Peptide und Peptid-Derivate, HerstellunR derselben sowie deren Verwendung zur Herstellung eines therapeutisch und/oder präventiv wirkenden Arzneimittels

Die Erfindung bezieht sich auf Peptide und Peptid-Derivate, deren Herstellung sowie deren Verwendung zur Herstellung eines therapeutisch und/oder präventiv wirkenden Heilmittels sowie ein solches Arzneimittel.

In EP1586586 wurde die Verwendung von Peptiden aus der Sequenz des Fibrins beschrieben, die eine entzündungshemmende Wirkung aufweisen.

Diese Wirkung könnte darauf beruhen, dass das Fibrin über seinen neo-N-Terminus der Bbeta-Kette an Endothelzellen und über die Sequenz der Aalpha-Kette an Zellen im Blutstrom bindet und so zur Adhäsion und Transmigration von Zellen ins Gewebe führt. Diese Verbindungen haben eine Nebenwirkung, und zwar wird die Fibrinbildung gehemmt. Diese Hemmung bedeutet jedoch für den Patienten keinen potentiellen Nachteil, da die Blutgerinnung auch in Abwesenheit von Fibrin bei banalen Verletzungen ausreichend ist. Lediglich bei chirurgischen Eingriffen könnte gegebenenfalls ein Absetzen einer derartigen Therapie zweckmässig sein. Andere Nebenwirkungen sind im wesentlichen auszuschliessen, da diese Substanzen nur mit den natürlichen Liganden interagieren. Weiters wird die natürliche Abwehr durch die Leukozyten im Blut nicht negativ beieinflusst. So bleibt die Zusammensetzung derselben, wie Granulozyten, Lymphozyten und Monozyten unbeeinflusst, so dass der natürliche Abwehrprozess erhalten bleibt und die Infektabwehr im Blut unverändert bleibt.

Fibrinogen wird in der Leber gebildet und ist in dieser Form biologisch inaktiv und befindet sich normalerweise in Konzentrationen um 3 g/l im Blut. Durch proteolitische Spaltung des Proenzyms Prothrombin wird Thrombin gebildet, welches vom Fibrinogen die Fibrinopeptide A und B abspaltet. Dadurch wird Fibrinogen in seine biologisch aktive Form umgewandelt. Es entstehen Fibrin und Fibrinspaltprodukte.

Thrombin wird bei jeder Aktivierung der Blutgerinnung gebildet, also bei jedem Gewebeschaden, sei dieser entzündlicher, traumatischer oder degenerativer Genese. Die durch Thrombin mediierte Bildung von Fibrin ist prinzipiell ein protektiver Vorgang, um entstandene Defekte im Gefässsystem rasch abzudichten. Die Bildung von Fibrin ist jedoch auch ein pathogener Vorgang. Die Entstehung eines Fibrinthrombus als auslösende Ursache beim Herzinfarkt ist einer der prominentesten Probleme in der Humanmedizin.

Bisher nicht oder nicht ausreichend untersucht wurde die Rolle von Fibrin bei der

Extravasation von Entzündungszellen aus dem Blutstrom ins Gewebe, ein einerseits erwünschter Vorgang bei der Abwehr von pathogenen Mikroorganismen oder Tumorzellen im Gewebe, andererseits aber ein Vorgang, der durch sich selbst Gewebeschaden induziert oder weiter erhält. Fibrin bindet über seinen neo-N-Terminus der Bbeta an Endothelzellen mittels der Sequenz zu Bbeta und an Zellen im Blutstrom mittels der Sequenz Aalpha und führt so zur Adhäsion und Transmigration von Zellen ins Gewebe.

Die erflndungs gemäßen Peptide oder Proteine können die Adhäsion von Zellen aus dem Blutstrom an Endothelzellen der Gefässwand und/oder ihre nachfolgende Transmigration aus dem Blut ins Gewebe verhindern.

In der Patentschrift WO9216221 werden Polypeptide beschrieben, die kovalent an langkettige Polymere wie z.B. Methoxy-Polyethylenglykol (PEG) gebunden sind. Die Bindung von Polypeptiden an solche Polymere führt häufig zu einer Verlängerung der biologischen Halbwertszeit dieser Polypeptide und verzögert ihre renale Ausscheidung. Eine Zusammenfassung dieser Eigenschaften findet sich in Davis et al., Polymerie Materials Pharmaceuticals for Biomedical Use, Seiten 441-451 (1980) Die Addition von PEG-Gruppen übt diese Wirkung in proportionaler Weise zum Molekulargewicht des pegylierten Peptids aus, da die glomeruläre Filtrationsrate bis zu einer bestimmten Größe des Moleküls invers proportional zum Molekulargewicht ist.

Die Patentanmeldung WO2004/101600 beschreibt ebenfalls neue Poly(ethylen glycol) modifizierte Verbindungen und ihre Verwendung mit besonderem Gewicht auf modifizierte Peptide, die den Erythropoietin-Rezeptor aktivieren.

Weitere Beispiele für die kovalente Modifierung von Peptiden und Proteinen PEG-Resten sind Interleukine (Knauf et al., J. Biol Chem. 1988, 263, 15064; Tsutumi et al., J. Controlled Release 1995, 33, 447), Interferone (Kita et al., Drug Delivery Res. 1990, 6 157), Katalase (Abuchowski et al., J. Biol. Chem. 1997, 252, 3582). Ein Review des Stands der Technik ist zu finden unter Reddy, Ann. Of Pharmacotherapy, 2000, 34, 915).

Für verschiedene therapeutische Anwendungen von Peptiden ist eine verlängerte biologische Halbwertszeit vorteilhaft. Dies gilt insbesondere für chronische Erkrankungen, bei denen eine Gabe der Wirksubstanz über einen längeren Zeitraum angezeigt ist. In solchen Indikationen kann dadurch die Compliance des Patienten erhöht werden, da eine z.B. einmal tägliche Applikation der Wirksubstanz besser akzeptiert wird als eine andauernde Infusion.

An verschiedenen Beispiele wurde gezeigt, dass für jedes Peptid die entsprechende Modifikation massgeschneidert werden muss, um eine signifikante Beeinflussung der pharmakodynamischen Wirkung im Vergleich zum unmodifizierten Peptid zu vermeiden. Als Referenz hierzu sind zu sehen: Calcitonin (Lee et al. Pharm. Res. 1999, 16, 813), Growth Hormon Releasing Hormon (Esposito et al., Advanced Drag Delivery Reviews, 2003, 55, 1279), Glucagon like peptide 1 (Lee et al., Bioconjugate Res. 2005, 16, 377), sowie der Wachstumshormon-Rezeptor Antagonist Pegvisomant (Ross et al., J. Clin. Endocrin. Metab. 2001, 86, 1716). In den übersichtsartikeln von Caliceti und Veronese (Adv. Drag DeKv. Rev. 2003, 55 1261) sowie Harris und Chess (Nature Rev. Drag Discovery 2003, 2, 214) wird diskutiert, dass für das Design von Peptid- oder Protein-PEG-Konjugaten die Struktur der Stammsubstanz, das Molekulargewicht des Peptids und des Polymers, die Anzahl der konjugierten Polymer-Ketten und die Linker-Chemie in Betracht gezogen werden muss, um ein wirksames Peptid-PEG-Konjugat zu erhalten.

Es wurde nun überraschend gefunden, dass Peptide abgeleitet von der Kette des Bbeta(15- 42)Fibrin-Fragments, bei denen gegenüber der natürlichen Fibrinsequenz einzelne oder mehrere Aminosäuren gegen andere Aminosäuren ausgetauscht worden sind, sowie am C- terminalen Ende der Peptidsequenz modifizierte Derivate ebenfalls eine starke entzündungshemmende Wirkung aufweisen.

Die Erfindung betrifft daher Peptide und Peptid-Derivate der folgenden allgemeinen Formel I:

H ₂ N-GHRPXIX ₂ X ₃ X ₄ X ₅ XeXvXsPXgXiOXi 1PX12PPPX13X14X15X16GYR-K- X ₁₇

B

H ₂ N-GHRPX ₁ X ₂ X ₃ X ₄ X ₅ XeXVXSPX ₉ XIOXIIPXnPPPXi ₃ XMXi ₅ Xi ₆ GYR-K- Xi ₇ (I),

in welcher bedeutet:

Xi - Xi6 eine der 20 genetisch kodierten Aminosäuren,

Xiv OH oder NH ₂

und

B einen Rest

-CO-(CH ₂ ) _m - Y-(CH ₂ ) _m -CO-

welcher über die CO-Gruppen an die ε-Aminogruppen des Rests K gebunden ist und in welchem wiederum

m eine ganze Zahl von 1-4 und

Y ein Rest

-N-CO-(CH ₂ ) _n -NH-CO-Z-PEG _5-6 oκ

oder ein Rest

-N-CO-(CH ₂ ) _n -NH-CO-CH-(CH ₂ ) ₄ -NH-CO-Z-PEG _5-6 oκ

NH-CO-Z-PEG _5-60 K

bedeutet, in welchen

n eine ganze Zahl von 1-4 und

Z NH oder ein Sauerstoffatom bedeuten,

sowie deren physiologisch verträgliche Salze.

Die Erfindung betrifft weiterhin Peptid-Dimere der allgemeinen Formeln (IIa) und (IIb),

H ₂ N-GHRPX ₁ X ₂ X ₃ X ₄ X ₅ X ₆ X ₇ X ₈ PX ₉ X _1O XI ₁ PX ₁₂ PPPX ₁₃ X1 ₄ X15CGYR X ₁₇

S-CH ₂ \

/CH- CH ₂ -CO-NH- Z (IIa) S- CH ₂

H ₂ N-GHRPX ₁ X ₂ X ₃ X ₄ X ₃ X _S X ₇ X _S PX ₉ X _IO XnPX ₁₂ PPPX _B XuXi _S CGYR X ₁₇ ,

H ₂ N-GHRPX ₁ X ₂ X ₃ X ₄ X ₅ X ₆ X ₇ X ₈ PX ₉ XIOXI X ₁₇

S-CH,

CH- CH ₂ -CO-NH- Z (IIb)

S- CH ₂

H ₂ N-GHRPX ₁ X ₂ X ₃ X ₄ X ₅ X ₆ X ₇ X ₈ PX ₉ X ₁ OX ₁ iPXi ₂ PPPX ₁₃ Xi 4CXi ₅ GYR X _n ,

in welchen alle Reste die oben angegebenen Bedeutungen haben und in welchen

Z einen Rest PEG ₅ _ ₃ o _k

oder einen Rest CH ₂ -NH-CO-CH(CH ₂ -O-PEG _5-3 Ok ) ₂

bedeuten kann, sowie deren physiologisch verträgliche Salze.

Bevorzugter Gegenstand der Erfindung sind Peptide und Peptid-Derivate der allgemeinen Formeln I, IIa und IIb, in welcher bedeuten:

Xi, X ₉ , Xio, Xi ₄ L, I, S, M oder A,

X ₂ , X ₆ , X ₇ E oder D,

X ₃ , X ₄ , X ₅ , Xn R oder K

X ₈ , Xi ₂ A, G, S, oder L

X ₁₃ I, L oder V

X ₁₅ , Xi ₆ G, A, S oder C

und in welcher X ₁₇ und B die oben angegebene Bedeutung hat, sowie deren physiologisch verträgliche Salze.

Besonders bevorzugter Gegenstand der Erfindung sind Peptide und Peptid-Derivate der Formel III, IVa und IVb,

H ₂ N-GHRPLDKKREEAPSLRPAPPPISGGGYR-K- X ₁₇

B

H ₂ N- GHRPLDKKREEAPSLRPAPPPISGGGYR-K- X ₁₇ (HI),

H ₂ N-GHRPLDKKREEAPSLRPAPPPISGCGYRX ₁₇

'CH- CH ₂ -CO-NH- PEG _5-30 K (IVa)

S- CH ₂

H ₂ N- GHRPLDKKREEAPSLRPAPPPISGCGYRXn

H ₂ N-GHRPLDKKREEAPSLRPAPPPISCGGYRX ₁₇

/ CH- CH ₂ -CO-NH- PEG _5-30K (TVii) S- CH ₂

H ₂ N- GHRPLDKKREEAPSLRPAPPPISCGGYRX ₁₇

in welchen X ₁₇ und B die oben für Formel I angegebene Bedeutung hat, sowie deren physiologisch verträgliche Salze.

Ganz besonders bevorzugter Gegenstand der Erfindung sind Verbindungen der Formel (III), (IVa) und (IVb),

in welchen

X _n NH ₂ und

B die oben angegebene Bedeutung hat, wobei

n und m die Zahl 1 bedeuten sowie deren physiologisch verträgliche Salze.

In den oben angegebenen Formeln I und II stehen folgende Buchstaben für Aminosäurereste entsprechend der allgemeinen Annotation für Proteine und Peptide: Phenylalanin ist F, Leucin ist L, Isoleucin ist I, Methionin ist M, Valin ist V ₅ Serin ist S, Prolin ist P, Threonin ist T, Alanin ist A, Tyrosin ist Y, Histidin ist H, Glutamin ist Q, Asparagin ist N, Lysin ist K, Asparaginsäure ist D, Glutaminsäure ist E, Cystein ist C, Tryptophan ist W, Arginin ist R, Glycin ist G.

Die Aminosäurereste in den Verbindungen der Formel I können entweder in der D- oder der L-Konfiguration vorliegen.

Der Begriff Peptid bezieht sich auf ein Polymer aus diesen Aminosäuren, die über eine Amidbindung miteinander verknüpft sind.

„Physiologisch verträglich" bedeutet, dass die Bildung von Salzen mit Säuren oder Basen erfolgt, deren Zugabe keine unerwünschten Wirkungen bei der Anwendung am Menschen verursacht. Bevorzugt sind Salze mit Säuren oder Basen, deren Verwendung in der U.S. Pharmakopoe oder einer anderen generell anerkannten Pharmakopoe für die Anwendung bei Warmblütern, insbesondere beim Menschen gelistet sind.

PEG steht für einen Polyethylenglykol-Rest mit einem Molekulargewicht zwischen 5.000 und 60.000 Dalton, wobei dieses Molekulargewicht das Maximum einer Molekulargewichts - Verteilung darstellt und einzelne Komponenten des Gemisches ein höheres oder niedrigeres Molekulargewicht aufweisen können.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der Peptide und Peptid- Derivate der allgemeinen Formel (I), dadurch gekennzeichnet, dass ein monomeres Peptid oder Peptid-Derivat der allgemeinen Struktur III,

H ₂ N-GHRPX ₁ X ₂ X ₃ X ₄ X ₅ X ₆ X ₇ X ₈ PX ₉ XIOXI !PX ₁₂ PPPXnXi ₄ Xi ₅ Xi ₆ GYR-K- X ₁₇

I (V)

(CH ₂ ) ₄ -NH ₂

das mit gegebenenfalls mit geeigneten Schutzgruppen an funktionellen Gruppen in den Seitenketten versehen ist, mit einem Reagenz der Formel IV umsetzt

BOC-NH-(CH ₂ ) _n -N-[(CH ₂ ) _m -CO-OU] ₂ (VI),

in welcher n und m die in B angegebene Bedeutung haben und U eine geeignete, mit Aminogruppen zu einer Amidbindung führende reaktive Gruppe darstellt, die BOC- Schutzgruppe mittels geeigneten Verfahren abspaltet und anschliessend den PEG-Rest oder die PEG-Reste über ein geeignet funktionalisiertes Derivat einführt.

Als Reste U kommen insbesondere Aktiv-Ester wie z.B. Succinylimido, p-Nitrophenyl oder Pentafluorphenyl in Betracht.

Geeignete Verfahrensschritte sowie geeignete Reagenzien sind beispielsweise in WO2004/101600 beschrieben.

Verbindungen der allgemeinen Formeln (IIa) und (IIb) erhält man unter anderem nach den folgenden Syntheseschemata:

Variante 1

YR-NH2

GHRPLDKKRE EAPSLRPAPP

GHRPLDKKRE EAPSLRPAPP

Variante 2

GHRPLDKKRE EAPSLRPAPP PIS TQCGYR-NH2

SH

GHRPLDKKRE EAPSLRPAPP

GHRPLDKKRE EAPSLRPAPP

Die erfindungsgemässen Substanzen bzw. die Verwendung der erfmdungsgemässen Substanzen zur Herstellung eines Arzneimittels sind von besonderer Bedeutung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Therapie von Erkrankungen, die durch gewebsschädigende Wirkung von autoreaktiven Lymphozyten entstehen.

Hierzu zählen Erkrankungen aus dem Formenkreis der Autoimmunität, wie z. B. Kollagenosen, rheumatische Erkrankungen, entzündliche Darmerkrankungen wir Morbus Crohn oder Colitis ulcerosa, Psoriasis und psoriatischen rheumatoide Artrithis, und post- parainfektiöse Erkrankungen und Erkrankungen, die durch eine Graft versus Host Reaktion entstehen. Eine heilende Wirkung tritt ein, da dieses Arzneimittel die Wanderung der Lymphozyten ins Gewebe blockiert. Die Lymphozyten bleiben somit im Blutstrom und können keine autoreaktive gewebsschädigende Wirkung erzeugen. Diese Wirkung der erfindungsgemäßen Substanzen ist weiterhin von Bedeutung bei der Behandlung von Schockzuständen, insbesondere beim septischen Schock ausgelöst durch Infektion mit grampositiven oder gramnegativen bakteriellen Erregern, sowie bei viralen Infektionen, und beim hämorrhagischen Schock ausgelöst durch starken Blutverlust aufgrund von Verletzungen oder bakteriellen oder viralen Infektionen.

Die erfindungsgemäßen Substanzen können allgemein bei Situation eingesetzt werden, die mit dem Begriff „Systemic Inflammatory Response Syndrome (SIRS)" , „Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS)" oder Organ- bzw. Multiorganversagen umschrieben werden.

Bei einem Arzneimittel zur Therapie und/oder Prävention von Abstossungsreaktionen bei Organtransplantationen tritt eine heilende Wirkung ein, da dieses Arzneimittel die Wanderung von Lymphozyten aus dem Blutstrom in das Fremdorgan verhindert und somit das Fremdorgan nicht durch autoreaktive Lymphozyten zerstört werden kann.

Bei einem Arzneimittel zur Therapie und/oder Prävention von Arteriosklerose tritt eine heilende Wirkung ein, da dieses Arzneimittel die Wanderung von Lymphozyten und Monozyten in die Gefässwand und somit die Aktivierung der Zellen der Gefässwand unterbindet. Damit wird das Fortschreiten der Arteriosklerose minimiert oder unterbunden und die Arterisklerose zurückgebildet.

Bei einem Arzneimittel zur Therapie und/oder Prävention des Reperfusionstraumas nach chirurgisch oder pharmazeutisch induzierter Wiederdurchblutung, wie z. B. nach Herzinfarkt, Schlaganfall, nach Gefässoperationen, Bypassoperationen und Organtransplantationen, tritt eine heilende Wirkung ein, da dieses Arzneimittel die Wanderung von Lymphozyten und Monozyten in die Gefässwand hemmt. Das Reperfusionstrauma entsteht durch Sauerstoffmangel/Azidose der Zellen des Gefässes während der Wiederdurchblutung und führt zu deren Aktivierung. Dadurch haften Lymphozyten und Monozyten an der Gefässwand und wandern in diese ein. Die Unterbindung der Anhaftung und Einwanderung von Lymphozyten und Monozyten in die Gefässwand lässt den Hypoxie/ Azidose-induzierten Schaden abklingen, ohne dass durch die nachfolgende Entzündungsreaktion ein bleibender Gefässschaden entsteht.

Bei einem Arzneimittel zur Therapie und/oder Prävention der Arteriosklerose im Gefolge von Stoffwechselerkrankungen oder Alterungsprozessen tritt eine heilende Wirkung ein, da dieses Arzneimittel die Wanderung von Lymphozyten und Monozyten in die Gefässwand hemmt und damit die daraus resultierende Progredienz der arteriosklerotischen Plaque hemmt.

Das erfϊndungsgemässe Arzneimittel kann auch zum Transport eines weiteren Arzneimittels eingesetzt werden. Das erfϊndungsgemässe Arzneimittel bindet spezifisch ein Oberflächenmolekül an Endothelzellen- Damit können daran gekoppelte Arzneimittel an Endothelzellen in hoher Konzentration gebracht werden, ohne dass diese an anderen Stellen Nebenwirkungen erzeugen können. Als Beispiel sei hier die Verwendung von zellteilungshemmenden Substanzen genannt, die spezifisch an Endothelzellen herangeführt eine antiangiogenetische Wirkung ausüben können. Eine heilende Wirkung tritt hier bei Tumorpatienten ein, da das Tumorwachstum durch eine Verhinderung der Endothelzellproliferation und damit durch eine Verhinderung derNeoangiogenese blockiert wird.

Die erfmdungsgemäßen Verbindungen der Formel (I) könne zusammen mit pharmazeutischen Hilfsmitteln um Zusätzen in pharmazeutische Zubereitungen gebracht werden, die ebenfalls Gegenstand der Erfindung sind. Zu Herstellung solcher Zubereitungen wird eine therapeutisch Wirksame Dosierung des Peptids oder Peptidderivats mit pharmazeutisch anwendbaren Verdünnern, Stabilisierern, Löslichmachern, Eniulgierhilfsmitteln, Adjuvantien oder Trägern gemischt und in eine geeignete therapeutische Form gebracht. Solche Zubereitungen enthalten beispielsweise Verdünnung verschiedener Puffer (z.B. Tris-HCl, Acetat, Phosphat) unterschiedlichen pH- Werts und Ionenstärke, Detergentien und Solubilisierer (z.B. Tween 80, Polysorbat 80), Antioxidantien (z.B. Ascorbinsäure), und Füllstoffe (z.B. Lactose, Mannit). Diese Formulierungen können die biologische Verfügbarkeit und das metabolische Verhalten der Wirkstoffe beeinflussen.

Die erfindungs gemäßen pharmazeutischen Zubereitungen können oral, parenteral (intramuskulär, intraperitoneal, inravenös oder subkutan), transdermal oder in einem erodierbaren Implantat aus einem geeigneten bioabbaubaren Polymer (z.B. Polylactat oder Polyglykolat) verabreicht werden.

Die biologische Wirksamkeit und Anwendbarkeit für die beanspruchte Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen wurde in einem Assay bestimmt, in welchem die Hemmung der Freisetzung von Interleukin-6 (IL-6) aus einer Kultur von human Nabelschnur- Endothelzellen nach Stimulation mit dem „N-terminal disulfide knot protein II" (NDSK-II) gemessen wurde. IL-6 ist bekannt als starker Mediator von Entzündungsreaktionen. Die Hemmung seiner Freisetzung ist daher ein starker Prediktor für eine generelle anti- inflammatorische Wirkung und damit eine Wirksamkeit in den oben beschriebenen Erkrankungen.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen hemmen die Freisetzung von IL-6 in diesem Assay in einem Konzentrationsbereich von 0.1 nmol/ml bis 100 mmol/ml, bevorzugt in einem Bereich von 1 nmol/ml bis 1 mmol/ml.

Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Illustration der Erfindung, ohne diese auf die Beispiele zu beschränken.

Generelle Herstellung und Aufreinigung erfindungsgemäßer Peptide

Prinzipiell erfolgt die Herstellung und Reinigung der genannten Peptidderivate mittels FMOC-Strategie auf säurelabilen Trägerharzen unter Benutzung eines kommerziell erhältlichen „Batch"-Peptidsynthesizers wie auch in der Literatur beschrieben (z.B. „solid

phase peptide synthesis - A practical approach" von E. Atherton , R.C. Sheppard, Oxford University press 1989). Als Aminosäurebausteine werden N-alpha-FMO C geschützte Derivate verwendet, deren funktionelle Seitenketten mit säurelabilen Schutzgruppen geschützt sind. Die Reinigung erfolgt sofern nicht anders beschrieben mittels RP-Chromatographie unter Verwendung eines Wasser- Acetonitril Gradienten und 0.1 % TFA als Ionenpaar- Reagenz.

Beispiel 1

100 mg Tentagel-S-RAM (Rapp-Polymere) mit einer Beladung von 0.24 mmol/g werden in ein kommerzielles Peptidsynthesegerät (PSMM(Shimadzu)) überführt, in dem der schrittweise Aufbau der Peptidsequenz nach der Carbodiimid/HOBt Methode erfolgt.

Die FMOC-Aminosäurederivate werden durch Zugabe von Di-isopropy-carbodiimid (DIC),

Di-isopropy-ethylamin (DIPEA) und Hydroxybenzotriazol (HOBt) in 5-fach äquimolarem

überschuss voraktiviert und nach Transfer in das Reaktionsgefäß für 30 Minuten mit dem

Trägerharz vermischt. Waschschritte erfolgen durch 5 -malige Zugabe von 900 μl DMF und

Durchmischen für 1 Minute. Abspaltschritte erfolgen durch Zugabe von 3 x 900 μl 30%igem

Piperidin in DMF und Durchmischung für 4 Minuten.

Die Entfernung der einzelnen Reaktions- und Waschlösungen erfolgt durch Durchdrücken der

Lösungen durch die Bodenfritte des Reaktionsgefäßes.

Es kommen die Aminosäurederivate FMOC-AIa, FMOC-Arg(Pbf), , FMOC-Asp, FMOC-

GIy, FMOC-His(Trt), FMOC-IIe, FMOC-Leu, FMOC-Lys(BOC), FMOC-Pro, FMOC-

Ser(tBu), FMOC-Cys(Trt) und FMOC-Tyr(tBu) von Fa. Orpegen zum Einsatz.

Nach erfolgter Synthese wird das Peptidharz getrocknet. Die Abspaltung des Peptidamides erfolgt anschließend durch Behandlung mit Trifluoressigsäure/TIS/ EDT/Wasser (95:2:2:1

vol) für 2 Stunden bei Raumtemperatur. Durch Filtration, Einengen der Lösung und Ausfällen durch Zugabe von eiskaltem Diethylether wird das Rohprodukt (75 mg) als Feststoff gewonnen.

Eine Reinigung des Peptides erfolgt per RP-HPLC auf Kromasil RP-18 250-20, 10 μm in 0.1

% TFA mit einem Gradienten von 5 auf 60 % Acetonitril in 40 Minuten bei einer Flussrate von 12 ml/min, und Beurteilung des Eluates mittels UV -Detektor bei 215 nm. Die Reinheit der einzelnen Fraktionen wird per analyt. RP-HPLC und Massenspektrometrie ermittelt.

ω,ω-Dijodmethyl-propionsäure wird mit Dicyclohexylcarbodiimid und N-Hydroxy- succinimid in den entsprechenden Aktivester umgewandelt. Nach Umsetzung mit Amino- ethyl-polyethylenglycol (20 KD) erhält man das entsprechende Amid.

Unter Verdünnungsbedingungen wird das wie oben hergestellte Peptid zugegeben. Nach Aufarbeitung und Reinigung mittels präparativer Reverse-Phase Chromatographie erhält man 32 mg des gewünschten Produkts. Dessen Identität mittels MALDI-MS bestätigt wurde.

Beispiel 2

GHRPLDKKRE EAPSLRP APP PISGCGYR-NH2

SH

GHRPLDKKRE EAPSLRP APP PISGCGYR-NH2

GHRPLDKKRE EAPSLRP APP PISGCGYR-NH2

Die Herstellung der Verbindung dieses Beispiel erfolgt in analoger Weise zur Verbinudng des Beispiel 1. wobei an Stelle des Amino-ethyl-PEG die Verbindung der Formel VII zum Einsatz kommt.