Peotides capables d'inhiber les interactions entre des antigènes et les lymphocytes T4. produits σui en sont dérivés et leurs applications 'invention concerne des peptides dérivés des antigènes de HLA de classe II, de l'antigène T4 et de protéines HIV capables d'inhiber les coopérations cellu¬ laires entre les macrophages, les lymphocytes et les lymphocytes B.

L' invention concerne en particulier des peptides ayant la capacité d'inhiber l'interaction du virus tenu, pour responsable du SIDA (syndrome d'i unodéficience acquise) avec les récepteurs T4 portés par les lymphocytes T4 et, plus généralement d'exercer un effet immunomodulateur à 1'égard des interactions entre les macrophages et les lymphocytes T auxiliaires, d'une part, et ces derniers et les lymphocytes B, d'autre part, dès lors que ces interactions sont normalement médiées par des récepteurs lymphocytaires codés par des complexes majeurs d'autohistocompatibilité de classe II (antigènes HLA de classe II chez l'homme). En d'autres termes, l'invention concerne plus particulièrement des peptides capables de moduler les réponses cellulaires mettant plus particulièrement en jeu des antigènes susceptibles 'induire des réponses immunitaires normalement médiées par des antigènes HLA de classe II, par exemple du type HLA DR.

Certains virus lymphotropes interfèrent avec ces réponses cellulaires, en particulier des virus tenus pour responsables du SIDA. De tels virus ont été isolés par plusieurs équi¬ pes. Ils ont été désignés sous des abréviations diverses : LAV, HTLV-III, ARV2, etc.. Ces virus, dénommés ci-après sous l'abréviation la plus générale HIV (anciennement LAV/HTLV III), possèdent en effet un tropisme spécifique

FEUILLE DE R

pour les lymphocytes T4. L'accès du virus aux lymphocytes T4 peut cependant être bloqué jjj vitro, lorsque ces derniers ont au préalable été incubés en présence d'anticorps onoclonaux (par exemple ceux commercialisés par la firme ORTHO sous la désignation 0KT4) qui bloquent les récepteurs T4 de ces lymphocytes. C'est par référence à la capacité de ces anticorps monoclonaux de bloquer ces sites T4, qu'il sera fait plus particulièrement référence dans ce qui suit, à l'affinité des virus LAV pour les récepteurs T4 des lymphocytes T4.

Les antigènes mettant en jeu des antigènes induc¬ teurs de réponses immunitaires relevant des antigènes HLA de classe II ne sont évidemment pas limités à ceux pré¬ sents dans des virus HIV. On mentionnera, à titre d'exemple de ces autres antigènes les virus de la grippe (influenza), d'Epstein-Barr, des rhinovirus, etc..

L'invention concerne également diverses applica¬ tions de ces peptides et des produits qui.peuvent en être dérivés. Par "produits dérivés de ces peptides", on entend des produits reconnus immunologiquement par des anticorps qui reconnaissent également ces peptides ou, encore, des produits susceptibles d'exercer sensiblement les mêmes e fets au niveau des susdites médiations cellulaires.

A titre d'exemples d'applications de ces peptides, on peut mentionner le diagnostic, voire le traitement ou la prévention des maladies contrôlées par les interactions entre les molécules HLA de classe II et l'antigène T4, parmi lesquelles les maladies induites par HIV.

D'autres applications de ces peptides peuvent s'adresser à la détection de ceux des antigènes qui sont susceptibles d'induire des réactions immunitaires relevant de. certaines catégories d'antigènes HLA de classe II, par exemple de HLA-DR.

D'autres applications de ces peptides s'adressent, en variante, et lorsque le type d'antigène HLA susceptible

FEUILLE ^Ù E R

de édier les réactions immunitaires induites par un anti¬ gène déterminé, à leur utilisation dans des tests visant à étudier ia vitro l'effet immunomodulateur de_sub_rtances à 1'étude.

L'invention découle de l'hypothèse initiale faite par les inventeurs que 1'infection des lymphocytes T4 par les virus LAV et le pouvoir pathogène de ces derniers tenaient à leur capacité d'interférer avec des séquences peptidiques concernées appartenant aux antigènes régulant les capacités de reconnaissance par ces lymphocytes de cellules porteuses de ces antigènes viraux, lorsque ceux- ci leur sont présentés par les macrophages, par l'inter¬ médiaire des récepteurs lymphocytaires appropriés. Parmi ces antigènes, on mentionnera plus particulièrement ceux qui sont constitués par des complexes majeurs d'auto-histocompatibilité, connus sous l'expression anglaise "self major histocompatibility complexes" et l'abréviation correspondante MHC, qui sera souvent utilisée dans ce qui suit. Les antigènes codés par le MHC sont appelés HLA chez l'homme.

Les fonctions des divers types de lymphocytes T4 ou T8 impliquent des interactions avec les molécules co¬ dées par le système MHC de classe II pour les T4 et de classe I pour les T8.

Leurs interactions respectives paraissent médiées par des molécules auxiliaires, parmi lesquelles des anti¬ gènes de différentiation T-cellulaires (notamment anti¬ gènes T4 et T8) et des molécules qui ont été décrites comme facteurs potentiels d'adhésion aux cellules. Pour plus de détails, on peut se reporter aux publications de (11), (12) et (13) identifiées à la fin de la présente description.

Les recherches qui ont abouti à la présente inven¬ tion ont été fondées sur la recherche de séquences pepti¬ diques qui pourraient être tenues pour responsables des

FE _U ILL _E D£ REMPLACEME

capacités d'adhésion mutuelle, d'une part, des lymphocytes T4 et, d'autre part, soit des antigènes MHC de classe II qui— sont____susceptibles de les reconnaître, soit des virus LAV, dont on présuppose qu'ils pourraient "mimer" l'action desdits antigènes vis-à-vis desdits lymphocytes.

Ces hypothèses ayant été posées, les inventeurs ont mis en évidence 1'existence de séquences peptidiques communes aux chaînes α de nombreux antigènes MHC de classe I, aux chaînes 0 des antigènes de classe II et à une protéine codable par l'une des régions de lecture ouverte que 1'on retrouve dans les génomes des différentes espèces de souches LAV qui ont été isolées. La mise en évidence de cette séquence commune, consistant en une séquence tétrapeptidique Arg-Phe-Asp-ser est d'autant plus- re¬ marquable qu'elle se trouve dans la seule région d'homo- logie connue à ce jour dans nombres des antigènes des classes I et II dont les séquences polypeptidiques partielles ou totales ont été analysées (18) et (19).

Dans ce qui suit, on fera souvent appel à la no¬ menclature officielle relative aux désignations des aminoacides naturels par une lettre unique, nomenclature que l'on rappelle ci-dessous.

M éthionine

L leucine

I isoleucine

V valine

F phénylalanine

S serine

P ^" proline

T thréonine

A alanine

Y tyrosine

H histidine

Q glutamine

N asparagine

FEUILLE DE. REMPLACEM

K lysine

D acide aspartique

E acide glutaminique

C cystéine tryptophane

R arginine

G glycine

En conséquence la séquence tétrapeptidique Arg- Phe-Asp-Ser est désignée dans la nomenclature susdite par RFDS.

Les séquences tétrapeptidiques codables par le génome de LAV sont corrélables à une phase de lecture ouverte présente dans la partie d'extrémité 3' qui che¬ vauche la "région de répétition longue" (de l'anglais "long terminal repeat") dans la région 03 du génome (20). Il a déjà été suggéré que parmi les protéines codées par la phase de lecture ouverte de la région d'extrémité 3', il pouvait y en avoir une qui, soit consisterait en un régulateur de transcription (21), soit interviendrait dans la cytotoxicité à l'égard des cellules T (20). En parti¬ culier une protéine F (p27) a été mise en évidence par Allan et al dans Science, 15 novembre 1985, 230. p. 813. Cette protéine F contient la séquence RFDS.

Plus particulièrement encore, on observe un dipep¬ tide commun EL situé dans la même région d'homologie dans de nombreux antigènes de classe II et dans la séquence peptidique codable concernée des virus LAV, et à la même distance (9 résidus a inoacide les séparent) de la séquence tétrapeptidique précédente du côté de l'extrémité C-terminale de celle-ci, tant dans les antigènes de classe II que dans lesdites séquences codables du génome de LAV. Ce dipeptide est inexistant dans les régions d'homologie correspondantes des antigènes de classe I.

De même, on observe fréquemment, du côté de 1'extrémité N-terminale du tétrapeptide une séquence

FEUILLE D REMPLA

dipeptidique (RE) commune entre la susdite région d'homologie des antigènes de classe II et le polypeptide codable correspondant du génome des virus LAV, si ce n'est que dans la susdite région d'homologie, cette séquence dipeptidique est séparée de la séquence RFDS par 3 résidus a inoacide et dans le polypeptide codable du virus par 4 résidus aminoacide. Une séquence dipeptidique SL est également présente. Elle est séparée de RFDS par 13 acides aminés. Cette séquence pourrait jouer un r le dans la fixation du virus HIV ou de la protéine F sur la protéine T4.

Les résultats des observations qui ont été faites résultent du tableau ci-après dans lequel ont été rappor¬ tées les parties des séquences peptidiques en cause, con¬ tenues dans les polypeptides initialement étudiés ou sé¬ quences et appartenant aux antigènes des classes I et II décrites dans les publications (19), (26), (27), (28), (29), (30) et (31) ou codables par des régions de lecture ouverte des ADNs correspondants de différents types de virus LAV (20), (21), (22) et (23) dans lesquelles les

:TABLEAU

séquences peptidiques communes ont été amenés en regard mutuel.

Dans la partie gauche du tableau sont indiqués les antigènes dont les séquences peptidiques montrées sont re- diquées. Les séquences peptidiques communes sont enca¬ drées.

Ces observations sont à la base de l'invention, laquelle a, à son tour, confirmé la validité des hypo¬ thèses initialement posées. La synthèse de peptides con¬ tenant de telles séquences a confirmé la validité de l'hy¬ pothèse initialement faite. Des peptides contenant la sé¬ quence RFDS se sont révélés capables d'adhérer aux lym¬ phocytes T4 et à prévenir l'adhésion du virus LAV sur les lymphocytes ainsi modifiés. Ces peptides se sont ainsi ré¬ vélés comme constituant l'un des déterminants intervenant dans la reconnaissance mutuelle des lymphocytes et soit des susdits antigènes, soit des virus LAV, d'où l'expres¬ sion "peptide adhésiotope" qui sera utilisée dans ce qui suit.

A 1'instar de ce qui a été observé dans d'autres systèmes qui ont été décrits, par exemple celui qui a conduit à la détermination du site de reconnaissance de nombreuses cellules eucaryotes par la fibronectine (1) , (2) et (3) (site qui s'est trouvé être localisé dans une séquence RGDS), on a constaté que dans le cas de l'inven¬ tion, le peptide RFDS pouvait être remplacé par un peptide ayant une séquence inversée ("forme miroir"), c'est-à-dire le peptide SDFR.

Dans la mesure où le site RFDS est porté par le virus LAV ou par les antigènes MHC spécifiques des lympho¬ cytes T4 (ou d'autres lymphocytes, tels que les lymphocy¬ tes T8), il en découlait aussi la possibilité que les mo¬ lécules T4 des lymphocytes eux-mêmes devaient comporter des séquences peptidiques définissant les sites suscepti¬ bles d'intervenir dans la reconnaissance mutuelle susdite.

FEUILLE DE REMPLACEME

L'invention devait ainsi permettre de reconnaître que cette séquence devait normalement être formée par l'un des peptides RADS ou SDAR, en raison de leur configuration spatiale et des charges portées par certains de leurs résidus aminoacide (charges complémentaires de celles des résidus chargés de RFDS ou SDFR) .

Les conditions qui précèdent peuvent être illus¬ trées par le schéma suivant :

MHC R F D S >

+

+ < S D A R T4

L'invention concerne donc plus particulièrement tout peptide contenant au moins une séquence tétrapepti¬ dique choisie parmi RFDS, SDFR, RADS qui constitue un site présent dans la molécule T, ou SDAR, ce peptide présentant une configuration telle que la séquence tétrapeptidique soit exposée dans des conditions lui permettant d'inter¬ agir avec un récepteur cellulaire, tenu de conserver ses propriétés d'adhésiotope.

A cet égard on remarquera que la glycoprotéine d'enveloppe des .LAV contient également une séquence té¬ trapeptidique SDAR (dans ARV 2) ou SDAK (dans LAV, LV, HTLV III) .

D'une façon générale, les peptides selon l'in¬ vention peuvent être choisis parmi ceux qui sont repré¬ sentés par les formules générales :

X R F D S Z (I)

X S D F R Z (II)

X S D A Z (III)

X R A D S Z (IV)

X S D A K Z (V) dans lesquelles X est un atome d'hydrogène ou un groupe peptidique avec une extrémité N-terminale et Z est un groupe OH ou un peptide ayant une extrémité C-terminale,

ces peptides X et Z ne contrevenant pas, lorsqu'ils sont eux-mêmes constitués par des séquences peptidiques, à la nécessité rappelée plus haut d'autoriser l'exposition de la séquence tétrapeptidique.

Des peptides préférés selon l'invention sont cons¬ titués par les tétrapeptides eux-mêmes. Des peptides plus actifs sont ceux qui contiennent dans une même structure l'un des tétrapeptides sus-indiqués. Des peptides intermé¬ diaires préférés sont ceux qui sont constitués par des acides aminés n'influençant pas la morphologie d'ensemble du peptide total, par exemple une chaîne comprenant de 2 à 10 résidus alanine.

D'une façon générale, le choix des groupes pepti¬ diques pouvant être associés aux séquences tétrapeptidi- ques selon l'invention (où dont l'utilisation devrait être évitée) peut être guidé par l'utilisation de programmes permettant la modélisation des configurations des polypep- tides susceptibles d'être obtenus au terme de l'assemblage de séries prédéterminées d'aminoacides. De tels programmes ont notamment été décrits par (14), (15) et (16).

D'autres peptides préférés conformes à 1'invention sont ceux qui peuvent être représentés par les formules suivantes (dans lesquelles chaque tiret "-" représente un résidu d'aminoacide) :

X R F D S EL Z (VI)

X RE R F D S Z (VII)

X RE R D S EL Z (VIII) dans lesquelles X et Z ont les significations sus-indi- quées.

Des peptides particulièrement préférés contiennent des séquences polypeptidiques choisies parmi :

REVLEWRFDSRLAFHHVAREL (I )

REVLEWRFDSKLAFHHVAREL (X)

REVLEWRFDSKLAFHHMAREL (XI) respectivement issues des séquences codables contenues

dans les génomes de LAV1a, HTLV III, ARV2 et LV rappelées dans le tableau. Les éléments de séquence soulignés cor¬ respondent aux séquences davantage spécifiques qui ont été définies plus haut.

D'une façon générale, le nombre total de résidus d'acides aminés contenus dans les séquences peptidiques selon l'invention n'est pas déterminant. Il sera essen¬ tiellement limité par des raisons d'ordre pratique, pour ce qui est de la synthèse chimique. Normalement le nombre total d'acides aminés ne dépassera pas 50. Avantageuse¬ ment, il est inférieur à 30, voire même à 20.

La capacité des peptides adhésiotopes selon 1'in¬ vention d'inhiber 1'adhésion d'un virus LAV à des lympho¬ cytes T4 peut être appréciée, notamment par la diminution, voire la suppression de la fixation du LAV au récepteur e branaire des lymphocytes T4 après que, soit les lympho¬ cytes (dans le cas de peptides contenant RFDS ou SDFR), soit les virus (dans le cas des peptides contenant SDAR ou RADS) aient été préincubés avec ces peptides.

A cet effet on peut utiliser le virus LAV marqué, par exemple couplé à la fluorescéine isothiocyanate (LAV FITC) . La propriété adhésiotope du peptide étudié s'apprécie alors par la réduction ou même la disparition totale de lymphocytes retenant le virus marqué, après séparation éventuelle de 1'excédent de virus marqué non fixé sur les lymphocytes.

On peut naturellement avoir recours à toute autre méthode appropriée pour la mesure du pouvoir adhésiotope des peptides à 1'étude.

Il va naturellement de soi que certains des amino¬ acides, dans les structures envisagées peuvent être rem¬ placées par d'autres. Eventuellement dans la séquence RFDS, le résidu F peut être remplacé par un résidu Y. D'une façon générale, on peut avoir recours à toute subs¬ titution d'aminoacide par un autre aminoacide isostérique.

Les peptides selon 1'invention sont utilisables comme réactifs, par exemple pour détecter dans un fluide biologique, tel que le sérum d'un malade, des anticorps dirigés contre les protéines du virus HIV dirigés contre la région de la protéine contenant la séquence RFDS ou contre la région contenant la séquence SDAR (ou SDAK) de 1'enveloppe du virus.

L'invention concerne plus particulièrement ces peptides en tant qu'ils peuvent être utilisés pour la fa¬ brication d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux suscep¬ tibles de les reconnaître spécifiquement. Ces peptides peuvent être modifiés par l'homme du métier pour qu'ils puissent se fixer sur le site de fixation du LAV sur des cellules T4 sans interférer avec l'activité de la protéine T4 avec le système HLA. Ces peptides ^• peuvent être utilisés dans des kits de diagnostic pour la recherche d'anticorps anti-HIV dans le sérum des malades. Ils peuvent aussi être utilisés pour la détection de protéines virales dans le sérum des malades et aussi à des fins thérapeutiques par administration à des malades dans le but d'empêcher la dissémination de l'infection à de nouvelles cellules ou à des personnes non encore atteintes et ce à des fins préventives, pour empêcher 1'infection.

L'invention concerne encore les régions intermé¬ diaires entre les sites RFDS et EL, d'une part, et RE, d'autre part, dans les génomes des différentes formes de virus LAV qui ont été isolés.

Ces régions sont caractérisées par un grand degré de conservation. Il s'agit plus particulièrement des ré¬ gions

VLE

RLAFHHVAR

KLAFHHVAR

RLAFHHMAR.

L'invention concerne aussi l'application de ces

derniers types de peptides, aux mêmes fins que celles qui ont été indiquées pour les précédents peptides. Ils peu¬ vent le cas échéant être utilisés directement pour sa fa¬ brication d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux, ceux-ci étant alors aptes à se fixer sur les protéines T4, iβ vitro ou in vivo sans interférer avec 1'activité de la protéine T4 avec le système HLA.

L'invention concerne encore les compositions immu- nogènes qui peuvent être préparées en mettant en jeu les peptides selon l'invention, le cas échéant amenés sous les formes appropriées à la manifestation in vivo de cette i munogénicité, d'une part, et la production d'anticorps-, de préférence monoclonaux, plus spécifiquement dirigés vers les sites spécifiques de ces peptides. Par "sites spécifiques", on entend plus particulièrement ceux qui ont été indiqués dans ce qui précède, en l'occurrence tant les sites RFDS, SDFR, SDAR, RADS, EL ou, d'ailleurs également, LE, RE ou ER (EL et ER faisant également partie de l'in¬ vention) , que les sites intermédiaires entre ces groupes peptidiques et plus spécifiquement les peptides intermé¬ diaires entre RFDS et EL, d'une part, RFDS et RE, d'autre part, dans les génomes des virus LAV concernés.

Il a de plus été constaté que la séquence RFDS constitue apparemment le site de reconnaissance utilisable par d'autres types de virus à l'égard des cellules qu'ils sont capables d'infecter. Tel est par exemple le cas du rhinovirus HRV14, dont la protéine VP1 contient également la séquence RFDS. La même généralisation peut se faire au niveau d'autres virus, par exemple le virus d'Epstein- Barr, dont une glycoprotéine contient 1'adhésiotope RADS.

D'autres peptides préférés selon l'invention sont caractérisés par la formule suivante :

X iZRFDSD Z. (XII) dans laquelle _£ et Z. ont les significations sus-indiquées et 2. est A, V ou L, ces peptides comportant de 6 à 20,

voire 30 résidus aminoacyle.

Des hexapeptides préférés appartenant à cette ca¬ tégorie de peptides présentent la formule :

H ₂ N-VRFDSD-OH (XIIIT ou la formule H Ji LRFDSD OH (XIV)

Un heptapeptide préféré appartenant à cette caté¬ gorie présente la formule :

H ₂ N-LRFDSDL-OH (XV)

(ci-après encore désignée par la formule LRFDSDL ou par 1'abréviation "DR-7") .

A cet heptapeptide correspond une séquence conte¬ nue dans le domaine β1 de molécules HLA-DR de classe 2.

D'autres peptides préférés conformes à l'invention sont caractérisés par la formule :

X EEMRFDSDVGE Z. (XVI) dans laquelle : et ont les significations sus-indiquées, fî est choisi parmi Y, S, D, F ou N, plus particu¬ lièrement Y ou D, et est choisi parmi A, V, L et avec F pouvant éventuellement être remplacé par Y.

Des peptides préférés appartenant à cette catégo¬ rie de peptides sont constitués par des dodecapeptides de formule : ^N-EE RFDSDVGE-OH (XVII) et plus particulièrement :

H ₂ -EEYDRFDSDVGE-OH (XVIII)

(ou encore désigné ci-après par la formule EEYDRFDSDVGE ou par la désignation "DR12"). D'une façon générale, l'invention concerne tout peptide du même type susceptible d'avoir une séquence essentiellement semblable, telle que susceptible d'être présente dans d'autres molécules HLA DR non identifiées dans le tableau présenté à la fin de cette description. Parmi ces peptides on mentionnera encore plus

particulièrement ceux de formule :

X EEBJRFDSDVGEDJRAVTEL Y (XIX) dans laquelle X et Y ont les significations sus-indiquées et II est Y, F ou H.

Dans tous les peptides qui viennent d'être iden¬ tifiés, il sera naturellement remarqué que les groupes X et Y (dès lors qu'ils sont différents de H N- et -OH respectivement) doivent être tels qu'ils ne modifient pas les qualités adhésiotopes de la séquence RFDS (ou RYDS) elle-même.

Comme précédemment évoqué, les peptides sus- indiqués peuvent être remplacés par ceux qui leur corres¬ pondent et dans les antigènes T4 des lymphocytes auxi¬ liaires, les séquences étant présumées intervenir dans la reconnaissance mutuelle des HLA-DR et des lymphocytes T4. A titre 'exemple de tels peptides, on mentionnera celui de formule :

DRADSKL (XX)

(ci-après désigné par "T4-7"). Ces séquences contenues dans les antigènes T4 sont celles qui sont présumées (ce qui a d'ailleurs été vérifié) intervenir dans les réac¬ tions de reconnaissance mutuelle des antigènes HLA (en l'occurrence des molécules HLA-DR dans l'exemple considéré) et des lymphocytes T4. A titre d'exemples de tels peptides, on mentionnera :

- celui de formule :

DRADSKL (XX)

(ci-après désigné par l'abréviation "T4-7"), ce peptide correspondant au peptide "DR-7" susdit, ou

- celui de formule :

KLNDRADSRRSL ( XI)

(ci-après désigné par l'abréviation "T4-12"), ce dernier peptide correspondant alors au peptide "DR-12"..

L'invention concerne donc également, et de façon plus générale, des peptides contenant la séquence RADS et,

CEMENT

entourant celle-ci, des séquences peptidiques n'interfé¬ rant pas avec la capacité de la séquence RADS à être re¬ connue par des molécules HLA humaines, plus particuliè¬ rement HLA-DR.

L'invention concerne encore plus particulièrement parmi les peptides précédents ceux qui sont capables d'exercer l'effet immunomodulateur dont il a été question dans le préambule de cette description, plus particuliè¬ rement à 1'égard ds antigènes généralement susceptibles d'induire in vivo des réponses immunitaires médiées par des antigènes HLA de classe II, notamment HLA-DR.

A cet égard, il a été constaté que des peptides conformes à l'invention, notamment les peptides de for¬ mules XIII, XIV, XVIII, XX et XXI, étaient capables, comme les anticorps monoclonaux spécifiques des molécules HLA-DR et T4, respectivement, d'inhiber in vitro les interactions entre les macrophages et les lymphocytes auxiliaires (lym¬ phocytes T4) , d'une part, et entre les lymphocytes T4 et les lymphocytes B, d'autre part. Les propriétés inhibi- trices de ces peptides ont été mises en évidence soit individuellement, soit dans des essais de synergie d'inhibition réalisés in vitro dans un système expérimental tout à fait analogue à celui décrit par A. FISHER et al, Eur. J. I unol. (1986), ±£ : 1111-1116, visant à étudier les réponses i munes in vitro de ces lymphocytes à l'égard du même virus de la grippe, si ce n'est que ces essais ont été réalisés avec des doses sub-inhibitrices de peptides complémentaires 1'un de l'autre (EEYVRFDSDVGE et KLNDRADSRRSL) , en lieu et place des doses sub-inhibitrices d'anticorps anti-HLA-DR et anti-T4 respectivement qui avaient été mises en oeuvre dans ces essais de synergie d'inhibition par FISHER et al.

On rappellera en effet que, dans ce système, l'in¬ cubation in vitro. d'une part, de lymphocytes T auxiliaires avec un anticorps anti-T4 en concentration infra inhibitrice, et, d'autre part, de lymphocytes B avec

un anticorps anti-HLA-DR en concentration infra-inhibi- trice, provoque une inhibition puissante de la production d'anticorps.

Il a ainsi été mis en évidence que le peptide EEYVRFDSDVGE (DR-12) analogue de molécules HLA de classe II DR (strictement des molécules murines IA. ) inhibe de façon très significative et reproductible la prolifération spécifique du virus influenza des lymphocytes T ainsi que la production d'anticorps contre ce virus à des concentra¬ tions de l'ordre de 10 micro-molaires. Cette inhibition est faible sous l'effet du peptide RFDS seul. Des ré¬ sultats intermédiaires sont obtenus avec des peptides contenant la séquence RFDS entourée d'acides aminés, de ceux qui, dans les molécules HLA de classe II, entourent la séquence RFDS. C'est ce que 1'on a notamment observé avec le peptide "DR-7".

Un peptide de 12 acides aminés contenant la sé¬ quence RADS, en particulier le peptide KLNDRADSRRSL a une activité inhibitrice modérée mais significative.

L'effet inhibiteur de ces peptides, analogues de la molécule HLA de classe II se sont révélés tout à fait parallèles à ceux que 1'on peut obtenir à 1'aide d'anti¬ corps monoclonaux dirigés contre la molécule T4. Ainsi un clone de lymphocytes T spécifique du virus influenza dont la prolifération induite par 1'antigène est résistante à 1'inhibition par des anticorps-anti T4 est également ré¬ sistante à 1'inhibition par les susdits peptides analo¬ gues, alors que l'effet auxiliaire (activation des lym¬ phocytes B) de ce même clone est sensible aussi bien aux anticorps anti T4 qu'à ces peptides, analogues de DR.

Un argument supplémentaire en faveur d'une inter¬ action réelle entre RFDS et RADS résulte d'expériences démontrant une synergie d'inhibition par ces peptides des interactions cellulaires.

On observe, dans les conditions expérimentales

décrites par FISHER et al, une inhibition importante de la prolifération ou de la production d'anticorps spécifiques du virus influenza, lorsque des lymphocytes T, après avoir été pré-incubés avec des concentrations infra-inhibitrices du EEYVRFDSDVGE, ont été mis en contact, soit avec des monocytes, soit avec des lymphocytes B, qui avaient égale¬ ment été pré-incubés avec des concentrations infra-inhibi¬ trices du peptide analogue de T4 KLNDRADSRRSL. L'effet de synergie ainsi observé n'est pas obtenu en utilisant d'autres peptides ou éventuellement d'autres anticorps sans rapport avec les molécules T4 et classe II.

La validité de ces résultats est confirmée par le fait que les peptides utilisés n'ont pas d'effet cyto- toxique sur les cellules employées. Ils n'inhibent pas des tests fonctionnels des lymphocytes T n'impliquant pas les molécules HLA de classe II. D'autre part, en pré-incubant les peptides avec des anticorps anti-peptides spécifiques, on peut bloquer l'effet inhibiteur diî au peptide.

Cependant, les séquences adjacentes à la structure préservée RFDS, mais qui varient entre molécules HLA DR, DQ et DP, pourraient avoir un rdle dans l'établissement d'une structure tertiaire indispensable à 1'interaction avec les molécules T4. En effet les peptides analogues de HLA DR n'ont pas d'effet inhibiteur.

Les peptides selon 1'invention peuvent être prépa¬ rés par les techniques classiques, dans le domaine de la synthèse des peptides. Cette synthèse peut être réalisée en solution homogène ou en phase solide.

Par exemple on aura recours à la technique de syn¬ thèse en solution homogène décrite par HOUBEN EYL dans l'ouvrage intitulé "Méthode der Organischen Che ie" (Mé¬ thode de la chimie organique) édité par E. WUNSCH, vol. 15-1 et II. THIEME, Stuttgart 1974.

Cette méthode de synthèse consiste à condenser successivement deux à deux les aminoacyles successifs dans

l'ordre requis, ou à condenser des aminoacyles et des fragments préalablement formés et contenant déjà plusieurs résidus aminoacyles dans l'ordre approprié, ou encore plu¬ sieurs fragments préalablement ainsi préparés, étant en¬ tendu que l'on aura eu soin de protéger au préalable tou¬ tes les fonctions réactives portées par ces aminoacyles ou fragments, à 1'exception des fonctions aminé de 1'un et carboxyle de l'autre ou vice versa, qui doivent normale¬ ment intervenir dans la formation des liaisons peptidi¬ ques, notamment après activation de la fonction carboxyle, selon les méthodes bien connues dans la synthèse des pep¬ tides. En variante, on pourra avoir recours à des réac¬ tions de couplage mettant en jeu des réactifs de couplage classique, du type carbodiimide, tels que par exemple la 1-éthyl-3-(3-diméthyl-aminoρropyl)-carbodiimide. Lorque l'aminoacyle mis en oeuvre possède une fonction acide supplémentaire (notamment dans le cas de l'acide gluta- ique) , ces fonctions seront par exemple protégées par des groupes ^' t-butylester.

Dans le cas de la synthèse progressive, acide aminé par acide aminé, la synthèse débute de préférence par la condensation de 1'aminoacide C-terminal avec 1'ami¬ noacide qui correspond à 1'aminoacyle voisin dans la séquence désirée et ainsi de suite, de proche en proche, jusqu'à l'acide aminé N-terminal. Selon une autre tech¬ nique préférée de l'invention, on a recours à celle décrite par R.D. MERRIFIELD dans l'article intitulé "Solid phase peptide synthesis" (J. Am. Chem. Soc, 45, 2149- 2154) .

Pour fabriquer une chaîne peptidique selon le pro¬ cédé de MERRIFIELD, on a recours à une résine polymère très poreuse, sur laquelle on fixe le premier aminoacide C-terminal de la chaîne. Cet aminoacide est fixé sur la résine par l'intermédiaire de son groupe carboxylique et sa fonction aminé est protégée, par exemple par le groupe

t-butyloxycarbonyle.

Lorsque le premier aminoacide C-terminal est ainsi fixé sur la résine, on enlève le groupe protecteur de la fonction aminé en lavant la résine avec un acide.

Dans le cas où le groupe protecteur de la fonction aminé est le groupe t-butyloxycarbonyle, il peut être éli¬ miné par traitement de la résine à l'Aide d'acide trifluo- roacétique.

On couple ensuite le deuxième aminoacide qui four¬ nit le second aminoacyle de la séquence recherchée, à par¬ tir du résidu aminoacyle C-terminal sur la fonction aminé déprotégée du premier aminoacide C-terminal fixé sur la chaîne. De préférence, la fonction carboxyle de ce deu¬ xième aminoacide est activée, par exemple par la dicyclo- hexyIcarbodiimide, et la fonction a iné est protégée, par exemple par le t-butyloxycarbonyle.

On obtient ainsi la première partie de la chaîne peptidique recherchée, qui comporte deux aminoacides, et dont la fonction aminé terminale est protégée. Comme pré¬ cédemment, on déprotège la fonction aminé et on peut ensuite procéder à la fixation du troisième aminoacyle, dans les conditions analogues à celles de l'addition du deuxième aminoacide C-terminal.

On fixe ainsi, les uns après les autres, les acides aminés qui vont constituer la chaîne peptidique sur le groupe aminé chaque fois déprotégé au préalable de la portion de la chaîne peptidique déjà formée, et qui est rattachée à la résine.

Lorsque la totalité de la chaîne peptidique dési¬ rée est formée, on élimine les groupes protecteurs des différents aminoacides constituant la chaîne peptidique et on détache le peptide de la résine par exemple à l'aide 'acide fluorhydrique.

L'invention concerne également les oligomères hy- drosolubles des peptides monomères sus-indiqués. L'oligo¬ merisation peut provoquer un accroissement de 1'immunogé- nicité des peptides monomères selon l'invention. Sans qu'une telle indication chiffrée puisse être considérée comme limitative, on mentionnera néanmoins que ces oligo¬ mères peuvent éventuellement contenir de 2 à 25 unités monomères.

Elle concerne plus particulièrement ceux des oli¬ gomères dans lesquels les motifs adhésiotopes sont reliés les uns aux autres par des chaînons peptidiques intermé¬ diaires n'interférant pas avec leurs possibilités d'expo¬ sition. Ces chaînons sont par exemple constitués par des dipeptides Ala-Ala.

On peut avoir recours, pour réaliser l'oligomeri¬ sation, à toute technique de polymérisation couramment utilisée dans le domaine des peptides, cette polymérisa¬ tion étant conduite jusqu'à l'obtention d'un oligomère ou polymère ontenant le nombre de motifs monomères requis pour l'acquisition de 1'immunogénicité désirée.

Une méthode préférée de 1.'oligomerisation ou de polymérisation du monomère consiste dans la réaction de celui-ci avec un agent de réticulation, tel que le gluta- raldéhyde.

On peut également avoir recours à d'autres méthodes d'oligomerisation ou de couplage, par exemple à celle mettant en jeu des couplages successifs d'unités monomères, par 1'intermédiaire de leurs fonctions termi¬ nales carboxyle et a iné en présence d'agents de couplage ho o- ou hétéro- bifonctionnels.

On peut également, pour la production de molécules comportant un ou plusieurs motifs nonapeptidiques tels que définis ci-dessus, avoir recours à des techniques du génie génétique mettant en oeuvre des micro-organismes transfor¬ més par un acide nucléique déterminé comprenant des

T

séquences nucléotidiques appropriées correspondantes.

L'invention concerne encore les conjugués obtenus par couplage covalent des peptides selon l'invention (ou des susdits oligomères) à des molécules porteuses (natu¬ relles ou synthétiques) physiologiquement acceptables et non toxiques, par l'intermédiaire de groupements réactifs complémentaires respectivement portés par la molécule por¬ teuse et le peptide. Des exemples de groupements appro¬ priés sont illustrés dans ce qui suit :

A titre d'exemples de molécules porteuses ou sup¬ ports macromoléculaires entrant dans la constitution des conjugués selon l'invention, on mentionnera des protéines naturelles, telles que l'anatoxine tétanique, l'ovalbu- mine, des sérums albumines, des hémocyanines, etc..

A titre de supports macromoléculaires synthéti¬ ques, on mentionnera par exemple des polylysines ou des poly(D-L-alanin )-poly(L-lysine) .

La littérature mentionne d'autres types de sup¬ ports macromoléculaires susceptibles d'être utilisés, lesquels présentent en général un poids moléculaire su¬ périeur à 20.000.

Pour synthétiser les conjugués selon l'invention, on peut avoir recours à des procédés connus en soi, tels que celui décrit par FRANTZ et ROBERTSON dans "Infect, and Immunity", 21ι 193-198 (1981), ou celui décrit dans "Applied and Environ ental Microbiology", octobre 1981, vol. 42, n ^* 4, 611-614 par P.E. KAUFFMAN en utilisant le peptide et la molécule porteuse appropriée.

Dans la pratique, on utilisera avantageusement comme agents de couplage les composés suivants, cités à titre non limitatif : aldéhyde glutarique, chloroformiate d'éthyle, carbodiimides hydrosolubles (N-éthyl-N* (3-dimé- thyla ino-propyl) carbodiimide, HC1), diisocyanates, bis- diazobenzidine, di- et trichloro-s-triazines, bromures de cyanogène, benzoquinone, ainsi que les agents de couplage

mentionnés dans Scand. J. Immunol., 1978, vol. 8, p.7-23 (AVRAMEAS, TERNYNCK, GUESDON) . On peut avoir recours à tout procédé de couplage faisant intervenir d'une part une ou plusieurs fonctions réactives du peptide et d'autre part, une ou plusieurs fonctions réactives des molécules supports. Avantageuse¬ ment, il s'agit des fonctions carboxyle et aminé, les¬ quelles peuvent donner lieu à une réaction de couplage en présence d'un agent de couplage du genre de ceux utilisés dans la synthèse des protéines, par exemple le 1-éthyl-3- (3-diméthylaminopropyl)-carbodiimide, le N-hydroxybenzo- triazole, etc.. On peut encore avoir recours à la glutaraldéhyde, notamment lorqu'il s'agit de relier entre eux des groupes aminés respectivement portés par le peptide et la molécule support.

Des caractéristiques supplémentaires de 1'inven¬ tion apparaîtront encore au cours de la description qui suit des conditions dans lesquelles des peptides préférés de 1'invention ont été obtenus. EXEMPLE 1 :

Synthèse du Arσ-Phe-Asp-Ser-Ala-Ala-Arσ-Phe-Asp-Ser

Pour préparer ce peptide, on a recours à la synthèse peptidique mentionnée ci-dessus et on procède comme suit ou de façon équivalente.

Les abréviations utilisées dans le cadre de cette synthèse ont la signification suivante :

BOC : i-butyloxycarbonyle

Asp : acide aspartique

Ala : alanine

Arg : arginine

Ser : serine

Phe : phénylalanine.

On utilise comme aminoacides des N-alpha-amino- acides protégés uniquement avec le groupe fc-butyloxy- carbonyle (BOC) .

FEUILLE DE REMPLACEME

Les groupes fonctionnels latéraux sont protégés comme suit :

Arg est protégé par le groupe tosyle.

Asp est protégé par le groupe cyclohexyle.

Ser est protégé par le groupe benzyle.

On distille CH ₂ C1 ₂ à partir de β _j CQ _j anhydre avant utilisation.

Il est avantageux d'utiliser un support de résine constitué par un copolymère chlorométhylé de styrène et de divinylbenzène à 1 % (commercialisé par les Laboratoires BIORAD) .

La N-alpha-±-butyloxycarbonyl-O-benzyl-sérine est de préférence estérifiée sous forme de son sel de césium (GISIN B.F. (1973) Helv. Chim. Acta !£. 1476).

La synthèse est effectuée dans un synthétiseur automatique du type de celui commercialisé par BECKMAN sous la désignation 990 B.

Chacun des acides aminés entrant dans la consti¬ tution du peptide selon 1'invention est fixé à la chaîne peptidique déjà formée comme il est indiqué ci-après. a) On lave trois fois la résine pendant environ 3 minutes avec du chlorure de méthylène pour la mettre en suspension. b) On lave ensuite une fois pendant environ trois minutes avec de 1'acide trifluoroacétique à 40 % pour imprégner la résine. c) On relave une fois pendant environ 30 minutes avec de 1'acide trifluoroacétique pour déprotéger le groupe N-terminal de la chaîne peptidique déjà formée. d) On lave ensuite deux fois pendant environ 3 minutes vec du chlorure de méthylène pour éliminer 1'acide trifluoroacétique. e) Puis on lave deux fois pendant environ 3 mi¬ nutes avec de l'alcool isopropylique pour éliminer le chlorure de méthylène.

f) Puis on réimprègne le milieu en lavant 4 fois pendant 3 minutes avec du chlorure de méthylène. g) On lave trois fois pendant environ 3 minutes - avec de la diisopropyléthyla ine pour neutraliser la fonction a iné, qui se trouvait salifiée sous forme de son sel avec l'acide trifluoroacétique. h) On lave quatre fois pendant environ 3 minutes avec du chlorure de méthylène pour chasser la diisopropy- lamine en excès. i) On ajoute l'acide aminé à fixer sur la chaîne peptidique déjà formée, comme indiqué ci-dessous. j) On lave ensuite trois fois pendant environ 3 minutes avec du chlorure de méthylène. k) Puis on chasse le chlorure de méthylène en lavant deux fois pendant environ 3 minutes avec de l'alcool isopropylique.

1) On lave enfin trois fois pendant environ 3 mi¬ nutes avec du chlorure de méthylène, pour remettre le mi¬ lieu réactionnel dans son solvant.

En ce qui concerne la fixation de chacun des aci¬ des aminés à une chaîne peptidique déjà formée, on a recours à un acide aminé (en excès par rapport à la chaîne peptidique déjà formée, cet excès correspondant à environ trois fois la charge de la chaîne peptidique) dont la fonction aminé est protégée par le groupe i-butyloxycar- bonyle et dont la fonction acide est activée par la dicyclohexylcarbodiimide, l'hydroxybenzotriazole ensuite additionné afin de minimiser les réactions secondaires (ARENDT A., KOLODZIEJZKYK A.M. (1978) Tetrahedron Lett 40, 3867), (MOJSOV S., MITCHELL A. R. (1980) J. Org. Che . 4£, 555).

Après chaque étape d'addition d'un acide aminé, on détermine la quantité d'acide aminé libre qui n'a pas été fixée sur la chaîne peptidique, par le test à la ninhy- drine (KAISER E., C0LESC0TT R.L. et al. (1976) Anal.

Biochem. 2A, 595) .

A la fin de la synthèse, on élimine tous les grou¬ pes protecteurs fixés__sur le peptide porté par la résine. On détache le peptide de la résine à 1'aide d'acide fluo- rhydrique anhydre à raison de 10 ml d'HF anhydre par gramme de résine, en présence de cresol (1 g par gramme de résine) à la température d'environ 0"C pendant environ 60 minutes.

Après évaporation de l'acide fluorhydrique, le mé¬ lange réactionnel est lavé à 1'éther et le peptide est sé¬ paré de la résine par extraction à 1'aide d'acide acétique à 5 %. Les extraits sont dilués à l'eau et lyophilisés.

Le peptide brut obtenu est soluble dans l'eau. Il est purifié par chromatographie sur une colonne du type de celle commercialisée sous le nom GF 05 (IBF) en utilisant comme phase mobile de l'acide acétique à 5 % . On mesure une absorption à 254 nm. Les différentes fractions du pic principal sont examinées sur le plan de leur homogénéité et rassemblées, puis repurifiées par HPLC (abréviation de l'expression anglaise "High Pressure Liquid Chromatogra- phy" ou "Chromatographie en Phase Liquide Haute Pression) , chargées en le matériau connu sous la marque PARTISIL 0DS2 ( hatman, magnum 9), au moyen d'un gradient de 0 à 70 % d'acétonitrile en présence de 1 pour mille d'acide tri- fluoroacétique. Les fractions sont collectées et lyophili¬ sées avec un rendement global de 25 %.

La composition en acides aminés, après hydrolyse acide totale, confirme la structure du peptide.

On mesure la pureté par chromatographie liquide sous haute pression en phase inversée sur une colonne du type de celle commercialisée sous le nom μ Bondapack C18 dans laquelle 1'éluant est un gradient que l'on fait pas¬ ser en 20 minutes de la composition 0 % d'acétone - 100 % de tampon phosphate 0,0025 M, pH 2,5 à la composition 60 % d'acétone-40 % tampon phosphate.

EXEMPLE 2 : Synthèse du peptide de formule RADS

La synthèse est réalisée dans des conditions ana¬ logues à celles décrites dans 1'exemple 1.

On obtient le peptide avec un rendement de 30 % . EXEMPLE ? :

De la même façon, on réalise les synthèses de KLNDRADSRRSL et des polypeptides suivants :

SDFRAARFDS

RADSAASDAR

SDARAARADS.

SXSMPEE 4 :

De la même façon, on réalise les synthèses des polypeptides dont les séquences correspondent à celles des virus ou lymphocytes dont les désignations abrégées appa¬ raissent à gauche de la liste qui suit : HLA-DR20 VRFLDRYFYNQEESVRFDSDVGEFRAVTELGRPDA LAV-F SLHGMDDPEREVLEWRFDSRLAFHHVARELHPEYF

HRV-14-V 1 SLVQLRKKLELFTYVRFDSEYTILATAS PDSANY

T8 RLGDTFVLTLSDFRRENEGYYFCSAL

T4 NQGSFLTKGPSKLNDRADSRRSLWDQGNFPL

EBV DGNKETFHERADSFHVRTNYKIV

EXEMPLE 5 :

Séquence contenue dans la glycorprotéine d'enveloppe

- de ARV2 : GVPV WKEATTTLFCASDARAYDTEVHNVWAT

- de lav )

HTLV III ) : GVPVW KEATTTLFCASDAKAYDTEVHNV AT

LV ) EXEMPLE 6 :

Les peptides suivants ont été synthétisés (et certains d'entre eux testés, comme décrit plus haut, dans des essais de médiation cellulaire in vitro selon la

technique de FISHER et al) :

- Peptides de 4 acides aminés

"DR-4" : RFDS HLA classe II

- Peptides de 7 acides aminés

"T4.-7" : DRADSRK T4 _Λ

"DR-7" : LRFDSDL DR ₂

- Peptides de 10 acides aminés

RFDS-A-A-RFDS SDFR-A-A-SDFR

- Peptides de 12 acides aminés

"T4.-12" : KLNDRADSRRSL

"DR-12" : EEYDRFDSDVGE

L'efficacité des peptides selon l'invention, en tant qu'inhibiteurs de l'adhésion du LAV à des lymphocytes T4, est illustrée ci-après pr les résultats qui ont été obtenus avec le peptide RFDS AA RFDS.

La fixation du LAV à son récepteur membranaire a été directement appréciée par 1'analyse de la fixation membranaire du virus LAV couplé à la fluorescéine (LAV FITC) . En bref, 10 cellules sont incubées avec 6 micro- grammes de LAV FITC, lavées, puis examinées au microscope à fluorescence. Par cette technique, on détecte habi¬ tuellement environ 10 % de cellules marquées dans une population de cellules T4 + puri iées. Pour évaluer la capacité du peptide synthétique à bloquer cette fixation, des cellules T4 ont été préincubées avec des concentrations variables du peptide, pendant 30 minutes à 4 ^* . Après lavage de l'excès du peptide non fixé, un marquage classique par le LAV FITC. Par cette technique, on a pu observer que le peptide étudié inhibait complè¬ tement la fixation du LAV FITC à son récepteur jusqu'à des concentrations aussi basses que 1 microgramme par millilitre.

On décrit ci-après des conditions préférées dans lesquelles les interactions cellulaires entre les mono- cytes, les lymphocytes T4 et les lymphocytes B peuvent être influencées par les peptides selon l'invention.

1 - Préparation des cellules mononucléées du sang périphé¬ rique (CMP)

Le sang veineux est collecté à partir de volon¬ taires sains sur liquémine (2500 U. 1/ml-Roche) et dilué dans une solution de Hank's 1 X (Bio érieux) . Les cellules mononucléées sont ensuite isolées par centrifugation sur Ficoll-Hypaque (Pharmacia Uppsala, Suède), densité 1,077, lavées et resuspendues dans du milieu RPMI 1640 (Gibco- Biocult, Ecosse) supplémenté avec 1 ml de L-glutamine (Biomérieux), 10 % d'un pool de sérum AB humain décomplé- enté (30 minutes à 56 ^* C) et d'antibiotiques (100 U/ml pénicilline, 100 μg/ l Streptomycine) .

2 - Enrichissement en lymphocytes T - Rosettes E (17)

2-1 Sensibilisation des globules rouσes de mouton

Les globules rouges de mouton sont lavés trois fois en milieu Hank's 1X. 20 ml de suspension de globules rouges à 2 % sont sensibilisés avec 1 ml de Neuraminidase 1 U/ml (test. Neuraminidase-Behring erke-Allemagne) pen¬ dant 30 minutes à 37 ^* C. Les globules rouges sensibilisés sont lavés trois fois en Hank's et réajustés à 2 % .

2.2 Absorption du sérum de veau foetal (SVF1

Le sérum de veau foetal (Gibco) est absorbé trois fois sur globules rouges de mouton ( 1 volume de culot glo¬ bulaire pour 1 volume de sérum de veau foetal)

- deux fois 30 minutes à 37 ^* C

- une fois 60 minutes à 4 ^* C

2.3 Formation des rosettes E

Les lymphocytes sont mis à une concentration de

7 10 /ml dans du RPMI 1640 sans sérum. 2 ml de suspension de globules rouges sensibilisés à la neuraminidase et 0.2 ml de SVF absorbé sont ajoutés à 1 ml de suspension lymphocy- taire.

FEUILLE DE REMPLACEMENT

Les tubes sont centrifugés à 200 g pendant 5 mi¬ nutes placés dans la glace pendant 1 heure au minimum.

Le culot est ensuite remis en suspension très délicatement. La population cellulaire formant rosettes (E ⁺ ), très enrichie en lymphocytes T est séparée du reste des cellules (E ^~ ) par sédimentation sur gradient de Ficoll à 4 ^* C.

Les globules rouges sont ensuite lysés par un choc hypotonique et les lymphocytes sont lavés trois fois en Han 's. 3 - Séparation des populations T. B. monocvtes

Les monocytes sont obtenus après adhérence des cellules mononucléées (10 /ml) sur boite de Pétri (Corning) pendant une heure à 37 ^* C. Ces boites de Pétri ont été préalablement incubées à 4 ^* C avec du SVF décom- plémenté, durant la nuit. Après avoir récupéré les cel¬ lules non adhérentes, les cellules adhérentes sont dé¬ tachées avec un barreau caoutchouté (rubber policeman) et par un pipettage vigoureux. Après deux lavages, elles sont irradiées à 4000 rads (IBL 137, source C--137, CEA) .

Les monocytes restants sont séparés des cellules non adhérentes par un traitement à la L-méthylleucine ester (5.10 /ml, 5 M final, Sigma) 40 minutes à tempé¬ rature ambiante (18). La réaction est arrêtée par addition de sérum AB humain (10 % final et lavages à froid).

Les lymphocytes T et B sont séparés par la techni¬ que des rosettes E. Les cellules T étant capables de for¬ mer des rosettes en présence de globules rouges de mouton sensibilisés à la neuraminidase, après une incubation d'une heure à 0 ^* C. Les cellules formant rosettes (E ⁺ ) se¬ ront séparées des cellules ne formant pas rosettes (E ^~ ou B) par sédimentation sur gradient Ficoll-Hypaque. Les glo¬ bules rouges de mouton sont lysés par choc hypotonique.

FEUILLE DE REMPLACEME

4 - Obtention de lignées T. interleukine 2 dépendantes, spécifiques du virus influenza

Les lignées spécifiques du virus influenza Bangkok (A/Bangkok) sont obtenues à partir de cellules mononu- _c cléées de donneurs sensibilisés (19).

Les lymphocytes sont mis à la concentration de

10 /ml dans du milieu RPMI, contenant 10 % de sérum AB humain (SAB) en présence du virus A/Bangkok à 5 μg/ml. 10

2 mmll ssoonntt répartis dans des flacons de culture (25cm , _Q Corning)

Après 7 jours de culture à 37 ^* C en atmosphère humide contenant 5 % de 0 ₂ , les cellules mortes sont éliminées par sédimentation sur gradient de Ficoll. Les blastes sensibilisés par le virus sont recueillis et 5 réajustés à (10 )/ml dans du milieu RPMI, 10 % SAB contenant de 1'interleukine 2 recombinant (BIOGEN-Suise) testé sur lignée CTLL- , et utilisé au 1/16000 final, en présence de lymphocytes autologues irradiés à 4000 rads ou de lignées B autologues immortalisées par le virus 0 d'Epstein-Barr, irradiées à 8000 rads (cellules de supplé- entation ou "feeders"). Ces "feeders" autologues sont ajoutés tous les 7 jours à un rapport : 1 "cellule feeder" pour 1 cellule de lignée. Le milieu de culture est remplacé par du milieu frais contenant 50 % de surnageant 5 riche en IL2., et de 1'IL 2 recombinant, les cellules étant réajustées à (10 )/ml tous les trois jours. 5 - Obtention des lignées B immortalisées par le virus d'Spstejn-93rr (SBV)

Des cellules mononucléées fraiches ou décongelées _Q sont resuspendues à la concentration de 2.10 /ml dans du illieu RPMI contenant 20 % de sérum de veau foetal dé- complémenté, en présence d'EBV, obtenue à partir de lignées hématopoîétiques B95-8 de mar osrt (N.I.G.M.S. Copewood St. Camden) , et de cyclosporine A à 1 μg/ml final, bloquant toute activation des lymphocytes T.

FEUILLE DE REMPLACEMENT

La culture se fait à 37 ^* C en atmosphère humide contenant 5 % de C0-. Le milieu est changé tous les 5 jours.

6 - Obtention des surnageants riches en IL 2 Des lymphocytes sont isolés du sang de deux ou trois donneurs, après incubation du sang une nuit à 37 ^* C.

Ces lymphocytes sont ensuite regroupés, irradiés à 1000 g rads et ajustés à 10 ml en RPMI 1640 supplémenté en

L-glutamine (2 mM) , antibiotiques, 20 % de sérum AB humain décomplémenté et 2 μg/ml de phytohémagglutinine purifiée

(DIFC0).

Après 48 heures de culture à 37 ^* C en atmosphère humide contenant S \ de CO,, le surnageant, riche en IL 2, est recueilli, filtré (filtre de 0,45 μm de porosité, Schlϋcher et Schell, Allemagne) et congelé à -20 ^* C jusqu'à 1'emploi.

L'IL 2 recombinant (BI0GEN, Genève, Suisse) testé sur lignées CTLL 2, et ajouté aux surnageants précédents, est aussi utilisé dans les tests de prolifération cel¬ lulaire au 1/16000 final.

7 - Test de prolifération cellulaire La prolifération lymphocytaire est induite soit par des itogènes :

- Phytohémagglutinine (PHA) 1/700e (DIFCO) , soit ^' par des antigènes après sensibilisation du sujet (naturelle ou par vaccination) ,

- Candidine (Cd) 500 μg/ml (Institut Pasteur),

- Virus influenza A/Bangkok 2 μg/ml (Institut Pasteur). Les cellules sont incubées à 37 ^* C en atmosphère humide contenant 5 % de CO, pendant trois jours pour les proliférations induites par. la PHA, et de six jours pour les proliférations induites par les antigènes précédents.

Selon le type de cellules utilisées : fraîches ou lignées, le test subira quelques modifications. - Pour les cellules fraîches, les lymphocytes sont

mis à la concentration de 10 /ml dans du RPMI 1640 conte¬ nant 10 % de sérum AB humain décomplémenté, supplé enté de L-glutamine et d'antibiotiques,

200 μl de la suspension cellulaire sont distribués dans des microplaques à fond rond, en triple (FLO ) .

Pour les populations séparées, les lymphocytes sont mis à la concentration de 10 /ml, dans le milieu RPMI 10 % sérum humain, et les monocytes irradiés à 0,25.10 /ml, 100 μl de chaque suspension cellulaire sont distribués dans des microplaques à fond rond, en triple.

Pour les lignées T spécifiques du virus in- 3 fluenza 15.10 cellules de la lignée préalablement lavées pour éliminer le TCGF, sont recombinées avec 3.10 lym¬ phocytes irradiés à 4000 rads, dans des microplaques à fond rond. Pour les lignées, la culture est de 72 heures.

Dans tous les cas, 1 'induction de la prolifération est réalisée avec 1 à 2 μg/ml de virus influenza A/Bangkok. La prolifération cellulaire est mesurée à l'aide d'un compteur à scintillations liquides (Minaxi tri-carb 4000, Packard) par l'incorporation de thymidine tritiée (CEA), 1 μCi/puits, 8 heures avant la fin de la culture. 4 lignées que nous avons obtenues sont testées : PT3, HT4, PT2, FPT1 , ainsi qu'un clone T auxiliaire (helper) disponible, obtenu par dilution limite : SB 12 (8). 8 - Test pour la production d'anticorps anti-influenza

Les préparations cellulaires T, B, séparées par la technique des rosettes E, et les monocytes irradiés, sont resuspendus dans du milieu RPMI 1640 contenant 10 % de sérum de chèvre décomplémenté (Flo ) , recombinés à raison de 10. 5 lymphocytes B, 5.104 monocytes, 2.105 lymphocytes

T qui sont les concentrations optimales préalablement mises au point par le laboratoire (16) . Le viruss A/Bangkok est ajouté à la concentration finale de 2 μg. Les cellules sont incubées à 37 ^* C en atmosphère

FEUILLE DE REMPLACEMENT

humide contenant 5 % C0 ₂ durant 7 jours. Les plaques sont alors centrifugées et les 200 μl de surnageant sont rem¬ placés par 100 μl de RPMI 1640 supplémente en L-glutamine (1 mM) , antibiotiques et 1 vol. de sérum de veau foetal décomplémenté. Après 5 jours de culture supplémentaires, les surnageants sont récoltés et stockés à -2 ^* C. La détermination des anticorps anti-influenza présents dans les surnageants de culture est réalisée par la méthode immuno-enzymatique (ELISA) ,

9 - Dosage des anticorps - technigue ELISA (20) Fixation de l'antigène

50 μl de virus influenza (50 μg/ml)

1 heure à 37'C

2 lavages PBS. 1 lavage PBS-BSA 3 %

PBS : tampon phosphate saline BSA : albumine bovine Saturation des sites de fixation 50 μl de PBS-BSA 3 %

1 heure à 37 ^* C

2 lavages PBS - 1 lavage PBS-BSDA 3 % Fixation spécifigue des anticorps à doser

50 μl de surnageants à tester

1 heure à 37 ^* C

2 lavages PBS - 1 lavage PBS-BSA 2 % Fixation de 1 'antiglobuline couplée à la phosphatase alcaline

50 μl de GaHIgG-phosphatase alcaline

1 heure à 37 ^* C

2 lavages PBS - 1 lavage PBS-BSA 2 %

3 lavages tampon bicarbonate pH 9,6, MgC- , 1,07 M Réaction enzyme substrat

100 μl de p-nitrophénylphosphate disodique (1 g/ ml) . Lecture de la densité optique à 405 nm sur un spec- tromètre MULTISKAN TITERTEX (FLOW) .

10 - Séguences peptidigues utilisées

- Peptides de 4 acides aminés "DR-4" : RFDS HLA classe II

- Peptides de 7 acides aminés "T ₄ -7" : DRADSRK T ₄ "DR-7" : LRFDSDL DR ₂

- Peptides de 12 acides aminés

"T4„-12" : KLNDRADSRRSL

"DR-12" : EEYDRFDSDVGE 11 - Anticorps monoclonaux utilisés

OKT ₄ A (IgG 2) Anticorps monoclonaux de la série OKT OKT.D (IgG 1) (ortho-diagnostic) préparés chez la souris, révélant les lymphocytes T dits inducteurs . ^I0T 3 ( ^I ?G2a) Anticorps monoclonaux (Immuno Tech)

IOM ₁ (IgG1) préparés chez la souris et révélés par une' antiglobuline anti-immunoglobuline de souris couplée à un fluorochrome (Nordic) I0T ₃ révélant 1 ' ensemble des lympho¬ cytes T matures IOM1 révélant les monocytes L243 (IgG2a> Anticorps monoclonaux (Becton-

Dickinson) CA206 (IgG2a) révélant les molécules HLA-DR L243 206 Leu 1 (IgG2a) Anticorps monoclonal révélant les populations T (CD5) (Becton-Dickinson) . RESULTATS 1 - Inhibition de la prolifération des lymphocytes T 1-2 - Utilisation de cellules T fraiches

Figure 1 Cette figure est illustrative de la variation de

la densité optique (fonction du taux de prolifération) en fonction de la concentration en peptide (en μg/ml) dans le milieu de culture dans l'essai qui suit.

Au cours d'un test de prolifération cellulaire de 6 jours induit par le virus influenza A/Bangkok, on ob¬ serve une inhibition significative par le peptide de 12 acides aminés ou "DR-12" (66 % ) . Cette inhibition est dé¬ pendante de la dose et reproductible ; elle varie d'indi¬ vidu à individu entre 50 et 70 % pour une concentration de 10 μg/ml de peptide. Elle est très proche de l'inhibition produite par l'anticorps monoclonal 0KT4 qui est de 86 % .

Un autre peptide de 12 acides aminés : "T _j^ -12" a un effet inhibiteur modéré variable (38 %) .

Figure 2

Si on compare 1'effet inhibiteur de trois types de peptides "DR" se différenciant par le nombre d'acides ami¬ nés entourant la séquence RFDS :"DR-12" , "DR-7", "DR-4", on note une corrélation entre la longueur des séquences peptidiques (1 sur l'axe des abscisses de la fig. 2) et l'intensité de l'inhibition (en ordonnées à la fig. 2).

Ces effets sont aussi reproductibles, et peuvent être retrouvés dans d'autres systèmes de prolifération tels le système tuberculine ou tétanos (non représenté) .

Il a été vérifié par comptage des cellules au bleu de trypan que cette inhibition par les peptides n'était pas due à un effet cytotoxique. Aucune inhibition n'est par contre observée dans un système induit par des lec- tines comme la PHA :

cpm

PBL seuls 893

PBL + PHA (1/700) 47 . 527 PBL + PHA + 0K ₄ -D (1 μg/ml) 44 . .083 PBL + PHA + L243 (0,1 μg/ml) 40 , . 1 1 9 PBL + PHA + "DR-12" (5 μg/ml) 49 , . 796 PBL + PHA + "DR-12" (10 μg/ml) 51 , . 570

1-3 Utilisation de lignées T antigène spécifique

Quatre lignées T auxiliaires (helper), spécifiques du virus A/Bangkok ont été testées avec les peptides de 12 acides aminés : "DR-12" et "T ₄ ~12" utilisés à 5 μg/ml fi¬ nal. Une inhibition très significative de 60 % à 90 % est notée par les deux peptides. On trouve une corrélation entre les effets du peptide "DR-12" et de l'anticorps

OKT4.-A. Cette corrélation d'inhibition est retrouvée avec le clone T helper SB 12 (décrit par FISHER et al) : aucune inhibition n'est observée avec le peptide "DR-12", ni avec l'anticorps OKT ₄ ~A. Les résultats apparaissent au tableau

1 ci-après.

2 - Inhibition de la proli ération des lymphocytes après incubation spécifique, avec les peptides analogues

Afin de préciser le mécanisme de 1'inhibition induite par le peptide "DR-12", des expériences

Tc leaμ 1 Effet des peptides utilisés sur des lignées T influenza

?péçjfique?

Peptides utilisés à 5 μg/ml

OKT4 A utilisé à 1 μg/ml

% d'inhibition sur la % d'inhibition sur la prolifération influenza production d'anticorps

Lignées T "DR-12" 0KT4 A "T4-12" "DR-12" OKT4 A "T4-12"

PT3 90 85 80 / / /

MT4 80 85 55 / / /

PT2 40 75 75 / / /

FPT1 60 65 70 / / /

Clone SB12 0 12 0 75 90 20

0 % d'inhibition : PT3.6000 cpm, MT4:6300, PT2:5000

FPT1:4500, SB12: 15200

Tableau 2 Test de fonctionnalité et phénotype des populations séparées

CPM

T + mγ + PHA 56, .000

T + mγ + IL2 55, .000

T + mγ + cd 17, .000

T + cd 2. .246

T seuls 1 .000

Monocytes seuls 184

T : lymphocytes T mγ : monocytes i cd : candidine

MENT

d'incubation des populations lymphoîdes purifiées avec les peptides ou des anticorps monoclonauxspécifiques des molé¬ cules T ₄ et HLA-DR ont été effectuées.

Il a d'abord été vérifié que les différents traitements utilisés pour séparer les populations lymphoî¬ des, en particulier la L-leucine méthyl ester, n'affecte pas la fonction des lymphocytes T et leur capacité à pro¬ liférer après stimulation par un antigène ou un mitogène. Il a aussi été montré que la population T est suffisamment dépourvue de monocytes pour éviter d'éventuelles interfé¬ rences dans les incubations. Les résultats résultent du tableau 2.

Sur le modèle des résultats obtenus antérieure¬ ment à l'aide d'anticorps anti-T ₄ (ou T ₄ ~D à 1 μg/ml fi¬ nal) , on a cherché à mettre éventuellement en évidence une synergie d'inhibition entre peptides équivalents de DR et anticorps anti-T. ainsi qu'entre peptides équivalents de T ₄ et anticorps anti-HLA-DR (20 à 10 final). Les ré¬ sultats apparaissent dans les tableaux 3 et 4.

L'expérience 1 montre une synergie d'inhibition entre les peptides "DR-12"/"T ₄ -12" , "DR-12"/anticorps anti-HLA-DR : 20 ainsi qu'entre les anticorps monoclonaux 0KT ₄ D/206 et 0KT ₄ D/"T ₄ .

Les mêmes synergies d'inhibitions sont retrou- vées dans l'expérience 2 entre "DR-12" et "T ₄ -12" ainsi qu'entre "T ₄ ~12" et 0KT ₄ D.

Dans cette expérience 2, ainsi que dans l'expé¬ rience 3, d'autres peptides de longueur différente ont été testés :

Tableau 3 Inhibition de la prolifération des lymphocytes T après incubations specifigues avec les peptides éguivalents de

T4 et de DR

Populations incubées Pourcentages d'inhibitions

Monocytes Expérience 1 Expérience 2

0 % 9300 cpm 0 % 7600 cpm

Peptides utilisés 100% 2000 cpm 100% 500 cpm ισ

0 206 10 /

DR-12 0 0 0

DR-12 206 57 /

0KT4D 0 5 15

0KT4D

15 206 75 /

0 T4-12 0 12

DR-12 T4-12 48 ^• 55

0KT4D T4-12 58 45

DR-12 DR-12 60 / 0 0 DR-12 20 /

0KT4D DR-12 60 /

Peptides utilisés à 1 μg/ml final

Tableau 4 Inhibition de la proli ération des lymphocytes T après incubations specifigues avec les peptides éguivalents de

T4 et de DR

Populations incubées Pourcentages d' inhibitions

Monocytes Expérience 2 Expérience 3

0 % 7600 cpm 0 % 4000 cpm

Peptides utilisés 100% 500 cpm 100% 200 cpm

DR-4 0 0 0

DR-4 T4-12 0 20

DR-7 (0, 1) 0 / 10

DR-7 0 / 25

DR-7 (0, 1) T4-12 / 40

DR-7 T4-12 / 65

DR-12 0 0 0

0 T4-12 12 10

DR-12 T4-12 55 90

RGDS 0 0 /

RGDS T4-12 0 /

Leu 1 T4-12 5 /

Leu 1 DR-12 0 /

peptides utilisés à 1 μg/ml

FEUILLE DE REMPLACEMENT

"DR-7", "DR-4". De nouveau, aucune action inhibitrice de "DR-4" n'est observée et une action intermédiaire entre "DR-4" et "DR-12" est notée pour le peptide "DR-7" quand il est utilisé en synergie avec "T. -12". _g Le test avec l'anticorps Leu 1 (à 1 μg/ml final) montre que les inhibitions ne sont pas dues à un effet non spécifique lié à une simple incubation.

Cependant, il est à noter l'inhibition obervée lors de l'incubation des monocytes avec le peptide "DR-12" _Q utilisé synergie avec 0KT.-D ou avec "DR-12". 3 - Inhibition de la réponse anticorps

Nous avons testé si ces peptides "DR" pouvaient bloquer la fonction auxiliaire (helper) des lymphocytes T vis-à-vis des cellules B. Après séparation par rosettes E, les populations sont recombinées à rais de 2.10 5 E+ 5 on , g _ 1,5.10 E en présence des différents peptides : "DR-12",

"DR-4", leurs effets étant comparés à celui de l'anticorps monoclonal OKT 4.-A. Ce test sera fait à trois concentra- tions finales : 0,1 μg/ml, 1 μg/ml, 10 μg/ml - Figure 4. 0 Les effets sont tout à fait comparables à ceux obtenus lors des tests de prolifération antigène spéci¬ fique. De même, quand on compare les effets des peptides de différentes longueurs - Figures 5-6-7. L'inhibition la plus élevée a lieu avec le peptide "DR-12", puis avec le 5 peptide "DR-7". Une faible, voire aucune inhibition, n'est observée avec le peptide "DR-4".

4 - Inhibition de la réponse anticorps après incubation specifigues avec les peptides analogues

Le même type d'expériences a été effectué dans 0 le cas de la réponse anticorps in vitro en incubant les lymphocytes T avec l'anticorps OKT .-A (0,1 μg/ml ou 1 μg/ml final) ou avec le peptide "DR-12" (1 μg/ml ou 5 μg/ml final) ; les lymphocytes B sont incubés avec le peptide "T ₄ -12" (1 μg/ml ou 5 μg/ml final ) - Figure 8.

35 Parallèlement aux tests de prolifération, on note une synergie d'inhibition entre "DR-12" et "T.-12" et

FEUILLE DE REMPLACEMENT

entre OKTA et "T.-12". On note donc une corrélation entre "DR-12" et 0KT ₄ A. L'effet est là aussi dépendant de la dose et reproductible.

Les résultats des expériences d'inhibition de la prolifération des lymphocytes T induite par le virus in¬ fluenza et de la production d'anticorps spécifiques HLA-DR restreints vis-à-vis du même virus, par différents pep¬ tides analogues de HLA et de T ₄ peuvent se résumer ainsi :

- Deux peptides respectivement de 12 et 7 acides aminés analogues de DR et comprenant la séquence RFDS, inhibent, de façon significative et dépendante de la con¬ centration, la prolifération et l'effet helper T spécifique du virus influenza.

L'inhibition obtenue est parallèle à celle consécutive à l'addition d'anticorps anti-T ₄ . Il est en particulier intéressant d'observer que la prolifération spécifique d'un clone T (SB 12) HLA-DR restreint, n'est ni inhibée par les anticorps T ₄ ni par le peptide "DR-12", alors que l'effet helper pour la production d'anticorps anti-influenza de ce clone est inhibé à la fois par les anticorps anti-T ₄ et le peptide "DR-12".

Il existe un effet modéré et variable d'inhi¬ bition de la prolifération T et de la réponse anticorps anti-influenza par le peptide de 12 acides aminés analogue de T ₄ incluant la séquence RADS.

- Il semble exister une synergie d'inhibition de la prolifération T et de la production ' nticorps lorsque les lymphocytes T sont préincubés avec le peptide "DR-12" ou un anticorps anti-T ₄ , et les monocytes ou les lympho- cytes B avec le peptide "T ₄ ~12" ou un anticorps anti- HLA-DR.

Plusieurs hypothèses peuvent expliquer l'effet inhibiteur des peptides "DR-12" et "DR-7" :

Ces peptides se fixent effectivement sur la molécule T. à la surface des lymphocytes T et inhibent de fait l'interaction T ₄ -classe II nécessaire à l'activation

et indispensable lors de la coopération T-B.

En faveur de cette hypothèse, on peut retenir la bonne corrélation entre le degré d'inhibition et le carac¬ tère HLA-DR restreint de- la réponse immune testée.

Le fait que la prolifération spécifique du clone SB n'est inhibée ni par le peptide "DR-12", ni par l'anti¬ corps anti-T ₄ , alors qu'une inhibition est observée dans la fonction helper par anti-T ₄ etle peptide "DR-12" indi¬ que également l'existence d'un étroit parallélisme entre les deux inhibitions.

Les réactions qui précèdent permettent également 1'étude de la capacité de substances déterminées à exercer une action immunomodulatrice que ce soit au niveau des lymphocytes T4 ou de celui des molécules HLA et à détecter si l'interaction, induite par un antigène déterminé, entre les différents types de cellules qui ont été étudiées, re¬ lève d'un type déterminé de molécules HLA, par exemple HLA-DR.

Par exemple dans le cas d'une molécule détermi¬ née, dont aurait été constatée la capacité d'inhiber les interactions, causées par un antigène déterminé, entre monocytes et lymphocytes T, d'une part, les lymphocytes T et lymphocytes B, d'autre part, lorsque cette molécule déterminée a été utilisée à une dose suivante, il sera ensuite possible, notamment en la substituant à l'un ou l'autre des peptides complémentaires dans les essais du type de ceux ^" décrits par FISHER qui ont été décrits plus haut, de détecter si son mode d'action est ou non sem¬ blable à celui du peptide remplacé.

En variante, les peptides selon l'invention peuvent également permettre de détecter si les réactions immunitaires induites par un antigène déterminé relèvent d'une intervention ou non demolécules HLA de classe I. déterminées, notamment de molécules HLA-DR. A cet effet les tests qui ont été décrits plus haut pourront être mis en oeuvre, si ce n'est que le virus influenza sera

remplacé, dans les étapes où celui-ci était amené à inter¬ venir, par cet antigène déterminé. Son mode d'action, mettant, en jeu: ou non les molécules HLA-DR, dépendra de

1'observation ou non d'une inhibition des coopérations cellulaires qui auront été constatées.

Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application et de réalisation qui ont été plus spécialem 1ent envisagés ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes.

Il est entendu que toute la littérature technique à laquelle renvoie la bibliographie incluse dans cette demande, notamment celle qui suit doit être considérée corne faisant partie de la présente description, en ce qu'elle serait nécessaire à l'illustration des points à partir desquels la présente invention a été dé¬ gagée.

FEUILLE DE REMPLACEMENT

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FEUILLE

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