CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con el campo de la medicina particularmente con las técnicas y principios utilizados en terapia para tratamiento del cáncer, específicamente se refiere a un péptido que tiene aplicación con fines terapéuticos, especialmente contra células provenientes de tumores de cáncer de mama: MCF-7 y MBA-MB-231.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los péptidos son cadenas de aminoácidos cuya longitud puede variar de dos a menos de cien aminoácidos, unidos covalentemente por enlaces peptídicos. Están presentes en la naturaleza y cumplen funciones como agentes vasoactivos (Rhomberg, 2018), hormonas (McLaughlin, 2019), neurotransmisores (Tringali, 2019), antioxidantes

(Nwachukwu, 2019), antibióticos (Lewies, 2019), etc. La estructura de los péptidos y proteínas se aborda en cuatro niveles de complejidad: estructura primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria. La estructura primaria se refiere al número y a la secuencia de los aminoácidos presentes: por convención, se escribe desde el extremo que tiene un grupo amino N-inicial libre (localizado a la derecha) hacia el extremo C-terminal que contiene al grupo a-carboxilo libre (al final de la cadena peptídica). En la estructura secundaria, el arreglo ordenado de aminoácidos, los puentes de hidrógeno que se forman entre los átomos y los enlaces sencillos del enlace peptídico, permiten que la cadena polipeptídica adopte conformaciones de menor energía libre y por lo tanto más estables. Esas conformaciones dependen de la secuencia primaria de los aminoácidos: Hélice a, lámina b, y otras como las hélices 3-10, hélices p; etc., y como estructuras supersecundarias se encuentran las horquillas b, hélice a- horquilla y motivos b-a-b (Tramontano, 2006). Existen varias funciones terapéuticas de los péptidos relacionadas con el tratamiento del cáncer, entre ellas destacan los péptidos que forman poros en la membrana celular y los que la desestabilizan, este tipo de péptidos forman parte del sistema inmune innato de varias especies, por ejemplo: las cecropinas en insectos, magaininas y dermaseptinas en anfibios, y las defensinas en los mamíferos. Poseen un relativo bajo peso molecular (menos de 5000 Da), baja antigenicidad y exhiben una estructura predominantemente catiónica antipática, lo que favorece su interacción con membranas celulares aniónicas (Ganz, 2003). El mecanismo de acción de estos péptidos consiste en la unión y la interrupción de la integridad estructural de la membrana a través de poros, agujeros o canales iónicos. Sin embargo, el mecanismo molecular exacto depende de la conformación específica de la molécula utilizada (Avci, 2018).

La ventaja de los péptidos membranolíticos es que, no son tóxicos para las células receptoras y no activan o suprimen vías metabólicas. Es por ello por lo que, los péptidos que lisan membranas son buenos candidatos para utilizarse en nuevos enfoques terapéuticos.

En las últimas décadas, el desarrollo de fármacos se ha centrado principalmente en moléculas pequeñas y en biofármacos, no obstante, se estima que más del 90% de las moléculas estudiadas no logran llegar al mercado, debido a la toxicidad y a los efectos secundarios, más que a la eficacia, tolerabilidad y toxicidad. Los péptidos se degradan fácilmente en el interior del cuerpo humano, esta clase de biomoléculas por mucho tiempo se mantuvieron inelegibles para el desarrollo de fármacos. Sin embargo, gracias a los avances tecnológicos se ha despertado un gran interés en su uso, tanto como agentes de diagnóstico, como de agentes terapéuticos (Lau, 2018). Las tecnologías actuales tienen el potencial de generar un amplio espectro de fármacos peptídicos eficaces y seguros. Los péptidos con fines terapéuticos pueden ser de origen natural o completamente sintéticos, diseñados por métodos bioinformáticos y computacionales. El diseño de un péptido sintético a partir de péptidos naturales permite modificar sus propiedades químicas y fisicoquímicas, por ejemplo, mejorar su solubilidad, pH, hidrofobicidad y permeabilidad en los tejidos blanco, o bien variar su estructura añadiendo moléculas centinelas sin que se modifiquen sus propiedades, lo que les confiere ventajas terapéuticas.

Por lo anterior, la química computacional y el modelado molecular son herramientas potencialmente útiles para el diseño de biofármacos, que tiene como objetivo la integración de aplicaciones encaminadas al diseño racional, al uso o a la obtención de estructuras químicas, para determinar mapas de interacción proteica (interacciones proteína-proteína) o para identificar nuevos sitios activos (acoplamiento molecular y cribado virtual), a partir de colecciones de compuestos (librerías químicas computacionales). Asimismo, la simulación molecular (dinámica molecular) permite recrear a las macromoléculas en su entorno nativo. Así, mediante técnicas computacionales, se pueden rediseñar moléculas (péptidos) con la finalidad de mejorar sus propiedades químico-biológicas, así como, para aumentar su afinidad, su especificidad, o ambas (Georgoulia, 2019).

Actualmente, la síntesis experimental de péptidos en fase sólida es el método más común. La síntesis en fase sólida consiste en numerosos pasos de desprotección, activación y acoplamiento, es decir, en lugar de proteger al C-terminal con un grupo químico, el C-terminal del primer aminoácido se acopla a un soporte sólido activado, como el poliestireno o poliacrilamida. Este tipo de estrategia tiene una función doble: la resina actúa como el grupo protector C-terminal y proporciona un método rápido para separar el péptido de las diferentes mezclas de reacción durante la síntesis. Esta síntesis comúnmente se realiza en sintetizadores de péptidos automatizados con una producción de péptidos con alta pureza y un buen rendimiento (Máde, 2014). Esto es crucial para continuar con los ensayos de las etapas clínicas. El cáncer de mama es un problema de salud pública en México y a nivel mundial, no solo por sus manifestaciones clínicas y su alta mortalidad, sino también por la gran variedad de factores de riesgo individuales y ambientales con los que se le asocia (WHO, 2019; Máde, 2014). El cáncer es una alteración de diversas rutas metabólicas, que conducen a la proliferación celular incontrolada e inhibición de la apoptosis, así como a la falta de la diferenciación celular y tisular (Metzcar, 2019). La cirugía, radiación y la quimioterapia son procedimientos terapéuticos utilizados ampliamente para tratar los diversos tipos de cáncer, sin embargo, estos tratamientos resultan invasivos y tienen efectos colaterales graves sobre el organismo. Actualmente, se encuentran en desarrollo nuevas terapias génicas que aprovechan la inducción selectiva de apoptosis o necrosis. Los péptidos con acción anticancerígena se han dividido en: aquellos que inducen necrosis (memebranolíticos), los que activan al sistema inmune (inmunomoduladores), los que conducen a la activación de las rutas apoptóticas y los que bloquean funciones específicas en las células neoplásicas. En estos últimos se encuentran los que interactúan con receptores, los que se unen a proteínas de adhesión celular y los inhibidores de las proteínas cinasas (Hilchie, 2019). En 2007, Barrientos-Salcedo y colaboradores realizaron un análisis detallado de la estructura electrónica y de las propiedades fisicoquímicas de los aminoácidos del dominio de transactivación de p53: PPLSQETFSDLWKLL, lo que permitió generar una familia de péptidos sintéticos con características químicas teóricas específicas, los cuales cumplieron con la regla de Lipinski (Lipinski, 2001) para su síntesis. Los estudios experimentales realizados de dichos péptidos mostraron que, uno de los péptidos presentó efecto citotóxico contra células de cáncer de mama.

El grupo de Huang en 2000 propuso la familia de proteínas Bcl-2 como blanco para el diseño de drogas antitumorales, ya que incluyen proteínas anti y proapoptóticas con funciones biológicas opuestas. En este sentido, se han generado péptidos que bloquean a Bcl-2 o Bcl-xL derivados de proteínas BH3-only (por ejemplo, EDIIRNIARHLAQVGDSMDR) (Chipuk, 2008; Huang, 2000), y más recientemente también se han desarrollado péptidos líticos a partir de proteínas BH3 nombrados por los autores como ABH3 (Liu, 2016).

Es bien conocido que varios péptidos con actividad antimicrobiana también presentan actividad antitumoral, con base en que tienen cargas positivas que les permiten interaccionar con membranas o moléculas blanco por medio de interacciones electrostáticas, hidrofobicidad o lipofilicidad tal que les permite entrar en contacto con las membranas celulares. Se ha estudiado mucho al respecto y recientemente, por ejemplo, se describió la actividad antitumoral de análogos de VmCT1 (FLGALWNVAKSVF) en células MCF-7 derivadas de cáncer de mama (Pedron, 2018; Felício, 2017; Gaspar, 2013).

En los últimos años, los péptidos sintéticos para el tratamiento del cáncer se emplean debido a su efecto terapéutico, especificidad y toxicidad baja (Barron, 2019; Wilke, 2018; Gómez-Rivas, 2019; Garrison, 2019; Taieb, 2019).

Para el desarrollo e innovación de péptidos sintéticos, se puede hacer uso de la química computacional, particularmente de los métodos químico-cuánticos, debido a que permiten la descripción detallada de la estructura electrónica, las propiedades fisicoquímicas y la estructura molecular en 3D, lo que facilita el diseño y la modificación racional y guiada de nuevas moléculas con características terapéuticas específicas. Como se describió anteriormente, en la literatura científica se cuenta con diversos reportes de péptidos antitumorales, muy promisorios, pero que, debido a su naturaleza bioquímica, sufren degradación por proteasas en la célula o en los tejidos, por lo que con base en el conocimiento detallado de su estructura química-molecular, se han propuesto modificaciones que impiden que se degraden y permiten que se ejerza su efecto, como es el caso de un grupo de péptidos monoméricos con actividad conocida

[HRYYESSLEPWYPD (p6.7), FRYYESSLEPWDD (pDD), FRYYES- SLEPWDDD (pDDD), YGGFM (Met-enkephalin, M-enk), YGGFL (Leu- enkephalin, L-enk), ELYENKPRRPYIL (neurotensin, NT), RRPYIL (NT 8-13), yFGGFTGARKSARKLANQ (nociceptin, NC)], que se multimerizaron como dendrímeros (Bracci, 2003). En este sentido, también algunos péptidos ya se encuentran en fase clínica I como es el caso de LTX-35-Oncopore™ y su análogo LTX-302 (WKKW-DipKKWK-NH2) que se han empleado exitosamente como inmunoactivadores y oncolíticos de melanoma tipo B16 (Berge, 2010). Lo anterior gracias al conocimiento de la geometría molecular y las propiedades fisicoquímicas de dichos péptidos. La solicitud de patente P A/a/2004/000561 titulada “Péptidos eficaces en el tratamiento de tumores y otras condiciones que requieren la remoción o destrucción de células" con fecha del 16 de enero de 2004 y la solicitud de patente MX/a/2017/007338 titulada “Péptidos cíclicos derivados de cd44v6 para el tratamiento de enfermedades relacionadas con cánceres y angiogénesis” con fecha de 5 de junio de 2017, ninguna de las solicitudes antes indicadas describe un péptido como el que se reclama en la presente invención. Por otra parte, la FDA en USA tiene registrados y autorizados los péptidos: Trastuzumab, Bevacizumab, Pertuzumab, Denosumab y Buserelin. (https://webs.iiitd.edu.in/raqhava/thpdb/submitkev.php?ran=6 327). Otras solicitudes de patente y patentes que describen péptidos son la patente norteamericana US 7,632,814 B2 titulada “HYD1 peptides anti -cáncer agents”, la solicitud de patente KR20190073338A titulada “Pharmaceutical composition for inhibiting expression of CCND3 or PAK2 gene”, la solicitud de patente australiana AU2019203377A1 titulada “Environmentally sensitive compositions”, la solicitud de patente EP3228632 A1 titulada “Seiective anticancer chimeric peptide”, la solicitud de patente norteamericana US2017042963 A1 titulada “Anticancer peptide for inhibiting proliferation of cáncer stem cells and use”, la solicitud de patente internacional WO2016139684A2 titulada “A modified peptides as an anticancer agent”, la solicitud de patente internacional WO2016099188 A1 titulada “Peptide having eight amino acid sequences derived from cage and retaining anticancer activity” y la patente US 9 067 970 B2 titulada “Anticancer agents comprising peptides with cancer-specific toxicity”, cabe destacar que ninguno de los documentos antes citados describe un péptido tal y como se reclama en la presente invención.

El péptido de la presente invención se diseñó a partir de estudios teóricos de la estructura electrónica, propiedades fisicoquímicas y de reactivad química, determinadas a través de descriptores químico-cuánticos a nivel ab initio.

Los estudios experimentales mostraron que el péptido sintético de la presente invención tiene un tiempo de acción corto, que es a partir de los 10 minutos en una concentración de 100 ng por cada 10 millones de células, lo que representa una ventaja al ser una dosis baja y en un tiempo de exposición reducido.

El péptido de la presente invención es altamente selectivo a células cancerosas de mama como lo demuestran los ensayos en las líneas celulares MCF-7 y MDA-MB-231 .

El péptido de la presente invención es factible de sintetizar y posee una estructura química que le confiere una alta estabilidad, es decir, es estable hasta los 305 ^° C.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se relaciona con el diseño de un nuevo péptido de interés farmacéutico y con aplicación en terapia antitumoral en células de cáncer de mama. El péptido propuesto posee una estructura hexapeptídica que corresponde a una secuencia de seis aminoácidos repetida 5 veces (FSKWLL) ₅ . De acuerdo con las características químicas, estructurales y a sus propiedades fisicoquímicas, el péptido posee funciones membranolíticas, lo que se confirmó de manera indirecta a través de ensayos de microarreglos de expresión de cDNA. Mismos que demostraron que se relaciona con supresión/activación de vías de señalización celular, que involucran a algunos miembros de la familia de los transportadores ABC, así como a la apolipoproteína H, todos ellos, involucrados en diversas funciones celulares, tales como flujo de metabolitos y moléculas señalizadoras, que en células transformadas conlleva a la resistencia a los agentes quimioterapéuticos.

Esta invención tiene como propósito formar parte de los esquemas terapéuticos empleados en el cáncer de mama. Particularmente aquellos tumores que no presentan expresión del dominio extracelular de la proteína EGFR que es el blanco del fármaco Herceptin. Puede ser útil después de la resección y antes de iniciar la administración quimioterapéutica.

El péptido propuesto se diseñó a partir de estudios teóricos a nivel atómico, y su tiempo de acción es a partir de los 10 minutos en una concentración de 100 ng por cada 10 millones de células, lo que representa una ventaja al ser una dosis baja y en tiempo de exposición reducido. Es altamente selectivo a células cancerosas de mama como lo demuestran los ensayos en las líneas celulares MCF-7 y MDA-MB- 231 . Además, posee una estructura química que le confiere una alta estabilidad; es decir, es estable hasta los 305.0 °C.

OBJETOS DE LA INVENCIÓN

Teniendo en cuenta las limitaciones y desventajas de los tratamientos y fármacos descritos en el estado de la técnica, es un objeto de la presente invención proveer un péptido que tiene como objetivo proporcionar una molécula de tipo peptídico, al que se ha denominado péptido-5 anti-cáncer de mama (P-5ACM), el cual posee alta selectividad a células cancerosas derivadas de adenocarcinoma de mama, MCF-7 y MDA-MB-231 . Es un objeto más de la presente invención proveer un péptido que tiene ventajas sobre los ya existentes en tumores que presentan resistencia a agentes quimioterapéuticos o aquellos para los que no existe fármaco o un blanco específico.

Un objeto adicional de la presente invención es proveer un péptido (P-5ACM) no tóxico para las células sanas en cultivo (MCF-10A), no transformadas de tejido mamario ni para los linfocitos humanos de sangre periférica de donadores sanos, tanto en cultivos individuales como en co-cultivo, es decir, el péptido no genera toxicidad celular circundante al degradarse rápidamente después de su efecto.

Es todavía más un objeto adicional de la presente invención proveer un péptido que posee una estructura tridimensional que le confiere una alta estabilidad a temperaturas elevadas (305 ^° C), de acuerdo con los resultados del análisis por calorimetría diferencial de barrido y en el análisis termogravimétrico DSC.

Es aún otro objeto de la presente invención proveer un péptido (P-5ACM) para ser incluido en los esquemas terapéuticos empleados en el cáncer de mama. Particularmente, que se aplique en aquellos tumores que no presentan expresión del dominio extracelular de la proteína EGFR que es el blanco del fármaco Herceptin; después de la resección y antes de iniciar la administración quimioterapéutica.

Estos y otros objetos, particularidades y ventajas del péptido (P-5ACM) de la presente solicitud de patente, serán evidentes para un técnico en la materia a partir de la descripción detallada de ciertas modalidades, de las figuras que se acompañan, así como de las reivindicaciones anexas. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS DE LA INVENCIÓN

Los aspectos novedosos que se consideran característicos de la presente invención se establecerán con particularidad en las reivindicaciones anexas. Sin embargo, la invención misma, tanto por su organización, así como por su método de operación, conjuntamente con otros objetos y ventajas de la misma, se comprenderán mejor en la siguiente descripción detallada de las modalidades de la presente invención, cuando se lea en relación con las figuras que se acompañan, en las cuales:

La Figura 1A muestra la estructura química tridimensional del péptido FSKWLL, que corresponde a la estructura de mínima energía optimizada a nivel HF/6-31 G (d,p).

La Figura 1 B muestra la estructura química tridimensional que corresponde a la estructura del hexapéptido, es decir, es la estructura repetida cinco veces del péptido (FSKWLL) _5.

La Figura 2 muestra un espectrograma de espectroscopia infrarroja (IR) del péptido (FSKWLL). En el espectro infrarrojo muestra una banda cerca de 1650 cnr ¹ que corresponde a la banda de la amida I. Las bandas cerca de 1540 cnr ¹ y 1200 cnr ¹ corresponden a la banda de amida II, y de la banda de amida III, respectivamente. La banda cerca de 1400 cnr ¹ corresponde a la flexión del grupo COO-. La banda correspondiente a la amida I, que se encuentra cerca de 1650 cnr ¹ , es característica de un desorden molecular por lo que no forma b-láminas, ya que estas absorben cerca de 1620 cnr ¹ , sin embargo, si puede formar hélices alfa. La Figura 3 es un gráfico que muestra un espectrograma de la espectroscopia

Raman del péptido (FSKWLL). En el espectrograma Raman se observa la banda cerca de 1650 cm- ¹ , que corresponde a la amida I. Al igual que en el espectro de IR el resultado del estiramiento del C = O en el enlace peptídico, a diferencia del IR, en Raman la banda se observa en menor intensidad.

La Figura 4 es un gráfico que muestra un Difractograma de Rayos X en polvos del hexapéptido. En el difractograma de rayos-X en polvo, se puede observar un comportamiento amorfo del péptido.

La Figura 5A es un gráfico que muestra un análisis termogravimétrico (TGA) del hexapéptido, mientras que la Figura 5B muestra un gráfico que expone un análisis por calorimetría diferencial de barrido (DSC) del hexapéptido. Se observa la pérdida de masa del péptido en función de la temperatura. En el análisis realizado por DSC a 90.43°C se detectó una ganancia de masa como consecuencia de la reacción de la muestra con la atmósfera que la rodea. Existe una pérdida de masa del 2.556% indicativo de una solvatación a 215.23 °C. Finalmente sufre descomposición a 306.18 °C, por lo que se concluye que es estable para su síntesis.

Las Figura 6A y 6B muestran imágenes de células en cultivo de la línea celular de cáncer de mama MCF-7 tratadas con el hexapéptido. Se observa el efecto citotóxico del péptido, las células se reducen en tamaño y se dañan las membranas nucleares, sin que se dañen por completo las membranas plasmáticas. Las imágenes fueron obtenidas con microscopía confocal a 100X, con apertura numérica de 0.9.

Las Figuras 7A y 7B muestran un cultivo de células MCF-7 derivadas de cáncer de mama sin tratamiento. Las células MCF-7 en cultivo se observan extendidas, forman grupos celulares. No se observa daño en las membranas celulares.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Ante el aumento de casos de muerte por cáncer y con la finalidad de proponer nuevas moléculas para el tratamiento de dicha enfermedad, se inició en el año 2007 la investigación de la presente invención. De acuerdo con una revisión bibliográfica exhaustiva se optó por emplear algoritmos Support Vector Machine (SVM), para generar secuencias peptídicas con características deseables para un péptido que interactúa con las membranas de las células cancerosas, pero se consideró que dichas secuencias no estuviesen reportadas en las bases de datos o como parte de proteínas naturales.

Una vez seleccionados los péptidos, se eligieron solo los cinco péptidos con el mayor puntaje de requerimientos en sus propiedades fisicoquímicas de acuerdo a las reglas de Lipinski, así como de un estudio detallado de la estructura electrónica, de sus propiedades fisicoquímicas y de reactividad química, a través de cálculos teóricos para determinar diversos descriptores químico-cuánticos, con lo que se estableció un modelo teórico con características químicas y estructurales específicas, mediante los métodos teóricos de Hartree-Fock (HF) y de la Teoría de Funcionales de la Densidad (DFT) con el funcional híbrido B3LYP, la metodología teórica está dada en Barrientos-Salcedo C, Arenas-Aranda D, Salamanca-Gómez F, Ortiz-Muñiz R, Soriano-Correa C. Cabe mencionar que, el péptido propuesto no se publicó en ese artículo.

Los resultados de los cálculos teóricos permitieron generar una serie de secuencias peptídicas que tenían como características en común: una carga neta positiva y parámetros geométricos que le confieren una estructura tridimensional potencial para formar hélices alfa o para plegarse como láminas beta, de un tamaño entre 5 y 30 aminoácidos, con una vida media corta (no mayor a 24 horas), baja toxicidad, solubilidad, anfipaticidad y lipofilicidad con valores que se predice pueden traspasar las membranas con alta fluidez, por ejemplo, como las células cancerosas.

Las secuencias de la familia de péptidos propuestos se enviaron a sintetizar con la Compañía Norteamericana American Peptide, utilizando el método en fase sólida. Se solicitó a dicha compañía debido a que todos los productos cumplen un intervalo de pureza de 90 a 99%, y se obtienen de forma liofilizada.

De acuerdo con los ensayos experimentales in vitro, se encontró que un HEXAPÉPTIDO con secuencia de aminoácidos FSKWLL repetida 5 veces (Figura 1 B) tuvo propiedades citotóxicas selectivas contra las células cancerosas de las líneas celulares de cáncer de mama MCF-7 y MDA-MB-231 , ambas procedentes de adenocarcinoma mamario, a partir de los 10 minutos después del tratamiento.

Se determinó la concentración efectiva de 100 ng/10 ⁶ células. Posteriormente, se hizo un análisis de la expresión génica; los resultados mostraron la alteración de algunas proteínas de la familia de los transportadores ABC, así como la apolipoproteína H, todas ellas, involucradas en diversas funciones celulares.

Resumiendo, el péptido de la presente invención comprende una secuencia de seis aminoácidos FSKWLL repetida 5 veces y es un hexapéptido que tiene un intervalo de pureza de 90 a 99% y se encuentra en forma liofilizada. Las ventajas del péptido propuesto son que: su efecto citotóxico se presenta a una concentración baja y el tiempo que se requiere para alcanzar el efecto de dicho péptido es corto, lo cual reduce la posibilidad de desarrollar resistencia, toxicidad y de presentar efectos secundarios. Además, posibilita un menor costo de tratamiento, y es muy estable a altas temperaturas.

Por lo anterior, y lo expuesto más adelante en ejemplos, el péptido de la presente invención con una secuencia de seis aminoácidos FSKWLL repetida 5 veces es útil en la preparación de composición farmacéutica para el tratamiento de cáncer de mamá, en combinación con un excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.

La presente invención será mejor entendida a partir de los siguientes ejemplos, los cuales se presentan únicamente con fines ilustrativos para permitir la comprensión cabal de las modalidades de la presente invención, sin que ello implique que no existan otras modalidades no ilustradas en la presente solicitud de patente y que puedan llevarse a la práctica con base en la descripción detallada previamente realizada. Se describen los siguientes datos y resultados experimentales, esto con la finalidad de aportar los elementos necesarios para llevar a cabo la invención, mas no son limitativos del alcance de la misma.

EJEMPLOS

RESULTADOS EXPERIMENTALES DETALLADOS

SÍNTESIS DEL PÉPTIDO

El péptido fue sintetizado por American Peptide, utilizando el método en fase sólida. Se recurrió a esta compañía debido a que todos los productos tienen un intervalo de pureza de 90 a 99%, y se obtuvo de forma liofilizada.

CARACTERÍSTICAS FISICOQUÍMICAS DEL HEXAPÉPTIDO

Se utilizó el péptido # 340572 sintetizado por American Peptide, con un porcentaje de pureza del 95% y peso molecular de 3892.82 g/mol calculado por espectroscopia de masas por electrospray y punto isoeléctrico (pl) de 10.6.

ENSAYO DE CITOTOXICIDAD

En un cultivo celular se determinó y sembró la concentración efectiva de 100 ng/10 ⁶ células cancerosas de las líneas celulares de cáncer de mama MCF-7 y MDA-MB- 231 , ambas procedentes de adenocarcinoma mamario. Posteriormente, se hizo un análisis de la expresión génica; los resultados mostraron la alteración de algunas proteínas de la familia de los transportadores ABC, así como la apolipoproteína H, todas ellas, involucradas en diversas funciones celulares. De acuerdo con las pruebas experimentales in vitro, se encontró que un HEXAPÉPTIDO con secuencia de aminoácidos FSKWLL repetida 5 veces (Figura 1 B), tuvo propiedades citotóxicas selectivas contra las células cancerosas de las líneas celulares de cáncer de mama MCF- 7 y MDA-MB-231 , a partir de los 10 minutos después del tratamiento. Lo anterior se observa como se observa en las imágenes de células en cultivo de la línea celular de cáncer de mama MCF-7 tratadas con el hexapéptido mostradas en las figuras 6A y 6B. Dichas imágenes muestran efecto citotóxico del péptido, las células se reducen en tamaño y se dañan las membranas nucleares, sin que se dañen por completo las membranas plasmáticas. Las imágenes fueron obtenidas con microscopía confocal a 100X, con apertura numérica de 0.9.

Por otro lado, las figuras 7A y 7B muestran imágenes de un cultivo de células MCF-7 derivadas de cáncer de mama sin tratamiento. Las células MCF-7 en cultivo se observan extendidas y forman grupos celulares. Además de lo anterior, no se observa daño en las membranas celulares.

DIFRACCIÓN DE RAYOS-X EN POLVOS

Se utilizó un Difractómetro de rayos-X Bruker D2 PHASER con radiación de cobre Ka y SSD160 ojo de lince, y se utilizó la paquetería del software DIFFRAC SUITE™. Para la lectura de la muestra, ésta se colocó en un portamuestra de vidrio con la ayuda de una espátula, y se colocó en la plataforma. El patrón de difracción se obtuvo a temperatura ambiente y en ángulos de incidencia theta de 5 a 60 por un tiempo de 10 minutos y al finalizar, la muestra se recuperó totalmente. ESPECTROSCOPIA INFRARROJA

Para la determinación del espectro de IR de la muestra se utilizó un Espectrofotómetro de Infrarrojo Nicolet™ iS™50 de Thermo Scientific™. Primero se determinó un espectro blanco del medio ambiente para evitar interferencias en la muestra. Posteriormente, se colocó una cantidad mínima de muestra, y se realizó la determinación espectroscópica de la muestra. El resultado se visualizó con el software del equipo OMNIC Spectra. El gráfico de la Figura 2, representa un espectrograma de espectroscopia infrarroja (IR) del péptido (FSKWLL). En el espectro infrarrojo muestra una banda cerca de 1650 cnr ¹ que corresponde a la banda de la amida I. Las bandas cerca de 1540 cnr ¹ y 1200 cnr ¹ corresponden a la banda de amida II, y de la banda de amida III, respectivamente. La banda cerca de 1400 cnr ¹ corresponde a la flexión del grupo COO-. La banda correspondiente a la amida I, que se encuentra cerca de 1650 cnr ¹ , es característica de un desorden molecular por lo que no forma b-láminas, ya que estas absorben cerca de 1620 cnr ¹ , sin embargo, si puede formar hélices alfa.

ESPECTROSCOPIA RAMAN

Para la determinación del espectro Raman se utilizó un equipo de microscopía Raman acoplado a un espectrofotómetro Raman adaptado con un láser de 630 nm de modelo Alpha 300M+ de la compañía Witec, Focus Innovation y se utilizó el programa Project Four y Control Four incluidos en la paquetería del equipo. En el equipo (microscopio) se colocó una cantidad mínima de muestra en un portaobjetos, y se enfocó la muestra a 5x y 50x; y posteriormente se hizo incidir la radiación láser a 630 nm sobre la muestra para obtener el espectro Raman. El gráfico de la figura 3 muestra el gráfico que representa un espectrograma de la espectroscopia Raman del péptido (FSKWLL). En el espectrograma Raman se observa la banda cerca de 1650 cm- ¹ , que corresponde a la amida I. Al igual que en el espectro de IR el resultado del estiramiento del C = O en el enlace peptídico, a diferencia del IR, en Raman la banda se observa en menor intensidad. TERMOGRAVIMETRÍA

Para la obtención del termograma de análisis termogravimétrico se utilizó un equipo de TA Instruments modelo Q50 y la paquetería de TA Universal Analysis. Para la determinación termogravimétrica primero se taró el porta muestras para ajustar a cero el valor de la medida de masa, posteriormente se adicionó la muestra. El peso de la muestra fue de 0.008 mg, y se varió la temperatura en el programa del ordenador de 20 ^e C / min; el intervalo de temperatura fue de 30°C a 400 °C.

CALORIMETRÍA DIFERENCIAL DE BARRIDO

Para la obtención del termograma de Calorimetría Diferencial de Barrido se utilizó un equipo de TA Instruments modelo Q200 y la paquetería de TA Universal Analysis. Para la determinación del termograma, la muestra se cargó en una cápsula de aluminio con una capacidad entre 10 - 50 mI. La cápsula se selló mediante la prensa selladora, con una tapa de aluminio para impedir que, por problemas de dilatación o descomposición de la muestra, ésta se proyectara fuera de la cápsula y contaminara el equipo. Además, se utilizó una capsula de referencia que se colocó a la par de la capsula que contenía la muestra. La muestra se corrió durante 20 minutos, a una temperatura inicial de 20°C y hasta 400°C.

La Figura 5a expone en un gráfico un análisis termogravimétrico (TGA) del hexapéptido, mientras que el gráfico de la Figura 5B expone el análisis por calorimetría diferencial de barrido (DSC) del hexapéptido.

A través de ambos gráficos se observa la pérdida de masa del péptido en función de la temperatura. En el análisis realizado por DSC a 90.43°C se detectó una ganancia de masa como consecuencia de la reacción de la muestra con la atmósfera que la rodea. Existe una pérdida de masa del 2.556% indicativo de una solvatación a 215.23 °C. Finalmente sufre descomposición a 306.18 °C, por lo que se concluye que es estable para su síntesis.

La presente invención tiene usos importantes en el tratamiento contra la proliferación de células cancerosas de mama, como lo demuestra la actividad membranolítica y alta selectividad que posee el péptido propuesto en contra de las células de cáncer de mama. No obstante, su efecto depende de la dosis, pero esta es muy baja en comparación con las empleadas en otros péptidos con efectos semejantes. El efecto citotóxico que posee el péptido propuesto (P-5ACM), es muy útil y conveniente para que forme parte del esquema terapéutico contra células de cáncer de mama resistente a quimioterapia. La vía de administración debe ser por inyección intraductal a la glándula mamaria y puede ser directa debido a que no es tóxico y a su corto tiempo de vida media.

Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por el solicitante para llevar a cabo la citada invención es el que resulta claro de la presente descripción de la invención. Aun cuando en la anterior descripción se ha hecho referencia a ciertas modalidades de la presente invención, debe hacerse hincapié en que son posibles numerosas modificaciones a dichas modalidades, pero sin apartarse del verdadero alcance de la invención, de tal modo que las características de la invención descritas en las modalidades de la misma, mostradas en las figuras y reclamadas en las reivindicaciones, pueden utilizarse individualmente o en cualquier combinación arbitraria para la realización de la presente invención, así como de diferentes modalidades que no hayan sido aquí descritas. Por consiguiente, debe entenderse que las modalidades de la presente invención son únicamente ilustrativas y no pretenden limitar el alcance de la presente invención, excepto por lo establecido tanto en el estado de la técnica como en las reivindicaciones anexas.