく、例えば、0.0 01~10μMであり、好ましくは0.001~1μMである。

 そして、前記反応液の温度をさらに変化� ��せ、前記増幅産物と前記標識化プローブと� ��ハイブリッド形成体の融解状態を示すシグ� ��ル値を測定する。具体的には、例えば、前� ��一本鎖DNAと前記標識化プローブとのハイブ� ��ッド形成体を含む前記反応液を加熱し、温� ��上昇に伴うシグナル値の変動を測定する。� ��述のように、例えば、末端のC塩基が標識化 されたプローブ(グアニン消光プローブ)を使� ��した場合、一本鎖DNAとのハイブリダイズし� ��状態では、蛍光が減少(または消光)し、解� �した状態では、蛍光を発する。したがって� �例えば、蛍光が減少(または消光)しているハ イブリッド形成体を徐々に加熱し、温度上昇 に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。

 蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲� ��、特に制限されないが、例えば、開始温度� ��室温~85℃であり、好ましくは25~70℃であり� �終了温度は、例えば、40~105℃である。また� �温度の上昇速度は、特に制限されないが、� �えば、0.1~20℃/秒であり、好ましくは0.3~5℃/� ��である。

 本発明においては、例えば、異なる2箇所 以上の変異を同じ反応液を用いて検出するこ ともできる。この場合、各変異に対応するプ ローブとして、前述のように、異なる標識物 質を付加した標識化プローブを使用すること が好ましい。そして、この測定工程において は、各標識物質に応じた検出波長で、それぞ れの標識物質のシグナル蛍光強度の測定を行 うことが好ましい。

 次に、前記シグナルの変動を解析してTm� �を決定する。具体的には、得られた蛍光強� �から各温度における単位時間当たりの蛍光� �度変化量(-d蛍光強度増加量/dt)を算出し、最� ��低い値を示す温度をTm値として決定できる� �また、単位時間当たりの蛍光強度変化量(d蛍 光強度増加量/t)が最も高い点をTm値として決� ��することもできる。なお、標識化プローブ� ��して、消光プローブではなく、単独でシグ� ��ルを示さず且つハイブリッド形成によりシ� ��ナルを示すプローブを使用した場合には、� ��対に、蛍光強度の減少量を測定すればよい� ��

 そして、これらのTm値から、検出対象配� �における遺伝子型を決定する。Tm解析におい て、完全に相補であるハイブリッド(パーフ� �クトマッチ)は、一塩基が異なるハイブリッ� ��(ミスマッチ)よりも、解離を示すTm値が高く なるという結果が得られる。したがって、予 め、前記プローブについて、完全に相補であ るハイブリッドのTm値と、一塩基が異なるハ� ��ブリッドのTm値とを決定しておくことによ� �、各検出対象部位における遺伝子型を決定� �ることができる。例えば、検出対象部位の� �基を変異型(例えば、配列番号1における730番 目の塩基がG)と仮定し、それを含む検出対象� ��列に相補的なプローブ(配列番号2または3)を 使用した場合、形成したハイブリッドのTm値� ��、完全に相補なハイブリッドのTm値と同じ� �あれば、前記増幅産物の多型は、変異型と� �断できる。また、形成したハイブリッドのTm 値が、一塩基異なるミスマッチのハイブリッ ドのTm値と同じ(完全に相補なハイブリッドの Tm値より低い値)であれば、前記増幅産物の多 型は、野生型(例えば、配列番号1における730� ��目の塩基がA)と判断できる。さらに、完全� �相補なハイブリッドのTm値のみが検出された 場合は、変異型のホモ接合性、ミスマッチの ハイブリッドのTm値のみが検出された場合は� ��野生型のホモ接合性であると判断できる。� ��方、両方のTm値が検出された場合には、ヘ� �ロ接合体と決定できる。このようにして、� �標識化プローブに対する2つのTm値から、遺� �子型を判断することができる。

 本発明においては、予め、各プローブに� ��いて、パーフェクトマッチのハイブリッド� ��成体のTm値、および、ミスマッチのハイブ� �ッド形成体のTm値を決定しておくことが好ま しい。このように予め決定した評価基準とな るTm値と、実際に検出対象配列とハイブリッ� ��を形成させた際のTm値とを比較することで� �容易に変異の有無や接合体の型を決定でき� �。前記評価基準となるTm値は、例えば、従来 公知のMELTCALCソフトウエア(http://www.meltcalc.com/ )や隣接法(Nearest Neighbor Method)によって決定� �きる。また、実際に、本発明のプローブと� �出対象配列とのハイブリッドを形成させ、Tm 解析を行うことによって決定することもでき る。

 また、本発明においては、前述のように� ��ハイブリッド形成体を含む反応液の温度を� ��昇させて(加熱して)、温度上昇に伴うシグ� �ル変動を測定する方法に代えて、例えば、� �イブリッド形成時におけるシグナル変動の� �定を行ってもよい。すなわち、前記プロー� �を含む反応液の温度を降下させてハイブリ� �ド形成体を形成する際に、前記温度降下に� �うシグナル変動を測定してもよい。

 具体例として、単独でシグナルを示し且� ��ハイブリッド形成によりシグナルを示さな� ��標識化プローブ(例えば、グアニン消光プロ ーブ)を使用した場合、一本鎖DNAとプローブ� �が解離している状態では蛍光を発している� �、温度の降下によりハイブリッドを形成す� �と、前記蛍光が減少(または消光)する。した がって、例えば、前記反応液の温度を徐々に 降下して、温度下降に伴う蛍光強度の減少を 測定すればよい。他方、単独でシグナルを示 さず且つハイブリッド形成によりシグナルを 示す標識化プローブを使用した場合、一本鎖 DNAとプローブとが解離している状態では蛍光 を発していないが、温度の降下によりハイブ リッドを形成すると、蛍光を発するようにな る。したがって、例えば、前記反応液の温度 を徐々に降下して、温度下降に伴う蛍光強度 の増加を測定すればよい。

 <プローブキット>
 本発明のプローブキットは、abl遺伝子の変� ��の検出に使用するプローブキットであり、� ��発明のプローブを含むことを特徴とする。� ��発明のプローブキットにおいて、本発明の� ��ローブは、一種類でもよいし二種類以上で� ��ってもよい。後者の場合、二種類以上のプ� ��ーブは、混合された状態で含まれてもよい� ��、別個の試薬として含まれていてもよい。� ��た、二種類以上の本発明のプローブが混合� ��れた状態で本発明のプローブキットに含ま� ��る場合や、別個の試薬として含まれている� ��、例えば、使用時に同じ反応系で、各プロ� ��ブと各検出対象配列とのTm解析を行う場合� �各プローブは、別個の標識化物質で標識化� �れていることが好ましい。このように標識� �物質の種類を変えることで、同じ反応系で� �っても、それぞれのプローブについての検� �が可能になる。前記標識化物質としては、� �えば、検出波長が異なる物質であることが� �ましい。

 前述のように、abl遺伝子には、白血病に� ��連する複数の変異が知られており、本発明� ��プローブによれば、前述した各種変異(9種� �)を検出することが可能である。他方、白血� ��に関与するabl遺伝子は、例えば、いずれか� ��箇所の変異のみが検出される場合もあるが� ��複数個所の変異が検出される場合もある。� ��発明において検出目的としている複数の変� ��は、白血病やその薬剤(例えば、イマチニブ )と関係を示す変異であるが、変異ごとに特� �の特徴を示すと考えられる。このため、例� �ば、複数の変異を検出し、それらの結果を� �合的に判断することで、より良い診断や治� �が可能になる。したがって、本発明のプロ� �ブキットにおいて、本発明のプローブを2種� ��以上含有させることによって、診断や治療� ��のための変異の検出をより簡便に行うこと� ��できる。

 <診断方法>
 本発明の診断方法は、白血病の診断方法で� ��って、本発明の変異検出方法によって、abl� ��伝子の変異を検出する工程を含むことを特� ��とする。本発明においては、abl遺伝子の変� ��を、前述の本発明のプローブを用いて検出� ��ることが特徴であり、その他の工程や条件� ��何ら制限されない。

 本発明によれば、abl遺伝子の特定の部位� ��おける変異の有無によって、白血病治療薬� ��対する耐性を判断することができる。前記� ��血病治療薬としては、例えば、イマチニブ� ��メシル酸イマニチブがあげられる。

 つぎに、本発明について、実施例をあげ� ��説明する。ただし、本発明は下記の実施例� ��より制限されない。