CAMPO DE LA INVENCION La presente invención está relacionada con las técnicas y principios utilizados en la nanotecnología y en las Ciencias Farmacéuticas para el estudio de las enfermedades en los ojos y su tratamiento, y más particularmente, está relacionada con un proceso de obtención de nanopartículas de polímero estabilizadas con tensoactivo polimérico no- iónico funcionalizado con un ligando, para la liberación mediada por receptor de fármaco, en donde la funcionalización es física.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

Es bien sabido que el cáncer es una de las principales causas de muerte en México y en el mundo y que el tratamiento de esta enfermedad requiere procedimientos como la cirugía, radioterapia y la quimioterapia. Con respecto a esta última, tiene el gran inconveniente que el paciente presenta efectos secundarios muy indeseables debido a que el fármaco no distingue entre células normales y células tumorales, afectando así tejido sano. Una manera de afrontar este problema es mediante el empleo de nano- acarreadores (vehículos) de fármacos que favorezcan la liberación del medicamento en las células objetivo. Enfermedades como el cáncer producen una sobre-expresión de receptores en las células tumorales por lo que para tomar ventaja de esto, los nano- acarreadores se diseñan para que posean en su superficie la molécula (el ligando) que se acopla con el receptor. Estos ligandos pueden incluir ácidos nucleicos (aptámeros), vitaminas, carbohidratos, péptidos o proteínas (anticuerpos y sus fragmentos) [Danhier et al., 2010]; el receptor de folato (la sal del ácido fólico o vitamina B9) es un ejemplo notable [Fernández et al., 2018] cuya expresión en tejidos normales está restringido a células epiteliales las cuales son inaccesibles por el sistema circulatorio evitando así toxicidad [Qiao et al., 2016]. Los ligandos mejoran en gran medida la absorción de nanopartículas por las células a través del proceso de endocitosis [Drummond et al., 2000].

Es por estas razones que existe un gran número de trabajos tanto en la literatura científica como de patentes o solicitudes de patente donde se emplean partículas poliméricas funcionalizadas con ligandos, en particular con folato para la liberación dirigida de agentes antitumorales.

Con la idea de hacer más eficiente la internalización del fármaco en la célula, se suelen emplear moléculas conjugadas, esto es, especies químicas en las que el ligando y el fármaco forman parte de la misma molécula, mediante un “linker” (conjugado L-L-F) o bien la unión entre el ligando y el “linker” es química (conjugado L-L).

Las partículas poliméricas reportadas en las patentes o solicitudes de patente son del tipo de micelas (producto del auto-ensamble de moléculas del conjugado) o del tipo en las que el núcleo está formado por cadenas poliméricas de alto peso molecular y recubiertas con el conjugado que también tiene la función de estabilizante. En el artículo de Bae et al. y que está relacionado con las patentes del mismo autor [US 7229973 B2, US7951846 B2, US 8263664 B2] con el título “Micelas poliméricas de pH sensible para entrega de fármaco" se muestran micelas formadas por el auto-ensamble de moléculas de un conjugado de folato.

El artículo de Yang et al. [2010], que está relacionado con la solicitud de patente TW 201247224 A titulada “Portador farmacéutico, estructura de fármaco que contiene el mismo y método de producción del mismo" muestra una partícula polimérica formada por un conjugado tipo L-L (Folato-quitosano) en el que el fármaco está separado, pero se aloja en el núcleo de la partícula.

Otros artículos que describen partículas poliméricas de tipo micelas o del tipo en las que el núcleo está formadas por cadenas poliméricas de alto peso molecular y recubiertas con el conjugado son “Thermal Cloud Point Fractionation of Poly(vinyl alcohol- co-vinyl acétate): Partition of Nanogels in the Fractions” de Atanase Ll and Riess G (2011); “Multifunctional polymeric micelles with folate-mediated cáncer cell targeting and pH-tríggered drug releasing properties for active intracellular drug deiivery” de Bae Y, Jang W-D, Nishiyama N, Fukushimaa S, y Kataoka K (2005); “To exploit the tumor microenvironment: passive and active tumor targeting of nanocarriers for anticancer drug deiivery" de Danhier F, Feron O y Préat V (2010); “Liposome targeting to tumors using vitamin and growth factor receptors” de Drummond DC, Hong K, Park JW, Benz CC y Kirpotin DB (2000); “Advances in targeting the folate receptor in the treatment/imaging of cancers” de Fernández M, Javaid F y Chudasama V (2018); ‘‘Drug Deiivery: Principies and Applications" de Galliford CV y Low PS (2016); “Desarrollo de nano-partfculas de poli acetato de vinilo establizadas con mezclas de PVA-folato y su evaluación como vehículo de un fármaco antitumoral” de Olvera Guillén LR y Rocha Botello G (2019); “Recent Patents on Polymeric Nanoparticles for Cáncer Therapy” de Pandey P and Dureja H (2018); “Macromolecules 36” de Philip J, Gnanaprakash G, Jayakumar T, Kalyanasundaram P, Raj B (2003); “Folie acid-conjugated fluorescent polymer for up- regulation folate receptor expression study vía targeted imaging of tumor cells” de Qiao J, Dong P, Mu X, Qi L y Xiao R (2016); “Kinetics of sty rene minisuspension polymerization using a mixture PVA-SDS as stabilizer. Polymer” de Ramírez JC, Herrera-Ordóñez J y González VA (2006).

Así mismo, existen algunas patentes o solicitudes de patente tales como, la patente US 8956602 B2 (Atherton DT et al.) con el título en español “Formulación de fármacos y polímeros de cadena lateral cristalina para proveer formulaciones de liberación de fármaco controlada y/o sostenida”·, la solicitud de patente CA 2372834 A1 titulada “Amplificación de folato mediado con objetivo a células tumorales usando nanopartículas” (McEwan JF et al.); la patente australiana AU 2013369982 B2 con el título “Conjugados objetivo encapsulados en partículas y formaciones de los mismos” (Bilodeau MT et al.). Los artículos, documentos, solicitudes de patente y/o patentes antes citadas tienen en común que el ligando (que con frecuencia es folato) se incorpora al conjugado mediante la formación de un enlace químico.

En contraste, en la presente invención las diferentes partes que formarían un conjugado no se encuentran unidas químicamente sino únicamente por interacción física. En particular, en el caso del ligando, éste está unido al estabilizante estérico de las partículas mediante asociación física. Esta es una característica distintiva de la presente invención.

Recientemente, Pandey and Dureja [2018] publicaron una revisión sobre las patentes relacionadas con nanopartículas de polímero para terapia del cáncer abarcando diferentes aspectos como el método de preparación, el tipo de polímero, ataque dirigido basado en ligandos, mecanismos de acción, etc. Esta revisión resalta el gran potencial de estos materiales para combatir con mayor efectividad el cáncer. Es importante destacar que Pandey and Dureja [2018] no hacen mención alguna sobre la funcionalización física de partículas de polímero, lo que confirma la novedad de la presente invención. La utilización de la asociación física para la liberación controlada de fármacos se empleó en la patente US 8956602 B2 de Atherton et al. Si bien es el mismo fenómeno que se explota en la presente invención, existen diferencias importantes en cuanto al aprovechamiento de la asociación física y, sobre todo, en la estructura química de polímeros involucrados tal y como se resumen a continuación:

I. Atherton et al. aprovechan la asociación física para regular la velocidad de liberación de un fármaco. En la presente invención se aprovecha este fenómeno para mantener asociado el ligante (por ejemplo, folato) al estabilizante estérico, más no para liberarlo;

II. La metodología y criterios empleados en la presente invención para determinar si un estabilizante se asocia a un ligante dado se basan en mediciones de tensión interfacial mientras Atherton et al. emplean otros datos como, por ejemplo, el parámetro de solubilidad;

III. El fármaco empleado podría no cumplir con los criterios de selección de Atherton et al. Para efectos de la presente invención es suficiente con que el fármaco: a) sea líquido, b) hinche al polímero que constituye el núcleo de la partícula, c) que al mezclarse con agua a condiciones ambientales forme dos fases y d) para el caso en que las partículas se sinteticen por un proceso tipo “bottom up” su solubilidad en agua a condiciones ambientales debe ser intermedia entre la del estireno y del acetato de vinilo, aproximadamente; y

IV. La patente de Atherton et al. aplica para polímeros que poseen a lo largo de su cadena grupos colgantes lineales de 6 a 50 átomos de carbono que le imparten cristalinidad al polímero. Los estabilizantes de la presente invención no poseen dichos grupos colgantes.

Varios investigadores (ver por ejemplo [Philip et al., 2003; Ramírez et al., 2006; Reiss et al., 2011]) han reportado evidencias de la asociación entre el poli(vinil alcohol) (PVA), un estabilizante polimérico no iónico, y el dodecil sulfato de sodio, un estabilizante aniónico. Ramírez et al., [2006] desarrollaron un método basado en mediciones de tensión interfacial para obtener dicha evidencia. En la presente invención se hace referencia a dicho método para evaluar la capacidad del estabilizante estérico para asociarse con moléculas de ligante. OBJETOS DE LA INVENCIÓN

Teniendo en cuenta las limitaciones y desventajas expuestos en el estado de la técnica, es un objeto de la presente invención proveer un proceso para desarrollar nanopartículas de polímero (NPs) para usarse como vehículo de fármaco(s) que haga más eficaz la acción de los mismos mediante su liberación mediada por receptores. Para esto, la presente invención describe un método de funcionalización física del estabilizante que cubre las NPs, con un ligando, lo que resulta mucho más sencillo que los métodos de funcionalización química. Es un objeto más de la presente invención proveer un proceso para desarrollar nanopartículas de polímero (NPs) para usarse como vehículo de fármaco donde la funcionalización física de las NPs con folato solamente requiere un proceso de mezclado en el que el estabilizante estérico y el folato se encuentren en la proporción óptima. Un objeto adicional de la presente invención es proveer un proceso para desarrollar nanopartículas de polímero (NPs) para usarse como vehículo de fármaco donde la funcionalización física es prácticamente instantánea, en contraste con la funcionalización química común que puede requerir varias horas para efectuarse. Es todavía más un objeto más de la presente invención proveer un proceso para desarrollar nanopartículas de polímero (NPs) para usarse como vehículo de fármaco donde la funcionalización física no requiere de procedimientos de purificación adicionales tal como suele ocurrir en la etapa de funcionalización química para eliminar material que no reaccionó.

Es un objeto más de la presente invención proveer un proceso para desarrollar nanopartículas de polímero (NPs) para usarse como vehículo de fármaco que también puede emplearse para el suministro a células mediado por receptor de fármacos y/o materiales de diagnóstico para otras enfermedades, siempre y cuando la molécula que se acoplaría al receptor en cuestión se asocie al estabilizante no-iónico empleado, esto es, dicha molécula no necesariamente tiene que ser folato. Estos y otros objetos, particularidades y ventajas del proceso para desarrollar nanopartículas de polímero (NPs) para usarse como vehículo de fármacos de la presente solicitud, serán evidentes para un técnico en la materia a partir de la descripción detallada de ciertas modalidades y de las figuras que se acompañan, así como de las reivindicaciones anexas.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS DE LA INVENCION

Los aspectos novedosos que se consideran característicos de la presente invención, se establecerán con particularidad en las reivindicaciones anexas. Sin embargo, la invención misma, tanto por su organización, así como por su método de operación, conjuntamente con otros objetos y ventajas de la misma, se comprenderán mejor en la siguiente descripción detallada de las modalidades de la presente invención, cuando se lea en relación con los dibujos que se acompañan, en los cuales:

La Figura 1 muestra la estructura química del folato. La Figura 2 muestra una representación gráfica de la endocitosis mediada por receptores para nanopartículas ancladas a folato.

La Figura 3 es un gráfico que muestra el efecto de la concentración de folato en la tensión interfacial (g) acetato de etilo/solución acuosa de folato.

La Figura 4 es un gráfico que muestra el efecto de la concentración de folato y de la mezcla PVA/folato, en la tensión interfacial (g) acetato de etilo/solución acuosa de folato, en donde la línea discontinua vertical indica la concentración de soluto (5 g/L de PVA + 1.5 g/L de folato) en el máximo de y y que corresponde a la relación masa folato/PVA óptima (15/5=0.3). Las letras “a)” y “b)” se refieren a los escenarios mostrados en las Figuras 5a y 5b, respectivamente.

Las Figuras 5a y 5b son gráficos que muestran una representación esquemática de la adsorción en interfase agua-líquido hidrófobo, de a) PVA y b) Mezcla PVA/folato. La Figura 6 es un gráfico que muestra distribuciones de tamaño de las nanopartículas con y sin “Eugenol+folato”.

La Figura 7 muestra una imagen de las nanopartículas de polímero obtenida por microscopía electrónica de barrido de alta resolución (FIR-SEM).

Las Figuras 8a a 8d consisten de gráficos que muestran los resultados de los ensayos de citotoxicidad y muerte celular por apoptosis/necrosis, empleando NPs solas (sin eugenol y sin folato), NPs funcionalizadas con folato (sin eugenol), NPs cargadas con Eugenol (sin folato), NPs funcionalizadas con folato y cargadas con eugenol.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las nanopartículas de polímero (NPs) a las que se refiere el título, consta de cuatro componentes principales: i. Núcleo de polímero de geometría aproximadamente esférica.

¡i. Capa de estabilizante estérico (recubre el núcleo)

Ni. Fármaco(s) (absorbido en el núcleo) iv. Ligando (asociado a la capa de estabilizante)

El núcleo está constituido de algún polímero, ya sea sintético o natural, pero que sea biocompatible y preferentemente biodegradable, por ejemplo, poli(acetato de vinilo), poli(metacrilato de metilo), poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico), poli(ácido láctico-co- glicólico), poli(caprolactona), poly(N-vinil pirrolidona), polisacáridos como quitosano, albúmina, etc.

La capa de estabilizante estérico está constituida por tensoactivo(s) polimérico(s) no iónicos que tenga(n) la capacidad de asociarse con el anión folato (producto de la neutralización del ácido fólico) y de proveer la estabilidad coloidal necesaria para obtener las partículas del tamaño deseado, como es el caso del poli(alcohol vinílico) (PVA). Más adelante se muestran resultados experimentales que permiten verificar dichas capacidades para un tipo de PVA.

Los agentes tumorales son diversos, pueden ser sintéticos o extractos de productos naturales, pero deben de cumplir el requisito de ser líquidos a temperatura ambiente, de tener una solubilidad en agua relativamente baja (10 ^_1 a 10 ¹ g/L) y que sea un buen solvente para el polímero que forma el núcleo. Un ejemplo de agente antitumoral que cumple con estos requisitos es el Eugenol (esencia de clavo).

El folato es el anión producto de la neutralización del ácido fólico, cuya estructura química se muestra en la Figura 1. A continuación, se explica la forma en la que actúan las NPs.

Dentro de los receptores celulares, los receptores folato (RF) son un grupo de moléculas unidas a la membrana celular, los cuales facilitan el transporte del folato al citosol para la síntesis de timina a través de la dihidrofolato reductasa, en donde el receptor se internaliza en la célula por medio de endocitosis y posteriormente se recicla a la membrana celular.

Hoy en día se sabe que estos receptores se encuentran sobre-expresados en una gran cantidad de tejidos cancerosos (100 veces más que en tejidos sanos), como tumores epiteliales, ováricos, cervicales, mamarios, pulmonares, renales, colorrectales y cerebrales, debido al alto requerimiento de folato por parte de estos. Está sobre-expresión de receptores folato y su característica de internalizarse en las células es lo que se aprovecha para hacer tratamientos para el cáncer más específicos y eficientes mediante el uso de vehículos que estén funcionalizados en su superficie con moléculas de folato.

La internalización de NPs en células tumorales mediada por receptores folato se ilustra tal y como se reproduce en la presente invención como Figura 2, en donde (1) nanopartículas, (2) folatos, (3) receptor de folatos, (4) citosol, (5) caveola y (6) membrana celular. El proceso comienza con la unión de la NP-FO a los receptores ubicados en la caveola (a) lo que genera que esta última comience un proceso de invaginación (b) provocando su migración al interior de la célula por la vía de endocitosis (c). Conforme ocurre esta migración, el interior de la caveola comienza a acidificarse hasta alcanzar un pH de 5 aproximadamente, lo que provoca la disociación de la NP-FO con el receptor, liberando la NP-FO al citosol de la célula cancerosa. Una vez que las células cancerosas internalizan las NP, lo agentes citotóxicos pueden ser liberados y ejercer su acción terapéutica. Las NPs dispersas en medio acuoso se administran al paciente vía intravenosa accediendo de esta manera a los diversos tejidos del cuerpo. El proceso descrito en el párrafo anterior ocurre predominantemente en tejidos tumorales debido a que, como ya se mencionó, éstos tienen una sobre-expresión de receptores folato. La obtención de las NPs, abarca 3 etapas:

I. Síntesis de las NPs recubiertas con la capa estérica.

II. Carga del agente antitumoral.

III. Funcionalización de la capa estérica con folato. La etapa en la que se está innovando mediante la presente invención es en la III, la funcionalización de la capa estérica con folato. Como se expuso en la sección de antecedentes de la invención, en todos los trabajos reportados en la literatura científica y de patentes, la funcionalización se logra mediante la utilización de conjugados de folato, en los que el folato se une químicamente a otra molécula que forma parte del vehículo y/o del fármaco. En contraste con todos estos trabajos, en la presente invención la funcionalización no es química sino física, ya que se logra mediante una fuerte asociación entre las moléculas de folato y segmentos hidrófobos del estabilizante estérico, cuya característica es distintiva de la presente invención.

Procedimiento para obtener NPs funcionalizados con el folato

I. Determinar si el estabilizante estérico que se desea emplear en la síntesis de las NPs tiene también la capacidad de asociarse con el folato. Para este fin, aplicar el método de Ramírez et al. como se explica a continuación (el estabilizante estérico debe ser biocompatible y deseablemente biodegradable). Para simular condiciones fisiológicas, las mediciones deben realizarse a 37°C y pH=7.3.

Método de Ramírez et al. (2006): Realizar mediciones de tensión interfacial (g) entre el monómero empleado en la síntesis del polímero (o un líquido de polaridad muy similar) y soluciones acuosas con diferente concentración de estabilizante que vayan desde cero hasta su valor de concentración micelar crítica (CMC). Al graficar estos datos (g vs concentración) se obtiene una curva de decaimiento. Una vez que se llega al valor de la CMC, ya no se añade más estabilizante, sino que ahora se comienzan a añadir cantidades conocidas de folato y en cada adición se mide g; es decir, la relación folato/estabilizante va aumentando pero la concentración de estabilizante se mantiene constante. La concentración total de soluto (estabilizante+folato) se sugiere que llegue hasta alrededor de 10 g/L. Si g continúa disminuyendo o se vuelve aproximadamente constante, entonces el estabilizante no se asocia al folato. Por el contrario, si al añadir folato se incrementa g hasta llegar a un máximo, entonces se puede considerar que el folato y el estabilizante sí se asocian. La relación peso folato/estabilizante en el máximo de la curva “g vs concentración”, es la que se empleará en la funcionalización. II. Sintetizar las NPs por un método conveniente para obtener el tamaño de partícula deseado, por ejemplo, por polimerización en emulsión, emulsificación- evaporación, etc. Emplear como estabilizante el/los agentes tensoactivos no-iónicos cuya capacidad de asociación con folato haya sido verificada mediante las mediciones de tensión interfacial descritas en el punto anterior. Además del tensoactivo, el polímero del cual están hechas las NPs también debe ser biocompatible. Se recomienda que su diámetro promedio sea menor a 100 nm, preferentemente de 50 nm ± 20 nm y deben estar dispersas en medio acuoso. Si se emplea un método de polimerización en heterophase (estrategia “bottom up”) se puede emplear la metodología mostrada en el punto II. De lo contrario, si se emplea un método de obtención de NPs que no implique polimerización (las NPs se forman empleando un polímero pre-sintetizado; estrategia “top down”), la incorporación del agente antitumoral es simultánea o inherente a la formación de las NPs por lo que se omite el punto III y se pasa directamente al punto IV. III. Cargar el agente antitumoral en las NPs. Para este fin, tomar una alícuota del lote de NPs en dispersión acuosa, por ejemplo de 50 ml_. El agente antitumoral (líquido) se introduce a las NPs contenidas en esta alícuota por el método de absorción. Éste consiste en que el agente se mezcla con la dispersión de partículas en una cantidad en exceso tal que asegure la saturación la fase acuosa y de las NPs. Para asegurar esto, debe apreciarse separación de fases en ausencia de agitación. La mezcla se somete a agitación suave para que se emulsione el agente antitumoral en forma de gotas; se deja en agitación durante toda la noche. De esta manera el agente se difunde desde las gotas hasta las partículas de polímero a través de la fase acuosa. Al siguiente día se centrifuga la muestra hasta que se observe una fase oleosa que corresponde al exceso de agente antitumoral. Se separa la fase acuosa que contiene a las NPs hinchadas con el agente.

IV. Someter a esterilización la dispersión acuosa de NPs del punto anterior, por ejemplo, por exposición a luz UV en una campana de flujo laminar equipada con una lámpara UV l = 250nm durante 20min. Para comprobar la esterilización se realiza un cultivo por 48hrs. con agar nutritivo en el que no debe observarse por microscopía óptica formación de bacterias. V. Dividir la dispersión acuosa de NPs esterilizada en dos partes, por ejemplo, una de 40 ml_ y otra de 10 mi. Añadir a una de estas alícuotas (por ejemplo, la de 40 mi), la cantidad óptima de ácido fólico determinada en el estudio de tensión interfacial. Añadir hidróxido de sodio a la otra alícuota en una cantidad igual a la estequiométricamente necesaria para neutralizar la cantidad de ácido fólico presente en la otra alícuota. La adición tanto de ácido fólico como del hidróxido de sodio se realiza en una campana de flujo laminar. Los frascos de estos reactivos deben someterse en todo momento a los procedimientos comunes para evitar su contaminación biológica.

VI. Mezclar ambas alícuotas bajo agitación suave y verificar por dispersión de luz dinámica (DLS) u otra técnica equivalente, que no haya cambiado significativamente el tamaño de las NPs (es normal que se incremente 1 o 2 nm el diámetro debido a la expansión de la capa estérica por la presencia del folato). Medir el potencial zeta de las NPs funcionalizadas y sin funcionalizar (los equipos de DLS suelen tener la opción de esta medición). Se espera que la diferencia de potencial zeta entre ambos tipos de partículas sea ³ ~4 mV.

Vil. Guardar la alícuota de NPs en refrigeración (5°C aproximadamente) sin llegar a la congelación. La presente invención será mejor entendida a partir de los siguientes ejemplos, los cuales se presentan únicamente con fines ilustrativos para permitir la comprensión cabal de las modalidades de la presente invención, sin que ello implique que no existan otras modalidades no ilustradas en la presente solicitud de patente y que puedan llevarse a la práctica con base en la descripción detallada previamente realizada. Se describen los siguientes datos y resultados experimentales, esto con la finalidad de aportar los elementos necesarios para llevar a cabo la invención, mas no son limitativos del alcance de la misma.

Ejemplo

A continuación, a manera de ejemplo de la invención se presentan resultados de la capacidad del poli(alcohol vinílico) (PVA) para asociarse con folato, y su empleo para la obtención de NPs de poli(acetato de vinilo) (PVAc) estabilizadas con PVA funcionalizado con folato, empleando como agente antitumoral eugenol. Los resultados mostrados se tomaron de Olvera Guillén y Rocha Botello [2019], quienes son co-inventores de la presente invención. Se parte de NPs de PVAc sintetizadas por polimerización en emulsión empleando PVA como estabilizante. La metodología esta reportada en Rocha Botello et al., [2019]. Se empleó PVA de 87a 89% de hidrólisis y peso molecular Mw=13,000 a 23,000. El diámetro promedio en número final (d) _n fue de 45 nm ± 5 nm. El contenido de eugenol (relación masa eugenol/polímero, W _e/P ) determinado por un método gravimétrico y por diferencia de tamaño entre partículas hinchadas y no hinchadas con eugenol fue de 1 24±0.1 y 1.23, respectivamente, por lo que en promedio se tiene que I/1 _/P =1.235. Aplicación del método de Ramírez et al.

Como ya se mencionó, la capacidad del estabilizante estérico (PVA en este ejemplo) para asociarse con el folato se evalúa aplicando el método desarrollado por Ramírez et al. [2006] que se basa en mediciones de tensión interfacial (g) entre el monómero (o un líquido de polaridad muy similar) y soluciones acuosas con diferente concentración de soluto. En este caso se empleó acetato de etilo, la molécula saturada análoga al acetato de vinilo (el monómero). De acuerdo con el método de Ramírez et al. [2006], deben realizarse tres series de experimentos, en los que la diferencia es el soluto a emplear: Soluto de la serie 1 : folato de sodio

Soluto de la serie 2: PVA

Soluto de la serie 3: Mezcla PVA/folato

Para las series 1 y 2, se mide y a diferentes concentraciones de folato y PVA, respectivamente. Cuando el soluto tiene propiedades tensoactivas, y disminuye a medida que aumenta su concentración mostrando la curva un cambio muy marcado cuando se alcanza la concentración micelar crítica (CMC), lo que indica formación de agregados de tensoactivo llamados micelas. Cuando el soluto no tiene propiedades tensoactivas, y se mantiene constante al variar la concentración de soluto.

Para la serie 3, inicialmente la fase acuosa debe tener una concentración de PVA igual a su CMC. Posteriormente, se añaden cantidades conocidas de folato de sodio hasta llegar a concentraciones totales de soluto (PVA+folato) de alrededor de 10 g/L.

En la Figura 3 se muestran los resultados de la serie 1 (solo folato de sodio). Se puede observar que y es insensible a la concentración de folato, lo que nos indica que esta especie no se adsorbe en la interfase. Esta molécula es anfífila ya que tiene una parte lipófila y otra hidrófila (dos grupos carboxilato), por lo que se hubiera esperado que se adsorbiera en la interfase. La ausencia de propiedades tensoactivas del folato puede explicarse por su estructura voluminosa y plana que dificulta su adsorción en interfases.

Como se puede observar a partir de la Figura 4 se muestran los resultados de las series 2 y 3 (solo PVA y mezcla PVA/folato). Puede observarse que ^disminuye a medida que aumenta la concentración de PVA (triángulos), como se esperaba, ya que PVA es un conocido tensoactivo polimérico no-iónico. De la gráfica se obtiene que la CMC del PVA es igual 5 g/L a 37°C. La Figura 5a es una representación esquemática de la adsorción de una cadena de PVA en la interfase. Para la mezcla PVA/folato, recordar que inicialmente ya existen 5 g/L de PVA que corresponden a su valor de CMC. Puede observarse que al ir añadiendo folato, g se incrementa hasta llegar a un máximo. La concentración total de soluto (PVA+folato) en este punto es de 6.5 g/L, de los cuales 5 g/L son de PVA y 1.5 g/L son de folato. De acuerdo con Ramírez et al. (2006), este incremento de g es indicativo de la asociación de PVA con el otro soluto, folato en este caso. Esto se debe a que al asociarse el folato con el PVA se generan repulsiones electrostáticas intramoleculares (el folato posee dos aniones carboxilato en su molécula), que a su vez ocasionan que la molécula se extienda más hacia la fase acuosa y que algunos segmentos hidróbobos del PVA que se encontraban adsorbidos en la interfase, se desorban lo que ocasiona el incremento de g (ver Figura 5b).

Funcionalización física de las NPs con folato y caracterización.

Mediante la aplicación del procedimiento explicado anteriormente, se obtienen las NPs cargadas con eugenol y funcionalizadas con folato. Se midió por triplicado el potencial z de estas NPs, obteniéndose -13.7±2.0 mV y -9.4±0.5 mV, para las NPs sometidas al procedimiento de funcionalización física y para las partículas solas, respectivamente, lo que indica una mayor densidad de carga en las primeras confirmando así la presencia del anión folato.

En la Figura 6 se muestran las distribuciones de tamaño de partícula (DTPs) para las NPs solas y para las NPs cargadas con eugenol y funcionalizadas con folato. Como puede observarse, la DTP de éstas últimas esta recorrida hacia tamaños mayores debido al efecto del hinchamiento del polímero con eugenol y a la funcionalización con folato que podría estar expandiendo la capa estérica como consecuencia de repulsiones electrostáticas intramoleculares del PVA funcionalizado. En la Figura 7 se muestra una imagen de microscopía electrónica de barrido de alta resolución (HR-SEM) de las NPs de polímero obtenidas en este ejemplo (debido a que las partículas PVAc son blandas a temperatura ambiente y relativamente pequeñas, se dificulta obtener imágenes más nítidas). Los tamaños observados en esta imagen son consistentes con las distribuciones mostradas en la Figura 6.

Pruebas in vitro.

En las Figuras 8a-8d, se muestran los resultados de los ensayos de muerte celular por apoptosis/necrosis efectuados mediante citometría de flujo empleando un kit de detección específico para este fin de la marca Termofisher. Se emplearon NPs solas (sin eugenol y sin folato), NPs funcionalizadas con folato (sin eugenol), NPs cargadas con Eugenol (sin folato), NPs funcionalizadas con folato y cargadas con eugenol. Se empleó la línea celular MDA-MB-231 , que corresponde a células humanas de cáncer mamario. Como puede observarse en las Figuras 8a y b, la muerte celular se presenta solo en los experimentos realizados con las mayores concentraciones de NPs y en porcentaje poco significativo. Esto implica que el vehículo no es significativamente citotóxico en el intervalo de concentración de NPs estudiado, y que la muerte celular observada en las Figuras 8c y 8d, es atribuible a la presencia del agente tumoral. Al comparar estas dos últimas figuras, puede observarse que para concentraciones ³1 mg/mL de NPs, se presenta una mucho mayor muerte celular con las NPs cargadas con eugenol y funcionalizadas con folato (Figura 8d) que en ausencia de esta funcionalización (Figura 8c). Esta diferencia nos indica que el folato incrementa la efectividad de las NPs cargadas con el agente antitumoral, lo que confirma también que el procedimiento de funcionalización física que se reclama en esta patente es exitoso induciendo el proceso de endocitosis mediado por receptor que da lugar a la muerte celular principalmente por la vía apoptótica inclusive a las concentraciones más elevadas de NPs. Aun cuando en la anterior descripción se ha hecho referencia a ciertas modalidades del proceso de obtención de nanopartículas de polímero estabilizadas para la liberación de fármaco de la presente invención, debe hacerse hincapié en que son posibles numerosas modificaciones a dichas modalidades, pero sin apartarse del verdadero alcance de la invención, de tal modo que las características de la presente invención descritas en las modalidades, mostradas en las figuras y reclamadas en las reivindicaciones, pueden ser usadas individualmente o en cualquier combinación arbitraria para la realización de dicha presente invención, así como de diferentes modalidades que no hayan sido aquí descritas. Por consiguiente, debe entenderse que las modalidades de la presente invención son únicamente ilustrativas y no pretenden limitar el alcance de la misma, excepto por lo establecido tanto en el estado de la técnica como en las reivindicaciones anexas.